nghiên cứu chuyển cấu trúc rnai chứa đoạn gen cpi của smw vào giống thuốc lá c9-1 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng virus

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM











-





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

- 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM











-



Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC






- 2014

i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

. Mọi trích dẫn trong luận văn
đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chƣa từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2014
Tác giả luận văn



Nguy

ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng
dẫn, chỉ bảo và tạo mọi đ .
- KTNN đã tạo điều
kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tậ .
.
.

-
- .

Tác giả luận văn

iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤC CÁC BẢNG


Trang
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro……………
22
Bảng 2.2. Thành phần đệm tách DNA tổng số……………………….
25

26
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen
CPi

26
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CPi
27
Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá…………………………
31

9-1…………………………………………………

33
















iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤC CÁC HÌNH


Trang
Hình 1.1. ấu trúc hệ gen của SMV
9
Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi

11
in vitro -
………………………………………

29
3.2. Các mảnh lá đƣợc ngâm trong dung dịch huyền phù vi
khuẩn A.tumefaciens , mảnh lá sau khi rửa khuẩn đƣợc cấy
trên môi trƣờng chọn lọc và các cụm chồi đƣợc tạo thành sau hai tuần
nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc……………………………………



31
, chồi màu xanh
đƣợc tách ra trên môi trƣờng chọn lọc và chồi cây chuyển gen sau 3
tuần trên môi trƣờng tạo rễ………… …………………………………


33
0
………………………………………………………….

34
Hình 3.5. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ các dòng thuốc lá
chuyển gen……………………………………………………………

35
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu
trúc pK7GW-SMV-CPi trong các cây thuốc lá chuyển
gen

36





v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

AS
Acetosyringone
A. tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
BAP
6-Benzyl Amino Purine
BGMV
Bean Golden Mosaic Virus
bp
Base pair (cặp base)
CP
Coat protein (protein vỏ)
cs
Cộng sự
ĐC
Đối chứng
EDTA

Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid
DNA
Deoxyribo Nucleic Acid
GA3
Gibberellic acid
GM
Môi trƣờng tạo chồi
hpRNA
Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc)
IhpRNA
Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron)
IBA
Indole-3butyric acid
Kb
Kilo base
LB
Luria and Bertani
MS
Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
PCR
Polymerase chain reaction

vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

RISC
RNA-inducing silencing complex
RM
Môi trƣờng ra rễ
RNA

Ribonucleic acid
RNAi
RNA interference
dsRNA
Double Stranded ribinucleic acid
mRNA
Messenger
siRNA
Short interfering RNA
SMV
Soybean mosaic virus
TAE
Tris Acetate EDTA
Taq
Thermus aquaticus
TMV
Tobacco Mosaic Virus
Ti- plasmid
Plasmid tạo khối u
Vir
Virulence Region
YEP
Yeast extract peptone

vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Trang
LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………….
i
LỜI CẢM ƠN
ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
iii
DANH MỤC CÁC HÌNH
iv
DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
v
MỤC LỤC
vii
MỞ ĐẦU……………………………………………………………
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………
3
1.1. BỆNH KHẢM DO SMV TRÊN CÂY ĐẬU TƢƠNG……
3
……
3
1.1.2. Bệnh khảm do virus trên cây đậu tƣơng
7

……………………
8
1.2. KỸ THUẬT RNAi
10
1.2.1. Cơ chế ức chế gen của RNAi
10
1.2.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo cây trồng chuyển gen kháng virus
12
1.3. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ
13
1.3.1. Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens……………………………………

13

16

18

viii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20

20
2.1.1. Vật liệu
20
2.1.2. Hóa chất
20

2.1.3. Thiết bị
20

21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
21
2.2.1. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua
Agrobacterium tumefaciens

21
2.2.2. Phƣơng pháp lây nhiễm và tạo cây thuôc lá chuyển gen
21
2.2.3. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen pK7GW-SMV-
CPi bằng phƣơng pháp PCR………………………………

24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
28
in vitro
……………………………………………

