Bài thuyết trình Tiểu luận môn Hóa sinh ứng dụng: Sinh tổng hợp kháng sinh Streptomycin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
KHOA KHTN & CN
BÀI TIỂU LUẬN
MÔN: HÓA SINH ỨNG DỤNG
NHÓM 1
1. Nguyễn Đình Thư
2. Nguyễn Thị Dung
3. Nguyễn Thị Trinh
4. Nguyễn Thị Hạnh
5. Nguyễn Thị Thùy Trinh
6. Nguyễn Thị Thanh Huyền
7. Nguyễn Khả Thị Giang
8. Lê Thị Huyền Trang
9. Trương Thị Hồng Oanh
10. Đỗ Thúy Kiều
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH STREPTOMYCIN
1. Khái quát
1. Khái quát
2. Lên men sản xuất
2. Lên men sản xuất
3. Tách chiết và tinh sạch
3. Tách chiết và tinh sạch
4. Ứng dụng
4. Ứng dụng
STREPTOMYCIN
1. Khái quát

Kháng sinh là các chất có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật.

Streptomycin là một kháng sinh dùng phổ biến trong y học, thú y và
bảo vệ thực vật.

Nguồn gốc: Streptomyces griseus (Actinomyces streptomycin)
Thuộc nhóm aminoglycosid, ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn
Phổ rộng, ức chế cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)
Phân lập: 19/10/1943 bởi Albert Schatz
1.1. Streptomycin
D-glucose-6P
1L-myo-inositol-1P
Myo-inositol
Scyllo-inosose
Scyllo-inosamine
Amidino-Scyllo-inosamine-4P
Scyllo-inosamine-4P
Amidino-3-keto-Scyllo-inosamine
Amidino-Scyllo-inosamine
Amidinostreptamine-6P
Amidinostreptamine
Dihydrostreptomycin-6P
Streptidine-6P
D- Glucose-1P
dTDP-glucose
dTDP-4-oxo-6-deoxy-D-Glucose
dTDP-4-oxo-L-rhamnose
dTDP-L-rhamnose
dTDP-L-dihydro-streptose
Butirosin and neomycin
biosynthesis
Polyketide sugar unit biosynthesis
O-1,4-α-L-dihydro-streptosyl-streptidine-6P
Streptomycin-6P
streptomycin

Aminoglycosides
NDP-N-methyl-L-glucosamine
D - glucose
Sơ đồ sinh tổng hợp streptomycin
1.2. Xác định hoạt tính kháng sinh của streptomycin
Theo phương pháp của Loo, Y.H. et al., (1945) và Waksman S.A (1945) bằng phương pháp khuyếch tán trên
thạch.

Môi trường khoáng: pH = 7,3

Trước khi xác định bổ sung thạch 1,5%, glucose 0,5% đã thanh trùng bằng phương pháp lọc và 1ml dung
dịch muối vào môi trường thạch nóng chảy sau khi làm lạnh xuống 55
o
C. Sau đó lắc đều và đổ 30ml môi
trường vào đĩa peptri vô trùng(φ= 100mm) và để đông lại. Độ dày của môi trường thạch 2,0± 0.2mm.

Vi sinh vật kiểm định được sử dụng là E.coli. Giống ban đầu được bảo quản trong môi trường thạch
nghiêng ở 4
o
C.
Thành ph nầ KH
2
PO
4
K
2
HPO
4
NaCl (NH
4

)
2
SO
4
% 0,32 0,42 0,2 0,2
1.2. Xác định hoạt tính kháng sinh của streptomycin

Sau khi đục lỗ thạch, nhỏ dung dịch streptomycin cần xác định đã pha loãng đến
nồng độ thích hợp vào lỗ thạch và xác định theo phương pháp của Dmitrieva,
1970.

Đối chứng sử dụng kháng sinh streptomycin base chuẩn.

