Mô tả đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến của phổi

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi (UTP) hay ung thư biểu mô phế quản là u ác tính phát sinh
từ phế quản, tiểu phế quản tận, phế nang hoặc từ các tuyến phế quản. Đây là
một loại ung thư gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước trên thế giới. Số các
trường hợp UTP đã gia tăng nhanh chóng trong những năm gần đây. Năm
2002, ước tính số mắc UTP trên toàn thế giới khoảng 1,35 triệu trường hợp,
chiếm 12,4% tổng số các loại ung thư. Ung thư phổi không còn là bệnh chủ
yếu ở nam giới như những năm 1930 -1950 mà hiện nay cũng là bệnh chủ yếu
ở nữ giới do tỷ lệ hút thuốc ở phụ nữ có xu hướng gia tăng (3). Ở Việt Nam,
tuy chưa có thống kê đầy đủ, nhưng những số liệu trong các báo cáo đã cho
thấy UTP ngày ngày càng tăng. Bệnh thường xảy ra ở người trên 40 tuổi, hơn
80% bệnh nhân UTP có tiền sử hút thuốc lá, UTP là loại ung thư có độ ác tính
cao, tiến triển nhanh, tiên lượng xấu (2).
Theo nhiều nghiên cứu đã công bố trên thế giới , Ung thư biểu mô tuyến
(UTBMT) là một trong 4 týp UTP thường gặp nhất, chiếm 30% UTP, đặc biệt
tăng nhanh ở nữ giới. Trước đây, UTBM vảy là týp UTP hay gặp nhất. Tuy
nhiên, từ khoảng thập niên 80 của thế kỷ 20 tỷ lệ UTBM vảy đã giảm xuống
rõ rệt và hiện nay, UTBMT vươn lên vị trí hàng đầu. Mặc dù UTBMT đã biết
đến từ rất lâu, đã hiện diện trong phân loại mô học UTP ngay từ những phõn
loại đầu tiên công bố trên y văn thế giới, song bản chất bệnh học của nó cũn
đang được nghiên cứu. Týp mô bệnh học (MBH) của UTBMT rất đa dạng và
phức tạp vỡ nú có nhiều phân typ nhỏ, có thể nhầm lẫn. Vì vậy, việc nghiên
cứu đặc điểm MBH cũng như biến đổi gen của UTBMT phổi có ý nghĩa rất
quan trọng trong chẩn đoán xác định và đánh giá tiên lượng bệnh.
Một trong những gen đang được nghiên cứu sõu trong những năm gần
đõy đó là gen ức chế thụ thể yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal growth
1
factor receptor – EGFR). Mục đích nghiên cứu gen này là tỡm ra thuốc ức chế
phát triển biểu mô.
Bộc lộ quá mức gen EGFR ở các khối u nói chung liên quan đến hậu quả
xấu trờn lâm sàng. Các thuốc ức chế EGFR – Tirosine Kinase đã được chứng

minh hiệu quả trong điều trị những bệnh nhõn (BN) UTP không tế bào nhỏ đã
thất bại với hoá trị trước đó. [3]
Tại Việt Nam đã có nhiều tác giả nghiên cứu đặc điểm lõm sàng, mô bệnh
học ung thư phổi. Tuy nhiên theo hiểu biết của chúng tôi chưa thấy tác giả
nào đi sõu nghiên cứu riêng mô học ung thư biểu mô tuyến, đặc biệt là mức
độ bộc lộ EGFR của týp này. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này
nhằm mục đích:
1. Mô tả đặc điểm mô bệnh học UTBMT của phổi
2. Xác định tần xuất bộc lộ yếu tố phát triển biểu mô và mối liên quan với
cỏc phõn týp mô học UTBMT phổi.
2
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ ĐĂC ĐIỂM MÔ HỌC CỦA PHỔI
1.1.1. Mô học chung
Phổi là cơ quan nội tạng, nằm trong lồng ngực nhưng lại mở thông với
môi trường bên ngoài để đảm nhiệm chức năng trao đổi khí. Bởi vậy, phổi có
cấu tạo khá phức tạp.
- Khí quản: Đi từ thanh quản tới chỗ chia đôi của nó trong trung thất, dài
khoảng 10-12 cm, nửa trên nằm ở vùng cổ, nửa dưới nằm trong trung thất.
- Phế quản gốc: Được tính từ nơi phân chia của khí quản đến rốn của mỗi
phổi.
- Cây phế quản: Mỗi phế quản gốc khi đến phổi sẽ chia nhánh nhỏ dần đi
vào trong phổi, cỏc nhỏnh chia từ phế quản gốc được gọi là cây phế quản.
Nhánh nhỏ nhất của phần dẫn khí trong tiểu thuỳ gọi là tiểu phế quản tận. Mỗi
tiểu phế quản tận chia đôi thành thành hai tiểu phế quản hô hấp. Mỗi tiểu phế
quản hô hấp lại phân chia thành 2-10 ống phế nang. Ống phế nang là đoạn
ống mà thành của chúng cú cỏc phế nang độc lập đứng cạnh nhau và các phế
nang kết thành chùm.
- Cấu tạo mô học: cấu tạo của thành các phế quản không hoàn toàn

