PHƯƠNG PHÁP SINH LÝ SINH HÓA NUÔI CẤY VÀ PHẦN LẬP VI KHUẨN

KHOA THỦY SẢN
Đề tài:
Phương pháp sinh lý sinh hóa nuôi cấy phân lập vi khuẩn.
GVHD : Lê Văn Bảo Duy
Lớp : Ngư Y 46
SVTH : Huỳnh Văn Lâm
Nguyễn Phương Nam



ĐẶT VẤN ĐỀ
B nh vi khu n gây ra ngày càng ph c t p và nghiêm tr ng ệ ẩ ứ ạ ọ
v i đ ng v t th y s nớ ộ ậ ủ ả
N m đ c các quy trình ph ng pháp sinh lý sinh hóa trong ắ ượ ươ
nuôi c y phân l p vi khu nấ ậ ẩ
C s quan tr ng cho vi c nghiên c u đ đ nh danh vi khu nơ ở ọ ệ ứ ể ị ẩ
tìm ra tác nhân gây b nh đ a ra nh ng bi n pháp phòng ch ngệ ư ữ ệ ố


ĐỊNH NGHĨA
Ph ng pháp sinh lý sinh hóa nuôi ươ
c y,phân l p vi khu n : ấ ậ ẩ
- Các ph ng pháp d a trên nh ng đ c ươ ự ữ ặ
đi m dinh d ng, hô h p, chuy n hoá và ể ưỡ ấ ể
kh năng ph n ng v i các ch t hóa h c ả ả ứ ớ ấ ọ
đ làm tăng s l ng,đ nh danh vi khu n.ể ố ượ ị ẩ


(*) Phân lo i môi tr ng:ạ ườ

(*) Phân lo i môi tr ng:ạ ườ
(+) Th :ể
(+) Th :ể
-


L ng: Canh thang, n c peptonỏ ướ
L ng: Canh thang, n c peptonỏ ướ
-
Đ c: Có 1-2% th ch nh th ch th ng, ặ ạ ư ạ ườ
Đ c: Có 1-2% th ch nh th ch th ng, ặ ạ ư ạ ườ
th ch máu…ạ
th ch máu…ạ
-
Môi tr ng m m: Có 0,3-0,5% th ch ườ ề ạ
Môi tr ng m m: Có 0,3-0,5% th ch ườ ề ạ
PH NG PHÁP NUÔI C Y PHÂN L P VI KHU NƯƠ Ấ Ậ Ẩ
(*) D ng c c yụ ụ ấ
+ Que c y : th ng, móc , vòng , trang.ấ ẳ
+ ng hút th y tinh.Ố ủ
+ Đĩa petri
+ Đèn c nồ
+ Hóa ch t (ch t ch th ,ch t ph n ng…… )ấ ấ ỉ ị ấ ả ứ
(+) M c đích s d ng:ụ ử ụ
(+) M c đích s d ng:ụ ử ụ
- C b n: n c th t,canh thang th ng…ơ ả ướ ị ườ
- C b n: n c th t,canh thang th ng…ơ ả ướ ị ườ
- Phân l p:th ch máu,….ậ ạ
- Phân l p:th ch máu,….ậ ạ

-Tính ch t sinh hóa:KIA,OF,…. ấ
-Tính ch t sinh hóa:KIA,OF,…. ấ


(*) C y ria trên đĩa petriấ
(*) C y ria trên đĩa petriấ


Vô trùng
que c y vòngấ
L y vi khu nấ ẩ

Ria que c y ấ
trên môi tr ng ườ
thích h pợ
L t ng a đĩa ậ ử
trong nhi t đ ủ ệ ộ
th i gian thích h p ờ ợ
(*) C y trang: ấ
0,1 ml d ch ị
ch a vi khu nứ ẩ
Tr i đ u d ch ả ề ị
lên m t th chặ ạ
Kh trùng ử
thanh g t ạ
Đ a vào c nư ồ
và h qua l aơ ử
L t ng a đĩa ậ ử
trong nhi t đ ủ ệ ộ

