phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai msh2 từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Thị Mai



PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2
TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Hà Nội – Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Thị Mai

PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2
TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN





Hà Nội – Năm 2012
MỤC LC
Trang
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Bảng ký hiệu các chữ viết tắt
Lời nói đầu 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Những nét khái quát về ung thƣ, bệnh ung thƣ và gen ung thƣ 3
1.1.1. Ung thư và bệnh ung thư 3
1.1.2. Gen ung thư (oncogene) 4
1.2. Những hiểu biết về ung thƣ đại trực tràng 5
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ung thư đại trực tràng 5

1.2.2. Sơ lược về bệnh ung thư đai trực tràng 6
1.2.3. Cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng di truyền 12
1.3. Hệ thống gen MMR và đột biến gen MSH2 với hội chứng
ung thƣ đại trực tràng 17
1.3.1. Hệ thống gen MMR 17
1.3.2. Gen MSH2 và đột biến gây ung thư đại trực tràng 21
1.4. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu ung thƣ
đại trực tràng 24
1.4.1. Kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR 25
1.4.2. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn RFLP 25
1.4.3. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn SSCP 26
1.4.4. Kỹ thuật phân tích sợi đôi dị hợp HET 27
1.4.5. Kỹ thuật điện di gel gradient biến tính DGGE 28
1.4.6. Các phương pháp giải trình tự ADN 28
1.5. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 29
1.5.1. Mục tiêu nghiên cứu 29
1.5.2. Nội dung nghiên cứu 29
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. Vật liệu, địa điểm, hoá chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu30
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 30
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 30
2.1.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 30
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 31
2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu 31
2.2.2. Tách ADN tổng số 31
2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số 31
2.2.4. Nhân bản các exon nhờ phản ứng PCR 32
2.2.5. Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gây ung thư đại trực
tràng 34
2.2.6. Giải trình tự ADN 37

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39
3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số 39
3.2. Kết quả nhân bản 09 exon gen MSH2 40
3.2.1. Kết quả nhân bản exon 2 40
3.2.2. Kết quả nhân bản exon 3 41
3.2.3. Kết quả nhân bản exon 6 42
3.2.4. Kết quả nhân bản exon 7 43
3.2.5. Kết quả nhân bản exon 8 44
3.2.6. Kết quả nhân bản exon 12 45
3.2.7. Kết quả nhân bản exon 13 46
3.2.8. Kết quả nhân bản exon 14 47
3.2.9. Kết quả nhân bản exon 15 48
3.3. Kết quả phân tích đột biến trên 09 exon gen MSH2 50
3.3.1. Kết quả phân tích đột biến exon 2 51
3.3.2. Kết quả phân tích đột biến exon 3 53
3.3.3. Kết quả phân tích đột biến exon 6 55
3.3.4. Kết quả phân tích đột biến exon 7 56
3.3.5. Kết quả phân tích đột biến exon 8 57
3.3.6. Kết quả phân tích đột biến exon 12 59
3.3.7. Kết quả phân tích đột biến exon 13 60
3.3.8. Kết quả phân tích đột biến exon 14 61
3.3.9. Kết quả phân tích đột biến exon 15 62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66
Kết luận 66
Kiến nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
Tài liệu tiếng Việt 68
Tài liệu tiếng Anh 68
Các trang Web 72
DANH MC CÁC BNG

Bảng 1: Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC
Bảng 2: Tiêu chuẩn Amsterdam I và Amsterdam II trong chẩn đoán lâm sàng
HNPCC
Bảng 3: Các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng
Bảng 4: Tỷ lệ các đột biến thường gặp trong hai gen MLH1 và MSH2
Bảng 5: Nguy cơ mắc một số bệnh ung thư ở người có đột biến gen liên quan
đến HNPCC so với các cá thể bình thường
Bảng 6: Trình tự các cặp mồi dùng để nhân bản 09 exon quan tâm
Bảng 7: Thành phần và chu trình nhiệt cho một phản ứng PCR
Bảng 8: Tỷ lệ các thành phần của PAGE 12% trong kỹ thuật SSCP
Bảng 9: Quy trình nhuộm bạc và thành phần các dung dịch nhuộm
Bảng 10: Kết quả tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản các exon
nghiên cứu





DANH MC CÁC HÌNH
Hình 1: Sơ đồ cấu tạo ruột kết và sự hình thành polyp bên trong
Hình 2: Cơ chế MMR ở E. Coli
Hình 3: Cơ chế MMR ở người
Hình 4: Sơ đồ cấu tạo NST số 2 và vị trí gen MSH2
Hình 5: Vị trí gen MSH2 trên NST số 2
Hình 6: Sơ đồ gen MSH2
Hình 7: Sơ đồ các phần của phân tử protein được mã hóa bởi gen MSH2
Hình 8: Tỷ lệ các dạng đột biến thường gặp trên gen MSH2
Hình 9: Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gen MSH2
Hình 10: Kết quả tách chiết ADN tổng số