giống nhau trong suốt chiều dài cây phế quản. Tuy nhiên, các phế quản từ lớn
đến nhỏ đều có cấu tạo đại cương giống nhau. Thành phế quản từ trong ra
ngoài gồm 4 lớp:
* Niêm mạc: Gồm có lớp biểu mô trụ giả tầng có lông chuyển. Các
phế quản lớn có cấu trúc giống khí quản.
* Lớp đệm được tạo bởi mô liên kết thưa.
3
* Lớp cơ trơn được gọi là cơ Reissessen.
* Lớp sụn và tuyến: Các mảnh sụn bé dần theo đường kính phế quản
và mất khi đường kính phế quản < 1mm. Các tuyến phế quản thuộc loại tuyến
nhày và tuyến pha. Các tiểu phế quản có biểu mô phủ loại trụ đơn có lông
chuyển nhưng ở đoạn cuối lại là biểu mụ vuụng đơn có hoặc không có lông
chuyển. Tiểu phế quản tận cũng có biểu mô phủ là biểu mụ vuụng đơn. Tiểu
phế quản hô hấp có biểu mô phủ là biểu mụ vuụng đơn tựa trên màng đáy,
gồm các tế bào có lông chuyển, tế bào Clara. Các phế nang được lót bởi lớp
biểu mô rất mỏng được gọi là biểu mô hô hấp. Biểu mô hô hấp lợp vách phế
nang gồm hai loại: Tế bào phế nang loại I (chiếm đa số, hình dẹt) và tế bào
phế nang loại II ( tế bào này lớn hơn loại I, cú hỡnh cầu). Vách phế nang có
một mạng lưới mao mạch dày đặc. Trong vách gian phế nang cũn cú một số tế
bào mà số lượng của nó phụ thuộc vào tuổi tác cũng như sự mỏng đi của
thành phế nang (tế bào chứa mỡ, đại thực bào bụi)
1.1.2. Các loại tế bào chủ yếu.
Tế bào có lông có ở cỏc vỏch phế quản và tiểu phế quản; tế bào hình đài
có nhiều ở các phế quản lớn, cú ớt ở tiểu phế quản; tế bào đáy có nhiều ở phế
quản, ít gặp ở tiểu phế quản; tế bào Kulchitsky có nhiều ở phế quản hiếm gặp
ở tiểu phế quản; tế bào vảy ở phế quản và tiểu phế quản; tế bào lớn ưa axit ở
tuyến dưới niêm mạc; tế bào Clara chủ yếu ở tiểu phế quản; tế bào phế nang
loại I có ở phế nang; tế bào phế nang loại II có ở phế nang.
Một số tế bào khác ở phổi: tế bào nội mô, tế bào quanh mạch, tế bào xơ,
đại thực bào, dưỡng bào lymphụ bào, tế bào trung tâm biểu mô ở màng phổi,

tế bào sụn, tế bào cơ trơn, tế bào thần kinh ngoại vi và các tế bào cơ biểu mô.
Chính sự phong phú về nguồn gốc của các loại tế bào ở phổi đã tạo nên hình
ảnh đa dạng và phong phú về các u của phổi, đặc biệt là các týp UTBM.
4
1.2. PHÂN LOẠI Mễ BỆNH HỌC UTP
1.2.1. Một số phân loại mô bệnh hoc UTP
Donald L. Morton ( 1998 ) đó nhận xột rất chính xác rằng: “UTP đang
tăng lên một cách đều đặn và thay đổi nhanh so với một số ung thư khỏc”.
Cùng với sự thay đổi về hình thái học, sự ra đời của các kỹ thuật HMMD,
sinh học phân tử, nuôi cấy tế bào đã làm thay đổi rất nhiều cách nhìn nhận của
chúng ta về UTP. Đú chớnh là lý do của nhiều phân loại MBH UTP đã được
công bố từ đầu thế kỷ trước đến nay . Năm 1924, lần đầu tiên trên y văn,
Marchesani ở viện giải phẫu bệnh Innbraok dựa trên nghiên cứu mô học của
26 trường hợp UTP, ụng đó đề nghị một phân loại MBH UTP với 4 typ sau:
UTBM tế bào đáy, UTBM đa hình , UTBM vảy sừng hoá, UTBM tuyến tế
bào trụ . Bảng phân loại này đã được chấp nhận trong vòng 25 năm (2).
Tại Anh , năm 1926, qua kết quả nghiên cứu MBH UTP, Barnard kết
luận: “Cái gọi là sacụm tế bào lúa mạch của trung thất sau thực chất là một
UTBM tuỷ của phế quản”. Trong mô tả và ảnh minh hoạ, ông nhấn mạnh tới
các đặc điểm của các tế bào lúa mạch nhỏ nhưng cũng cho thấy các u này
chứa các tế bào “đa diện” và “hỡnh thoi”, cả hai loại đó đều to hơn chính tế
bào lúa mạch. Barnard cũng đã mô tả sự hình thành “cỏc ống nhỏ được lót bởi
các tế bào trụ và khối” trong typ ung thư này [3]. Cũng năm đó ở Đức, Brandt
cũng nêu ý kiến tương tự về nguồn gốc tế bào nhỏ trong khi Saupe Schmorl
chấp nhận quan điểm của Riesel đó nờu từ trước là u các tế bào nhỏ của thợ
mỏ Schnecberg là các UTBMT thực sự. Tính đa hình của typ UTBMT này về
sau đã được xác nhận và thảo luận rộng rãi và theo quan điểm hiện nay đõy
chớnh là týp UTBM tế bào nhỏ tổ hợp.
Warren W.H và cộng sự (1985) dựa vào các kết quả nghiên cứu về
HMMD, hoá miễn dịch tế bào, siêu cấu trúc, nuôi cấy tế bào, đã đề nghị một

5
phân loại mới về một số u của phổi dựa trên các công trình nghiên cứu sâu
của họ về u thần kinh nội tiết của phổi như sau [3]:
- U carcinoid
- Ung thư TKNT rất biệt hoá
- Ung thư TKNT ít biệt hoá
- Ung thư TKNT tế bào nhỏ và các týp khác của TKNT bao gồm:
+ UTBM tế bào lớn typ TKNT
+ UTBM tế bào nhỏ hỗn hợp tế bào lớn
+ UTBM tế bào nhỏ tổ hợp
Năm 1985, nhóm tác giả Teplitz R.L, Paladugu R.R, Benfield J.R, Pak
H.Y, Ross P.K cũng đã đề nghị áp dụng một phân loại mới cho các khối u
carcinoid điển hình và không điển hình .
Vào những năm 80 của thế kỷ 20 bắt đầu xuất hiện quan niệm chia
UTP thành 2 nhóm lớn: UTBM tế bào nhỏ và UTBM tế bào không nhỏ.
Năm 2003, Debra Hawes, Clive R.Taylor, Richard J.Cote đã đưa ra
một phân loại các UTBM TKNT như sau :
Typ u Tên cũ Biến thể mô học
UTBM
TKNT biệt
hoá tốt
U cacxinoit Dạng cơ quan; Thể bè; vi
nang (giả hoa hồng); Giả
tuyến; Nhú; Tế bào hình
thoi; tế bào lớn ưa axit với
xương và sụn
UTBM
TKNT biệt
hoá vừa
Uccxinoit không điển hình Dạng cơ quan với ổ hoại

