Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm - Lê Phương Hà.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN










LÊ PHƯƠNG HÀ



TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM
TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN
THỰC PHẨM





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Buôn Ma Thuột, năm 2009
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
……………………….







LÊ PHƯƠNG HÀ




TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM
TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN
THỰC PHẨM



Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG







Buôn Ma Thuột, năm 2009

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và
kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, ñược các ñồng tác giả
cho phép sử dụng và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ một công trình
nào khác.

Họ tên tác giả




Lê Phương Hà

ii

LỜI CẢM ƠN !

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gởi lời
cảm ơn chân thành ñến:
Ban giám hiệu trường Đại học Tây Nguyên.
Các thầy cô Khoa sau Đại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học
Tây Nguyên.
Các thầy cô phòng thí nghiệm Sinh học thực vật – Khoa Nông Lâm
Nghiệp Trường Đại học Tây nguyên ñã ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi sớm
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị, các bạn ñồng nghiệp và ñặc
biệt là Khoa Trồng Trọt trường Cao ñẳng Công Nghệ và Kinh Tế Bảo Lộc
ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian
công tác và học tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến PGS.TS Nguyễn Anh
Dũng, người ñã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dạy và giúp ñỡ trong suốt
thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Xin ghi nhận sự giúp ñỡ của các anh chị trong lớp Cao học Sinh Học
Thực Nghiệm K1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn sự quan tâm , khích lệ của người thân
trong gia ñình ñã luôn luôn ñộng viên về mọi mặt ñể tôi hoàn thành tốt khóa
học này.
Xin chân thành cảm ơn!
LÊ PHƯƠNG HÀ

iii
MỤC LỤC
Trang
Các chữ viết tắt………………………………………………………………i
Danh mục ảnh……………………………………………………… ii
Danh mục bảng…………………………………………………………… iv
Danh mục hình………………………………………………………………v

MỞ ĐẦU……………………………………….…………………… 1
Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… …………… 3
1.1. Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer………………………… 3
1.1.1. Công thức cấu tạo …………………………………………………….3
1.1.2. Tính chất của chitosan ……………………………………………… 4
1.1.3. Các ñặc tính của chitosan 6
1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn suất …………………… ………7
1.1.5. Tình hình nghiên cứu cải biến chitosan 15
1.1.6. Các dẫn suất cải biến của Chitosan 20
1.1.6.1. Chitooligosaccharide …………………………………… …….20
1.1.6.2. Các dẫn suất của Chitosan …………………………… ……….21
1.1.7. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan và dẫn suất 25
1.2. Tình hình bảo quản thực phẩm hiện nay 26
1.3. Một số ñặc ñiểm của ñối tượng nghiên cứu 27
1.3.1. Vi khuẩn Escherichia coli 27
1.3.1.1. Đặc ñiểm chung 27
1.3.1.2. Đặc ñiểm sinh vật 28
1.3.1.3. Phòng và trị 28

1.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 28

iv
1.3.2.1. Đặc ñiểm chung 28
1.3.2.2. Phòng bệnh và chữa bệnh 29
Phần 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 30
2.1. Nội dung nghiên cứu 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu 30
2.2.2. Vật liệu hoá chất 30
2.2.3. Thiết kế thí nghiệm 30
2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 30
2.2.4. Các bước tiến hành 31
2.2.5. Phương pháp nghiên cứu cải biến chitosan 32
2.2.5.1. Phương pháp cải biến chitosan-glucose 32
2.2.5.2. Phương pháp cải biến chitosan-glucosamine 33
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất
chitosan cải biến 33
2.2.6.1. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp ño ñộ ñục 33
2.2.6.2. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên
ñĩa 34
2.2.7. Phương pháp thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo
quản thực phẩm 34
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu 37
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Nghiên cứu chế tạo dẫn suất Chitosan cải biến 38
3.1.1. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và tỷ lệ nồng ñộ
chitosan/glucose ñến phản ứng Maillard 38
3.1.2. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và nồng ñộ ñường
glucose ñến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan 40