28
3.2. Kết quả chuyển cấu trúc pK7GW-SMV-CPi vào thuốc lá
29
3.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc
lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

35
……………………………………
39

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………
40



1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tƣơng [Glycine max (L.) Merrill] thuộc cây họ đậu (Fabaceae),
đây là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị dinh dƣỡng và kinh tế cao. Ở Việt
Nam, theo số liệu thống kê chính thức của Chính phủ, đậu tƣơng đƣợc trồng ở
28 tỉnh trên khắp cả nƣớc, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam.
Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện đậu tƣơng có vai trò
chữa và điều trị một số bệnh nan y nhƣ ung thƣ, đái tháo đƣờng, béo phì,
huyết áp cao, chảy máu não và tim mạch [4]. Tuy nhiên, hiện nay diện tích
trồng cây đậu tƣơng còn khá phân tán, năng suất đậu tƣơng giảm và chất
lƣợng chƣa ổn định bởi nhiều nguyên nhân đó là sâu bệnh , môi trƣờng,
chất lƣợng hạt giống, kĩ thuật canh tác. Đậu tƣơng là loại cây trồng dễ mẫn
cảm với nhiều tác nhân gây bệnh, trong đó có những bệnh do tác nhân là virus
gây ra. Bệnh khảm ở cây đậu tƣơng do Soybean mosaic virus (SMV) gây ra,
lần đầu tiên đƣợc ghi nhận tại Hoa Kỳ vào năm 1915 bởi Clinton (1916) và
đƣợc Gardner và Kendrick đặt tên năm 1921. Sau đó đƣợc tìm thấy ở Trung
Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Canada, Brazil, Úc và nhiều quốc gia khác.
SMV thuộc chi Potyvirus và có vật liệu di truyền là sợi RNA đơn
dƣơng [42]. SMV lây truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới. Sự lan truyền từ cây
bệnh sang cây khỏe do rệp ở ngoài đồng là chủ yếu, bệnh còn truyền qua hạt.
Bọ trĩ, rệp càng nhiều tỉ lệ nhiễm bệnh càng lớn. Hiện nay mới dừng lại ở biện
pháp phòng mà chƣa có thuốc trị. Phƣơng pháp chuyển gen để tạo ra cây

trồng kháng virus đƣợc xem là biện pháp có hiệu quả trong ngành chọn giống
cây trồng nói chung và chọn giống đậu tƣơng nói riêng.
Gần đây, RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống
lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật bởi nó là một quá trình sinh lý tự nhiên

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

tế bào. Cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều của
virus mục tiêu đƣợc sử dụng để chuyển vào cây, nó sẽ đƣợc biểu hiện thành
RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hpRNA) trong cây chuyển gen và kích thích cơ
chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Nhiều
giống cây trồng kháng đƣợc các loại bệnh virus khác nhau đã đƣợc tạo ra
bằng kỹ thuật chuyển gen .
Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV vào giống thuốc lá
C9-1 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng virus”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Chuyển đƣợc cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV vào giống
thuốc lá C9-1 và tạo đƣợc cây chuyển gen .
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tái tổ hợp vào mảnh lá của
giống thuốc lá C9-1;
(2) Tái sinh và tạo cây thuốc lá ;
(3) Phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển trong cây chuyển
gen bằng kỹ thuật PCR.