th i gian thích h p ờ ợ
PH NG PHÁP NUÔI C Y PHÂN L P VI KHU NƯƠ Ấ Ậ Ẩ


(*) nuôi c y phân l p.ấ ậ
L y b nhấ ệ
ph mẩ
B ngằ
que c yấ
vô trùng
C yấ
Vùng 1
H que c yơ ấ
=>Vùng 2
H que c yơ ấ
=> Vùng 3
nuôi
30 – 37
0
C
24
h
Căn cứ
Màu s c, hình d ng,kích th cắ ạ ướ
khu n l c => ẩ ạ
Ch n Khu n l c nghi ngọ ẩ ạ ờ
( u th s l ng) ư ế ố ượ
PH NG PHÁP NUÔI C Y PHÂN L P VI KHU NƯƠ Ấ Ậ Ẩ

(*)
(*)
C y chuy nấ ể
C y chuy nấ ể


C y gi ngấ ố
t ng nghi mừ ố ệ
môi tr ng l ngườ ỏ
sang
Môi tr ng l ngườ ỏ
ng th ch nghiêngố ạ
C y b m t nghiêng b ng cách ấ ề ặ ằ
c y t đáy ng lên đ u trênấ ừ ố ầ
theo đ ng zic z cươ ắ
PH NG PHÁP NUÔI C Y PHÂN L P VI KHU NƯƠ Ấ Ậ Ẩ
M đĩa có khu n l c ở ẩ ạ
nghi ng d i ng n ờ ướ ọ
đèn c n ho c phòng ồ ặ
vô trùng
Que c y vô trùngấ
L y khu n l cấ ẩ ạ
Nghi ngờ
(th ng vùng 3)ườ
Đĩa th ch m iạ ớ
ho c th ch nghiêngặ ạ
30- 37
o
C trong 24 gi ờ
(*)

(*)
Nuôi c y thu n ch ng:ấ ầ ủ
Nuôi c y thu n ch ng:ấ ầ ủ


C yấ


(*) Nhu m vi khu n ộ ẩ
(*) Nhu m vi khu n ộ ẩ
Que vô trùng
L y vi khu nấ ẩ
T m u b nhừ ẫ ệ
dàn m t ộ
l p m ngớ ỏ
trên t mấ
lam s ch ạ
T khô nhi t đ phòng r iự ở ệ ộ ồ
h trên ng n l a đèn c n ơ ọ ử ồ
đ di t khu n g n Vk vàoể ệ ẩ ắ
lam kính
Nhu mộ
Gram
Dd Crystal,
30-60 giây
Dd Lugol
1 phút
C n-Acetoneồ
Nghiêng lam
Đ ch y quaể ả

Ch ph tỗ ế
Đê t y màu ả
R a nhanhử
V y khôẩ
R a nhanhử
V y khôẩ
R a nhanhử
V y khôẩ
Dd Fuchsin
1-2 phút
R a n cử ướ
Khô t nhiênự
Quan sát
D i kính ướ
Hi n viể
(+)Xanh tím
(-) đ h ngỏ ồ
PH NG PHÁP NUÔI C Y PHÂN L P VI KHU NƯƠ Ấ Ậ Ẩ


Th các ph n ng hóa h cử ả ứ ọ
Th các ph n ng hóa h cử ả ứ ọ
QUE
C YẤ
VÔ
TRÙNG
L YẤ
VI
KHU NẨ
TÁC

D NGỤ
V IỚ
gi y t m ấ ẩ
Tetramethyl Phenylenediamine
Edihydrochloride 1%.
Vk có Enzyme
Cytochrom-Oxydase
H
2
0
2
- oxy già
(đ c vk)ộ
KL
Xanh tím
2 ng ch a mt OF(xanh)ố ứ
1 ng ph d u parafin ố ủ ầ
môi tr ng Tryptoneườ
KL
có enzyme
Catalase
B tọ
khí
O
2
30-37
0
C,
24
h

có kn lên men
2 vàng
acid
lactic
Có kn oxy hóa
Ph d u xanhủ ầ
Còn l i vàngạ
sinh Indol (C8H5-NH2)
Vòng tròn đ s m bên trênỏ ẫ
30-37
0
C,
24
h
Mt KIA
Mt KIA
(1)Rìa trênth ch nghêngạ
(2)Đâm th ng không ẳ
ch m đáy th ch đ ngạ ạ ứ
30-37
0
C,
24
h
- Th ch đ ng => vàng ạ ứ
=>Lên men glucose
Th ch nghiêng => vàngạ
=>lên men lactose
- C ng => vàngả ố
=> Lên men c haiả