v

3.2. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến
trong invitro 41
3.2.1. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan – glucose 41
3.2.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn chitosan – glucosamine
cải biến 52
3.3. Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan cải biến bằng
phương pháp khuyếch tán trên ñĩa 62
3.3.1. Đối với chitosan – glucose 62
3.3.2. Đối với chitosan – glucosamine 65
3.4. Nghiên cứu thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản
thực phẩm 67
3.4.1. Đối với chitosan – glucose 67
3.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose ñến trạng thái cảm quan
của thịt trong quá trình bảo quản 67
3.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine ñến trạng thái cảm
quan của thịt trong quá trình bảo quản 71
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76
4.1. Kết luận ……………………………………….………………………76
4.2. Đề nghị ……………………………………………………………… 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
Tiếng Việt 77
Tiếng Anh …………………………………………… ………………… 79
PHỤ LỤC

vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT



CGC Chitosan – glucose
CT1 Công thức 1
CT2 Công thức 2
CT3 Công thức 3
ĐC Đối chứng
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
CV Coefficient of Variation
Da Daton
ppm parts per million
CGC chitosan - glucose
LMWC khối lượng phân tử thấp
PEG polyethylene glycol

vii
DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng1.1: . Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến khả năng
kháng khuẩn…… …………………………………………………………17
Bảng 1.2: Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 18
Bảng 2.1: Cơ sở cho ñiểm thịt bò theo TCVN 3215-79………………… 37
Bảng 2.2: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan của thịt………… 38
Bảng 2.3: Bảng phân cấp chất lượng thịt…………………………………. 38
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucose ñến
mức ñộ phản ứng Maillard……………………………………………… 40
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường
glucosamine ñến mức ñộ phản ứng Maillard………………………………41
Bảng 3.3: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………… 43

Bảng 3.4: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………………… 45
Bảng 3.5: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………………… 46
Bảng 3.6: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus………………… 48
Bảng 3.7: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………………… 50
Bảng 3.8: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus………………… 51
Bảng 3.9: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……………….53

viii

Bảng 3.10: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 55
Bảng 3.11: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………… 56
Bảng 3.12: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 57
Bảng 3.13: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………… 59
Bảng 3.14: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 60
Bảng 3.15: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose
bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn S. aureus……… 62
Bảng 3.16: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose
bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn Escherichia
coli………………………………………………………………………….63

Bảng 3.17: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan -
glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn
Staphylococcus aureus………………………………………………… 64
Bảng 3.18: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan -
glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn
Escherichia coli…………………………………………………………….65







ix



DANH MỤC HÌNH VẼ, CÁC ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose……………………… 3
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25
0
C) ñến trạng thái
cảm quan của thịt………………………………………………………… 67
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25
0
C) ñến trạng thái
cảm quan của thịt………………………………………………………… 67

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25
0
C) ñến trạng thái
cảm quan của thịt………………………………………………………… 68
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm quan
của thịt…………………………………………………………………… 69
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm quan
của thịt…………………………………………………………………… 69
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm quan
của thịt…………………………………………………………………… 70
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine
có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25
0
C) ñến trạng thái
cảm quan của thịt………………………………………………………… 71

x

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine
có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25

0
C) ñến trạng
thái cảm quan của thịt………………………………………………………71
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine
có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25
0
C) ñến trạng
thái cảm quan của thịt………………………………………………………72
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine
có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm
quan của thịt……………………………………………………………… 72
Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine
có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm
quan của thịt……………………………………………………………… 73
Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine
có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm
quan của thịt……………………………………………………………… 73