tử
Lan toả là chủ yếu
Tế bào hình thoi
UTBM
TKNT không
biệt hoá
UTBMTBN Không biệt hoá
UTBMTBN typ tế bào lúa mạch
UTBMTBN typ tế bào trung
gian
UTBMTBN typ hỗn hợp tế bào
nhỏ và lớn
UTBMTBN thần kinh nội
tiết
UTBMTBN thần kinh nội
tiết hỗn hợp tế bào nhỏ/ tế
bào lớn
Tế bào lớn TKNT
6
UTBMTBN tổ hợp
Tế bào lớn TKNT
Năm 1967 ở Gờneve xuất bản một bộ sách Phân loại một bộ sách
“Phõn loại mô học các u của phổi” . Năm 1981 cuốn sách này được tái bản
lần thứ 2, có thay đổi và sửa chữa .
Tuy nhiên, do tính phức tạp mặt về vi thể nên trong vòng 30 năm qua,
đó cú khoảng 40 bảng phân loại khác nhau được công bố trên y văn, trong đó
quan trọng nhất và cũng phổ biến nhất là 3 phân loại MBH các u phổi vào các
năm 1967, 1981, 1999 của TCYTTG. Phân loại mô học các u phổi lần 3 của
TCYTTG có nhiều điểm khác biệt với các phân loại trước đó. Riêng týp
UTBMT có bổ sung thứ týp hỗn hợp và 5 biến thể [3].

PHÂN LOẠI MBH CÁC UTBM PHỔI CỦA
TCYTTG(1999) [38]
Týp mô học Mã hình thái học
1.Ung thư biểu mô tế bào vảy
Biến thể
8070/3
Nhú. 8052/3
Tế bào sáng 8084/3
Tế bào nhỏ 8073/3
Dạng đáy 8083/3
II.Ung thư biểu mô tế bào nhỏ
Biến thể
8041/3
Ung thư biểu mô tể bào nhỏ tổ hợp 8045/3
III.Ung thư biểu mô tuyến 8140/3
Chùm nang 8550/3
Nhú 8269/3
UTBM tiểu phế quản phế nang 8250/3
+ Không chế nhày 8252/3
+ Chế nhày 8253/3
+ Týp hỗn hợp nhầy và không nhày hay týp tế bào
trung gian
8254/3
7
Ung thư biểu mô tuyến đặc với chất nhày 8230/3
UTBMT với các thứ nhóm hỗn hợp 8255/3
Biến thể
UTBM tuyến thai biệt hoá cao 8333/3
UTBM tuyến nhày “ dạng keo” 8480/3
UTBM tuyến nang nhày 8470/3

UTBM tuyến tế bào nhẫn 8490/3
UTBM tuyến tế bào sáng 8310/3
IV.UTBM tế bào lớn
Biến thể
8012/3
UTBM thần kinh nội tiết tế bào lớn 8013/3
UTBM thần kinh nội tiết tế bào lớn tổ hợp
UTBM dạng đáy 8123/3
UTBM dạng u lympho biểu mô 8083/3
UTBM tế bào sáng 8310/3
UTBM tế bào lớn với phenotyp hình gậy 8014/3
V.UTBM tuyến vảy 8560/3
VI.UTBM với các phần tử đa hình sarcoma hay dạng
sarcoma
UTBM có tế bào hình thoi/ hoặc khổng lồ 8030/3
+ UTBM đa hình 8022/3
+ UTBM tế bào hình thoi 8032/3
+ UTBM tế bào khổng lồ 8031/3
UTBM sarcoma 8098/3
U nguyên bào phổi 8972/3
Các loại u khác
VII.U carcinoit 8240/3
Carcinoit điển hình 8240/3
Carcinoit không điển hình 8249/3
VIII.UTBM tuyến nước bọt
UTBM dạng biểu bì nhầy 8430/3
UTBM nang dạng tuyến 8200/3
Các loại khác
IX.UTBM không xếp loại 8010/3
Bên cạnh các phân loại mô học về toàn bộ các u của phế quản – phổi,

cũng có những phân loại mang tớnh chuyờn sõu về mọi nhóm hoặc một týp u
8
riêng biệt. Dựa trên các tiến bộ về hoỏ mụ miễn dịch, hoá miễn dịch tế bào,
siêu cấu trúc và nuôi cấy tế bào, Warren W.H và cộng sự ( 1985 ), đã đề nghị
một phân loại mới về u thần kinh nội tiết của phổi như sau [3]:
- U carcinoid
- UTBM thần kinh nội tiết rất biệt hoá
- UTBM thần kinh nội tiết ít biệt hoá
- UTBM thần kinh nội tiết týp tế bào nhỏ và các týp khác của u thần
kinh nội tiết bao gồm:
+UTBM tế bào lớn
+UTBM tế bào nhỏ cùng với tế bào lớn
+UTBM tế bào nhỏ hỗn hợp
9
1.2.2. Đặc điểm MBH các phõn týp và các biến thể của UTBMT của phổi
1.2.2.1. Chùm nang
Mô u được tạo bởi cỏc túi tuyến và ống thường được cấu tạo bởi các tế
bào chế nhầy giống các tế bào biểu mô tuyến phế quản hay biểu mụ lút phế
quản. Các cấu trúc nang hoặc ống tuyến chiếm ưu thế cú kốm hay không kốm
cỏc vựng nhỳ hay đặc.
1.2.2.2.Nhú
U cú các cấu trúc nhú chiếm ưu thế và thay thế cấu trúc phế nang
nằm dưới và xâm lấn nhu mô phổi. Tế bào u có hoặc không chế nhày, hình
khối hoặc trụ thấp, đôi khi là hình chốt phủ lên cỏc lừi liên kết, thay thế các tế
bào lút vỏch phế nang và hình thành những nhỏnh nhỳ bậc 2, bậc 3 phức tạp
1.2.2.3.Tiểu phế quản phế nang
Đây là UTBM có một mẫu u tiểu phế quản phế nang thuần khiết và
không có bằng chứng xâm nhập mô đệm mạch hay màng phổi. Typ này được
chia thành ba nhóm:
a. Không chế nhày: các tế bào Clara hay tế bào typ II phát triển dọc theo