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. BỆNH KHẢM DO SMV TRÊN CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.1.1. Nguồn gốc
Đậu tƣơng có tên khoa học Glycine max (L) Merrill là một trong những
loài cây trồng đƣợc biết đến từ rất sớm. Các bằng chứng về lịch sử, địa lí và
khảo cổ học đều chỉ ra rằng đậu tƣơng có nguồn gốc từ Trung Quốc. Đậu
tƣơng đƣợc thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở Trung quốc vào khoảng
thế kỉ 17 trƣớc công nguyên. Sau đó, nó đƣợc truyền bá sang Nhật Bản vào
khoảng thế kỉ thứ 8, du nhập vào nhiều nƣớc châu Á khác nhƣ Indonesia,
Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam…vài thế kỉ sau đó. Ngày nay, Hoa Kì là quốc gia
sản xuất đậu tƣơng hàng đầu thế giới, chiếm 50% sản lƣợng trên toàn thế giới,
tiếp theo các nƣớc Trung Quốc, Ấn Độ…[43].
Đậu tƣơng là cây trồng thuộc bộ Đậu Fabales, họ đậu Fabaceae, họ
phụ cánh bƣớm Papilionoideae, chi Glycine. Có nhiều hệ thống phân loại
khác nhau, trong đó hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự
phân bố địa lý và số lƣợng nhiễm sắc thể do Hymowit và Newell (1984) xây
dựng đƣợc xây dựng rộng rãi. Theo cách phân loại này thì ngoài chi glycine
còn có chi phụ Soja. Chi glycine đƣợc chia thành 7 loài hoang dại lâu năm,
chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài đậu trồng Glycine max (L) Merrill [6].
Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng đã lâu đời, từ thế kỷ 13 Lê Quý
Đôn đã ghi trong “Vân đài loại ngữ” là cây đậu tƣơng đƣợc trồng ở một số
tỉnh vùng Đông Bắc, miền Bắc nƣớc ta [4], [6]. Mặc dù, đƣợc trồng từ rất
sớm nhƣng chỉ trong vài chục năm gần đây đậu tƣơng mới đƣợc quan tâm,
phát triển và ngày nay nó đƣợc xem là một giống cây trồng có giá trị dinh

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

dƣỡng cao, chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế. Nhƣng diện tích
trồng và sản lƣợng chƣa cao so với các nƣớc trên thế giới.
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merril) là cây hai lá mầm, thân thảo.
Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoặc màu tím, khi
về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa
sau này. Nếu thân có màu xanh, hoa sẽ có màu trắng, nếu thân có màu tím thì
sau hoa sẽ có màu tím đỏ. Chiều cao của thân từ 0,3 - 1m. Khác với những
cây trồng khác thân cây đậu tƣơng phát triển mạnh nhất lại chính vào lúc cây
ra hoa rộ nhất. Đây là lúc mà giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng và sinh trƣởng
sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến khủng hoảng dinh dƣỡng. Vì vậy, trồng
trọt cần chú ý cung cấp đầy đủ dinh dƣỡng cho cây trƣớc khi chúng bƣớc vào
giai đoạn này [6].
Cây đậu tƣơng có 3 loại lá là lá mầm, lá nguyên và lá kép. Lá mầm (lá
tử diệp) khi mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì
chuyển sang màu xanh. Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dƣỡng nuôi
cây mầm, cho nên khi trồng đậu tƣơng nên làm đất tơi nhỏ và chọn hạt to cây
sẽ mọc khoẻ, sinh trƣởng tốt. Lá nguyên (lá đơn) xuất hiện sau khi cây mọc từ
2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau. Lá đơn to màu
xanh bóng là biểu hiện cây sinh trƣởng tốt. Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của
một giống có khả năng chịu rét. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh
trƣởng không bình thƣờng. Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá kép
mọc so le thƣờng có màu xanh tƣơi khi già biến thành màu vàng nâu. Lá có
nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu
hạn khoẻ nhƣng thƣờng cho năng suất thấp. Những giống lá to chống chịu
hạn kém nhƣng thƣờng cho năng suất cao hơn. Nếu 2 lá kép đầu to và dày
thƣờng biểu hiện giống có khả năng chống chịu rét [6].