Hình 11: Kết quả nhân bản exon 2
Hình 12: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 3
Hình 13: Kết quả nhân bản exon 6
Hình 14: Kết quả nhân bản exon 7
Hình 15: Kết quả nhân bản exon 8
Hình 16: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 12
Hình 17: Kết quả nhân bản exon 13
Hình 18: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 14
Hình 19: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 15
DANH MC CÁC HÌNH (tip theo)
Hình 20: Kết quả SSCP exon 2
Hình 21: Mô hình sợi đơn sai khác của mẫu 35 so với đối chứng exon 2
Hình 22: Kết quả giải trình tự mẫu số 35 exon 2
Hình 23: Kết quả SSCP exon 3
Hình 24: Kết quả giải trình tự mẫu 14 exon 3
Hình 25: Kết quả SSCP exon 6
Hình 26: Kết quả SSCP exon 7
Hình 27: Kết quả SSCP exon 8
Hình 28: Mô hình điện di sai khác của các mẫu 31, 34, 36 exon 8
Hình 29: Kết quả SSCP exon 12
Hình 30: Kết quả SSCP exon 13
Hình 31: Kết quả SSCP exon 14
Hình 32: Kết quả SSCP exon 15
Hình 33: Mô hình sợi đơn sai khác của mẫu 19 exon 15
Hình 34: Kết quả giải trình tự mẫu 19 exon 15 gen MSH2
BNG KÍ HIU CÁC CHỮ VIT TT
Chữ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ADN

Deoxiribonucleic Acid
Axit deoxiribonucleic
APS
Amonipersulphate
Amonipersulphate
ARN
Ribonucleic Acid
Axit ribonucleic
bp
Base paire
Cặp bazơ
CRC
Colorectal Cancer
Ung thư đại trực tràng
DGGE
Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis
Điện di gel Gradient biến tính
dNTP
Deoxyribonucleotide
triphosphate
Deoxyribonucleotide triphosphate
FAP
Familial Adenomatous
Polyposis
Polyp tuyến theo dòng họ
HET
Heteroduplex Analysis
Phân tích sợi kép dị hợp
HNPCC

Hereditary Non-polyposis
Colorectal Cancer
Ung thư ruột kết không polyp di
truyền
HPV
Human Papilloma Virus
Virut gây ung thư cổ tử cung ở
người
IHC
Immunohistochemistry
Hóa mô miễn dịch
Kb
Kilobase
1000 bazơ nitơ
LOH
Loss of Heterozygosity
Mất tính dị hợp tử
MMR
Mismatch Repair
Sửa chữa bắt cặp sai
MSI
Microsatellite Instability
Bất ổn vi vệ tinh
MSH2
MutS Homolog 2
Gen MSH2
NST

Nhiễm sắc thể
NCBI

National Center for
Biotechnology Information
Trung tâm quốc gia về thông tin
công nghệ sinh học (Mỹ)
OD
260/280
Optical Density
Đo mật độ quang phổ ở bước sóng
260 và 280nm
PAGE
Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
Điện di trên gel polyacrylamide
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
SSCP
Single Strand Conformation
Polymorphisms
Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn
SSR
Simple Sequence Repeats
Trình tự lặp lại đơn giản
RFLP
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Đa hình độ dài các đoạn cắt giới
hạn
RT-PCR
Reverse Transcription-

Polymerase Chain Reaction
Kỹ thuật PCR phiên mã ngược
TAE
Tris-Acetic acid-EDTA
Đệm điện di TAE
TEMED
N,N,N’,N’-
tetramethylenediamine
Tetramethylenediamine
WHO
World Health Organization
Tổ chức Y tế Thế giới





Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
1
LI NÓI ĐU
Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1
triệu trường hợp mới mắc ung thư. Cũng theo tổ chức này cho biết, mỗi năm có
khoảng 6,7 triệu người chết do ung thư. Tỷ lệ chết do ung thư chiếm tới 12% trong
tổng số các nguyên nhân gây tử vong ở người. Các loại ung thư hàng đầu được tổng
kết ở nam giới là ung thư phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; ở nữ giới
là ung thư vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi [30].
Trong hơn một thập niên trở lại đây, tỷ lệ mắc ung thư có xu hướng gia tăng
ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Qua các kết quả thống kê cho biết, hiện toàn
cầu có khoảng 25 triệu người đang sống chung với bệnh ung thư. Con số này ước

