sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai mlh1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





Lê Thị Lan Anh





SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN
QUAN ĐẾN UNG THƢ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở
NGƢỜI VIỆT NAM









LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





Lê Thị Lan Anh




SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN
QUAN ĐẾN UNG THƢ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở
NGƢỜI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân









Hà Nội – Năm 2012

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Di truyền ung thƣ 3
1.1.1. Khái niệm ung thƣ 3
1.1.2. Gen ung thƣ và gen ức chế khối u 3
1.2. Hội chứng ung thƣ ruột kết 5
1.3. Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch) 6
1.3.1. Đặc điểm di truyền của HNPCC 7
1.3.2. Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u 9

1.3.3. Chẩn đoán lâm sàng 10
1.4. Cơ sở phân tử của HNPCC 11
1.4.1. Tính bất ổn định vi vệ tinh 12
1.4.2. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair) 13
1.4.3. Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thƣ 18
1.4.4. Gen MLH1 20
1.5. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC 23
1.5.1. Kỹ thuật PCR 23
1.5.2. Kỹ thuật PCR phiên mã ngƣợc (RT-PCR: Reverse Transcription -
Polymerase Chain Reaction) 24
1.5.3. Kỹ thuật phân tích các trình tự lăp lại đơn giản (SSR - Simple
Sequence Repeat) 24
1.5.4. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP:
Restriction Fragment Length Polymorphism) 25
1.5.5. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand
Conformation Polymorphism) 26
1.5.6. Phƣơng pháp giải trình tự ADN 28
1.6. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 29
1.6.1. Mục tiêu nghiên cứu 29
1.6.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài 29
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. Vật liệu nghiên cứu 30
2.1.1. Đối tƣợng và địa điểm nghiên cứu 30
2.1.2. Hóa chất 30
2.1.3. Thiết bị 31
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 31
2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu 31
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 31
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

1
2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lƣợng ADN tổng số 33
2.2.4. Kỹ thuật PCR 34
2.2.5. Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP - Single Strand Conformation
Polymorphism) 35
2.2.6. Phản ứng cắt bằng enzym giới hạn 37
2.2.7. Giải trình tự gen 37
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Tách chiết ADN tổng số 38
3.2. Phản ứng PCR 39
3.2.1. Kết quả tối ƣu phản ứng PCR 39
3.2.2. Nhân bản các exon quan tâm bằng kỹ thuật PCR 42
3.3. Kết quả phân tích SSCP 46
3.4. Kết quả phân tích đột biến bằng PCR – RFLP 51
3.4.1. Kết quả xử lý exon 16 bằng enzym MspI 51
3.4.2. Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQI 54
3.4.3. Kết quả xử lý exon 18 bằng enzym CviQI 56
3.5. Kết quả giải trình tự ADN và so sánh trình tự 59
3.5.1. Phân tích trình tự exon 13 của mẫu mô từ bệnh nhân số 6 59
3.5.2. Kết quả phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19 60
3.5.3. Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65
I. KẾT LUẬN 65
II. KIẾN NGHỊ 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Độ thâm nhập của các đột biến MLH1 và MSH2 trong các bệnh nhân ung
thƣ

Bảng 2. Thống kê các bệnh ung thƣ liên quan đến HNPCC
Bảng 3.
Các gen MMR liên quan tới HNPCC

Bảng 4. Cấu trúc các gen MMR
Bảng 5. Tỉ lệ các đột biến thƣờng gặp trong hai gen MLH1 và MSH2 ở các bệnh
nhân HNPCC
Bảng 6. Các thành phần phản ứng PCR
Bảng 7. Trình tự mồi tƣơng ứng của các exon 8, 13, 14, 16, 17, 18, 19 của gen
MLH1
Bảng 8. Thành phần PAGE 12% cho 10 ml dung dịch
Bảng 9. Thành phần tham gia phản ứng cắt exon 16, 18 và 19 gen MLH1
Bảng 10. Chu trình nhiệt PCR tối ƣu của exon 8, 13, 14, 16, 17, 18 và 19 gen
MLH1








DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Các con đƣờng hình thành ung thƣ đại trực tràng
Hình 2. Các phân nhóm chính của ung thƣ ruột kết
Hình 3. Sửa chữa bắt cặp sai ở trình tự vi vệ tinh
Hình 4. Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở E.coli
Hình 5. Sửa chữa ADN bắt cặp sai ở ngƣời
Hình 6. Con đƣờng dẫn đến ung thƣ di truyền ở ngƣời thông qua đột biến các gen
sửa chữa bắt cặp sai (MMR)

Hình 7. Tỷ lệ các loại đột biến phát hiện ở gen MLH1, MSH2 và MSH6
Hình 8. Vị trí của MLH1 trong NST số 3
Hình 9. Sơ đồ gen MLH1
Hình 10. Sơ đồ các protein đƣợc mã hóa bởi MLH1
Hình 11. Kết quả phân tích SSCP exon 5 của gen AR
Hình 12. (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô. (B) Kết quả tách ADN tổng số
từ mẫu máu
Hình 13. Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1 với các nhiệt độ gắn mồi: 60
0
C, 60,5
0
C,
61
0
C, 61,5
0
C
Hình 14. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1
Hình 15. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1
Hình 16. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1
Hình 17. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1
Hình 18. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1
Hình 19. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1
Hình 20. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1
Hình 21. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 8 gen MLH1
Hình 22. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 13 gen MLH1
Hình 23. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 14 gen MLH1
Hình 24. Kết quả phân tích SSCP exon 16 gen MLH1
Hình 25. Kết quả phân tích SSCP exon 17 gen MLH1
Hình 26. Kết quả phân tích SSCP exon 18 gen MLH1