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hoa của đậu tƣơng đƣợc phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân.
Hoa đậu tƣơng mọc thành từng chùm, mỗi chùm thƣờng có 3-5 hoa. Hoa
lƣỡng tính nên đậu tƣơng là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn là rất thấp chỉ
chiếm 0,5 – 1%. Thời gian bắt đầu ra hoa s m hay muộn, dài hay ngắn phụ
thuộc vào từng giống đậu tƣơng. Căn cứ vào phƣơng thức ra hoa ngƣời ta
chia đậu tƣơng ra làm 2 nhóm: nhóm ra hoa hữu hạn, hƣớng ra hoa từ trên
xuống dƣới và từ ngoài vào trong và nhóm ra hoa vô hạn, hƣớng ra hoa từ
dƣới lên trên và từ trong ra ngoài [6].
Quả đậu tƣơng thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2-7cm. Mỗi quả thƣờng có
2-3 hạt. Hạt đậu tƣơng có hình tròn hoặc bầu dục, giồng có hạt vàng có giá
trị thƣơng phẩm cao. Khối lƣợng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 – 200g.
Hình dạng và màu sắc của rốn hạt đặc trƣng cho mỗi giống [6].
Bộ rễ đậu tƣơng gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần,
đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt
sần có thể dài 1cm, đƣờng kính 5 – 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng
sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều ở
tầng đất có độ sâu từ 0 – 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm
từ nito không khí, với lƣợng đạm cung cấp cho cây khoảng 30 – 60kg/ha [6].
Chu kì sống của cây đậu tƣơng đƣợc chia ra 5 giai đ phát triển là
giai đoạn nảy mầm – cây con; giai đoạn sinh trƣởng thân, lá; giai đoạn ra hoa;
giai đoạn hình thành quả, hạt và giai đoạn chín [6].
Giai đoạn nảy mầm – cây con đƣợc tính từ khi gieo hạt giống xuống
đất, hạt hút ẩm trƣơng lên, rễ mọc ra, thân vƣơn lên đội hai lá mầm lên khỏi
mặt đất, lá mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân chính. Trong
giai đoạn này cây con chủ yếu sống dựa vào nguồn chất dinh dƣỡng dự trữ ở
hai lá mầm, đến khi hết chất dinh dƣỡng các lá mầm này chuyển dần sang

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

màu vàng rồi rụng và đồng thời cùng lúc đó mà bộ rễ phát triển đủ khả năng
hút nƣớc và chất dinh dƣỡng để nuôi cây. Giai đoạn này dài hay ngắn tùy
thuộc ở điều kiện ngoại cảnh. Nếu gieo vào vụ hè thì giai đoạn này ngắn hơn
giai đoạn ở vụ đông. Thông thƣờng thời gian này khoảng 15 – 20 ngày sau
khi gieo. Thời kì này chính là thời kì quyết định mật độ của cây con cũng nhƣ
sức sinh trƣởng của cây đậu tƣơng sau này.
Kể từ khi cây con ra đƣợc 1 – 2 lá kép thì bắt đầu giai đoạn sinh trƣởng
của thân và lá kéo dài tới khi cây bắt đầu ra hoa. Thời kỳ đầu của giai đoạn
này cây con sinh trƣởng rất chậm, trong khi đó rễ của nó lại phát triển nhanh
cả về chiều sâu lẫn chiều ngang, các nốt sần đƣợc hình thành và phát triển,
mở đầu cho hoạt động cố định đạm khí trời để cung cấp cho cây. Đến thời kì
cây chuẩn bị ra nụ, ra hoa thì tốc độ sinh trƣởng của cây tăng lên nhanh.
Chính lúc này là mấu chốt để tạo ra thân cây to, mập, các đốt ngắn. Giai đoạn
này dài hay ngắn cũng tùy thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện ngoại cảnh,
nhƣng nói chung vào khoảng 20 – 40 ngày.
Khác với một số cây khác là cây đậu tƣơng khi đã ra hoa thì các bộ
phận khác nhƣ rễ, thân, lá vẫn tiếp tục sinh trƣởng và phát triển. Giai đoạn
này sinh trƣởng dài hay ngắn tùy thuộc vào đặc tính của giống là chín sớm
hay muộn. Thời kì này cây đậu tƣơng rất mẫn cảm với điều kiện khí hậu thời
tiết bất thuận nhƣ mƣa to, gió lớn, khô, nóng, lúc đó mặc dù số hoa của mỗi
cây có rất nhiều nhƣng kết quả cuối cùng là số hoa đƣợc thụ phấn và kết quả
sẽ rất ít, vì thông thƣờng 75% số hoa thƣờng bị rụng.
Quả đậu tƣơng đầu tiên đƣợc hình thành trong vòng 7–8 ngày kể từ lúc
hoa nở. Trong điều kiện bình thƣờng sau khoảng 3 tuần lễ là quả phát triển
đầy đủ. Lúc các chùm quả non đã xuất hiện thì các chất dinh dƣỡng trong lá
đƣợc vận chuyển về nuôi hạt làm cho hạt nảy mầm. Vào thời kì này sự sinh