tính lên tới 30 triệu người vào năm 2020 nếu như chúng ta không tìm ra liệu pháp
can thiệp và chữa trị kịp thời.
Riêng ở Việt Nam, mỗi năm có trên 150.000 người mắc ung thư. Trong đó,
khoảng 100.000 người chết vì căn bệnh quái ác này. Riêng số ca tử vong do ung thư
đại trực tràng ước tính khoảng 55.000 trường hợp. Đây được xem là những con số
đáng báo động và là thách thức lớn lao đối với Y học nước nhà.
Hiện nay, trên thế giới ung thư đại trực tràng chiếm khoảng 11,5% tổng số
các trường hợp ung thư và chiếm tới 15,2% tổng số trường hợp tử vong có nguyên
nhân từ ung thư. Loại ung thư này được nhận định là liên quan đến chế độ ăn uống
và lối sống, thường gặp ở các nước phát triển và có xu hướng tăng nhanh ở các
nước đang phát triển. Căn bệnh này thường xuất hiện ở những người có độ tuổi trên
50 và có xu hướng dần “trẻ hóa” trong hơn một thập niên trở lại đây. Đặc biệt,
những người có tiền sử viêm đại trực tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có người bị
ung thư đại trực tràng thì nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng xảy ra cao hơn. Nhiều
nghiên cứu chỉ ra rằng, một bộ phận ung thư đại trực tràng có xu hướng chung di
truyền theo dòng họ liên quan đến các gen gây đột biến (mutator gene) [4].
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
2
Trong ung thư đại trực tràng, hội chứng HNPCC – ung thư ruột kết không
polyp di truyền còn gọi là hội chứng Lynch chiếm khoảng 15%. Hội chứng này
cũng được xem là một bệnh di truyền tương đối phổ biến và gần đây được biết đến
như một căn bệnh riêng biệt [30]. Bên cạnh đó, HNPCC là hội chứng có khuynh
hướng ung thư không chỉ ở đại trực tràng mà còn liên quan đến các bệnh ung thư ở
các cơ quan khác nhau như dạ dày, ruột non, não, tụy, buồng trứng, cổ tử cung và
da.
HNPCC là hội chứng có tính chất di truyền, vì nó có liên quan mật thiết đến
sự sai hỏng một trong các gen thuộc hệ thống gen sửa chữa bắt cặp sai MMR. Hệ
thống này gồm 6 gen chính là MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS2, PMS6. Trong
đó, MLH1 và MSH2 được cho là hai gen có liên kết chặt đến sự hình thành

HNPCC. Bởi vì, nếu MLH1 tham gia vào quá trình sửa chữa sự sai hỏng thì MSH2
lại đóng vai trò nhận diện các lỗi sai hỏng trong tái bản ADN. Khoảng 40% các
trường hợp mắc hội chứng Lynch với một đột biến được xác định có liên quan đến
đột biến gen MSH2. Hàng trăm đột biến gen này có khả năng dẫn đến ung thư đại
trực tràng cũng như các loại ung thư khác liên quan đến HNPCC [22].
Mặc dù ung thư đại trực tràng, trong đó có ung thư đại trực tràng mang
khuynh hướng di truyền là một trong những dạng ung thư có tỷ lệ mắc phải ở Việt
Nam khá cao nhưng những nghiên cứu về gen liên quan đến căn bệnh này chưa
nhiều, đặc biệt là những nghiên cứu về gen MSH2. Chính vì thế, chúng tôi tiến
hành “Phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai MSH2 từ bệnh nhân ung
thƣ đại trực tràng” nhằm đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen
MSH2 ở các bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam, nghiên cứu mới về các
gen MMR khác nhằm phục vụ có hiệu quả trong việc chẩn đoán cũng như phát
hiện sớm bệnh ung thư đại trực tràng đang có xu hướng ngày một gia tăng tại Việt
Nam.

Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
3
Chương 1. TNG QUAN TÀI LIU
1.1. NHỮNG NÉT KHÁI QUÁT VỀ UNG THƢ, BỆNH UNG THƢ VÀ GEN
UNG THƢ
1.1.1. Ung thƣ và bệnh ung thƣ
Ung thư là sự phân chia một cách bất thường của một nhóm tế bào tạo thành
những khối u. Các khối u này là tập hợp các tế bào có quan hệ di truyền với nhau,
chúng có khả năng phân chia không kiểm soát. Chính vì thế, thuật ngữ “ung thư”
theo nghĩa hẹp được dùng để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các tổ chức mô
xung quanh gồm các tế bào bình thường [4].
Để phân biệt giữa khối u lành và khối u ác tính ta dựa vào khả năng xâm lấn
của các tế bào bất thường đối với các tế bào xung quanh nó. Nếu là khối u lành, nó

chỉ hình thành nên những tổ chức tế bào có khả năng sinh sản bất thường, khi tiếp
xúc với mạch máu hay mạch bạch huyết cũng không có khả năng di chuyển tới một
vị trí, một mô hay bất kì một cơ quan nào khác [4]. Ngược lại, nếu là khối u ác tính
sẽ có thể di chuyển (di căn) tới bất cứ vị trí nào và tiếp tục tăng sinh mạnh ngay tại
vị trí mà chúng chuyển tới. Các u di căn có khả năng gây ra những rối loạn cục bộ
chức năng của các mô, thậm chí cả các mô liên đới và có thể dẫn đến tử vong.
Các khối u thường phát sinh từ một tế bào ban đầu bị biến đổi di truyền nhất
định khiến chúng có khả năng tăng sinh mạnh, được gọi là quá trình phát sinh ung
thư hay sự phát sinh ung thư. Các khối u thường bắt nguồn từ những u nhỏ lành tính
sau đó chuyển sang trạng thái ác tính và di căn. Các khối u này có xu hướng tích lũy
các biến đổi di truyền và tạo nên các đặc tính mới. Sự tích lũy các gen ung thư ở các
tế bào khối u chính là nguồn gốc phát sinh ung thư [4].
Bệnh ung thư được dùng để chỉ một nhóm bệnh đa dạng nào đó ở người. Và
trong số đó, một vài bệnh chỉ đơn thuần gây nên những biến đổi nhỏ về sinh lí, còn
phần lớn là gây ra những rối loạn sinh lí nghiêm trọng. Các bệnh ung thư phổ biến ở
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
4
người trưởng thành là các bệnh như ung thư biểu mô (caxinôm), ung thư mô liên
kết (sacôm), ung thư bạch huyết và bạch cầu còn gọi là các khối u dạng lỏng [4].
Các bệnh ung thư đều phát sinh do sự biến đổi các gen tạo nên các alen đột
biến. Trong thực tế, sự phát sinh các bệnh ung thư lại liên quan đến nhiều nhân tố.
Nhờ những tiến bộ về khoa học kĩ thuật với các công cụ nghiên cứu và phân tích di
truyền hiện đại đã dần làm sáng tỏ cơ chế phát sinh ung thư. Đặc biệt, những nghiên
cứu trong khoảng 20 năm trở lại đây đã mang lại những kiến thức thiết thực và nhất
quán. Những nghiên cứu này đã hình thành nên các nguyên lý di truyền học ung
thư. Tuy nhiên, mãi tới đầu thế kỉ XIX ung thư mới thật sự được ghi nhận [4].
1.1.2. Gen ung thƣ (oncogene)
Gen ung thư là một dạng đột biến làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc
đẩy quá trình phát sinh ung thư. Ngoài ra, gen ung thư cũng có thể được coi như các

