nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng lan huệ lai (hippeastrum equestre

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THU THỦY
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG
LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – Năm 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THU THỦY
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG
LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Nguyễn Trung Thành
Hà Nội – Năm 2014
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc
đến PGS.TS. Nguyễn Trung Thành, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS.
Nguyễn Quang Thạch, TS. Nguyễn Hạnh Hoa và toàn thể tập thể cán
bộ, nhân viên trong Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông
nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện về cơ sở
vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình,
người thân và bạn bè, những người luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ

và góp ý cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2014
Học viên
Nguyễn Thị Thu Thủy
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BAP 6-benzylaminopurin
CT Công thức
CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance)
ĐC Đối chứng
IBA indol-3-acetic acid
MS Murashige và Skoog, 1962
LSD
0,05
Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P - 0,5
(Leant Significant Difference)
ND Nước dừa
αNAA α-naphthylacetic acid
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC BẢNG
Trang
DANH MỤC HÌNH
Trang
MỞ ĐẦU
Lan huệ (Hippeastrum equestre) là một trong những loài hoa được
yêu thích và rất có tiềm năng phát triển trong những năm gần đây. Lan huệ
được trồng khá phổ biến để làm cảnh do màu sắc đa dạng, khả năng
thương mại cao khi là hoa cắt cành hoặc được trồng trong chậu cảnh hay
vào các dịp lễ, tết. Bên cạnh đó, đây còn là cây thuốc chữa bệnh vì theo

đông y trong củ của nó có chứa các thành phần biệt dược có giá trị như các
ankaloids (Funganti, 1975), các lectins có khả năng chống ung thư, cầm
máu, chữa lành vết thương…
Lan huệ ở Việt Nam hiện nay còn nghèo nàn về màu sắc (chủ yếu là
màu đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại khá muộn (khoảng từ giữa tháng 3
đến cuối tháng 5) nên khả năng phát triển loài hoa này còn rất nhiều hạn
chế. Bằng con đường thu thập nguồn gen, lai hữu tính và chọn lọc có thể
làm phong phú bộ giống hoa Lan Huệ ở nước ta. Năm 2009 – 2010,
Nguyễn Hạnh Hoa và cs đã chọn tạo ra hàng loạt con lai có màu sắc lạ,
đẹp, đa dạng, hoa có độ bền lâu và có thời gian ra hoa đáp ứng đúng thị
trường. Điển hình là các dòng H2, H4, H9, H10, H18. Tuy nhiên các dòng lai
này lại có nhược điểm là sinh sản vô tính kém (trong điều kiện tự nhiên),
đặc biệt là các dòng lai H2, H4 và H18. Do vậy, những cá thể lai có đặc
điểm ưu tú được chọn lọc cần phải nhân giống vô tính nhằm duy trì được
tính trạng ban đầu.Từ nhiều năm nay, để nhân giống vô tính cây Lan huệ có
thể sử dụng các phương pháp: Tách chồi hoặc củ nhỏ từ cụm cây mẹ
(Siddique và cs., 2007); kỹ thuật cắt lát (Chipping); nhân giống bằng hạt
hoặc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro (Husey, 1975; Seabrook và
cs., 1976; De Buruyn, 1992; Chieh Li Huang và cs., 2005). Mặc dù đơn giản
nhưng hiệu quả khi nhân giống bằng phương pháp truyền thống không cao
do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp, cây không đồng nhất cũng
như không tạo được cây sạch bệnh. Phương pháp nhân giống in vitro đã
khắc phục được những nhược điểm đó tạo được cây con sạch bệnh, thời
7
gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất, do vậy đáp
ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao và tính di truyền ổn
định. Để đánh giá và duy trì nguồn vật liệu thì việc nghiên cứu nhân giống
vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết. Ở nước ta, Nguyễn Thị
Phương Thảo và cs (2009,2010) đã bước đầu xác định được một số kết
quả nhất định để xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro hoa Loa kèn đỏ