1 đơn vị streptomycin tương đương 0,97mcg streptomycin base.
2. Lên men sản xuất streptomycin
2.1. Chủng giống sản xuất

Xạ khuẩn Streptomyces griseus
2.2 Môi trường và điều kiện lên men

Môi trường: phải phù hợp với điều kiện nơi sản xuất và điều kiện phát triển của chủng giống.

pH= 7,2

Môi trường lên men được cấy 5% thể tích môi trương nhân giống sau 48h.

Nhiệt độ lên men tối ưu là 28
o
C và thời gian lên men là 5-10 ngày.
Thành ph n ầ Cao th tị Pepton Glucose NaCl

( g) 3 5 10 5
Thành
ph nầ
Dextrose Cao th t- peptonị NaCl Kali phosphat Amon
sunphat
MgSO
4
.7H
2
O CaCO
3
(g) 10 1 5 1 2,5 0,25 3,5
Nhân giống
Nhân giống
•
Cấy bào tử vào môi trường nhân giống trong bình tam giác, lắc 180 – 220 vòng 26 –
28
o
C/30-70 giờ.
•
Cho vào nồi nhân giống (có sục khí và khuấy) 20 – 40 giờ
•
Cấy bào tử vào môi trường nhân giống trong bình tam giác, lắc 180 – 220 vòng 26 –
28
o
C/30-70 giờ.
•
Cho vào nồi nhân giống (có sục khí và khuấy) 20 – 40 giờ
Lên men
2 pha

Lên men
2 pha
•
26 – 28
o
C/96 giờ.
•
Lượng khí thổi qua môi trường: 1 thể tích/1 thể tích môi trường/ 1 phút.
•
pH đạt cực đại sau 96 – 120 giờ lên men
•
26 – 28
o
C/96 giờ.
•
Lượng khí thổi qua môi trường: 1 thể tích/1 thể tích môi trường/ 1 phút.
•
pH đạt cực đại sau 96 – 120 giờ lên men
Các giai đoạn lên men
Pha1
•
Các bào tử nảy chồi và mọc thành sợi sau 6-8h
•
Mỗi bào tử mọc một chồi, khuẩn ty thường mọc thẳng
và phân nhánh rất yếu, tế bào chất kiềm
Pha1
•
Các bào tử nảy chồi và mọc thành sợi sau 6-8h
•
Mỗi bào tử mọc một chồi, khuẩn ty thường mọc thẳng

và phân nhánh rất yếu, tế bào chất kiềm
Pha 2
•
Khuẩn ty không phát triển
•
Cuối ngày thứ ba sợi xạ khuẩn bị chia nhỏ và bắt dầu
tự phân
Pha 2
•
Khuẩn ty không phát triển
•
Cuối ngày thứ ba sợi xạ khuẩn bị chia nhỏ và bắt dầu
tự phân
2.3. Quá trình lên men sản xuất
Phương pháp lên men: nuôi cấy chìm gồm 2 pha
3. Tách chiết và tinh sạch
3.1. Tách chiết bằng dung môi
 Điều chế streptomycin sunphat
100l dịch lên men + 250g than hoạt tính, khuấy trộn 30 phút
Sản phẩm là bột màu trắng có 600đv/ml, hiệu suất thu hồi 60%, độ sạch đạt 400đv/mg
Lọc ép khung bản với 2000g bột trợ lọc diatomit, rửa bằng 10l nước
Hỗn hợp dịch lọc với dịch rủa được trung hòa đến pH=7 bằng NaOH và khuấy với 1000g than hoạt tính trong 30 phút
Than hoạt tính chứa streptomycin lọc ép với bột trợ diatomit và rửa sạch 2 lần với 10l nước
Tách Streptomycin ra khỏi than hoạt tính bằng 3,5l aceton (5-10%) đã acid hóa đến pH=2,5 bằng H
2
SO
4
Dịch streptomycin được khuấy với 3 lần thể tích (28,5l) aceton để rửa streptomycin sunphat
Ướp lạnh ở 4
o

C để qua đêm, thu kết tủa bằng cách gạn và lọc
Rửa = 250ml nước cất, lọc loại bỏ chất không hòa tan, tiếp tục trung hòa bằng NaOH đến pH=7, lọc loại bỏ chất không hòa tan
Dịch streptomycin sunphat sạch được đông và cô chân không ở 200 đến 600psi
Điều chế streptomycin hydrochlorid

Quá trình điều chế tương tự như streptomycin sunphat nhưng thay HCl trong quá trình acid hóa.