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

trƣởng của cây chậm lại dần. Các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm trong giai đoạn này
sẽ có tác động rất lớn đến tốc độ phát triển của quả và hạt.
Khi hạt đã phát triển đạt đến kích thƣớc tối đa, các khoang hạt đã kín,
quả đã đủ mẩy thì cây ngừng sinh trƣởng. Khi các hạt đã rắn dần và đạt đến
độ chín sinh lý vỏ hạt có màu sắc đặc trƣng của giống, còn vỏ quả thì chuyển
dần sang màu vàng, vàng tro, xám, lá của cây cũng chuyển dần sang úa vàng
và rụng dần. Hàm lƣợng dầu trong hạt đƣợc ổn định sớm vào thời kì hạt đang
phát triển nhƣng hàm lƣợng protein thì vẫn còn chịu ảnh hƣởng của điều kiện
dinh dƣỡng của cây cho đến cuối thời kì của quá trình chín.
Dựa vào thời gian sinh trƣởng, đậu tƣơng đƣợc chia làm các loại: chín
rất sớm: thu hoạch sau 80 – 90 ngày, chín sớm thu hoạch sau 90 – 100 ngày,
chín trung bình thu hoạch sau 100 – 110 ngày, chín muộn trung bình cho thu
hoạch sau 110 – 120 ngày, chín muộn cho thu hoạch sau 130 – 140 ngày, chín
rất muộn cho thu hoạch sau 140 – 150 ngày. Thời gian sinh trƣởng của mỗi
giống đƣợc đánh giá theo từng vùng và vụ trồng nhất định do thời gian sinh
trƣởng của nó chịu ảnh hƣởng nhiều bởi thời gian chiếu sáng và nhiệt độ [6].
1.1.2. Bệnh khảm do virus trên cây đậu tƣơng
Bệnh khảm là một trong những bệnh xuất hiện và gây thiệt hại ở nhiều
nơi trồng đậu tƣơng trên thế giới và đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những
năm đầu của thập niên 1900. Triệu chứng bệnh: khi bị bệnh lá bị mất màu,
loang lổ giống nhƣ tấm khảm, lá nhỏ lại, phát triển không đều, bìa lá cong
xuống làm lá biến dạng. Phiến lá bị xếp nếp nhăn nhúm, có màu loang lỗ xanh
nhạt và xanh đậm, thƣờng dày hơn lá bình thƣờng. Các triệu chứng ở trên lá
này gần giống với triệu chứng khi đậu tƣơng bị ngộ độc thuốc diệt cỏ 2,4 D.
Cây lùn do các lóng thân phát triển kém. Do đó, quả và hạt phát triển chậm
lại, nhất là các quả ở phần trên của cây. Hạt nhỏ và vỏ hạt bị biến đổi thành