dạng alen đặc biệt do các gen bình thường xuất hiện các đột biến [4]. Còn gen gây
ung thư được coi là một dạng đặc biệt của gen ung thư. Nếu gen ung thư sinh ra bởi
đột biến, thì gen gây ung thư chỉ làm thay đổi chứ không làm mất chức năng sản
phẩm của protein mà gen đó tạo ra.
Trong quá trình tăng trưởng, các khối u tích lũy dần các gen ung thư. Sự tích
lũy này chủ yếu theo ba con đường sau:
1. Sự tích lũy truyền qua các tế bào dòng sinh dục.
2. Sự tích lũy do đột biến tự phát trong tế bào sôma.
3. Sự tích lũy đột biến do lây nhiễm virut.
Trong đó, gen ung thư dòng sinh dục chiếm tỉ lệ nhỏ (từ 0,1 – 10%) nhưng
lại rất đáng kể trong các trường hợp gây ung thư ở người [4]. Còn gen ung thư dòng
tế bào sôma đươc gọi là các đột biến sôma. Đột biến sôma dùng để chỉ quá trình
phát sinh đột biến cũng như sản phẩm do quá trình đột biến đó tạo ra.
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
5
Cả hai loại đột biến dòng sinh dục và đột biến sôma đều có thể làm biến đổi
một gen bình thường tạo nên dạng alen đột biến. Nhưng không phải tất cả mọi đột
biến gen đều dẫn đến phát sinh ung thư.
Riêng dạng tích lũy gen ung thư trong cơ thể do nhiễm virut thì ít phổ biến
hơn và thường giới hạn trong một số bệnh nhất định (ví dụ virut viêm gan B, C gây
ung thư gan, virut HPV gây ung thư cổ tử cung ). Ở dạng phát sinh ung thư này,
virut đóng vai trò quan trọng. Nó không chỉ là nhân tố truyền gen ung thư mà còn
trực tiếp làm biến đổi môi trường mà ở đó các gen ung thư có thể được nhân lên
nhanh chóng và được phát tán rộng rãi.
1.2. NHỮNG HIỂU BIẾT VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng là bệnh lý khá phổ biến trong các bệnh ung thư có liên
quan đến hệ tiêu hóa. Trong đó, ung thư đại trực tràng không polyp di truyền được
xem là hội chứng thường gặp nhất khi nhắc đến ung thư đại trực tràng. Vào cuối thế

kỉ XIX (năm 1895), ung thư đại trực tràng được phát hiện bởi Aldred Warthin. Theo
quan sát của ông trên một gia đình làm thợ may, có rất nhiều người bị chết bởi ung
thư đại trực tràng hoặc ung thư nội mạc tử cung [34]. Tuy nhiên, ông chỉ dừng lại ở
việc quan sát mà chưa đi sâu vào nghiên cứu những ghi chép của mình nên đặc tính
di truyền của hội chứng này chỉ được biết đến sau những công bố của bác sĩ Henry
Lynch.
Theo kết quả của ông cho biết, ở các thế hệ đầu, ung thư dạ dày chiếm ưu
thế. Càng về sau, ung thư đại tràng xuất hiện càng nhiều hơn. Sự thay đổi này phản
ánh những biến đổi của môi trường có liên quan đến từng giai đoạn phát triển của
bệnh ung thư cũng như loại ung thư, đồng thời khẳng định, sự biến đổi môi trường
là một trong những nhân tố quan trọng dẫn đến ung thư đại tràng [4].
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
6
Hội chứng Lynch được chia thành hội chứng Lynch I và hội chứng Lynch II
để phân biệt các gia đình chỉ có ung thư đại tràng với các gia đình có cả ung thư đại
tràng lẫn các loại ung thư khác. Ngày nay, người ta cho rằng, các gia đình có các
bệnh ung thư liên quan tới ung thư ruột kết đều được coi là HNPCC [17].
Đến năm 1993, một sai hỏng mới và hiếm gặp trong hệ thống gen MMR của
một bệnh nhân mắc ung thư ruột kết được phát hiện đã cung cấp một đầu mối quan
trọng trong quá trình nghiên cứu ung thư đại trực tràng di truyền. Nghiên cứu được
tiến hành trên những đột biến mất đoạn và đột biến khuếch đại gen nhằm chỉ ra các
gen ung thư và gen áp chế khối u mới. Kết quả, đã tìm thấy các biến đổi sôma về độ
dài các trình tự lặp lại được biết đến như các vi vệ tinh [19], [36]. Một nghiên cứu
khác cũng tìm thấy những biến đổi liên quan đến sự hình thành khối u ở đoạn đầu
ruột kết. Gần đây nhất, người ta đang nỗ lực lập bản đồ cho các vùng bị mất tính dị
hợp tử LOH và cũng đã phát hiện được các đột biến ở trình tự vi vệ tinh. Nhờ đó
người ta đã khám phá ra bản chất di truyền của ung thư đại trực tràng và khẳng
định, hội chứng này do một số gen xảy ra các đột biến khác nhau, được di truyền
qua các thế hệ và biểu hiện rõ rệt ở một số dòng họ. Ngoài ra, tính hỗn tạp của các