ĐẶT VẤN ĐỀ

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những mối quan tâm chung của

toàn xã hội và là vấn ñề thời sự ñược dư luận quan tâm, nhất là khi các cơ
quan chức năng mới phát hiện hàng loạt những vi phạm nghiêm trọng về vệ
sinh an toàn thực phẩm.
Khi xu hướng sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn của thị trường
ñang gia tăng, ñặc biệt là ñối với các sản phẩm thịt chế biến cổ truyền của
Việt Nam như giò lụa, nem chua, lạp xưởng, xúc xích ñược người tiêu dùng
ngày càng ưa chuộng. Tuy nhiên, theo báo cáo của Chi cục Thú y Thành phố
Hồ Chí Minh (1999) cho thấy 50-60% mẫu xét nghiệm không ñạt tiêu chuẩn
vi sinh và sinh hóa. Ngộ ñộc thực phẩm do vi khuẩn và ñộc tố của nó thường
xảy ra do thiếu sót trong quá trình chế biến, công tác kiểm tra, thanh tra thực
phẩm và nguyên liệu dùng ñể chế biến thực phẩm. Loại ngộ ñộc này thường do
Salmonella enteritidis, Clostridium perfrigens, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Hiện nay, ñể bảo quản các loại thực phẩm tươi như thịt, cá, giò
chả… phần lớn người ta ñã sử dụng các chất hóa học như phân urê, hàn the,
benzoate natri, trong nước mắm có urê hay sử dụng formon trong làm bánh phở,
hàn the ñể làm chả nem, hầu hết các chất này khi vào cơ thể tích tụ lâu ngày sẽ
gây ảnh hưởng ñến sức khỏe của con người và nghiêm trọng hơn nữa là gây ra các
bệnh ung thư và làm giảm giá trị của thực phẩm.
Chitosan là một polimer sinh học, ñược tách từ vỏ tôm, cua, côn trùng, giáp
xác và tế bào nấm. Chitosan là một poly-glucosamin ñược cấu tạo từ các gốc
glucosamin kiên kết với nhau bằng liên kết
β
- 1,4 glucoside. Chitosan và các
sản phẩm thủy phân của chitosan là chitosan oligomer là các sản phẩm của tự
nhiên, không ñộc, không gây ô nhiểm môi trường nhưng có hoạt tính sinh học
rất cao. Chitosan ñược chứng minh là một chất có hoạt tính kháng khuẩn,
chống nấm và chống oxi hóa nhờ tính chất polycation tự nhiên nên có nhiều
ứng dụng trong nông nghiệp và bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, enzyme của

2


một số vi khuẩn tiết ra có khả năng phân hủy và làm mất hoạt tính của
chitosan. Vì vậy, ñể tăng cường hoạt tính kháng khuẩn, hạn chế khả năng
phân huỷ của enzyme do vi sinh vật tiết ra, cần phải cải biến thay ñổi cấu trúc
của chitosan. Xuất phát từ thực tiễn ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
“Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn ñể
ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”.
Mục tiêu của ñề tài là:
1. Cải biến chitosan nhằm nâng cao hoạt tính kháng khuẩn.
2. Thử nghiệm ứng dụng chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm.

3


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer
1.1.1. Công thức cấu tạo
Chitosan là một polymer sinh học với các ñơn phân N-acetyl
glucosamine ñược deacetyl hoá một phần, hiện diện tự nhiên trong vách một
số giống nấm như Mucorales (Muzarelli, 1993)[42]. Tuy nhiên, phần lớn
lượng chitosan hiện ñang ñược thu nhận và sử dụng lại chủ yếu từ quá trình
deacetyl hoá chitin, thành phần chính của trong bộ xương ngoài của ñộng vật
giáp xác như tôm, cua hay mực.
Chitosan dễ tan trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic. Khi
phân hủy chitosan bằng các tác nhân khác nhau như axít clohidric, enzyme
chitosanase, cellulase hoặc bức xạ gamma sẽ tạo nên các sản phẩm có chiều
dài mạch ngắn hơn gọi là oligoglucosamine.


Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose.