Hình 27. Kết quả phân tích SSCP exon 19 gen MLH1
Hình 28. Kết quả PCR-RFLP các mẫu máu từ 20 thành viên của gia đình mắc hội
chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở Nhật Bản
Hình 29. Dự đoán kết quả phản ứng cắt exon 16 gen MLH1 bằng enzym MspI
Hình 30. Sản phẩm cắt exon 16 và sản phẩm PCR exon 16 điện di trên gel agarose
2%
Hình 31. Dự đoán sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI
Hình 32. Sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide
12%
Hình 33. Dự đoán sản phẩm cắt exon 18 gen MLH1 bằng enzym CviQI
Hình 34. (A), (B), (C), (D) Sản phẩm cắt exon 18 bằng enzym CviQI điện di trên
gel polyacrylamide 12%
Hình 35. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 13 của đối chứng và bệnh nhân số 6. (B)
Trình tự ngƣợc của exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 203
G>A
Hình 36. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 14 của đối chứng và bệnh nhân số 19.
(B) Trình tự xuôi của exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí
176C>G và một đột biến thay thế ở vị trí 185T>A.
Hình 37. So sánh trình tự exon 18 từ mẫu mô ung thƣ của bệnh nhân 20 và mô
ngƣời bình thƣờng
Hình 38. Kết quả so sánh trình tự exon 18 từ mẫu máu và mẫu mô của bệnh nhân số 19
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


Chữ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ADN
ARN
RNase

APS
BLB
bp
dNTP
EDTA
FAP

HNPCC

Kb
LOH
MMR
MSI
NST
PCR
RFLP

RT-PCR
SNP
SSCP

SSR
TLB
TAE
TE
TEMED
Deoxyribonucleic Acid
Ribonucleic Acid
Ribonuclease
Ammonium persulphate

Blood Lysis Buffer
base pair
Deoxyribonucleotide Triphosphate
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Familial Adenomatous Polyposis

Hereditary Non – Polyposis
Colorectal Cancer
Kilobase
Loss of Heterozygosity
Mismatch Repair
Microsatellite Instability

Polymerase Chain Reaction
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Reverse Transcription PCR
Single Nucleotide Polymorphism
Single Strand Conformation
Polymorphism
Simple Sequence Repeat
Tissue Lysis Buffer
Tris – Acetic acid – EDTA
Tris – EDTA
N,N,N’,N’- tetramethylenediamine
Axit deoxyribonucleic
Axit ribonucleic
Ribonuclease

Dung dịch đệm phân giải tế bào máu

cặp bazơ nitơ
Deoxyribonucleotit triphotphat

Hội chứng u tuyến polyp theo dòng
họ
Ung thƣ ruột kết không polyp di
truyền
Kilobazơ
Mất tính dị hợp tử
Sửa chữa bắt cặp sai
Tính bất ổn vi vệ tinh
Nhiễm sắc thể
Phản ứng chuỗi nhờ polymeraza
Tính đa hình độ dài đoạn giới hạn

PCR phiên mã ngƣợc
Tính đa hình đơn nucleotit
Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn

Trình tự lặp lại đơn giản
Dung dịch đệm phân giải tế bào mô


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

1
MỞ ĐẦU

Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử
đã góp phần thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học. Các kỹ
thuật mới nhƣ tách dòng gen, tạo ADN tái tổ hợp, giải trình tự gen và nhiều kỹ
thuật sinh học phân tử khác ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả
trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh, trong đó có bệnh ung thƣ.
Sự phát hiện ung thƣ là một bệnh di truyền đƣợc coi là một thắng lợi của
sinh y học hiện đại. Nhiều

nỗ lực nghiên cứu không ngừng nghỉ và hiệu quả đã
giúp xác định chi tiết các biến đổi di

truyền là nhân tố trực tiếp gây ung thƣ,
bắt đầu từ sự hình thành các khối u, sau đó là sự

tăng sinh và lan rộng của
chúng.
Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ có xu hƣớng gia tăng ở phần lớn các nƣớc trên thế
giới. Hiện tại, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có khoảng 22,4 triệu ngƣời
đang sống chung với bệnh ung thƣ. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính hàng
năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trƣờng hợp mới mắc ung thƣ. Các ung thƣ
hàng đầu trên thế giới ở nam giới là ung thƣ phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt
tuyến, gan; Ở nữ giới là ung thƣ vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi.
Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính mỗi năm có khoảng trên 6,7 triệu
ngƣời chết do ung thƣ. Tỷ lệ chết do ung thƣ chiếm 12% trong số các nguyên
nhân gây tử vong ở ngƣời [28]. Riêng tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện mới
khoảng 200.000 ngƣời và khoảng 75.000 ngƣời chết vì bệnh ung thƣ [47].
Trong số các bệnh ung thƣ thƣờng gặp ở ngƣời, ung thƣ đại trực tràng là
loại ung thƣ tƣơng đối phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số các trƣờng hợp
ung thƣ và chiếm tới 15,2% tổng số các trƣờng hợp tử vong vì ung thƣ. Loại ung
thƣ này thƣờng gặp nhiều hơn ở các nƣớc phát triển và có xu hƣớng tăng nhanh

ở các nƣớc đang phát triển. Nguy cơ ung thƣ đại trực tràng tăng cao hơn ở những
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

2
ngƣời có tiền sử viêm đại tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có ngƣời bị ung thƣ
đại trực tràng [3].
Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary
Nonpolyposis Colorectal Cancer), còn đƣợc gọi là hội chứng Lynch chiếm 15%
các trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng. Đây là hội chứng di truyền trội do gen
trên
nhiễm sắc thể thƣờng gây ra. Những đột biến gây bất hoạt ở tế bào mầm
của một trong các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2,
MSH6 và PMS2, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa
chữa bắt cặp sai là nguyên nhân gây HNPCC. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các
đột biến trong gen MLH1 chiếm khoảng 50% trong số các đột biến xác định
đƣợc ở các gen MMR [2, 5]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1
đƣợc thực hiện ở rất nhiều quần thể ngƣời khác nhau. Tại Việt Nam, xét nghiệm
di truyền trong chẩn đoán ung thƣ nói chung và ung thu đại trực tràng nói riêng
hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện. Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các
gen MMR liên quan đến ung thƣ đại trực tràng có khuynh hƣớng di truyền, nhằm
đƣa ra những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thƣ
đại trực tràng tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và
mở ra hƣớng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm
ung thƣ ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam là rất cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ
ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời Việt Nam”.
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung

tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học thụ thể và
phát triển thuốc thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và
Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Di truyền ung thƣ
1.1.1. Khái niệm ung thư
Ung thƣ không phải là bệnh mà là một tên chung cho một nhóm các bệnh
phát sinh từ các tế bào có tốc độ tăng trƣởng không kiểm soát đƣợc, có đƣợc sự bất
tử, xâm lấn và khả năng di căn. Thuật ngữ “ung thƣ” theo nghĩa hẹp đƣợc dùng
để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các mô xung quanh gồm các tế bào
bình thƣờng [17].
Khối u là tập hợp các tế bào có quan hệ di truyền với nhau và có khả năng
phân chia một cách không kiểm soát. Sự phân biệt giữa các khối u lành và u ác
tính đơn thuần dựa trên khả năng xâm lấn của chúng. Nếu một khối u ác tính sau
khi xâm lấn tiếp cận đƣợc với mạch máu hoặc mạch bạch huyết, thì tế bào của nó
có thể di căn và phát triển tại các mô ở xa tại nơi chúng di chuyển tới. U di căn
có thể gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong. Quá trình
tăng trƣởng của một khối u bắt đầu từ tế bào bị biến đổi di truyền bất thƣờng
này đƣợc gọi là quá trình hay sự phát sinh ung thư. Vì các khối u thƣờng bắt
nguồn từ những khối u nhỏ lành tính, rồi sau đó chuyển sang trạng thái ác tính
và di căn, nên trong quá trình phát sinh ung thƣ, những tế bào hình thành khối u
có xu hƣớng tích lũy các biến đổi di truyền và qua đó có những đặc tính mới.
Sự tích lũy các gen ung thƣ ở các tế bào khối u là căn nguyên của phát sinh ung
thƣ [17].

1.1.2. Gen ung thư và gen ức chế khối u
Gen ung thƣ (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng
nguy cơ ung thƣ hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thƣ. Các gen ung thƣ cũng
có thể đƣợc coi nhƣ các dạng alen đặc biệt của các gen bình thƣờng xuất hiện do
kết quả của đột biến [3].
Các cá thể đƣợc truyền các gen ung thƣ phát sinh từ các tế bào mầm sinh
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

4
dục (còn gọi là các gen ung thư bẩm sinh) từ bố, mẹ sẽ mang gen ung thƣ này
trong hầu hết các tế bào của cơ thể, ở cả các tế bào sinh dƣỡng và các tế bào
sinh dục (những cá thể này đƣợc gọi là các thể mang). Ngƣợc lại, các gen ung
thƣ phát sinh từ các tế bào sôma sẽ không đƣợc truyền cho các thế hệ sau [17].
Các khối u tích lũy dần các gen ung thƣ khi chúng tăng trƣởng. Sự tích
lũy các gen đột biến gây ung thƣ có thể diễn ra theo ba con đƣờng: 1) Đƣợc
truyền qua dòng sinh dục, 2) Do đột biến tự phát trong tế bào sôma và 3) Do sự
lây nhiễm của virut.
Các gen ung thƣ quan trọng có thể đƣợc nhóm lại theo chức năng bình
thƣờng của chúng trong một tế bào. Các tiền gen ung thƣ (Proto-oncogenes) là các
gen có vai trò quan trọng, ví dụ điều hòa sự sinh trƣởng tế bào, sinh sản và biệt hóa
tế bào. Các gen tiền ung thƣ có thể đƣợc kích hoạt và trở thành gen ung thƣ thông
qua đột biến điểm, sao chép hoặc chuyển đoạn. Các gen ung thƣ đƣợc di truyền trội,
vì chỉ có một đột biến là đủ gây ra thay đổi chức năng tế bào, tuy nhiên, các gen ung
thƣ hiếm khi là nguyên nhân gây ra sự nhạy cảm di truyền ung thƣ.
Mặt khác, gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế
sự sinh sản của tế bào có thể gây tổn thƣơng ADN và do đó cung cấp cho các khối u
một lợi thế tăng trƣởng. Knudson quan sát thấy rằng các gen ức chế khối u là các
gen lặn, cần phải có “cú đánh thứ hai” (cả hai alen trở thành bất hoạt) cho sự phát

triển của bệnh ung thƣ. Sự ức chế khối u đã đƣợc mô tả trong một số hình thức di
truyền của bệnh ung thƣ, “đòn thứ nhất” đƣợc di truyền và “đòn thứ hai” xảy ra ở tế
bào soma [28]. Hơn nữa, các gen ức chế khối u có thể đƣợc chia thành gen gác cổng
(Gatekeeper), gen trông giữ (Caretaker) và gen làm cảnh (Lanscaper). Gen gác cổng
trực tiếp ức chế sự phát triển hoặc thúc đẩy tế bào chết, ví dụ gen APC khi bị đột
biến sinh u tuyến polyp theo dòng họ (FAP). Ngƣợc lại, các gen trông giữ, không
trực tiếp thúc đẩy sự phát triển khối u, nhƣng sự bất hoạt của chúng dẫn đến sự mất
ổn định di truyền là nguyên nhân gia tăng tỷ lệ đột biến trong cả gen ung thƣ và gen
ức chế khối u, góp phần cho sự tạo thành các khối u. Một ví dụ về gen trông giữ là
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

5
các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) mở đƣờng cho hội chứng Lynch. Gen “làm
cảnh”, nhƣ tên của nó, gián tiếp gây ra ung thƣ bằng cách thay đổi cảnh quan, có
nghĩa là vi môi trƣờng, tạo thuận lợi đối với sự hình thành khối u. Hiện tƣợng này
đã đƣợc quan sát thấy trong ung thƣ ruột kết, nơi các môi trƣờng mô đệm bất
thƣờng ảnh hƣởng đến sự phát triển và tăng trƣởng của các tế bào biểu mô, dẫn đến
sự hình thành ung thƣ (Hình 1).