gen gây ung thư ở các bệnh nhân ung thư ruột kết di truyền cũng được biết đến như
là một tác nhân gây khó khăn trong chẩn đoán và phát hiện bệnh [20].
1.2.2. Sơ lƣợc về bệnh ung thƣ đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng là một loại ung thư biểu mô, chiếm 11,5% tổng số các
ca ung thư và chiếm tới 15,2% tổng số các trường hợp tử vong vì ung thư. Loại ung
thư này thường liên quan đến chế độ ăn uống và lối sống, gặp nhiều ở các nước phát
triển, đặc biệt là các nước phương Tây và đang có xu hướng gia tăng ở các nước
đang phát triển [4].
Riêng ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng là một trong ba loại ung thư phổ
biến hay gặp đối với hệ tiêu hóa. Do đó, ngày càng có nhiều dự án tập trung những
nghiên cứu nhằm tìm ra nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng này. Theo thống kê
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
7
của Hội Ung thư Thành phố Hồ Chí Minh, ung thư đại trực tràng nằm trong số 5
bệnh ung thư có số người mắc cao nhất. Một khảo sát mới nhất về tình trạng ung
thư tại Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, ung thư đại trực tràng xếp thứ 4 ở nam
giới (sau ung thư gan, phổi, dạ dày) và xếp thứ 3 ở nữ giới (sau ung thư cổ tử cung
và ung thư vú).
Hiện nay, y học
chưa biết chính xác nguyên
nhân gây ung thư đại trực
tràng. Tuy nhiên, có những
yếu tố dẫn đến nguy cơ
chắc chắn làm dễ mắc
bệnh hơn tuổi tác. Vì trên
9% bệnh nhân ung thư đại
trực tràng là trên 50 tuổi,
có tiền sử bị polyp, viêm
loét đại tràng và bệnh Crohn (một loại bệnh do hồi tràng – đoạn cuối ruột non bị tổn

thương) trong gia đình có người mắc ung thư đại tràng hay đường ruột.
Ung thư đại trực tràng là hội chứng khá phổ biến và được phân chia thành 3
loại chính, gồm: hội chứng u tuyến polyp theo dòng họ (FAP) (Hình 1), hội chứng
HNPCC và các bệnh ung thư khác có liên quan đến hệ tiêu hóa. Trong đó, hội
chứng u tuyến polyp theo dòng họ đặc trưng bởi bệnh nhân mang hội chứng này
hình thành rất nhiều polyp trong ruột già từ khi còn khá trẻ. Các khối u có thể quan
sát được chiếm tỷ lệ rất nhỏ, số ít trong đó có khả năng hình thành u ác tính. Hội
chứng HNPCC đặc trưng bởi không xuất hiện các polyp mà thay vào đó là sự xuất
hiện u tuyến. Chính những u tuyến này có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao hơn
nhiều [4].
80% người mắc ung thư ruột già dạng HNPCC có nguy cơ mắc ung thư đại
trực tràng. Tuổi trung bình của người mắc bệnh ung thư ruột già đơn phát là 61,
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
8
trong khi các bệnh nhân HNPCC đều phát triển ung thư ở độ tuổi trung bình là 42,
tức là sớm hơn 20 năm. Đối với phụ nữ, có khoảng 20 – 60% bệnh nhân HNPCC
có nguy cơ mắc ung thư nội mạc tử cung. Tuổi trung bình cho chẩn đoán ung thư
nội mạc tử cung là 46 – 62. Trong số những phụ nữ mắc HNPCC phát triển thành
ung thư ruột kết và ung thư nội mạc tử cung, khoảng 50% xuất hiện ung thư nội
mạc tử cung từ trước đó [17]. Có thể xem xét tỷ lệ mắc các bệnh ung thư khác có
liên quan đến HNPCC trong Bảng 1 dưới đây.
Bảng 1: Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC [17]
Ung thƣ liên quan đến
HNPCC
Tỷ lệ mắc
HNPCC
Nguy cơ mắc
bệnh
Tuổi phát

bệnh
Đại trực tràng
5.5%
80%
44
Nội mạc tử cung
2.7%
20-60%
46
Dạ dày
<1%
11-19%
56
Buồng trứng
1.6%
9-12%
42.5
Đường tiết niệu
<1%
4-5%
55
Ruột non
<1%
1-4%
49
Não bộ và hệ thần kinh TƯ
<1%
1-3%
50