4


Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong ñó nhóm (-NH

2
)
thay thế nhóm (-COCH
3
) ở vị trí C(số 2). Chitosan ñược cấu tạo từ các mắt
xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết b-(1-4-glicoside, do vậy
chitosan có thể gọi là poly b-(1,4)-2-amino-2-deoxi-D-glucose hoặc là poly b-
(1-4)-D-glucosamine (cấu trúc bậc III).
Các ñơn vị cấu tạo nên phân tử chitosan là -D-glucosamine hay -(1,4)-
2-amino-2-deoxy-D-glucose.
1.1.2. Tính chất của chitosan
a. Tính chất vật lý
Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không vị,
hòa tan dễ dàng trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic. Ngay từ
năm 1968, K.Arai và cộng sự ñã xác ñịnh chitosan hầu như không có tính
ñộc, không gây ñộc trên ñộng vật thực nghiệm và người. Nhiều tác giả chỉ rõ
chitosan, chitosan glucosamine có nhiều ưu ñiểm: tính chất cơ học tốt, không
ñộc, dễ tạo màng, hòa hợp sinh học không những ñối với ñộng vật mà còn ñối
với các mô thực vật.
b. Tính chất hóa học
Phân tử lượng từ 10 -1000 kDa tùy theo ñiều kiện sản xuất.
Mức ñộ deacetyl hoá thường từ 70% ñến 100%.
Nhiệt ñộ nóng chảy từ 309
o
C ñến 311
o
C tùy theo trọng lượng phân tử
và mức ñộ deacetyl hoá.
Chitosan tan trong dung dịch loãng các axít hữu cơ như axít acetic, axít
formic, axít adipic, axít propionic và một số axít vô cơ. Ba thuộc tính cơ bản

nhất của chitosan là: phân tử lượng, mức ñộ deacetyl hoá và ñộ tinh sạch.
Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH
3

trong các mắt xích axetyl-D-glucosamine và nhóm –OH, nhóm –NH
2
trong


5


mắt xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là
amit. Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế
O-, dẫn xuất thế N- hoặc dẫn xuất thế O-, N
Mặt khác chitosan là những polimer và các monomer ñược nối với
nhau bởi các liên kết b-(1,4)-glicoside, các liên kết này rất dễ bị cắt ñứt bởi
các chất hóa học như: acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzime thủy phân.
* Các phản ứng của nhóm –OH
Phản ứng của nhóm –OH có thể tạo ra các dẫn suất.
- Dẫn xuất sunfat.
- Dẫn xuất O-axyl của chitin/chitosan.
- Dẫn xuất O-tosyl hóa chitin/ chitoan.
* Phản ứng ở vị trí N.
- Phản ứng N-acetyl hóa chitosan.
- Dẫn xuất N-sunfat chitosan.
- Dẫn xuất N-glycochitosan(N-hydroxyl-etylchitosan).
- Dẫn xuất acroleylen chitosan.
* Các phản ứng xảy ra tại vị trí O, N.
-Dẫn xuất O,N-cacboxymetylchitosan.

-Dẫn xuất N,O-cacboxymetylchitosan.
- Phản ứng cắt ñứt liên kết b-(1,4) glycoside.
c. Các phương pháp thu nhận chitosan oligomer
Để thu nhận chitosan oligomer từ chitosan hiện nay có 3 phương pháp
chủ yếu:
- Phương pháp hóa học
Đây là phương pháp khá ñơn giản, sử dụng các axít clohidric (6-12N)
ñể thủy phân, nhiệt ñộ thủy phân từ 80-100
0
C Domard,(1989). Tuy nhiên
nhược ñiểm của phương pháp này là chi phí dành cho thiết bị cao, phải có
thiết bị chống ăn mòn axít, gây ô nhiễm môi trường và nhất là hiệu suất thu