Hình 1. Các con đường hình thành ung thư đại trực tràng [3]
1.2. Hội chứng ung thƣ ruột kết
Ung thƣ ruột kết hay còn gọi là ung thƣ đại trực tràng là một loại ung thƣ
biểu mô rất thƣờng gặp. Đây là một trong những bệnh ung thƣ biểu mô phổ biến
nhất trên thế giới, là ung thƣ gây tử vong đứng thứ hai ở Mỹ và đang có xu hƣớng
tăng lên ở các nƣớc đang phát triển [8, 19]. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thƣ đại
trực tràng chỉ sau ung thƣ dạ dày. Tƣơng tự nhƣ các loại ung thƣ khác, nguyên nhân
gây ra ung thƣ đại trực tràng có thể là do đột biến phát sinh trong quá trình phát
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

6
triển cá thể (ung thƣ thứ phát) hoặc đƣợc di truyền từ cha mẹ. Rất khó xác định chắc
chắn sự di truyền các gen ung thƣ góp bao nhiêu phần vào sự phát sinh ung thƣ trực
tràng, nhƣng con số ƣớc tính về tỉ lệ ca ung thƣ trực tràng liên quan đến các gen ung
thƣ bẩm sinh vào khoảng 15 - 50%. Độ tuổi mắc bệnh trung bình khoảng 45 – 50,
nhƣng cũng có thể sớm hơn ở giai đoạn thanh thiếu niên và gần đây có xu hƣớng trẻ
hoá với nhiều trƣờng hợp mắc bệnh ở độ tuổi 18 - 20 [47].
Ung thƣ đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) đƣợc chia thành 3 dạng
chính là rải rác, gia đình và di truyền. Trong đó, ung thƣ ruột kết rải rác (không di
truyền) chiếm 65-85%, ung thƣ ruột kết gia đình chiếm tỉ lệ 10%-30% và ung thƣ
đại trực tràng di truyền chiếm khoảng 5% trong tổng số các dạng ung thƣ ruột kết
(Hình 2).

Hình 2. Các phân nhóm chính của ung thư ruột kết [11]
Ung thƣ đại trực tràng di truyền lại đƣợc chia thành 3 nhóm chính: Sinh
polyp u tuyến theo dòng họ (FAP), Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền

(HNPCC - Hội chứng Lynch) và Hội chứng giống Lynch. Hội chứng Lynch đƣợc
lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về căn bệnh này.
1.3. Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch)
Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) là một
bệnh di truyền tƣơng đối phổ biến. Sự nhận biết chậm trễ hội chứng này xảy ra
R
R
ả
ả
i r
i r
á
á
c (không di truy
c (không di truy
ề
ề
n)
n)
(
(
65%
65%
–
–
85%)
85%)
Theo dòng họ
(10%–30%)
HNPCC (5%)

FAP (1%)
Các hội chứng
ung thư ruột
hiếm gặp khác
(<0.1%)
R
R
ả
ả
i r
i r
á
á
c (không di truy
c (không di truy
ề
ề
n)
n)
(
(
65%
65%
–
–
85%)
85%)
Theo dòng họ
(10%–30%)
HNPCC (5%)

FAP (1%)
Các hội chứng
ung thư ruột
hiếm gặp khác
(<0.1%)
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

7
do ung thƣ đại trực tràng rất phổ biến trong quần thể, và vì các cá thể bị ảnh
hƣởng bởi HNPCC không có các tính trạng có thể phân biệt đƣợc, ngoài việc có tỷ
lệ mắc phải ung thƣ tăng cao. Các nhân tố này đóng góp vào những khó khăn của
việc xác định chắc chắn bệnh [14].
1.3.1. Đặc điểm di truyền của HNPCC
HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên
nhiễm sắc thể thƣờng, gây
nên bởi những đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen

tham gia vào hệ
thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ
yếu là gen MLH1 và MSH2 [14]. Đa số các đột biến ở gen MLH1 và MSH2 là đột
biến vô nghĩa, nhầm nghĩa hoặc đột biến dịch khung cũng nhƣ các thay đổi ảnh
hƣởng đến vị trí ghép nối. Tuy nhiên, gần đây hơn, sử dụng kỹ thuật mới cho thấy
trong một số quần thể, một tỷ lệ tƣơng đối lớn của việc thay đổi tác nhân gây bệnh
là sắp xếp lại bộ gen, mất các vùng đa exon, đơn exon, tái bản của gen MLH1 hoặc
gen MSH2. Các đột biến đã biết đƣợc phân bố rải rác ở khắp các vùng mã hóa của
các gen này. Mặc dù vậy, ở một vài quần thể (ví dụ Phần Lan, Ba Lan và Hoa Kỳ)
một số thay đổi lặp lại đã đƣợc tìm thấy và đƣợc mô tả nhƣ các đột biến khởi phát.
Cho đến nay, hơn 300 đột biến gen MMR khác nhau đã đƣợc xác định trong khoảng

500 gia đình HNPCC [42]. Những bệnh nhân HNPCC hình

thành ung thƣ ở tuổi
còn trẻ, điển hình là khoảng giữa tuổi 40, nhƣng cũng có thể sớm hơn ở

giai
đoạn thanh thiếu niên
[34].
Bƣớc đầu tiên có thể tiến hành xét nghiệm đối với các cá thể có nguy cơ mắc
bệnh cao từ các quần thể đƣợc phân lập [44]. Tuy nhiên, trong số các gia đình đƣợc
chẩn đoán lâm sàng với hội chứng Lynch, tỷ lệ đột biến MMR thay đổi đáng kể
giữa các nghiên cứu khác nhau, dao động khoảng từ 30 - 90% [32]. Trong các gia
đình âm tính với đột biến MMR, nguyên nhân vẫn chƣa đƣợc giải thích rõ ràng,
nhƣng có thể giải thích do sự thay đổi cấu trúc phức tạp nhất định cũng nhƣ những
thay đổi điều hòa trong các vùng không mã hóa [53]. MSI đƣợc sử dụng để kiểm tra
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