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

màu nâu nhạt và đậm không đều, từ tễ hạt lan ra, có vị đắng. Từ đó làm giảm
năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng. Triệu chứng bệnh biểu hiện rõ ở 18,5
o
C. Ở
nhiệt độ cao trên 30
o
C bệnh không biểu hiện triệu chứng ra ngoài [23].
SMV lan truyền qua rệp vừng, bọ trĩ và hạt giống bị nhiễm bệnh. Rệp
có thể lây lan từ cây này sang cây khác là do chúng ăn. Trên 30 loài rệp
truyền virus SMV trên toàn thế giới. Nghiên cứu gần đây đã khẳng định rệp
vừng ở đậu tƣơng (Aphis Glycine) là vector của virus khảm đậu tƣơng.
Rệp càng nhiều thì tỉ lệ nhiễm bệnh càng cao. Vậy cách hiệu quả nhất kiểm
soát bệnh là tạo ra giống đậu tƣơng kháng virus SMV nhằm nâng cao năng
suất và chất lƣợng đậu tƣơng.
1.1.3. Virus gây bệnh khảm đậu tƣơng
1.1.3.1. Hệ gen của SMV
Soybean mosaic virus (SMV) thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae gây
bệnh khảm lá đậu tƣơng. Virus SMV phổ biến nhất và đang gây thiệt hại
nghiêm trọng, không thể kiểm soát đƣợc ở nhiều vùng đậu tƣơng ở Việt Nam
và trên thế giới [37]. Thiệt hại về năng suất có thể lên đến 8-50% trong điều
kiện tự nhiên [23], cá biệt lên tới 100% [28]. Mức độ của bệnh tùy thuộc vào
giống và khí hậu. Bệnh xuất hiện khá sớm (vào 4 tuần sau khi gieo) và biểu
hiện rõ nhất là giai đoạn ra hoa. SMV tƣơng đối ổn định ở mức pH = 6 và mất
tính lây nhiễm ở giá trị 4<pH<9.
SMV bao gồm một lớp vỏ hình sợi mềm đó là các phân tử protein đƣợc
bố trí đối xứng xoắn ốc xung quanh sợi RNA, với chiều dài và chiều rộng là:

650-760nm và 15-18nm. Hệ gen của SMV gồm các gen trên RNA sợi đơn, có
kích thƣớc khoảng 10,4kb. Thành phần bộ gen bao gồm 24,3%G; 29,9%A;
14,9%C và 30,9%U [22]. Phân lập và giải trình tự nucleotide của 45
dòng SMV cho thấy có tất cả 7 chủng G1-G7 và các gen có kích thƣớc

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

khoảng 9600 nucleotide [25]. Có một loại protein (VPg) nối hệ gen của virus
vào đầu 5’ và poly (A) liên kết vào đầu 3’.
Hệ gen của virus SMV gồm các gen mã hóa cho 3066 amino acid, gồm
10 chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1) là protein đầu tiên, Helper component
proteinase (HC-pro) là các thành phần trợ giúp hoặc là proteinase, Protein P3
(P3), 6 Kda protein 1 (6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI) bao gồm
protein hình trụ, 6 Kda protein 2 (6K2), Viral genome-linked protein
(VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B
(NIb), Coat protein (CP) (Jayaram và cs). Cấu trúc hệ gen của SMV đƣợc
thể hiện hình 1.1.



Hình 1.1. ấu trúc hệ gen của SMV
cơ sở trình tự gen của SMV chủng G2 và G7
theo Jayaram và cs, 1992 .
CP là protein vỏ của virus, C1 là protein hình trụ; HC-Pro là thành phần trợ
giúp và protease; NIb là RNA polymerase phụ thuộc RNA; P1, P3, và NIa là
protease; VPg là protein liên kết; PolyA: đuôi polyA; protein 6K1, 6K2:

Theo nghiên cứu trình tự gen CP mã hóa cho protein vỏ của SMV
thông qua hai chủng SMV-G1 và SMV-G6 của tác giả Qusus (1997). Sau khi

hoàn chỉnh trình tự nucleotide của gen CP cho thấy gen CP của cả 2 chủng
này phù hợp với trình tự gen CP của 2 chủng SMV-G2 và SMV-G7[25]. Kết
quả đọc trình tự gen CP cho thấy, sản phẩm gen tách dòng từ 2 chủng virus