vách phế nang, không xâm lấn mô đệm.
b. Chế nhày: bào u dạng trụ cao với lượng chất nhày thay đổi trong bào
tương, nhân lệch về phía đáy, tế bào u phát triển dọc cỏc vỏch phế nang,
không xâm nhập mô đệm. Các khoảng phế nang thường lấp đầy chất nhày.
c. Loại hỗn hợp chế nhày và không chế nhày hoặc typ tế bào trung gian
1.2.2.4.UTBMT đặc với chất nhày
UTBMT không có cỏc tỳi tuyến, ống nhỏ và nhú, nhưng thường xuyên có
tế bào u chứa chất nhầy. Nhân tế bào thường to, hạt nhân nổi rõ, lượng bào
tương thay đổi.
10
1.2.2.5.UTBMT hỗn hợp
Cấu trúc mô u cho thấy các mẫu chùm nang, nhú hay đặc hoặc tiểu phế
quản phế nang pha trộn vào nhau và không có mẫu nào ở dạng thuần khiết.
Các mẫu hay gặp là mẫu chùm nang với tuyến đặc.
1.2.2.6.Các biến thể:
a. UTBMT thai biệt hoá cao.
b. UTBMT nhầy “dạng keo”: Tế bào u nổi trờn cỏc mảng chất nhày và
thường gõy gión cỏc phế nang.
c. UTBMT nang nhầy: Hình ảnh điển hình là một UTBMT nang có sinh
rất nhiều chất nhày
d. UTBMT tế bào nhẫn: Giống UTBMT chế nhày tế bào nhẫn ở dạ dày
ruột. Các tế bào u có bào tương sáng, căng phồng, nhân dẹt và lệch về một
phía.
e. UTBMT tế bào sáng: Các mẫu u có thể là tuyến đặc, tuyến nhú hoặc hỗn
hợp với các tế bào u hình đa diện, hoặc hơi tròn, có bào tương sáng
1.3. CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA EGFR
1.3.1. Cấu trúc của EGFR
EGFR là một glycoprotein bề mặt màng, trọng lượng phân tử 170
kDaltons, (kDa), gồm một vùng gắn kết các phối tử nằm ngoài màng tế bào,
một vựng xuyờn màng đặc hiệu và một vùng trong tế bào với vai trò kích

thích sự tăng sinh, biệt hoá của tế vào bình thường và các tế bào ác tính . Khi
phối tử là yếu tố phát triển biểu mô (Epidermal Growth Factor: EGF) gắn với
EGFR sẽ gây nên sự phân cực thụ thể và sự tự phosphoryl hoỏ vựng cú hoạt
tính enzym của thụ thể. Điều này khởi đầu cho một loạt phản ứng tế bào dẫn
đến sự tăng sinh và tiến triển ác tính của khối u: tăng sinh mạch máu, di căn
và ức chế quá trình chết theo chương trình (apotosis) [1].
11
Các phối tử của EGFR là gia đình protein EGF gồm tám thành viờn bao
gồm Epidermal growth factor (EGF), Transformin growth factor (TGFα),
Epiregulins (ER), heparin binding EGF like growth factor (HB – EGF),
Epigen (EPGN, EPG), Amphiregulin (AR), Betacellulin (BTC) và
Neuregulins 1-4 EGF là chuỗi đơn acid polypeptid có 53 acid amin có chứa
ba liên kết disulfua nội phân tử để đảm bảo cấu trúc bậc ba của phân tử EGF.
Đặc tính quan trọng của EGF chính là truyền vào trong tế bào các tín hiệu từ
ngoài tế bào thông qua việc kết nối với các EGFR.
Phần ngoài màng của EGFR có trọng lượng khoảng 100 kDa có hai vùng
giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử EGF. Vựng xuyờn màng trọng
lượng nhỏ, chỉ 3 kDa, tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng. Phần
trong tế bào trọng lượng khoảng 60 kDa là protein kinase với đuôi tận cùng
carboxyl nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hoá của EGFR. Cấu trúc phần
ngoài màng của các thành viên trong gia đình EGFR giống nhau khoảng từ 36
– 40%, phần xuyên màng khoảng 60 – 82%, trong khi phần trong màng của
các thành viên gia đình EGFR chỉ giống nhau khoảng 24-32%.
Có 4 thành viên trong gia đình EGFR: HER1 (EGFr, ErbB1), HER2
(neu, ErbB2), HER3 (ErbB3), và HER4 (ErbB4). ErbB receptor ở dạng cặp
đôi với chính nó hay với ErbB khác (ErbB2) khi gắn kết với các phối tử EGF,
chúng hoạt hoá phần trong bào tương của EGFR, mang các gốc phosphat của
tyrosin kinase bằng các phản ứng tự phosphoryl hoá. Phần tyrosin kinase này
được hoạt hoá, kết quả làm phân cực để lộ các gốc phosphat, bằng cách đó
làm tăng hoạt tính vùng tyrosin kinase của EGFR. Phản ứng tự phosphoryl

hoá để lộ những vị trí gắn kết với các protein tín hiệu trong để bào và hoạt
hoỏ cỏc con đường tín hiệu. ErbB1 thành viên đầu tiên của EGFR, tăng biểu
lộ ở nhiều dòng tế bào biểu mô cả bình thường và ác tính. Chỉ riêng EGFr
được hoạt hoá khi gắn kết với EGF hoặc TGFα [1].
12
1.3.2. Chức năng của EGFR
Các EGFR đều có phần để liên kết ngoài màng, phần xuyên màng và
phần trong bào tương có hoạt tính tyrosin kinase. Phần ngoài màng, vùng III
(domain III) chính là cùng để gắn kết các yếu tố hoạt hoá hay ức chế các thụ
thể, để dẫn truyền tín hiệu vào trong tế bào làm tế bào có thể phát triển bình
thường hoặc trở nên ác tính. Vùng IV chính là phần xuyên màng của EGFR.
Phần trong bào tương, đầu tận carboxy chính là phần đáp ứng trả lời hoạt tính
tyrosin kinase và điều hoà chức năng tyrosin kinase. Phản ứng tự phosphoryl
hoá của tyrosin kinase xảy ra ở vùng này nó đóng vai trò chớnh trong điều
hoà sự phát triển tăng sinh của tế bào. Khi vắng mặt các phối tử (ví dụ GF,
TGF…), vùng tyrosin kinase không phosphoryl hoỏ, chỳng ở dạng đơn phân
và vùng kinase không hoạt động. Vùng tyrosin kinase trở nên hoạt hoá khi
phối tử gắn với vùng ngoại bào kết quả làm phân cực để lộ các gốc phosphat
và tự phosphoryl hoá tyrosin điều hoá trong vòng hoạt hoá của kinase. Sau
khi hoạt hoá, việc tự phosphoryl hoá để lộ những vị trí gắn kết các protein tín
hiệu và hoạt hoỏ cỏc con đường tín hiệu [1].
Các đột biến phầm ngoài mang EGFRvIII được nghiên cứu nhiều nhất vì
chính sự đột biến của vùng này làm cho không có sự gắn các phối tử truyền
tín hiệu vào trong nhân thông qua các EGFR. Sự tăng biểu hiện EGFRvIII
hay gặp trong các khối u ác tính của hệ thống thần kinh, ung thư vú, ung thư
buồng trứng . Đột biến xảy ra là kết quả của sự sắp xếp lại gen sao chép bị đột
biến từ exon 2-7 gồm 801bp. Các thụ thể này thiếu từ acid amin 6-273, hoàn
toàn thiếu hụt ở phần ngoài tế bào của EGFR và đây cũng là phần chính của
EGFR để liên kết với các phối tử. Tại vùng này các glycin luân phiên kết nối
với nhau chèn vào các vị trí của acid amin cấu trúc EGFR, chính vì thế mà