Căn cứ vào bảng số liệu trên có thể thấy, tỷ lệ người bị HNPCC dẫn tới mắc
ung thư đại trực tràng là rất cao (khoảng 80%). Khi đó, chẩn đoán các mẫu mô trực
tràng được phân lập để phân tích ADN là rất quan trọng và cần thiết. Nhờ tính phổ
biến và dễ tiếp cận, các khối u đại trực tràng là mô hình lí tưởng để nghiên cứu các
gen đóng góp vào quá trình phát sinh ung thư. Hơn nữa, độ tuổi mắc ung thư đại
trực tràng cũng sớm hơn so với các dạng ung thư khác và thường nằm trong độ tuổi
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
9
40 – 42. Trong một nhóm các bệnh nhân HNPCC cũng như các bệnh nhân ung thư
đại trực tràng không đủ tiêu chuẩn HNPCC thì các cá thể mang đột biến dòng mầm
ở một trong các gen MMR sẽ được xác định là mắc hội chứng Lynch. Để biết được
một bệnh nhân có phải mắc hội chứng HNPCC không, người ta đã thiết lập các tiêu
chuẩn để xác định các cá thể có nguy cơ cao với loại hội chứng này. Ngoài những
chỉ dẫn của Bethesda cải tiến là dựa vào thông tin lâm sàng, lịch sử gia đình hoặc
mô bệnh học hay các tiêu chuẩn Amsterdam I và II, người ta còn tiến hành các xét
nghiệm di truyền các đột biến MMR. Tuy nhiên, các xét nghiệm này thường rất
phức tạp, mất nhiều thời gian và chi phí tốn kém. Chính vì thế, người ta đã đưa ra
khuyến cáo rằng các bệnh nhân có nguy cơ cao với hội chứng Lynch nên thực hiện
phương pháp tiền sàng lọc với phân tích MSI và hóa mô miễn dịch IHC. Khi đó,
các cá thể có khối u sẽ thể hiện mức độ bất ổn vi vệ tinh cao hoặc mất sự biểu hiện
của các protein MMR bằng IHC sau đó tiến hành xét nghiệm đột biến dòng mầm.
Nếu tuân thủ đúng việc sử dụng hướng tiếp cận từng bước này thì hầu hết các
trường hợp mắc hội chứng Lynch đều được phát hiện và cho độ tin cậy rất cao [29].
1.2.2.1. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, y học chưa
xác định rõ đâu là nguyên nhân chủ yếu. Người ta chỉ biết rằng, có một số nguyên
nhân khách quan khác ngoài yếu tố về tuổi tác hay yếu tố gia đình có tiền sử mắc
các bệnh về đại trực tràng liên quan đến HNPCC, đó là cách thức ăn uống cũng như
lối sống của chúng ta. Ăn quá nhiều chất béo, thịt, mỡ, thức ăn chứa nhiều

Cholesterol sẽ làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng. Hay ăn ít hoặc không
ăn các chất xơ như rau xanh, trái cây cũng là nguyên nhân dẫn tới sự hình thành
bệnh. Ngoài ra, những người thừa cân, béo phì cũng rất dễ mắc loại bệnh này.
Chính vì thế, để phòng tránh ung thư đại trực tràng, ngoài chế độ ăn uống hợp lý,
tăng cường các hoạt động thể dục, thể thao thì từ 50 tuổi trở đi, mỗi người nên tới
bác sĩ thăm khám định kỳ ít nhất 1 lần trong năm để kịp thời phát hiện những biến
đổi tiềm ẩn giúp phòng tránh ung thư đại trực tràng.
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
10
1.2.2.2. Triệu chứng biểu hiện ung thư đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng là căn bệnh có những triệu chứng ban đầu không rõ
rệt, nó có thể khởi phát ở bất cứ vị trí nào của đại trực tràng, từ phía trong ra phía
ngoài qua các lớp khác nhau của thành ruột. Ung thư ở mỗi vị trí sẽ có những biểu
hiện triệu chứng khác nhau và thông thường là có máu trong phân khi người bệnh đi
đại tiện. Đại đa số trường hợp, bệnh phát triển âm thầm qua nhiều năm. Sự phát
triển của nó tương đối chậm chạp nên người bệnh hoàn toàn không có một triệu
chứng nào cho đến khi ung thư phát triển đến giai đoạn cuối và lan tràn khắp nơi.
Có tới 95% các trường hợp ung thư đại tràng là loại ung thư tế bào tuyến được bắt
nguồn từ các tế bào thuộc lớp niêm mạc đại tràng.
Ở giai đoạn sớm, triệu chứng bệnh thường không rõ rệt, nhiều khi người
bệnh chỉ đau bụng nhẹ, cũng có khi bị trướng hay đầy bụng, đau tức vùng bụng
trước hoặc sau khi ăn. Tuy nhiên, triệu chứng được xem là có giá trị chẩn đoán bệnh
đó là đại tiện ra máu, nhất là ở những người ở độ tuổi khoảng 45 – 55 hay xảy ra
các rối loạn tiêu hóa như có ngày bị táo bón, có ngày lại đi lỏng kiểu tiêu chảy. 85%
bệnh nhân nhập viện trong tình trạng bị ung thư giai đoạn giữa hoặc đã chuyển sang
giai đoạn di căn.
Do tính chất nguy hiểm và tính phổ biến của bệnh nên những người trong độ
tuổi từ 45 – 55 cần đi kiểm tra, xét nghiệm định kỳ như thử phân, nội soi ruột già.
Ngoài ra, khi có những triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa như ăn không tiêu, táo