10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

SMV-G1 và SMV-G6 đều có kích thƣớc 798 nucleotide, mã hóa cho 265
amino acid.
Protein CP của Potyviruses đã tham gia vào một số chức năng sinh học,
với chức năng chính là giữ hình dạng virus ổn định và bảo vệ RNA. Ngoài ra
protein CP còn tham gia tƣơng tác với tế bào thực vật (vật chủ)
[15][16][17][21].
1.2. KỸ THUẬT RNAi
1.2.1. Cơ chế ức chế gen của RNAi
RNAi là cơ chế để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu
hóa hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Mỹ là Andrew Fire
và Craig Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày
19/12/1998. Khám phá cũng báo hiệu sự khởi đầu của một lĩnh vực nghiên
cứu mới. Fire và Mello đã vinh dự nhận giải thƣởng Nobel về Y học và sinh lí
học vào năm 2006 cho phát minh quan trọng này. Cơ chế này đƣợc kích hoạt
khi các phân tử ARN kép (dsRNA) xuất hiện trong tế bào. Khi đó chuỗi
dsRNA kích hoạt “cỗ máy” sinh hoá, làm suy biến các phân tử mRNA đƣợc
sao mã di truyền từ DNA không biểu hiện đƣợc chức năng giải mã, cho ra
chuỗi protein tƣơng ứng. Đặc biệt, can thiệp RNA với chuỗi dsRNA ngắn trực
tiếp có thể thực hiện trong các tế bào động vật có vú mà không gây nên các
hiệu ứng không đặc hiệu.

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên










Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi

Các phần tử quan trọng tham dự vào cơ chế can thiệp RNA này là
Dicer và Argonaute và những RNA kích thƣớc nhỏ (siRNA) đƣợc tạo ra từ
RNA sợi đôi (ds RNA). Khi có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tế
bào, Dicer lập tức cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn,
khoảng 21-28 nucleotides, gọi là siRNA. Sau khi bị cắt ngắn bởi Dicer, chuỗi
kép RNA can thiệp đƣợc tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn
RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất đƣợc chọn để tiếp
tục liên kết với Argonaute. Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA này xảy ra
trong phức hệ RISC (RNA-induced silencing complex), trong đó có chứa
Argounaute và Helicase. Phức hệ RISC sau đó thu nhận các phân tử phiên mã
mRNA của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn
RNA can thiệp lúc này đang có mặt trong phức hệ RISC. Sau khi nhận dạng
mRNA qua việc bắt cặp các bases tƣơng đồng với trình tự của siRNA, mRNA

12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA. Phức hệ RISC sẽ cắt
mRNA, làm phân cắt phân tử mRNA.
Dựa vào hoạt động của cơ chế RNAi, có thể tiến hành thiết kế các
vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng ức chế hoạt động của
gen ngoại lai, nhằm tạo giống cây chuyển gen kháng bệnh virus. Vector mang
gen là đoạn cDNA có nguồn gốc từ RNA của virus. Chúng đƣợc đƣa vào tế
bào vật chủ để khi virus xâm nhiễm, các đoạn cDNA này sẽ bắt cặp bổ sung
và cắt phân tử mRNA của virus thành những siRNA dẫn tới không tổng hợp
đƣợc protein và không biểu hiện bệnh.
1.2.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo cây trồng chuyển gen kháng virus
Gần đây, RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại nhằm chống lại các
bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế
hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại
virus ở thực vật [18]. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây
trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hoá protein vỏ CP,
enzyme phiên mã RdRp ) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc
chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại
virus khác nhau nhƣ: Potato virus Y PVY [38][33] cucumber mosaic virus
CMV, Plum pox potyvirus PPV [19] Tobaco mosaic virus TMV và Potato
virus Y PVY [35],
Cho đến nay, đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus
đƣợc công nhận nhƣ: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya
ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc,
Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus,
Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công nhận
và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus,

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

đƣợc công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây
trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để
đƣợc công nhận là giống cây trồng thƣơng mại nhƣ: Sắn chuyển gen kháng
African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize
steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus
Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus
(Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus);
Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus).
Năm 2007, Bonfim và cs đã tạo ra đƣợc một dòng cây đậu chuyển gen kháng
virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Lim và
cs (2007) nghiên cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tƣơng đã nhận thấy
rằng, cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau 2 tuần triệu chứng nhiễm
bệnh khảm lá do SMV biến mất và lƣợng SMV đã giảm đáng kể, tuy nhiên
HC-Pro của SMV đã gây biến đổi hình thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây
đậu tƣơng chuyển gen.
Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hƣớng ứng dụng kỹ
thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus
gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do
Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên
ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây
chuyển gen kháng virus [8]
các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus
khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên.
1.3. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ
Chuyển gen là biện pháp công nghệ đƣợc ứng dụng để tạo dòng thuốc lá
kháng virus. Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tƣơng đối đơn giản và thời gian