không xảy ra sự sao chép từ acid amin -273. EGFRvIII khác EGFRvI ở chỗ,
EGFRvI làm thay đổi liên kết của thụ thể với các phối tử còn EGFRvIII làm
13
vùng liên kết với phối tử bị mất hoàn toàn. Chính vì vậy EGFRvIII kích thích
tăng sinh và tăng phát triển khối u ác tính không phụ thuộc tương tác của các
phối tư. Phản ứng tự phosphoryl của thụ thể TK ở EGFRvIII thấp hơn EGFR
thể tự nhiên (wildtypEGFR: wtEGFR). Vì thế, hoạt tính các phối tử TK trong
tế bào của EGFRvIII khác khi so với hoạt tính các phối tử wtEGFR.
EGFRvIII bền vững và hiện diện trên bề mặt tế bào hơn là phần trong tế bào
của thụ thể.
Đột biến cấu trúc phần trong bào tương EGFR ít thấy hơn vùng cấu trúc
phần ngoài màng. Chưa có nghiên cứu nào thấy sự đột biến xảy ra tại vựng cú
hoạt tính tyrosin kinase trong tế bào của thụ thể EGF [1].
1.4. CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN EGFR.
1.4.1. Kỹ thuật hoá mô miễn dịch (HMMD)
Kỹ thuật HMMD đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Đây là bước
đột phá trong nghiên cứu bệnh học phân tử góp phần định tính hoặc bán định
lượng các phân tử kháng nguyên. Kỹ thuật này là phương pháp áp dụng các
nguyên lý và kỹ thuật miễn dịch để nghiên cứu tế bào và mô. Dựa trên sự biểu
lộ mang tính đặc hiệu kháng nguyên trên bề mặt tế bào hay tại khu vực gian
bào, các kháng thể đặc hiệu sẽ giúp cho việc nhận ra và phân loại các tế bào
hay mụ trờn cỏc lát cắt tổ chức.
Phương pháp sử dụng phức hợp avidin – biotin được hầu hết cỏc phũng
xét nghiệm hoá miễn dịch sử dụng trong nghiên cứu tế bào và mô. Với kỹ
thuật này, ái lực cao của avidin đối với biotin được sử dụng để gắn chất đánh
dấu peroxidase.
14
B
B
é

é
c l
c l
é
é
–
–
KÕt h
KÕt h
î
î
p
p
–
–
KhuyÕch
KhuyÕch
®¹
®¹
i
i
Kh
Kh
¸
¸
ng th
ng th
Ó
Ó
II

II
g
g
¾
¾
n biotin
n biotin
Kh
Kh
¸
¸
ng th
ng th
Ó
Ó
I
I
Kh
Kh
¸
¸
ng nguy
ng nguy
ª
ª
n
n
Biotin
Biotin
Avidin

Avidin
Men
Men
B
B
Ö
Ö
nh ph
nh ph
È
È
m
m
®
®
î
î
c c
c c
è
è
®
®
Þnh formol
Þnh formol
Các bước cơ bản của kỹ thuật miễn dịch enzym
Biotin – avidin
1.4.2. Kỹ thuật sinh học phân tử.
1.4.2.1. Xác định nồng độ, độ sạch RNA, cDNA bằng phương pháp quang phổ kế.
Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử

ngoại ở bước sóng 260 nm của các purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở
bước sóng 260 nm (OD
260 nm
– Optical Densit
260 nm
) của các mẫu đo cho phép
xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào tương quan sau:
Một đơn vị OD
260 nm
tương ứng với nồng độ là:
- 50 g/ ml cho một dung dịch DNA sợi đôi.
- 40 .ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn.
Tuy nhiên, cỏch tớnh này chỉ đỳng vúi cỏc dung dịch acid nucleic sach.
Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm
(OD
280 nm
). Các protein có mức hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, nhưng
cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các acid nucleic. Do đó, làm
sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleic. Một dung dịch acid nucleic đạt
15
tiêu chuẩn về độ sạch ( không tạp nhiễm protein) khi tỷ số OD
260 nm
/ OD
280
nằm trong khoảng 1,8 – 2 [2], [17].
Các mẫu RNA và c DNA trong nghiên cứu được pha loãng ở nồng độ
100 lần và tiến hành đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm.
1.4.3. Phương pháp điện di acid nucleic.
Nguyên lý của phương pháp điện di: dựa vào các đặc tính cấu trúc của
các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mẳt

nên khi chịu tác động của một điện trường, di chuyển về cực dương.
Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tuỷ thuộc
kích thước trung bình của các phân đoạn acid nucleic cần phân tích. Gel
agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tích những đoạn có
kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel được đổ trên một thể giá nằm
ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Các acid nucleic
trong gel agarose sẽ hiện hình ( dưới dạng những vạch màu đỏ cam) dưới tia
tử ngoại (UV) với sự có mặt của ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn
xen vào giữa các base của acid nucleic và sẽ phát huỳnh quang dưới tác
dụng của tia tử ngoại.
Quy trình điện trên gel agarose như sau:
+ Điện di trên agarose 2%: 8µl sản phẩm PCR được trộn với 2µl đệm
tra mẫu.
+ Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 110V, trong khoảng thời gian từ 20
-30 phút.
+ Chụp ảnh và phân tích kết quả điện di đồ trên hệ thống máy
Chemidoc EQ – Bio – Rad (URA).
16
1.4.4. Kỹ thuật RT – PCR tổng hợp cDNA
1.4.4.1. Tổng hợp cDNA sử dụng phương pháp MMLV – RT
Những mẫu RNA đạt được nồng độ tối ưu có độ tinh sạch dao đọng từ
1,8 -2 sẽ được sử dụng để tổng hợp c DNA.
Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Sử dụng 4 -5 µg RNA tổng số, thêm nước khử DEPC cho đủ 6 µl/l ống.
Để ở nhiệt đoj 65
0
C trong vòng 5 phút. Sau đó, đặc trong đá lạnh 1 phút.
Bước 2: Giai đoạn gắn mồi (annealing)
Thêm 2 µl random pimer (5 pmol/ µl) và 5 µl dNTP
s