bón, đầy bụng hoặc tiêu chảy thì cần khẩn trương đi khám ngay. Khoảng 58% bệnh
nhân bị ung thư được phát hiện khi bệnh đã bước sang giai đoạn II và chuẩn bị sang
giai đoạn di căn. Trên 85% số bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng bị di căn và tử
vong do phát hiện bệnh chậm. Vì vậy, cần hết sức quan tâm đến những thay đổi của
hệ tiêu hóa, đặc biệt với những người trong gia đình có tiền sử về ung thư đại tràng
hay các bệnh ung thư liên quan thì việc thăm khám định kỳ là một việc làm rất cần
thiết.
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
11
1.2.2.3. Chẩn đoán lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng dạng HNPCC thường hình thành ung thư từ khi còn
khá trẻ, trung bình vào độ tuổi 40, có những trường hợp sớm hơn. Với các bệnh
nhân mang đột biến dòng mầm ở hội chứng này không những có nguy cơ cao phát
sinh bệnh ung thư mà còn làm tăng nguy cơ mắc một số bệnh ung thư khác như ung
thư nội mạc tử cung, dạ dày, buồng trứng, ruột non, gan, mật, đường tiết niệu trên,
não và da.
Việc chẩn đoán ung thư đại trực tràng di truyền có thể dựa trên cơ sở các tiêu
chuẩn lâm sàng Amsterdam hoặc các xét nghiệm di truyền phân tử các đột biến
dòng mầm trong hệ thống gen nhận biết và sửa chữa bazơ bắt cặp sai. Năm 1990,
tập đoàn hợp tác quốc tế về HNPCC đã thành lập các tiêu chí nhằm chẩn đoán lâm
sàng cho các gia đình mắc ung thư ruột già (gọi là tiêu chuẩn Amsterdam I) [31].
Tuy nhiên, các tiêu chí này về sau bị coi là quá hạn chế cho chẩn đoán lâm sàng các
bệnh ung thư khác có liên quan đến HNPCC và được sửa đổi thành tiêu chuẩn
Amsterdam II [32] được thể hiện qua Bảng 2.
Bảng 2: Tiêu chuẩn Amsterdam I và II trong chẩn đoán lâm sàng HNPCC
Tiêu chuẩn Amsterdam I
Tiêu chuẩn Amsterdam II
- Có tối thiểu ba người trong phả hệ
mắc ung thư đại tràng.

- Một người là trực hệ của một
trong hai người còn lại.
- Ít nhất có một người bị ung thư
đại tràng ở độ tuổi dưới 50.
- Có tối thiểu ba người trong phả hệ
mắc các bệnh ung thư liên quan đến
HNPCC.
- Một người là trực hệ của một trong
hai người còn lại.
- Ít nhất có một người bị các bệnh
ung thư liên quan đến HNPCC ở độ
tuổi dưới 50.
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
12
Độ chính xác của một chẩn đoán dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng phụ thuộc vào
tính chính xác của những số liệu báo cáo về lịch sử các gia đình nghiên cứu.
1.2.3. Cơ sở phân tử của ung thƣ đại trực tràng di truyền
Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh được xác định là di truyền
ngoài những nguyên nhân lối sống và tuổi tác. Do hội chứng này liên quan đến đột
biến xảy ra tại một trong các gen thuộc hệ thống nhận biết và sửa chữa các bazơ bắt
cặp sai MMR. Hiện nay, tính bất ổn vi vệ tinh MSI và cơ chế MMR được coi là cơ
sở phân tử giải thích sự hình thành ung thư đại trực tràng di truyền.
1.2.3.1. Tính bất ổn vi vệ tinh
Vi vệ tinh là các trình tự ADN ngắn (khoảng 1 – 4 nucleotide) lặp lại từ 10 –
100 lần, chúng phân bố rộng khắp hệ gen. Chính khả năng đột biến cao của các
trình tự vi vệ tinh là nguyên nhân khiến chúng trở nên có tính đa hình cao.
Nghiên cứu về cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng người ta đã tìm thấy
những biến đổi sôma về độ dài của các yếu tố lặp lại cao mà chúng ta gọi là các vi