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trên những nghiên cứu về
chuyển gen các nhà khoa học thƣờng chọn cây thuốc lá là cây mô hình. Vì
vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá đã đƣợc tiến hành khá
sớm. Cây thuốc lá chuyển gen kháng diệt cỏ đƣợc tiến hành tại Mỹ và Pháp
năm 1986. Cây thuốc lá là đối tƣợng chuyển gen kháng sâu đầu tiên vào năm
1987 [20]. gen kháng
kanamycine vào mô thuốc lá N. tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens [3]
cho đến nay, phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium
tumefaciens đã đƣợc ứng dụng phổ biến và thành công đối với cây thuốc lá.
Theo Somers và cộng sự (2003), có ba yêu cầu chính để tạo nên một hệ
thống chuyển gen hiệu quả [34]: (i) một nguồn tế bào tổng năng có tác dụng
tiếp nhận DNA cung cấp; (ii) các hệ thống đƣa DNA vào các tế bào đích; (iii)
một hệ thống để lựa chọn hoặc nhận biết tế bào chuyển gen.
1.3.1. Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) là loài vi khuẩn đất, có
khả năng chuyển một đoạn DNA từ Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) vào
tế bào thực vật. Ti plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trong
lƣợng phân tử bằng 3-5% so với trọng lƣợng phân tử của nhiễm sắc thể vi
khuẩn. Ti plasmid có kích thƣớc khoảng 200kb, trong tế bào chúng tồn tại
nhƣ một đơn vị sao chép độc lập gồm 4 vùng tƣơng đồng: A, B, C và D. Để
khai thác và sử dụng A. tumefaciens nhƣ là một vector chuyển gen các nhà
khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của Ti plasmid
và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ
phải và bờ trái của Ti plaismid và các gen vir. Gen chuyển đƣợc xen vào giữa

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

các vùng bờ của Ti plasmid. Nó sẽ đƣợc chuyển vào tế bào và trở nên hợp
nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật.
Các vector dùng trong chuyển gen thông qua A. tumefaciens là: vector
liên hợp và vector nhị thể, hai loại vector này đang đƣợc sử dụng rất có hiệu
quả. Hệ vector nhị thể đặc trƣng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần
riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA. Khắc phục tình trạng khó nhân bản
trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể đƣợc thiết kế bao gồm các phần nhƣ
sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E.
coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động đƣợc ở cả vi khuẩn và
thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (nhƣ oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi
chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp; v)
Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc
phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác nhƣ đoạn kích thích vận
chuyển T – DNA .
Quá trình chuyển DNA vào thực vật
Đoạn T- DNA muốn đƣợc chuyển, trƣớc tiên nó phải đƣợc hoạt hoá.
Chính hoạt động của các gen vir đóng vai trò này. Hiện tƣợng này xảy ra khi
A. tumefaciens bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol đƣợc tiết ra từ vết
thƣơng của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy hay protoplast. Đầu tiên là sự hoạt
động của các sản phẩm đƣợc tạo ra từ gen virA. Potein này nằm ở màng trong
của tế bào A. tumefaciens, đóng vai trò nhƣ một chất thụ cảm đối với
acetosyringon có trong môi trƣờng. Tín hiệu này sẽ đƣợc truyền dẫn qua sự
hoạt hoá gen virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gen chỉ huy nằm sát gen
khởi động thuộc các gen vir khác nhau. Bằng cách nhƣ vậy, protein của gen
virG đã đƣợc hoạt hoá làm tăng quá trình hoạt hoá của chính nó đồng thời làm
giảm quá trình này của các operon B, C, D và E. Trong tiến trình chuyển T-