Sinh h iơ
(+) n t ho c ứ ặ
đ y lênẩ
(+ H
2
S) màu đen


Th các ph n ng hóa h cử ả ứ ọ
Th các ph n ng hóa h cử ả ứ ọ
QUE
C YẤ
VÔ
TRÙNG
C YẤ
VI
KHU NẨ
C y th ng đ ngấ ẳ ứ
mt Manitol di đ ngộ
Mt màu vàng =>Lên men đ ng Mantiolườ
Di đ ng => m c thành đ ng th ngộ ọ ườ ẳ
môi tr ngườ Nitrate
môi tr ngườ
Simoms Citrate Agar
(s d ng citrate mt) ử ụ
C y các đi m khác nhauấ ể
trên đĩa l ng ồ
mt NA + 2% tinh b tộ
thu c th ố ử
1ml Acid Sulffalinic

1ml Naphthyllamine
1-2
P
30 - <35
0
C
24
h
30-37
0
C
24
h
30-37
0
C,
24
h
+
S n ph m chuy n hóa ả ẩ ể
Làm môi tr ng ki m hóaườ ề
Thay đ i màu ch thổ ỉ ị
4 ng ch a mtố ứ
Decarboxylase
(s d ng a.a mt)ử ụ
+
- không thêm => đ i ch ngố ứ
- 1% Arginine
-
1% Lysine

-
1% ornithin
-
ph 0,5ml parafin 4 ngủ ố
30-37
0
C
24
h

-96
h
(+) ng nghi m khác v i ố ệ ớ
màu ng đ i ch ngố ố ứ
30-37
0
C,
24
h
Đ dd lugol lênổ
m t mtặ
(+) có vùng sáng xung
quanh đi m c yể ấ


Th các ph n ng hóa h cử ả ứ ọ
Th các ph n ng hóa h cử ả ứ ọ
QUE
C YẤ
VÔ

TRÙNG
C YẤ
VI
KHU NẨ
mt MR-VP
Đ nh tínhị
5 gi i thu c th ọ ố ử Methyl Red
(+) đ pH < 4,2 , (-) vàng pH > 6 ,ỏ
(±) Cam 4,2 < pH <6
mt MR-VP
Voges - Proskauer test
Mt tryptone 1%
(nhu c u và ầ
k.n ch u đ ng mu i)ị ự ố
1ml Alpha - Naphthol 10%
1ml KOH 20%
1-2
P
30 - 37
0
C
24
h
–

48
h
B ổ
sung
(+) mt đ c đ uụ ề

Mt đ ng khác nhauườ Mantose; Sucrose
Glucose; Arabinose
NaCl :1%, 2%, 3%
4%, 5%, 6%, 7%
(+) H ng => vàng (-) không đ iồ ổ
30 - 37
0
C
24
h
–

48
h
(+) đ camỏ
(-) xanh đ ngồ
30 - 37
0
C
24
h
30 - 37
0
C, 24
h
k.N nh y c m v i ksạ ả ớ
Đĩa l ng ch a mt TSAồ ứ
Huy n phùề
vk Lên
m t th chặ ạ

1-2
P
Đăt đĩa
Kháng sinh
Lên m t thachặ
+
30 - 37
0
C
24
h
(+) vòng vô
trùng quanh
Đĩa k.sinh


PH NG PHÁP NUÔI C Y PHÂN L P VI KHU NƯƠ Ấ Ậ Ẩ
(*) u đi mƯ ể
(*) u đi mƯ ể
-


Đ chính xác caoộ
Đ chính xác caoộ
-


Xác đ nh hình d ng, cách s p x p ị ạ ắ ế
Xác đ nh hình d ng, cách s p x p ị ạ ắ ế
và đ c đi m sinh lý sinh hóa c a vi khu nặ ể ủ ẩ

và đ c đi m sinh lý sinh hóa c a vi khu nặ ể ủ ẩ
(*) H n chạ ế
(*) H n chạ ế
-


C n nhi u th i gian đ đ a ra k t quầ ề ờ ể ư ế ả
C n nhi u th i gian đ đ a ra k t quầ ề ờ ể ư ế ả
-