vệ tinh. Khi những trình tự vi vệ tinh này bị biến đổi, chúng có thể liên quan đến
các khối u ở đoạn đầu đại trực tràng. Quan sát này đã cung cấp một sự kết nối giữa
các bất thường vi vệ tinh với sự hình thành ung thư đại trực tràng. Ngoài ra, trong
khi lập bản đồ di truyền, người ta cũng phát hiện ra các vùng bị mất tính dị hợp tử
LOH. Từ đó họ cũng đã phát hiện được các đột biến ở trình tự vi vệ tinh. Cùng với
nhiều nghiên cứu khác, sự bất ổn ở các trình tự vi vệ tinh được tìm thấy ở hầu hết
các bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng dạng HNPCC. Tuy nhiên, trong các khối
u phát hiện ở các bệnh nhân mắc HNPCC chỉ khoảng 15% chứa các bất ổn vi vệ
tinh. Mặc dù các bất ổn vi vệ tinh không có tác dụng lâm sàng, nhưng đó là dấu hiệu
cụ thể cho thấy hệ thống sửa chữa bắt cặp sai nhờ mạch ADN được methyl hóa bị
lỗi [4].
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
13
Vi vệ tinh là các trình tự ADN lặp lại phân bố rộng khắp hệ gen nên sự lặp
lại cao của các vi vệ tinh làm cho chúng thường bị đột biến do hiện tượng bắt cặp
nhầm bởi sự ngắt quãng sợi ADN (slippage) trong quá trình sao chép. Các đoạn lặp
1 nucleotide như A
n
hoặc G
n
và các đoạn lặp 2 nucleotide như (CA/GT)
n
thường bị
ảnh hưởng bởi sự ngắt quãng nhất. Chính sự ngắt quãng này gây nên sự bắt cặp sai
hoặc giảm bớt số lượng bazơ trong trình tự lặp lại. Phần lớn các bazơ bắt cặp sai
được sửa chữa bởi các cơ chế đọc sửa vốn có của phức hợp ADN-polymerazse sao
chép. Ở các tế bào bình thường, hầu hết các bazơ bắt cặp sai thoát khỏi quá trình
đọc sửa của phức hợp ADN-polymerase sao chép đều bị phân giải bởi MMR. Các
trình tự vi vệ tinh ở các tế bào sai hỏng về MMR dễ bị ảnh hưởng và có xu hướng

mở rộng hoặc thu ngắn trình tự vi vệ tinh từ thế hệ này sang thế hệ khác.
Tính bất ổn vi vệ tinh phản ánh tần số đột biến tăng, ảnh hưởng lên toàn bộ
hệ gen. Sự phát hiện MSI liên quan đến các sai hỏng MMR đã cung cấp một mấu
chốt quan trọng trong việc xác định các gen gây ung thư ruột già dạng HNPCC.
MSI được đánh giá như là mô hình đột biến giống với mô hình được phát hiện ở
nấm men và vi khuẩn mang các đột biến MMR [4].
Mặc dù tính bất ổn vi vệ tinh không có tác dụng trong chẩn đoán lâm sàng
ung thư ruột kết nhưng việc phát hiện ra MSI đã cung cấp một đầu mối khá quan
trọng trong việc xác định các gen liên quan đến ung thư đại trực tràng, đặc biệt là
các gen liên quan chặt đến hội chứng này như MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 [27],
[32].
1.2.3.2. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai
Trong quá trình sao chép ADN, khi xảy ra các sai hỏng, các bazơ bắt cặp sai
ngay lập tức được sửa chữa bằng phức hợp ADN-polymerase sao chép có chức
năng đọc sửa. Kết quả, lỗi của quá trình sao chép ADN theo thống kê chỉ là 10
-12

đến 10
-9
. Mức độ chính xác đáng kinh ngạc này cho thấy chỉ dưới 1% tế bào sẽ
mang bazơ bắt cặp sai trong một pha S hoàn chỉnh. Bên cạnh cơ chế sửa lỗi hoàn
Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Học viên Khóa 2010 – 2012 Nguyễn Thị Mai
14
chỉnh của ADN-polymerase, các bazơ bắt cặp sai trên mạch mới tổng hợp được xử
lý nhờ hệ thống MMR do mạch ADN mới chưa được methyl hóa. Rất hiếm trường
hợp các bazơ bắt cặp sai tránh được sự phát hiện của MMR trong quá trình sao chép
ADN [3].
Hệ thống MMR nhận ra
các bazơ bắt cặp sai trong quá

trình sao chép đồng thời cắt bỏ
các bazơ sai hỏng này và tiến
hành tổng hợp thay thế chúng. Ở
E. coli, giai đoạn đầu của MMR
liên quan đến 3 gen là mutS, mutL
và mutH mã hóa cho 3 protein
tương ứng là mutS, mutL và
mutH. Đầu tiên mutS ở dạng
dimer sẽ nhận biết và liên kết vào
bazơ bắt cặp sai. Sau đó hệ thống
sửa chữa nhận ra bazơ nào đúng,
bazơ nào sai tương ứng với mạch
nào làm khuôn và mạch nào được
tổng hợp mới để tiến hành sửa
chữa những sai hỏng đó [3].
Ở E. coli, hai mạch này được phân biệt bởi sự methyl hóa nucleotide A (gắn
gốc CH
3
) ở trình tự [GA
m
TC] (Hình 2). Trong quá trình sao chép, cả hai nucleotide
A trên cả hai mạch của phân tử ADN khuôn đều được sao chép. Nhưng khi sự sao
chép vừa kết thúc thì chỉ có nucleotide A trên mạch khuôn được methyl hóa còn
nucleotide A trên mạch được tổng hợp mới chưa được methyl hóa [4].
Lúc này mutS đã liên kết với bazơ bắt cặp sai sẽ tạo phức với mutL và mutH
ở dạng dimer để mang trình tự [GA
m
TC] chưa được methyl hóa ở vị trí bắt cặp sai.