6


hồi các phân ñoạn oligoglucosamine có hoạt tính thấp, sản phẩm là các
monomer là glucosamine cao (>30%).
- Phương pháp phân hủy bằng bức xạ gamma
Bức xạ gamma tăng cường ñộ deacetyl hóa và giảm bớt trọng lượng
phân tử của chitosan. Quá trình deacetyl hóa kiềm mạnh trọng lượng phân tử
của chitosan giảm từ 890 kDa ñến 380 kDa (bức xạ 50 kGy) và 200 kDa (bức
xạ 75 kGy). Điều chế chitosan oligomer ñược thực hiện bởi axít clohidric và
cellulase N.A.Dzung, (2001)[8].
- Phương pháp emzyme
Để thủy phân chitosan có thể sử dụng nhiều loại enzyme như
chitosanase, celluloase, glucanase. Phương pháp này ñược sử dụng khá rộng
rãi hiện nay (Muraki, 1993; Aiba, 2002). Phương pháp này có nhiều ưu ñiểm
như:

+ Hiệu suất thu hồi các phân ñoạn cao.
+ Điều kiện diễn ra phản ứng thủy phân nhẹ nhàng, nhiệt ñộ thấp, pH
ôn hòa nên chi phí thiết bị thấp, không gây ô nhiễm môi trường.
+ Nhược ñiểm của phương pháp này là chi phí dành cho enzyme khá
cao.
1.1.3. Các ñặc tính của chitosan
Chitosan có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công, nông nghiệp, y
dược, thực phẩm… nhờ vào những ñặc tính sau Antoni (2005)[73]:
- Tính chất ña ñiện ly mang ñiện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho
phép gắn kết với các thành phần sinh học mang ñiện tích âm.
- Có thể tái sinh theo con ñường sinh học trên trái ñất.
- Có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể.
- Có khả năng tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào ñộng
thực vật.
- Có khả năng kích thích quá trình ñông máu và làm lành vết thương.


7


- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các thành phần của chất nền ngoại
bào và các nhân tố tăng trưởng.
- Giảm cholesterol do liên kết có chọn lọc với các lành axít béo.
- Không gây ñộc do các sản phẩm sau thủy phân ñều là các chất chuyển
hoá tự nhiên.
- Không gây ñáp ứng miễn dịch trong mô và cơ quan ñộng vật.
- Có tác dụng hỗ trợ trong ñiều hòa miễn dịch.
- Có thể xử lý tạo nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, màng, tấm xốp,
sợi, hạt, bột mịn, bông và gel.
1.1.4. Ứng dụng của chitosan và các dẫn suất

Hiện nay, chitosan, chitin và chitosan oligomer là một trong những vật
liệu mới ñã và ñang ñược ứng dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực như: công
nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, môi trường, công
nghệ sinh học và vật liệu mới. Tất cả các ứng dụng của chitosan phụ thuộc
chủ yếu vào các tính chất lý hóa và sinh học như: các thuộc tính lưu biến học,
hoạt tính kháng khuẩn, ñiều chỉnh miễn dịch, làm lành vết thương và ñông
máu, liên kết với enzyme, hấp thu kim loại, tạo màng và gel… Tùy vào lĩnh
vực ứng dụng mà người ta sử dụng chitosan ở các mức ñộ tinh sạch khác
nhau.
Chitin, chitosan và oligoglucosamine ñều là các sản phẩm có nguồn
gốc tự nhiên, không gây ñộc hại cho con người và gia súc, có khả năng phân
huỷ sinh học và không gây ô nhiễm môi trường.
• Ứng dụng của chitosan trong công nghiệp
+ Xử lý nước thải, hấp thu kim loại nặng
Hiện nay, phương pháp hóa lý là phương pháp tiện dụng và phổ biến
trong hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy công nghiệp. Tuy nhiên, bất
lợi chính của phương pháp này là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Vì thế,
việc tìm ra một phương pháp "xanh" (phương pháp an toàn với môi trường) là