nhung (H. equestre Herb.) và cây Lan huệ mạng (H. reticulatum var.
striatifolium). Bên cạnh việc kế thừa một số kết quả trên cần phải có những
nghiên cứu tiếp theo nhằm bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân giống in
vitro cây hoa Lan huệ để nhân nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho công
tác chọn tạo giống. Xuất phát từ những yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề
tài:“Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ lai
(Hippeastrum equestre)”.
8
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung về cây Lan huệ
1.1.1 Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ
Lan huệ có tên khoa học: Hippeastrum esquetre Herb, thuộc họ
Liliaceae, bộ Hành ( Liliales), phân lớp Hành ( Liliidae), lớp thực vật một lá mầm
(Liliopsida) [3],[4].
Tên của loài hoa này có rất nhiều cách để Việt hóa như: Loa kèn đỏ
nhung, Lan huệ, Huệ đất, Lan tứ diện, Tứ diện, Tứ diện xích lan, Huệ loa
kèn, Mạc chu lan Người châu Âu gọi là Valentine Flower bởi vì Lan huệ
nở hoa trong khoảng đầu năm vào dịp lễ hội tình yêu (14/2).
1.1.1.1 Đặc điểm thực vật học của cây Lan huệ ở Việt Nam:
Lan huệ có dạng thân hành, hình cầu, có áo mỏng bao ở ngoài [5].
a. Lá cây
Lá tập trung ở gốc gần như thành 2 dãy, phiến lá hình dải, màu xanh
đậm, kích thước (30)45-50(60) x 2-4(5)cm, hình kiếm hoặc hình dải mác,
hơi khum thành hình máng, dai, cứng, có nhiều gân sọc song song và gân
phụ ngang song song, mép hơi cong xuống, chóp tù. Gốc lá dạng bẹ ôm lấy
nhau. Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm 2 cái, mỏng, kích thước 6-7 x 3-4
cm, màu trắng xanh, mỏng, 2 chiếc, tồn tại.
b. Hoa
Cụm hoa tán, 2- 4 hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, dài 30-
50 cm, đường kính 1,5-2 cm ,thẳng đứng và rỗng, mặt ngoài phủ phấn

trắng. Hoa to khi nở đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ,
màu đỏ hoặc đỏ cam, có cuống dài 4-5 cm, gốc màu xanh hoặc xanh vàng
hoặc vàng trắng.
Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh,
dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5 cm, họng có 1
vòng vảy ngắn hoặc 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình
trứng xếp 2 vòng, các thùy bằng nhau hoặc các thùy vòng trong hẹp hơn.
Nhị 6; chỉ nhị rời nhau, hình trụ dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống
9
bao hoa, nghiêng về một phía; bao phấn hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng
ngà,2 ô, đính lưng , hướng trong, mở bằng khe dọc.
Bầu hoa, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi
nhụy dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy, màu trắng.
Hình 1.1: Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre)
c. Củ và rễ
Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ mẹ, chu vi
của củ con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây.
Rễ:cây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ tương
đối đồng đều về kích thước.
d. Quả
Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh.
Hạt nhiều, dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ.
1.1.1.2 Yêu cầu ngoại cảnh
Cây Lan huệ mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, được nhập vào
Việt Nam, trồng trong vườn hoa, trong chậu. Cây ra hoa vào mùa xuân- hè,
do đó để hoa nở vào đúng dịp Tết thì các yếu tố ngoại cảnh là điều kiện vô
10
cùng quan trọng mà chúng ta cần chú ý đối với việc sinh trưởng phát triển
của cây [2].
a . Nhiệt độ