(2.5 mM).
Để ở nhiệt độ 25
0
C trong vòng 10 phút. Sau đó, đặt trờn đỏ một phút.
Bước 3: Giai đoạn tổng hợp cDNA (extention).
thêm vào 7µl/ ống hỗn hợp sau: 4µl 5 x first strand PCR buffer; 1µl DTT
(ức chế protein); 1µl HPRI (ức chế Rnase); 1µl MMLV –RT (enzym tổng
hợp). Để ở nhiệt độ 37-
0
C trong 55 phút và 70
0
c trong 15 phút 4
0
C ~ . cDNA
được giữ ở nhiệt độ – 20
0
C cho đến khi sử dụng cho PCR.
1.4.4.2. PCR.
Sau khi tổng hợp cDNA, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR bán định
lượng để đánh giá mức độ sao chép HIP và EGFR.
Nguyên tắc của phản ứng PCR: Dựa vào hoạt tính của các DNA
polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA
khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt
của những mồi xuôi và mồi ngượi có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự
DNA khuôn. Phản ứng PCR là mọt chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu
kỳ gồm ba bước như sau:
Bước 1: Giai đoạn biến tính. Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao
hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 95
0
C – 95

0
C trong vòng
30 giây đến 1 phút.
17
Bước 2: Giai đoạn bắt cặp. Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt
cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40
0
C đến 70
0
C, tuỳ thuộc Tm của các
mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Bước 3: Giai đoạn tổng hợp này kéo dài. Nhiệt độ được tăng lên 72
0
C để
cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth
polymerase, Pfu polymerase…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời giain phụ
thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây
đến nhiều phút.
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA
ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi
AND mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm các DNA khuôn cho sự tổng
hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR
là đoạn DNA chuỗi đụi cú chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi,
và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5
’
của hai
đoạn gen mồi [2], [85].
Cặp mồi đặc hiệu với HIP, EGFR và GAPDH có trình tự như sau:
HIP –F: 5
’

– GCT TAT GGT GCA GAC ATGG – 3
’
HIP – G: 5
’
– CAG AGA CTA CTC TGA AGC – 3
’
GAPDH – R: 5
’
– ACA TCC AAT ATG ATT CC – 3
’
GAPDH – R: 5’ – TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA – 3
’

EGFR – F: 5
’
– GCT TAT GGT GCA ATG G – 3
‘
EGFR – R: 5
’
– CGA AGT CTC ATA AGA GAC – 3
’
Thành phần phản ứng PCR: được tiến hành với tổng thể tích 10 gồm:
150 ng cDNA với cặp mồi HIP, 400 ng cDNA với cặp mồi EGFR và 1200 ng
với cặp mồi GAPDH; 1 x Ex – Tap Plymerase (takara Bio Inc. Kyoto, japan).
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đối với cặp mồi HIP và GAPDH như
sau: 94
0
C /5 phút, 35 chu kỳ [94
0
C / 50 giây, 58

0
C / 50 giây], 72
0
C / 50 giây,
72
0
C/ 5 phút.
18
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đối với cặp mồi RGFR như sau: 94
0
C
/10 phút, [94
0
C / 30 giây, 55
0
C / 45 giây, 72
0
C / 45 giây], trong 30 chu kỳ;
72
0
C/ 10 phút; bảo quản ở 4
0
C.
Sử dụng gen nội chuẩn GAPDH để đánh giá chất lượng RNA và xác
định lượng mẫu sử dụng trong phản ứng PCR. Đậm độ mỗi vạch HIP, EGFR
và GAPDH được xác định nhờ phần mềm chuyên dụng. Mức độ sao chép của
HIP và EGFR được tính bằng giá trị đậm độ vạch HIP và EGFR rồi vẽ đồ thị.
1.4.4.3. PCR định lượng điện di mao quản
Sau khi khuếch đại gen HIP và EGFR, phân tích sản phẩm PCR bằng 2
phương pháp điện di trên thạch agarose nồng độ 1,5% và điện di mao quản

bởi máy Agilent 2100 Bianalyzer. Đậm độ vạch các băng HIP và EGFR bởi
thạch agarose (nhuộm ethidium bromide) sẽ được so sánh với nồng độ HIP và
EGFR được đo trờn mỏy Agilent 2100 Bioanalyzer.
Agilent 2100 Bioanalyzer là công cụ phân tích mẫu acid nucleic cũng
như protein đạt các tiêu chuẩn công nghiệp thay thế cho phương pháp điện di
trên thạch agarose vốn đòi hỏi nhiều công sức. Đặc trưng của Agilent 2100
Bioanalyzer là nó có thể được sử dụng cả trong phân tách điện di ( ví dụ: tỏch
cỏc đoạn DNA) và phân tích các chỉ số huỳnh quang tế bào trong phương
pháp đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry). Nhờ vậy, phân tích kết quả điện
di DNA có thể cho biết đồng thời cả kích thước và nồng độ đoạn DNA được
phân tách. Kể từ khi được đưa vào sử dụng năm 1999 Agilent 2100
Bioanalyzer được các nhà nghiên cứu ưa chuộng nhờ kết quả chính xác, thời
gian phân tích ngắn, lượng mẫu nhỏ (1 -4///) và khả năng tự động hoá cao
Trong phản ứng xác định nồng độ gen HIP và EGFR trong các mẫu mô
ung thư, khi điện di sản phẩm PCR được khuếch đại bởi các cặp mồi đặc hiệu
của hai gen HIP và EGFR, kết quả được thể hiện ở hình 2.2.
19
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN EGFR TRấN THẾ GIỚI
Hiện nay cùng với các phương pháp đang được áp dụng trong chẩn đoán
và điều trị ung thư, các nhà khoa học đã và đang đi sâu vào nghiên cứu các
gen , các marker ung thư đặc hiệu trong đó cú nhúm cỏc protein màng tế bào
nhằm góp phần chẩn đoán sớm ở mức độ sinh học phân tử.
Nhúm các protein màng có vai trò trong việc dẫn truyền tín hiệu tế bào -
tế bào hay khoảng gian bào - tế bào và có chức năng trong việc chưởng thành,
phát triển và biệt hoá của tế bào. Trong nhúm cỏc protein màng có một
protein màng tham gia vào việc dẫn truyền tín hiệu tế bào là thụ thể của yếu
tố phát triển biểu mô (Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR). Một số
nghiên cứu đã thấy rằng hoạt động của yếu tố phát triển biểu mô (EGF) và thụ
thể của nó (EGFR) đóng vai trò quan tọng đối với quá trình phát triển và tái
tạo của tế bào. EGFR tăng cao trong tế bào ung thư là một yếu tố quan trọng