8
trực tiếp xem tình trạng thiếu hụt MMR (một kiểu hình đột biến) tham gia vào các
loại ung thƣ cụ thể.
Mặc dù, tất cả các tế bào ở những bệnh nhân mắc hội chứng Lynch mang
một đột biến gen MMR ("cú đánh đầu tiên"), nhƣng sự phát triển khối u yêu cầu
thêm sự bất hoạt thể soma của các alen kiểu dại còn lại ("cú đánh thứ hai") trong
một mô đích. Đột biến dòng mầm trong gen MMR dẫn đến sự tích lũy các lỗi sao
chép, chủ yếu là tại các trình tự ADN ngắn lặp đi lặp lại trong các tế bào khối u và
làm phát sinh các dấu hiệu phân tử của hội chứng Lynch. Sự bất ổn vi vệ tinh (MSI)
đóng góp đối với ung thƣ thông qua sự tăng tỷ lệ đột biến trong cả trình tự vi vệ tinh
và các gen quan trọng trong ức chế ung thƣ. ADN từ các khối u HNPCC cho thấy

có sự bất ổn vi vệ tinh. Các báo cáo cho thấy bệnh nhân HNPCC có tiên lƣợng tốt
hơn so với bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng rải rác [17].
Trong khi, HNPCC đƣợc nhận biết nhƣ là một thực thể bệnh bằng việc
xác định một số lƣợng lớn thành viên trong gia đình bị ảnh hƣởng, nhiều
ngƣời mang các đột biến gen HNPCC khác cũng đƣợc xác định trong quần thể
dựa vào những sàng lọc di truyền. Xét

nghiệm di truyền đã cho thấy rằng các
đột biến gen MMR có độ thâm nhập khá cao
trong các cá thể mang ung thƣ
nội mạc tử cung và đại trực tràng di truyền, hầu hết
trong số đó không phải là
thành viên của các gia đình có HNPCC
(Bảng 1).
Bảng 1. Độ thâm nhập của các đột biến MLH1 và MSH2 trong các bệnh nhân ung thƣ
[54]

Tiền sử cá nhân
Lịch sử gia đình
Tỷ lệ những ngƣời trong họ
không bị bệnh (%)
Tỷ lệ những ngƣời bị
bệnh ≥ 1
Ung thƣ đại trực tràng (< 50 tuổi)
9,1
22
Ung thƣ đại trực tràng (> 50 tuổi)
< 5
15
Ung thƣ nội mạc tử cung (< 50 tuổi)

11
23
Các ung thƣ khác liên kết HNPCC
6,5
16
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

9
Xét nghiệm di truyền dự đoán cho các đột biến dòng mầm trong các gen
MMR nhƣ MLH1 hoặc MSH2 có thể cho phép xác định HNPCC theo dòng họ, tạo
điều kiện thuận lợi cho việc điều trị sớm và giảm tỷ lệ tử vong. Vì vậy, sàng lọc các
đột biến gen MMR có tầm quan trọng lâm sàng trực tiếp cho tƣ vấn và quản lý các
gia đình HNPCC.
Việc xác định thể mang bệnh thƣờng dựa trên các thể đƣợc sàng lọc từ các
gia đình đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế cho hội chứng này, cụ thể là tiêu chuẩn
Amsterdam I và II hoặc tiêu chuẩn ít nghiêm ngặt hơn đƣợc gọi là chỉ dẫn Bethesda
[52].
1.3.2. Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u
Khi hội chứng Lynch đƣợc mô tả lần đầu tiên, nó đƣợc coi là một hội chứng
dòng họ đặc trƣng bởi sự gia tăng của bệnh ung thƣ nội mạc tử cung và trực tràng.
Tuy nhiên, các khối u có nguy cơ tƣơng đối cao so với quần thể chung đƣợc coi là
các khối u của hội chứng Lynch [54]. Vì vậy, thuật ngữ ung thƣ ruột kết không
polyp di truyền có thể là quá hạn chế và hội chứng Lynch đã đƣợc đề xuất nhƣ một
tên thích hợp hơn để bao phủ hội chứng này [49, 50].
Việc chẩn đoán của HNPCC có thể đƣợc thực hiện trên cơ sở các tiêu chuẩn
lâm sàng Amsterdam hoặc bằng cách kiểm tra di truyền phân tử của các đột biến
dòng mầm trong một gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR). Năm 1990, tập đoàn hợp tác
quốc tế về ung thƣ đại trực tràng không polyp di truyền đã thành lập các tiêu chí với

mục đích chẩn đoán lâm sàng các gia đình có HNPCC (tiêu chuẩn Amsterdam I).
Theo tiêu chuẩn Amsterdam I những gia đình đáp ứng các điều kiện sau đây đƣợc
coi là mắc HNPCC: (1) Có tối thiểu ba ngƣời trong phả hệ mắc ung thƣ đại trực
tràng; (2) Một ngƣời là trực hệ của một trong hai ngƣời còn lại; (3) Ít nhất có một
ngƣời bị ung thƣ đại trực tràng ở độ tuổi dƣới 50. Sau đó, các tiêu chí này đƣợc coi
là quá hạn chế cho các mục đích lâm sàng và đƣợc sửa đổi để phù hợp với các bệnh
ung thƣ khác có liên quan đến HNPCC (tiêu chuẩn Amsterdam II) [51, 52]. Độ
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