Lan huệ có khả năng chịu nóng, ưa khí hậu lạnh và ẩm. Nhiệt độ thích
hợp ban ngày từ 20-28
o
C, ban đêm 13-17
o
C, dưới 5
o
C và trên 30
o
C cây
sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù. Giai đoạn đầu nhiệt độ thấp có lợi cho sinh
trưởng của rễ và sự phân hoá hoa.
b . Ánh sáng
Lan huệ là cây ưa cường độ ánh sáng trung bình, cường độ ánh sáng
thích hợp từ 12.000-15.000lux nhất là thời kỳ cây cao 20-30cm. Người
trồng Lan huệ luôn biết muốn điều khiển độ dài của lá và chiều cao của vòi
hoa, chỉ cần điều tiết ánh sáng. Cây nhiều ánh sáng có vòi hoa và lá ngắn,
cây mọc trong bóng râm thường cao và lá dài.
c . Nước
Thời kỳ đầu cây rất cần nước, khi ra hoa giảm bớt nước. Nhiều nước
dễ làm cho củ bị thối, rụng nụ. Độ ẩm đất thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn
phát triển của cây (thường từ 70-85%).
d . Đất
Đất tơi xốp, không chứa mầm bệnh và thoát nước tốt. Lan huệ rất mẫn
cảm với muối, nồng độ muối trong đất cao, cây không hút được nước ảnh
hưởng tới sinh trưởng, ra hoa. Nói chung, hàm lượng muối trong đất không
được cao quá 1,5mg/cm
2
, lượng hợp chất Clo không được vượt quá
1,5mmol/lít, pH = 6,5-7,0.

1.1.1.3 Phân bố
Cây Lan huệ có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được trồng khắp Châu Mỹ
nhiệt đới, từ Mêhico và phía Nam Tây Ấn đến Brazil và Chile [4],[5]. Chi
Hippeastrum hiện có 70- 76 loài. Ở Việt Nam, chi Hippeastrum có 2 loài, 1 thứ
thường được trồng làm cảnh.
11
1.1.2 Giá trị kinh tế và sử dụng
Trên thế giới, nhiều loài thuộc chi Hippeastrum được trồng làm cảnh
bởi chúng có ưu điểm là hoa to, đẹp, khá đa dạng về màu sắc, có thể sử
dụng dưới dạng hoa cắt cành, trồng chậu hoặc trồng thảm. Hoa được sử
dụng trong ngày lễ, ngày tết, được trang trí trong nội thất, hoặc làm quà
tặng rất trang trọng. Hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, làm
tăng vẻ đẹp, tăng sức sống cho mọi người [6].
Ở Việt

Nam, hoa được sử dụng trong những ngày lễ, ngày tết,
được trang trí trong hội trường, công viên, làm quà tặng rất trang trọng,
trong gia đình hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, làm
tăng vẻ đẹp, tăng sức sống cho mọi người.
Trong Đông dược, Lan huệ là một vị thuốc quan trọng vì củ có vị ngọt
cay, tính ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng. Thân hành của cây được
dùng giã nát đắp cầm máu và trị tổn thương khi té ngã.
Bên cạnh đó, Lan huệ (Hippeastrum equestre) là một trong những loài
hoa có tiềm năng phát triển của chi Hippeastrum do củ của nó có chứa các
biệt dược giá trị như các loại alkaloids (Funganti, 1975), các lectins có hoạt
tính chống siêu vi trùng, chống sưng viêm, chống ung thư, chữa bệnh
Alzheimer, cầm máu và chữa vết thương. Các alkaloids trong Lan huệ đang
được nghiên cứu về một số tác động dược học. Trong số các alkaloids,
lycorine (tên cũ Narcissine) là chất được chú ý nhất. Narcissine được cô lập
vào 1578, là một alkaloid rất bền. Đến 1920, narcissine được chứng minh là