8


rất cần thiết. Do có nguồn gốc từ tự nhiên và có khả năng thủy phân sinh học,
chitosan là một chất thay thế hợp lý. Chitosan ñã ñược sử dụng trong quá trình
lọc nước từ khoảng 3 thập niên trước. Các nghiên cứu ñã cho thấy chitosan có
khả năng:
- Hấp thu kim loại nặng: chitosan mang ñiện tích dương kết hợp với
những polymer ña ñiện âm tạo phức với các ion kim loại và kết tủa.
Chitosan cũng có thể ñược sử dụng như một chất hấp thụ ñể tách các

ñồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nước bị nhiễm phóng xạ và thu hồi
uranium từ nước biển và nước ngọt.
- Loại bỏ 100% các polyme hiện diện trong nước thải.
- Giảm mùi hôi khó chịu (do làm giảm số lượng vi sinh vật gây thối)
- Một số ứng dụng mở rộng khác bao gồm: xử lý vệt dầu loang, xử lý
nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước hồ bơi, thu hồi protein và khoáng
từ nước thải nông nghiệp, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong
nước tiểu và tách các ñộc tố từ dung dịch.
+ Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm
Chitosan ñược dùng như một thành phần trong thực phẩm ở Nhật và
Châu Âu từ khoảng 20 năm trước. Chất này có tác dụng ổn ñịnh màu, mùi vị
của thực phẩm. Ngoài ra, chitosan còn thể hiện tác dụng tuyệt vời trong bảo
quản thực phẩm.
Ở Mỹ, chất này ñược sử dụng ñể "bẫy" lipid trong thực phẩm chức
năng chống béo phì. Chitosan ñược ưa chuộng không chỉ vì có tác dụng như
chất xơ, thành phần quan trọng trong khẩu phần ăn, mà còn gắn với lipid
trong dạ dày và ruột tạo thành một dạng chất mà cơ thể không thể hấp thu và
sẽ ñược loại thải ra ngoài. Các nghiên cứu cho thấy chitosan gắn ñược với
lượng chất béo gấp 4 lần khối lượng của chúng Andreu (2003)[14].



9


+ Trong công nghiệp mỹ phẩm
Chitosan là loại polymer tích ñiện dương tự nhiên duy nhất có khả năng
chuyển thành dạng dung dịch nhớt khi hòa tan trong môi trường acid yếu.
Nhờ tính chất này mà chitosan ñã ñược ứng dụng rất nhiều trong sản phẩm
chăm sóc tóc như dầu gội, dầu xả và sản phẩm tạo nếp Harida (1996)[74].

Ngoài ra, chitosan cũng ñược dùng trong mỹ phẩm chăm sóc da, móng tay do
có các tính chất như bảo vệ, duy trì ñộ ẩm, tạo màng trên da ñồng thời gắn
kết với các dưỡng chất cần thiết, tạo ñiều kiện cho các chất này hoạt ñộng tích
cực trên da. Tính kháng khuẩn của chitosan cũng góp phần vào công dụng của
chitosan trong các sản phẩm mỹ phẩm và chăm sóc cá nhân. Các ứng dụng cụ
thể của chitosan trong lĩnh vực này bao gồm:
- Duy trì ñộ ẩm trên da, trị mụn, làm da khỏe hơn, tươi hơn, bảo vệ lớp
biểu bì.
- Giảm sự tích ñiện trên tóc (gây thương tổn tóc), trị gàu, giúp cho tóc
mềm mại hơn, Andreu (2003)[14].
+ Trong một số công nghiệp khác
- Tăng ñộ bền cơ học và ñộ mịn của giấy, tăng chất lượng in trên giấy do
thấm mực in tốt hơn.
- Chitosan có thể ñược dùng làm chất cầm màu trong khi nhuộm và in
sợi dệt. Khả năng kháng khuẩn giúp vải bền hơn.
Cải tiến quá trình in ảnh khi có mặt trong nhũ tương bạc cản quang. Chitosan
cũng còn ñược dùng làm chất bắt hình ñen trắng
• Ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp
Chitosan ñược sử dụng như một chất thay thế an toàn cho các chất hoá
học từ lâu vẫn ñược sử dụng có thể gây hại ñến môi trường và sức khỏe con
người. Chitosan tác ñộng hỗ trợ vào cơ chế phòng vệ ở thực vật (như trường
hợp vaccine ñối với con người), kích thích sự tổng hợp và tiết một số loại