thúc đẩy sự phát triển tế bào u, ngăn chặn sự chết theo chương tình
(apoptosis) và tạo thuận lợi cho tiến trình di căn theo các cơ chế khác nhau.
Ngăn chặn tiến trình này là một trong những mục tiêu nghiên cứu tạo ra các
thuốc mới để điều trị đích trong ung thư (3).
Tiến bộ của khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử protein
trong thập kỷ gần đây đã chứng minh có sự tăng cường biểu hiện EGFR ở cả
mức độ mRNA và protein trong một số loại ung thư.
Tăng hoạt tính của EGFR cũng có thể thúc đẩy khả năng di căn của các
tế bào ung thư. Gia tăng biểu lộ các thành viên trong gia đình EGFR khác
nhau ở các thể loại ung thư khác nhau: ung thư vú, ung thư phổi , ung thư đại
tràng, ung thư dạ dày , ung thư tuỵ, ung thư buồng trứng , ung thư thần kinh ,
ung thư tiền liệt tuyến, ung thu vùng đầu cổ và một số loại ung thư khác (1).
Ức chế quá trình biểu lộ EGFR là một trong những định hướng của liệu
pháp điều trị gen cho một số lại hình ung thư . Từ các nghiên cứu này, hai
hướng nghiên cứu chính gần đây tiếp cận sản xuất thuốc điều trị ung thư trên
lâm sàng là: 1) sản xuất kháng thể đơn dòng ức chế các EGFR ở phần ngoài
20
màng tế bào; 2) sản xuất chất ức chế tiểu phân tử tyrosin kinase EGFR
đặc biệt là các EGFRvI – III. Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu sản
xuất được nhiều loại thuốc tác dụng đặc hiệu EGFR. Các chất này hoặc ức
chế phần ngoài màng tế bào hoặc phần trong tế bào của EGFR nhưng mục
đích chính là ngăn chặn dũng thỏc tớnh hiệu đường truyền vào trong tế
bào của EGFR.
Trên thế giới đã có nhiều tìm hiểu mức độ bộc lộ EGFR trong UTP. Cùng
với loại mô học, giai đoạn bệnh, EGFR cũng được coi là yếu tố tiên lượng
quan trọng.
EGFR thường bộc lộ ưu thế trong UTP không tế bào nhỏ, tỷ lệ từ 43-89%
[27]. Bộc lộ ưu thế thấy nhiều nhất trong UTBM tế bào vảy: 70%, sau đó là
UTBMT: 50% và UTBM tế bào lớn. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho
thấy UTBM phế quản phế nang có nồng độ cao EGFR [3]. Cơ chế về hoạt

tính EGFR trong UTP hiện vẫn chưa được biết [3]. Sự bộc lộ ưu thế có liên
quan tới tiên lượng xấu của bệnh [3].
1.6. ĐIỀU TRỊ ĐÍCH ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN UTP LOẠI TUYẾN Cể
ĐỘT BIẾN EGFR
Ở những bệnh nhân ung thư khu trú và chưa di căn qua hạch, phẫu thuật
có thể mang lại tỷ lệ thời gian sống còn trong thời gian 5 năm là khoảng 40%.
Kể từ khi ghi nhận có bộc lộ quá mức EGFR ở các khối u ở người và có liên
quan đến hậu quả sấu trên lâm sàng, các thuốc ức chế EGFR – Tyrosine
Kinase (EGFR – TKI) đã được phát triển và chứng minh hiệu quả trong điều
trị ở những bệnh nhân NSCLC đã thất bại với hoá trị trước đó .
Paez và cộng sự đã khảo sát gen EGFR từ exon 2 đến exon 25 trên 119
mẫu khối u NSCLC
(16)
. Phân tích trình tự DNA cho thấy các đột biến mất
đoạn và đột biến (missense) ở tổng số 16 mẫu mô. Tất cả các đột biến được
biểu hiện trong các exon 18 – 21 của vùng kinase. Theo các nghiên cứu trước
đó, bệnh nhân bị đột biến EGFR và có đáp ứng tốt với EGFR – TKI cú cỏc
đột biến chủ yếu ở exon 18,19 và 21; trong khi những bệnh nhân bị đột biến
21
exon 20 có đáp ứng kém
(7,8)
. Người ta thường ghi nhận có sự thay thế xảy ra
ở exon 18 và 21, và có sự mất đoạn ở exon 19
(9)
. Đột biến mất đoạn (in frame)
hoặc đột biến thay thế tác động đến các acid amin chuyên biệt; do đó nó có
thể làm thay đổi vị trí gắn vào vùng tyrosine kinase. Do đó, sự thay thế này
ảnh hưởng đến hiệu quả của EGFR – TKI. Hơn nữa, người ta ghi nhận có mối
liên quan giữa tình trạng đột biến EGFR và tỉ lệ đáp ứng với điều trị bằng
EGFR – TKI ở bệnh nhân NSCLC. 38,6% trong số những bệnh nhân nghiên