Streptomycin hòa tan trong aceton và tủa với aceton 75%.

Năng suất thu nhận tốt hơn khi kết tủa với aceton 80%.

HCl bổ sung để duy trì pH = 2 trong khi khuấy được tiếp tục trong 60 phút.

Than hoạt tính được lọc qua phễu lọc Buchner và rửa bằng aceton đã acid hóa.

Dung dịch tách chiết và dịch rửa đã được điều chỉnh pH = 7,7 bằng NaOH và cô đặc chân không đến còn 1/10 thể tích.

Bổ sung 4 lần thể tích aceton để kết tủa streptomycin hydrochlorid.

Hỗn hợp được làm lạnh qua đêm, lọc thu nhận kết tủa, hòa tan vào nước, đông lạnh và sấy khô chân không.

Streptomycin hydrochlorid thu được là dạng bột hơi với năng suất thu được 43,5%
Điều chế streptomycin hydrochlorid

Streptomycin hydrochlorid cũng được tạo ra từ streptomycin sunphat bằng cách cho 1g streptomycin
sunphat (632000đv) hòa tan trong 7ml nước, pH = 3,2.

Dung dịch CaCl
2
(100ml) đã được bổ sung nhỏ giọt với khuấy liên tục đến một điểm kết tủa và kết tủa

được loại bỏ bằng cách ly tâm và rửa sạch.

Dịch lọc nhận được được làm lạnh đông và sấy khô. Streptomycin hydrochlorid thu được là 905mg bột
màu trắng với hoạt tính là 590đv/mg, hiệu suất đạt 84% từ streptomycin sunphat.
Dịch lên men
Dịch lên men
Thu hoạch
Thu hoạch
Lọc
Lọc
Pha loãng
Pha loãng
Qua cột
nhụa
Qua cột
nhụa
Loại bỏ tạp
chất
Loại bỏ tạp
chất
Streptomycin
sunphat tinh khiết
Streptomycin
sunphat tinh khiết
Cô đặc chân
không
Cô đặc chân
không
Sấy khô
Sấy khô

3.2. Tách chiết bằng phương pháp trao đổi ion
4. Ứng dụng

Là kháng sinh đầu tiên và đứng đầu trong nhóm aminoglycosid điều trị bệnh lao.

Streptomycin được dùng trong điều trị bệnh tularemia, dịch hạch.

Phối hợp với tetracyclin trong điều trị bệnh Brucella và phối hợp với tetracyclin hoặc sulfonamid để điều trị bệnh sổ
mũi ngựa (nhiễm khuẩn Mallomyces mallei).

Dùng đơn độc hoặc phối hợp với các thuốc chống nhiễm khuẩn khác để điều trị u hạch bẹn và da cam, lậu.

Phối hợp với penicilin G hoặc ampicilin thường có hiệu quả trong điều trị viêm màng trong tim do Enterococcus và
Strepxococcus.

Streptomycin sunphat hấp thu từ ruột kém nên thường được sử dụng ở dạng tiêm.

Liều bình thường là 0,5 – 1,0g/ngày.

Tác dụng phụ: ảnh hưởng thính giác bài tiết, gây độc cho thính gác của thai nhi và tê liệt thần kinh cơ, khả năng gây
độc ở trẻ em cao hơn ở người lớn.
Cảm ơn THẦY và các bạn đã lắng nghe!