10
chính xác của một chẩn đoán dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng phụ thuộc vào tính chính
xác của các báo cáo về lịch sử gia đình nghiên cứu.
Không giống với FAP, HNPCC không đƣợc đặc trƣng bởi số lƣợng tăng lên
của các polyp. Ở các bệnh nhân HNPCC, thƣờng thì số các u tuyến giống với
tỉ lệ chung của quần thể. Tuy vậy, các u tuyến xuất hiện ở các bệnh nhân
HNPCC có nguy cơ tiến triển thành ung thƣ cao hơn nhiều. Không nhƣ nhiều loại
khối u khác, các khối u trực tràng rất dễ tiếp cận. Bằng thiết bị nội soi, các khối u
này có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng ở hầu hết các giai đoạn phát triển và lan
rộng của nó. Những khối u này có một số đặc điểm đặc thù. Mức độ biệt hóa về
mặt tế bào học của những khối u này thƣờng thấp hơn so với các khối u đơn phát
có cùng kích thƣớc; điều này cho thấy mức độ trầm trọng của thƣơng tổn là cao
hơn. Đối lập với tiên lƣợng tiêu cực nhƣ vậy, các khối u ruột già ở các bệnh
nhân HNPCC điển hình có biểu hiện tốt hơn so với các bệnh nhân ung thƣ đơn
phát. Điều này phần nào cho thấy các khối u ruột già liên quan đến bệnh HNPCC
tiến hóa theo cách khác với các khối u đơn phát [17, 36]
.

1.3.3. Chẩn đoán lâm sàng

Những bệnh nhân mắc HNPCC thƣờng hình thành ung thƣ khi còn khá trẻ,
trung bình là 40 tuổi, có những trƣờng hợp còn phát bệnh sớm hơn. Những ngƣời
mang đột biến HNPCC dòng mầm không những có nguy cơ cao phát sinh bệnh ung
thƣ trực tràng mà còn làm tăng nguy cơ mắc một số bệnh ung thƣ khác nhƣ nội mạc
tử cung, dạ dày, buồng trứng, ruột non, gan, đƣờng tiết niệu trên, não, da 80%
ngƣời mắc HNPCC có nguy cơ sẽ mắc ung thƣ đại trực tràng. Tuổi trung bình của
ngƣời mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng đơn phát là 61 tuổi, trong khi các bệnh nhân
HNPCC đều phát triển ung thƣ ở độ tuổi trung bình là 42, tức là sớm hơn khoảng 20
năm. Đối với phụ nữ, 20 - 60% bệnh nhân HNPCC có nguy cơ mắc ung thƣ nội
mạc tử cung. Tuổi trung bình của chẩn đoán ung thƣ nội mạc tử cung là 46 - 62
tuổi. Trong số những phụ nữ có HNPCC phát triển thành cả ung thƣ ruột kết và ung
thƣ nội mạc tử cung khoảng 50% xuất hiện ung thƣ nội mạc tử cung trƣớc [23].
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

11
Trong HNPCC, tuổi trung bình của chẩn đoán ung thƣ dạ dày là 56 tuổi, với ung
thƣ u biểu mô đƣờng ruột là loại bệnh lý phổ biến nhất đƣợc báo cáo. HNPCC kết
hợp với ung thƣ buồng trứng có độ tuổi chẩn đoán trung bình là 42,5, khoảng 30%
đƣợc chẩn đoán trƣớc tuổi 40 (Bảng 2) [33].
Bảng 2. Thống kê các bệnh ung thƣ liên quan đến HNPCC [33]
Ung thƣ liên quan đến
HNPCC
Tỷ lệ mắc
HNPCC
Nguy cơ
mắc bệnh
Tuổi phát
bệnh

Đại trực tràng
5,5%
80%
44
Nội mạc tử cung
2,7%
20-60%
46
Dạ dày
< 1%
11-19%
56
Buồng trứng
1,6%
9-12%
42,5
Đƣờng tiết niệu
< 1%
4-5%
55
Ruột non
< 1%
1-4%
49
Não bộ, hệ thần kinh TƢ
< 1%
1-3%
50

Hiện nay, các phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng đang đƣợc sử dụng nhƣ:

khám lâm sàng, thăm dò cận lâm sàng góp phần xác định khả năng mắc hay không
mắc ung thƣ của bệnh nhân. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này không giúp chúng ta
xác định chắc chắn nguyên nhân ung thƣ hoặc nếu phát hiện ra thì bệnh nhân cũng
ở giai đoạn muộn. Vì thế, để xác định chính xác khả năng mắc ung thƣ cũng nhƣ
xác định đƣợc loại ung thƣ, từ đó đƣa ra phác đồ điều trị bệnh ung thƣ nhất thiết
phải dùng các phƣơng pháp sàng lọc sớm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử: chẩn
đoán tế bào học, các xét nghiệm huyết học, chẩn đoán mô bệnh học Khi chẩn
đoán, các mẫu mô trực tràng có thể đƣợc phân lập để phân tích ADN. Nhờ tính phổ
biến và dễ tiếp cận, các khối u trực tràng là mô hình lí tƣởng để nghiên cứu về các
gen đóng góp vào sự phát sinh khối u.
1.4. Cơ sở phân tử của HNPCC
Nghiên cứu về cơ sở phân tử của HNPCC bao gồm các hƣớng tiếp cận
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

12
bổ trợ đƣợc áp dụng bởi nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau. Năm 1993, việc
khám phá một sai hỏng mới và ít gặp trong sửa chữa ADN ở các tế bào ung thƣ
đại trực tràng cung cấp một mấu
chốt quan trọng
.
Một nhóm đứng đầu là
Manuel Perucho, trong khi nghiên cứu những
đột biến mất đoạn và đột biến
khuếch đại gen để có thể chỉ ra những gen ung thƣ và các gen ức chế khối u mới,
thay vào đó đã tìm thấy những biến đổi soma về độ dài của các yếu tố lặp lại
cao đã đƣợc biết nhƣ là các vi vệ tinh. Một nhóm độc lập do Stephen
Thibodeau đứng đầu cũng đã tìm thấy những trình tự vi vệ tinh bị biến đổi và thấy
rằng chúng có thể liên quan đến các khối u ở đoạn đầu ruột kết. Quan sát này