cứu không có đột biến EGFR có tăng nồng độ EGFR phosphoryl hoá trong
khi 66,6% bệnh nhân đột biến EGFR có tăng EGFR phosphryl hoá. Người ta
cũng ghi nhận sống còn không có bệnh tiến triển và sống còn toàn bộ tốt hơn
ở bệnh nhân NSCLC có đột biến EGFR . Hiệu quả điều trị cao hơn cũng được
ghi nhận ở bệnh nhân carcinoma tế bào tuyến có đột biến EGFR (85%) so với
không có đột biến (khoảng 40%). Tuy nhiên, trong một nghiên cứu pha II đơn
trung tâm, gefitinib được thiết kế nhằm chứng minh hiệu quả kháng ung thư
trong điều trị đơn trị bước đầu cho những bệnh nhân NSCLC gia đoạn IIIB/IV
chưa được điều trị bằng hoá trị trước đó . Các mẫu mô khối u được thu thập
để đánh giá các dấu ấn sinh học. Tỷ lệ đáp ứng toàn bộ là 50,9%; tuy nhiên
bệnh nhân có đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến L858R ở exon 22 có tỷ
lệ đáp ứng lần lượt là 95% và 73,9%. Đột biến EGFR thể mất đoạn exon 19
và đột biến L858R ở những bệnh nhân carcinoma tế bào tuyến là yếu tố tiên
lượng tốt nhất cho thấy có thời gian đến khi điều trị thất bại (TTF) lâu hơn ở
bệnh nhân NSCLC giai đoạn tiến triển chưa được điều trị hoá trị sử dụng
gefitinib đơn trị bước đầu.
Cetuximab là kháng thể đơn dòng gắn lên thụ thể của EGFR. Trên những
BN NSCLC có đột biến EGFR qua nhuộm HMMD thì khi phối hợp
Cetuximab với hoá trị giúp tăng thời gian sống còn toàn bộ so với hoá trị đơn
thuần. Tuy nhiên phối hợp này không làm tăng thời gian sống bệnh không
tiến triển.
22
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Các BN UTP loại biểu mô tuyến được phẫu thuật tại bệnh viện K từ
1/2009 đến tháng 10/2011.
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
- UTBMT phổi các giai đoạn cả nam và nữ.
- BN được phẫu thuật cắt thuỳ hoặc cắt một phổi tại bệnh viện K

- BN có đủ hồ sơ bệnh án, u nguyờn phỏt, được mổ lần đầu.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Các khối u di căn
- Mô bệnh học không phải UTBMT
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi cứu và tiến cứu
2.2.2. Tính cỡ mẫu
04,96
)2,0.5,0(
)5,01(5,0
.96,1
).(
)1(
.
2
2
2
)2/1(
2
=
−
=
−
=
−
ε
α
p
pp

Zn
n: Cỡ mẫu nghiên cứu
p: Tỷ lệ EGFR + là 50% = 0,50 ( Theo: Giorgio V. Scagliotti
1

và cs)
α : Mức ý nghĩa : 0,05
Hệ số tin cậy là 95% thì Z = 1,96 và
)2/1(
2
α
−
Z
= 1,96²
(Giá trị Z thu được từ bảng Z ứng với giá trị α lựa chọn)
ε : Giá trị tương đối = 0,2 ( 20% so với p )
Từ công thức trên, chúng tôi dự kiến cỡ mẫu nghiên cứu là 97 đối tượng.
23
2.2.3.Các bước tiến hành
2.2.3.1. Nghiên cứu MBH
+ Hồi cứu: các khối nến UTBMT của phổi được cắt lại nhuộm HE, ghi
nhận kích thước u, tình trạng di căn hạch trung thất, hạch rốn phổi
+ Tiến cứu: bệnh phẩm phẫu thuật
- Vị trí u: Theo thuỳ trờn trờn, giữa, dưới (phổi phải); thuỳ trên, dưới (phổi trái)
- kích thước u: bộc lộ khối u, dùng thước đo đường kính lớn nhất của khối
u. Bệnh phẩm được lấy ở vùng giáp ranh giữa vùng u và không u.
- Số lượng hạch: hạch trung thất và hạch rốn phổi
- Các bệnh phẩm phẫu thuật đều được chuyển đúc, cắt nhuộm (HE) theo
quy trình xét nghiệm GPB thường quy của Khoa GPB – Tế bào Bệnh viện K .
+ Tất cả các tiêu bản được đọc và phân tích kết quả dưới kính hiển vi

quang học, phân loại MBH theo phân loại UTBMT của TCYTTG 1999
+ phân loại MBH UTBMT phổi theo TCYTTG 1999:
- Chùm nang
- Nhú
- UTBM tiểu phế quản phế nang:
Không chế nhày
Chế nhày
Typ hỗn hợp nhày và không nhày hay typ tế bào trung gian
- UTBMT đặc với chất nhày
- UTBMT với các thứ nhóm hỗn hợp
- Biến thể:
UTBMT thai biệt hoá cao
UTBMT nhày “dạng keo”
UTBMT nang nhày
UTBMT tế bào nhẫn
UTBMT tế bào sáng
24
• Các kết quả được kiểm duyệt lại bởi PGS.TS Tạ Văn Tờ.
+ Kỹ thuật nhuộm HE được thực hiện tại Khoa GPB - Tế bào Bệnh viện K
theo quy trình sau:
- Tẩy paraffin trong 3 bể toluen (hoặc xylen, xylon), mỗi bể 5 phút.
- Qua 4 bể cồn: 100º – 95º – 80º – 70º, mỗi bể nhúng 15 lần.
- Rửa nước cất: nhúng 15 lần.
- Nhuộm nhân bằng Hematoxylin Harris: 3 -5 phút hoặc lâu hơn.
- Rửa nước chảy: 5-10 phút.
- Kiểm tra màu của nhân qua kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhệ bằng cồn- axit.
- Rửa nước chảy: 1 phút.
- Nhuộm Eosin 1%: 1 – 2 phút.
- Rửa nước chảy: 1 phút.
- Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º -100º , mỗi bể 15 lần nhúng.

- Qua 3 bể Toluen, bể I và II nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút.
- Gắn lỏ kớnh
Kết quả: Nhân tế bào xanh đến xanh đen, bào tương tế bào hồng đến đỏ,
hồng cầu hồng đậm, sợi tạo keo hồng nhạt.
* Tìm mối liên quan loại mô học với vị trí u
* Tìm mối liên quan loại mô học với giới, tuổi
* Tìm mối liên quan loại mô học với di căn hạch.
2.2.3.2. Nghiên cứu yếu tố phát triển biểu mô bằng HMMD
Kỹ thuật nhuộm hoỏ mô miễn dịch để phát hiện bộc lộ quá mức EGFR:
- Sửa soạn tiêu bản vùi nến
+ Cắt mỏng mẫu mô 3-5 àm và đặt vào lam sạch cú trỏng silan.
+ Ủ tiêu bản ở nhiệt độ 56ºC trong 1-2 giờ trước khi nhuộm
- Kháng thể được sử dụng.
25