có cùng cấu trúc với lycorine, trích từ Lycoris radiata, và từ đó tên
Narcissine bị bỏ. Lycorine là một alkaloid loại isoquinolone (chuyển hóa từ
phena thridine), có phân tử lượng 287.32, có các hoạt tính sinh học loại
cholino mimetic; ức chế hoạt tính sinh học của men acetylcholinesterase.
Các hoạt tính của Lycorine có tác dụng chống siêu vi trùng, có tác dụng
chống sưng-viêm do ức chế sự sản xuất TNF-alpha (tumor necrosis factor)
nơi các đại thực bào của chuột thử nghiệm; ức chế tiến trình sinh tổng hợp
proteins. Vì TNF-alpha là một chất cytokine căn bản điều hòa tiến trình
12
sưng viêm nên lycorine có triển vọng được dùng làm thuốc chống sưng, trị
thấp khớp.
Ở Việt Nam hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) hầu như chỉ có màu đỏ, hoa
nở trong 1 thời gian ngắn còn quanh năm nó chỉ có màu lá xanh biếc. Hoa Lan huệ
chỉ trổ bông mỗi năm một lần, có khi đôi lần nhưng không nhiều cây được như thế
[6].
1.2 Một số phương pháp nhân giống vô tính cây Lan huệ
1.2.1 Phương pháp tách củ con
Trong quá trình sinh trưởng phát triển, một củ Lan huệ có thể đẻ ra
nhiều củ con ở xung quanh. Có thể tách những củ con đem trồng. Củ con
sau khi tách có khả năng sống rất cao và sớm cho hoa, thông thường sau
18-24 tháng cây sẽ cho hoa.
Khi đường kính củ con được 2-3 cm thì tách khỏi cây mẹ, có thể
trồng trong chậu đất hoặc chậu nhựa, nếu trồng trong chậu đất thì cần phải
tưới nước thường xuyên hơn là trong chậu nhựa. Nhúng phần đế của củ
cùng với bộ rễ trong nước ấm, điều này có tác dụng làm mềm rễ và thuận
lợi cho bộ rễ lan ra khắp chậu. Khoét một hố trên bề mặt đất rộng hơn
đường kính củ, đặt củ vào hố sao cho 1/3 củ nổi trên mặt đất [17].
1.2.2 Phương pháp cắt lát
Kỹ thuật cắt lát (chipping) được sử dụng khá phổ biến nhất là đối với
những cây họ Hành có củ (là những lớp vảy xếp khít nhau xung quanh đỉnh

sinh trưởng trung tâm) như chi Hippeastrum, Narcissus (hoa thủy tiên),
Galanthus. Các bước tiến hành [17]:
1. Chọn những củ Lan huệ bố mẹ khoẻ mạnh không bị nấm bệnh,
nhổ củ khi củ còn ở trạng thái ngủ nghỉ.
2. Dùng dao sắc nhọn sao cho khi cắt lát cắt phẳng, mịn không làm
dập nát củ. Khử trùng bề mặt củ và dao cắt.
3. Cắt bớt phần rễ và phần trên của củ, dùng dao cắt dọc chia đôi củ
từ đỉnh củ xuống phần đế củ, tiếp tục chia nhỏ các nửa hành sao cho mỗi
lát đều mang một phần đế củ. Một củ có thể chia thành 8-16 lát.
4. Các lát được ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm khoảng 10-15
phút lắc đều, sau đó được vớt ra để ráo nước.
13
5. Cho mỗi lát vào trong 1 túi nilon có chứa đá trân châu có thêm chất
khoáng, cho nhiều khí vào túi và buộc kín túi. Đưa vào nơi mát và tối với
nhiệt độ thích hợp 20-21
o
C, thường xuyên kiểm tra dấu hiệu thối hỏng.
6. Sau khoảng 12 tuần các hành con sẽ xuất hiện ở gốc của lát cắt.
Tách các cây con trồng vào giá thể tơi xốp và thoát nước. Cây con rất bé và
yếu ớt nên cần đặt dưới ánh sáng tán xạ một thời gian trước khi đưa ra
ngoài ánh sáng trực tiếp.
Phải mất khoảng 2-4 năm cây mới sinh trưởng phát triển thành thục
và cho hoa. Ở Việt Nam, mùa đông không có tuyết và sương giá nên cây sẽ
lớn nhanh hơn và cho hoa sớm hơn so các nước ở xứ lạnh.
Nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát củ đã được rất nhiều nhóm tác
giả nghiên cứu cả trong điều kiện in vivo và in vitro. Epharath và cs. (2001)
đã sử dụng 7 phương pháp cắt củ [17], chia củ mẹ thành 2, 4, 8, 12, 16, 32
và 48 lát cắt, mỗi lát cắt đều mang 1 phần đế củ và giâm vào túi nilon có
chứa chất khoáng bón cho cây. Các túi này được đặt trong điều kiện nhiệt
độ 23