D b sinh v t ngo i nhi mễ ị ậ ạ ễ
D b sinh v t ngo i nhi mễ ị ậ ạ ễ
-


Qua nhi u công đo nề ạ
Qua nhi u công đo nề ạ
(*) ng d ng trong th y s nỨ ụ ủ ả
(*) ng d ng trong th y s nỨ ụ ủ ả
-


Đ nh danh loài vi khu n nghiên c uị ẩ ứ
Đ nh danh loài vi khu n nghiên c uị ẩ ứ
-


C s cho vi c nghiên c u s n xu t thu c kháng sinhơ ở ệ ứ ả ấ ố
C s cho vi c nghiên c u s n xu t thu c kháng sinhơ ở ệ ứ ả ấ ố

TRẢ LỜI CÂU HỎI
TRẢ LỜI CÂU HỎI
1) Môi trường và thành phần môi trường KIA?
1) Môi trường và thành phần môi trường KIA?
-
Kligler Iron Agar gồm 2 loại đường:Lactose và glucose, tỷ lệ 10/1 chỉ thị pH là đỏ
Kligler Iron Agar gồm 2 loại đường:Lactose và glucose, tỷ lệ 10/1 chỉ thị pH là đỏ
phenol
phenol
2) Vì sao trong mt manitol dùng t
2) Vì sao trong mt manitol dùng t
0
0
30 - <35
30 - <35
0
0
C
C
-
Manitol mt thử khả năng di động vi khuẩn,khả năng này do vi khuẩn có tiêm mao,
Manitol mt thử khả năng di động vi khuẩn,khả năng này do vi khuẩn có tiêm mao,
mà tiêm mao cấu tạo protein mà t
mà tiêm mao cấu tạo protein mà t
0
0
từ 35
từ 35

o
o
C sẽ làm protein biến tính.
C sẽ làm protein biến tính.
3) Mt ODC là gì?
3) Mt ODC là gì?
-
Ornithin Decacboxylaza gồm Ornithine,Cao men,Glucose,Bromocresol purple
Ornithin Decacboxylaza gồm Ornithine,Cao men,Glucose,Bromocresol purple
(1,6g/100ml cồn),nước cất.
(1,6g/100ml cồn),nước cất.
4) Mt OF?
4) Mt OF?
-
Oxydative-Fermentative, xác định cách sử dụng cacbonhydrat là kiểu oxy hóa,
Oxydative-Fermentative, xác định cách sử dụng cacbonhydrat là kiểu oxy hóa,
lên men hay trơ
lên men hay trơ
5) Nhiệt độ thời gian thích hợp của phương pháp nuôi cấy phân lập?
5) Nhiệt độ thời gian thích hợp của phương pháp nuôi cấy phân lập?
-
Tùy thuộc vào loại vi khuẩn có khoảng nhiệt độ khác nhau
Tùy thuộc vào loại vi khuẩn có khoảng nhiệt độ khác nhau
-
Thông thường là từ 30 – 37
Thông thường là từ 30 – 37
o
o
C trong vòng 24h – 48h.
C trong vòng 24h – 48h.

6) Vì sao trong cấy thuần chủng lại thường lấy khuẩn lạc từ vùng cấy thứ 3?
6) Vì sao trong cấy thuần chủng lại thường lấy khuẩn lạc từ vùng cấy thứ 3?
-
Vì ở vùng cấy thứ 3 sẽ có khuẩn lạc rời.
Vì ở vùng cấy thứ 3 sẽ có khuẩn lạc rời.
7) Khi nào thì sử dụng que cấy vòng, móc,trang?
7) Khi nào thì sử dụng que cấy vòng, móc,trang?
-
Sử dụng que cấy phụ thuộc vào mục đích của việc cấy
Sử dụng que cấy phụ thuộc vào mục đích của việc cấy
Vd) muốn xác định tổng số vi khuẩn thì ta sử dụng cấy trang
Vd) muốn xác định tổng số vi khuẩn thì ta sử dụng cấy trang


còn khi muốn cấy để phần lập thì ta sử dụng cấy vòng.
còn khi muốn cấy để phần lập thì ta sử dụng cấy vòng.