đã cung cấp
một sự kết nối tiềm tàng giữa những bất thƣờng về các vi vệ tinh
với HNPCC
. Gần đây,

một nhóm hợp tác do Albert de la Chapelle và Bert
Vogelstein đứng đầu đã nỗ lực lập bản đồ vị trí các locus ức chế khối u ở những
bệnh nhân Lynch sử dụng các phƣơng pháp tách dòng vị trí. Trong khi lập bản đồ
các vùng LOH, nhóm của de la Chapelle/ Vogelstein
đã phát hiện đƣợc các đột
biến ở các trình tự vi vệ tinh [35, 37, 59]
.
1.4.1. Tính bất ổn định vi vệ tinh
Ung thƣ đại trực tràng (CRC), nhƣ tất cả các ung thƣ khác, dƣờng nhƣ có
liên quan đến sự bất ổn định về mặt di truyền. Sự không ổn định di truyền có thể
chia hai loại: Bất ổn định nhiễm sắc thể (CIN) và sự bất ổn định vi vệ tinh (MSI).
Các vi vệ tinh đƣợc lặp lại đơn giản, thƣờng là hai nucleotit, trên vùng không
mã hóa của ADN, cũng có thể nằm trong gen hoặc ở giữa gen. Các trình tự vi vệ
tinh ở các tế bào sai hỏng MMR dễ bị ảnh hƣởng và có xu hƣớng mở rộng hoặc thu
hẹp chiều dài của trình tự vi vệ tinh từ thế hệ này sang thế hệ khác (Hình 3). Dạng
siêu đột biến dễ phát hiện này đƣợc gọi là tính bất ổn vi vệ tinh (microsatellite
instability - MSI) [25, 55]. MSI phản ánh tình trạng đột biến tăng cao ảnh hƣởng lên
toàn bộ hệ gen. Quan sát về các MSI ở các tế bào ung thƣ đại trực tràng cho thấy
một cơ chế hình thành khối u hoàn toàn mới. MSI không chỉ bị hạn chế đối với các
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

13
khối u đại trực tràng mà nó có thể phát hiện ở các khối u ngoài ruột kết nhƣ dạ dày,

nội mạc tử cung [57].
Một thang chuẩn đƣợc sử dụng để đánh giá sự bất ổn vi vệ tinh trong mô
khối u và mô bình thƣờng [10]. Một khối u đƣợc phân loại nhƣ sau:
- MSI cao nếu có nhiều hơn 30% sự bất ổn.
- MSI thấp nếu ít hơn 30% sự bất ổn.
- MSI ổn định nếu không có sự bất ổn.

Hình 3. Sửa chữa bắt cặp sai ở trình tự vi vệ tinh [10]
MSI có thể đƣợc phát hiện trong hơn 90% các khối u HNPCC. Khoảng 12 -
17% các khối u ngẫu nhiên cũng cho thấy MSI [5, 47]. Khoảng 10 - 20% ung thƣ
đại trực tràng xảy ra ở những cá thể không đƣợc biết là có hoặc nghi ngờ có
HNPCC có MSI gây ra bởi sự im lặng của gen MLH1 do sự methyl hóa hoặc gây ra
do đột biến soma ở các gen sửa chữa bắt cặp sai [22]. Do đó, MSI trong một u tuyến
đã đƣợc xác định là một yếu tố dự báo tốt về đột biến sửa chữa bắt cặp sai dòng
mầm tiềm ẩn [16, 30]. Tuy nhiên, vì nhiều u tuyến liên quan đến HNPCC không thể
hiện MSI nên sự vắng mặt của MSI trong các mẫu này không loại trừ HNPCC [31].
1.4.2. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair)
Trong quá trình sao chép ADN, các bazơ bắt cặp sai ngay lập tức đƣợc sửa
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

14
chữa bằng phức hợp ADN polymeraza sao chép, có chức năng đọc sửa. Kết quả là
tỷ lệ lỗi của quá trình sao chép ADN theo thống kê chỉ là 10
-12
bazơ. Mức độ chính
xác này cho thấy chỉ dƣới 1% tế bào sẽ mang bazơ bắt cặp sai trong một pha S hoàn
chỉnh. Bên cạnh cơ chế sửa lỗi của ADN polymeraza, các bazơ bắt cặp sai còn đƣợc
xử lý nhờ cơ chế sửa chữa bắt cặp sai (MMR). Rất hiếm trƣờng hợp các bazơ bắt

cặp sai tránh đƣợc sự phát hiện của MMR trong quá trình sao chép ADN [3].
Khoảng 15% các trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng đƣợc thống kê là mang các sai
hỏng trong MMR. Những đột biến gây bất hoạt tế bào mầm ở một trong sáu gen
liên quan đến con đƣờng sửa chữa bắt cặp sai (MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1
và PMS2) là nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng không polyp di truyền
(HNPCC) [3].
Khi các gen mã hóa các protein này bị đột biến, sẽ dẫn đến việc các protein
tạo thành bị bất hoạt, khiến hệ thống không còn khả năng đọc sửa các bazơ kết cặp
sai, do đó làm mất tính ổn định di truyền của tế bào. Các tế bào có đột biến trong
MMR có tỷ lệ đột biến tăng 2 – 4 lần so với các tế bào bình thƣờng. Đối với bệnh
ung thƣ đại trực tràng thứ phát, các đột biến này có thể xuất hiện dƣới các tác nhân
đột biến từ môi trƣờng. Nhƣng với HNPCC, các đột biến đã tồn tại sẵn trong hệ gen
của cơ thể bố mẹ, qua quá trình thụ tinh, đƣợc truyền vào cơ thể con cái [56].
Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai đƣợc phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn E. coli đƣợc
gọi là
con đƣờng MutHLS
. Giai đoạn đầu của MMR liên quan đến 3 gen là mutS,
mutL và mutH mã hóa cho 3 protein tƣơng ứng là MutS, MutL, MutH. Đầu tiên,
MutS ở dạng dimer sẽ nhận biết và liên kết vào bazơ bắt cặp sai. Sau đó, hệ thống
sửa chữa nhận ra bazơ nào đúng, bazơ nào sai tƣơng ứng với mạch nào làm khuôn
và mạch nào đƣợc tổng hợp mới [3]. Lúc này MutS đã liên kết với bazơ bắt cặp sai
sẽ tạo phức với MutL và MutH ở dạng dimer để mang trình tự [GA
m
TC] chƣa đƣợc
methyl hóa ở gần tới vị trí bắt cặp sai. MutH sẽ làm đứt mạch tại vị trí trình tự
[GA
m
TC] chƣa đƣợc methyl hóa. Từ vị trí đó một enzym exonucleaza sẽ cắt mạch
ADN không đƣợc methyl hóa đến hết vị trí nucleotit bắt cặp sai. Rồi sau đó enzym
ADN polymeraza III và ligaza sẽ tổng hợp bù và lấp đoạn ADN rỗng (Hình 4) [3].

Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

15

Hình 4. Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở E.coli [18]
Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai diễn ra ngay trong quá trình sao chép ADN.
Ngoài quá trình methyl hóa xảy ra đối với nucleotit A ở trình tự [GA
m
TC], quá trình
methyl hóa còn xảy ra đối với nucleotit C ở trình tự CC
m
(A/T)GG. Quá trình methyl
hóa đƣợc thực hiện nhờ enzym ADN methyl tranferaza [17, 27].
Cơ chế MMR ở eukaryota cũng hoạt động tƣơng tự nhƣ cơ chế hoạt động ở
vi khuẩn (E. coli). Dạng tƣơng đồng với mutS vi khuẩn của eukaryota đƣợc gọi là
dạng tƣơng đồng mutS hay MSH đƣợc tìm thấy ở nấm men (γMSH) và ở các tế bào
ngƣời (hMSH). Sự kết hợp một số dạng protein MSH tạo ra các phức hợp có chức
năng giống với protein MutS ở vi khuẩn. Dạng tƣơng đồng với mutL vi khuẩn của
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

16
eukaryota đƣợc gọi là dạng tƣơng đồng mutL hay MLH cũng đƣợc tìm thấy ở nấm
men (γMLH) và ở các tế bào ngƣời (hMLH). Tuy nhiên, các protein do các gen
MLH mã hóa sẽ không thực hiện đƣợc chức năng mà phải kết hợp với protein do
một số gen PMS và MSH quy định (γPMS, γMSH ở nấm men và hPMS, hMSH ở
ngƣời) mới có chức năng giống nhƣ protein MutL ở vi khuẩn [20, 26].

Ở ngƣời đã xác định đƣợc các gen có liên quan đến hoạt động của MMR
gồm có các gen human mutL homolog 1 (hMLH1), human mutL homolog 3
(hMLH3), human mutS homolog 2 (hMSH2), human mutS homolog 3 (hMSH3),
human mutS homolog 6 (hMSH6), human postmeiotic segregation increased 2
(hPMS2), human postmeiotic segregation increased 1 (hPMS1) [13]. Trong đó phức
hợp chứa gen hMSH2 có chức năng tƣơng đƣơng với mutS ở E. coli, phức hợp chứa
gen hMLH1 có chức năng tƣơng ứng với mutL ở E. coli. Các gen này còn đƣợc gọi
là các gen gây đột biến, bởi vì việc mất chức năng của chúng dẫn đến sự tích lũy
tăng lên các đột biến trong hệ gen. Các đột biến xảy ra ở các gen này làm tăng cao
nguy cơ mắc các bệnh di truyền trong đó có HNPCC [21].
MMR là một quá trình sinh học có tính bảo thủ về mặt tiến hóa. Các tế bào
ngƣời chứa ít nhất năm trình tự tƣơng đồng MutS và bốn trình tự tƣơng đồng MutL.
Năm trong số các gen này đã đƣợc chỉ ra là đóng vai trò quan trọng trong MMR và
gây HNPCC khi chúng bị đột biến (Bảng 3).
Bảng 3.

Các gen MMR liên quan tới HNPCC [26]

Gen
E. coli

Dạng tƣơng đồng
ở
Homo sapiens

Vị trí trên
NST
Tỷ lệ đột biến ở
HNPCC (%)
Khuynh hƣớng

MutS

hMSH2
hMSH6
2p21-22
2p16
40
10
HNPCC điển hình
HNPCC không điển
hình
MutL
hMLH1
hPMS1
hPMS2
3p21
2p31-33
7p22
50
Hiếm
<2
HNPCC điển hình
HNPCC điển hình
Hội chứng Turcot
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh Cao học K18

17
Trong khi các bƣớc đầu tiên của quá trình MMR ở vi khuẩn liên quan tới

hoạt tính của MutS và MutL ở dạng homodimer thì hai protein ở ngƣời hình thành
các heterodimer theo nhiều tổ hợp khác nhau. Tính đặc hiệu khác nhau của các
phức hợp này cho phép nhận biết các cơ chất khác nhau (Hình 5).

Hình 5. Sửa chữa ADN bắt cặp sai ở người [26]

Ở dạng tƣơng đồng MutS, MSH2 đóng vai trò cơ bản trong sự nhận biết và
bám vào các bazơ bắt cặp sai, trong khi MSH3 và MSH6 đóng vai trò sửa đổi tính
đặc hiệu của sự nhận biết này [39]. Heterodimer MSH2 – MSH6 đƣợc gọi là phức
hợp MutSα nhận biết đơn bazơ bắt cặp sai, chiếm từ 80% đến 90% các bắt cặp sai
trong tế bào [24]. Heterodimer MSH2 – MSH3 đƣợc gọi là phức hợp MutSβ có
nhiệm vụ nhận biết vị trí sai hỏng từ 2 đến 8 nucleotit, hoặc những đột biến mất
hoặc thêm bazơ tạo ra các cấu trúc khác biệt nhƣ vòng thắt diel. Có sự tƣơng tác lẫn
nhau trong ái lực nhận biết của MutSα và MutSβ [26, 29].