0
C trong 4 tháng. Kết quả cho thấy, khi cắt củ thành 48 phần thì sô
lượng chồi thu được là cao nhất, 34 chồi/mẫu. Năm 1991, O’Rourke và cs.,
cắt củ nhỏ in vitro tạo ra từ vảy củ đôi trên môi trường tạo củ của loài
Hippeastrum hybridum "Apple Blossom” thành 2 hoặc 4 phần và tiếp tục nuôi
cấy trong 10 - 12 tuần. Sau 26 - 28 tuần nuôi cấy, hệ sô nhân thu được đã
tăng lên 100 chồi/mẫu ban đầu [22]. Bằng phương pháp cắt củ này,
Slabbert và cs. (1993) cũng đã thu được 700 - 1000 cây từ 1 củ ban đầu
sau 12 tháng, cây con thu được khỏe, có sức sống cao [25].
14


Hình 1.2. Phương pháp cắt lát củ cây Lan huệ
1.2.3 Phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp này có ưu điểm là tạo được cây con trẻ hóa và sạch
bệnh nên cây có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao. Đồng
thời, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất do
15
vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định,
có thể cung ứng cho sản xuất trên quy mô rộng.
Đã có một số nghiên cứu bước đầu về nhân in vitro cây Lan huệ, các
tác giả cho biết: Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo chồi ở cây Lan huệ
(Loa kèn đỏ nhung Hippeastrum equestre Herb.) là môi trường MS có bổ
sung 5 mg/l BA (Nguyễn Hạnh Hoa và cs, 2009) và cây Lan huệ mạng là
môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BA, 100% mẫu tái sinh tạo chồi và củ
nhỏ. Chồi và củ nhỏ tạo ra được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh. Đa
số các chồi đều ra rễ. Các cây con in vitro hoàn chỉnh được đưa ra thích
nghi với điều kiện giá thể cát và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 [10, 11].
1.2.3.1 Cơ sở khoa học [12]
Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học

người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông,
mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng
tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế
bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được
đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp
tử ban đầu.
Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực
vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là
sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng
trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích
hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào
đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng
minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào
chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần
kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng
hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc
(Galson, 1986; Murashige, 1974).
16
Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm
năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì
được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay
từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ
mục đích nhân giống của con người.
1.2.3.2 Ý nghĩa của phương pháp nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân
giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý
nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì
nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế
có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao

nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do:
Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số
nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng,
khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ
cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất
này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công
nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá
trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất
về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu
quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất.
Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự
phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov
(1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây
con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây
bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành
phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)
…[1],[12].
Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô
tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học
17
lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược
điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là
các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của
cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm
có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo
điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy
mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền
thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh
qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là
5 - 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), …

hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng
phí, tốn kém.
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính
truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên
thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro,
phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như:
- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo
thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong
phạm vi 3
6
đến 10
12
/ năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào.
- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra
giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc
ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng
không hạn chế.
- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại
bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống,
vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng
phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống
cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được
rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng,
riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952).
18
Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt
độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây,
virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng
kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975).
- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết

hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải
mất 10-15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một
giống mới rất khó khăn. Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro,
người ta có thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng
một năm (Staritsky, 1970).
- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và
chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm.
- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội.
- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen.
Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh
khỏi một số nhược điểm như:
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa
thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và
tái sinh thực vật.
- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện
đại và lao động có tay nghề.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do
biến dị soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ
(đặc biệt là khi nuôi cấy từ callus).
Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình
phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực
vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau,
mặc dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ
có một phương thức chung cho tất cả các thực vật.
19
1.2.3.3 Các phương thức nhân giống in vitro
Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo
Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau,
chúng được nhân bằng sinh sản vô tính. Trong nhân giống in vitro, cây con
có thể được tái sinh từ các điểm sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận

(phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm
sinh trưởng phụ, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương
thức sau:
- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi
nách.
- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.
Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những
điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các
cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể
2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của
cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ
những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh
lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân
chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm
sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên.
Với đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh
thành cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus). Trong môi trường
nuôi cấy thích hợp, thường là với auxin, mẫu nuôi cấy có thể đem lại sự gia
tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Sự
tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô
sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào
mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để
tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nhiều
cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền. Nguyên
nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của
20
mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể
không giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện
tượng nội nguyên nhân (endomitosits hay endoreduplication). Nội nguyên
nhân là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào

trong thực tế và là một hiện tượng tự nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng
tăng lên dưới ảnh hưởng của cá thành phần của môi trường dinh dưỡng và
điều kiện cũng như phương pháp nuôi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều
lần. Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính
di truyền (trueness – to – type) trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là
đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò
vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và
cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay
phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có
thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt
nhân tạo. Có thể thấy ngay là hệ số nhân của con đường này vô cùng lớn.
Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân
tạo. Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng
lý tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến
hoặc công nghệ gen [1],[12].
Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã
chọn lọc người tư thường tái sinh cây theo đường hướng trực tiếp, còn mục
tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọn
lọc và cải tạo giống cây trồng.
1.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến môi trường nuôi cấy
a. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy
Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần
thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên
mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu
là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự
21
thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng
nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu.
Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc
vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ

ngách trên bề mặt của mô cấy.
Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào
từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với
hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl
2
thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm
nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết
nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm.
Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ
đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy
có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy.
b. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học
Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây
trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh
dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ
sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần
cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý
như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải
được duy trì trong giới hạn chấp nhận.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi
trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi
trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…
Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều
loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông
thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa
học sau:
Các nguyên tố khoáng
22
Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai
nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.

- Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng
khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các
muối vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein,
acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp
suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp,
thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…
- Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh
trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, Cu, coban,
Bo, Mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng
được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt
trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản
ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục…
Chất hữu cơ bổ sung
- Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và
cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin
B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro.
Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào
để nuôi cấy.
- Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino
acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng
nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết.
Nguồn cacbon
Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang
hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó
phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn
cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương
đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose
23
và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt
có thể cung cấp tốt hơn đường saccarose.

Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời
còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng
góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and
Gray, 2000). Thông thường đường saccarose được sử dụng ở nồng độ 0,2-
0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và
mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng
lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước).
Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang
hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ
thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu
nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ: theo Sharma (1993) cây
Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/l saccarose trong môi
trường.
Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây
in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ
thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn
và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi
của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có
đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở
trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-
100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường
không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống
(Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).
Chất điều tiết sinh trưởng
Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe
trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều
tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc
các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin,
24
gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm

được sử dụng phổ biến nhất.
- Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong
nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân
chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi
chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi… (Bhojwani and
Razdan, 1983).
Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10
-6
– 10
-1
M tùy theo
từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ
kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo.
Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin
tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số
môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng.
Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến
hơn làm giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự
IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D,
IBA. NAA.
Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng
của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn
Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích
thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế
bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ
(Narayaswamy, 1994). Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử
dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine).
Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và
không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử
dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế

bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi
cấy tế bào thực vật.
25