10

enzyme như phytoalexin, chitinase, pectinase, glucanase và lignin (Andreu,
2003)[14]. Các ứng dụng chủ yếu của chitosan trong nông nghiệp gồm có:
+ Phóng thích chậm các hợp chất vào trong ñất
Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón, chất

ñiều hòa tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết. Chitosan ñược sử
dụng như chất mang tự nhiên ñể kếp hợp và phóng thích từ từ các hợp chất
mong muốn vào trong ñất. Chitosan bị phân hủy sinh học trong ñất trong
khoảng 2 tháng, kèm theo sự phóng thích các chất. Do ñó, người ta tiết kiệm
ñược ñáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp khi dùng chitosan làm
chất mang.
+ Vỏ bao của hạt
Hoạt ñộng chitinase ñược gia tăng trong giai ñoạn nảy mầm khi bề mặt
của hạt giống ñược bao bằng một lớp chitosan. Khi sử dụng chitosan làm vỏ
bao của hạt, khả năng kháng nấm và vi khuẩn của chitosan hỗ trợ hữu hiệu
cho sự nảy mầm và sự phát triển của cây trồng.
+ Chất bổ sung vào thức ăn gia súc
Các khảo sát liên quan ñến việc bổ sung chitin và chitosan vào thức ăn
gia súc cho một số kết quả sau:
- Ở gà mái và gà giò, chitin và chitosan cho ăn hầu như ñược tiêu hoá
hoàn toàn.
- Ở thỏ khoảng 30% lượng chitin cho ăn ñược tiêu hoá hoàn toàn. Tỉ lệ
này hầu như không thay ñổi sau 25 ngày cho ăn liên tục. Trong khi ñó,
chitosan ñược tiêu hoá 35% sau 5 ngày cho ăn và khả năng này tăng tới
80% sau 15 ngày. Điều này có lẽ là do sự gia tăng số lượng vi khuẩn
ñường ruột, Antoni (2005)[73].




11

+ Kích thích tăng trưởng thực vật
Hiện nay, oligoglucosamine ñược xếp vào nhóm ñiều hoà sinh trưởng
thế hệ mới (Zubay, 1998)[75]. Hiện nay ñang ñược nghiên cứu sử dụng trong

nuôi cấy mô thực vật cho phong lan (Nagasawa, 2002, Khin Lay Nge, 2002).
Chvagrit (2002) thử nghiệm chitosan chiếu xạ ñể kích thích sinh trưởng
cho phong lan sau 30 ngày sinh khối rễ và cây tăng từ 20-60% so với ñối
chứng ở nồng ñộ thích hợp nhất là 50 ppm. (Sasitorn, 2002) phun chitosan
cho rau cải có thể tăng năng suất từ 13-31%.
Cơ chế tác ñộng của chitosan, oligoglucosamine ñã ñược làm sáng tỏ
bằng kỹ thuật sinh học phân tử. (Hadwiger, 2002)[76] ñã chứng minh
oligoglucosamine là tín hiệu phân tử hoạt hoá và tăng cường hoạt ñộng của
hàng loạt gen trong hệ thống ñề kháng của thực vật và các gen liên quan ñến
trao ñổi chất như chitinase, chitosanase, glucanase, tăng cường tổng hợp
phytoalexin, proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp xenlulose, lignin,…
Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan và nhất là
oligoglucosamine còn khá mới mẻ. (Nguyễn Quốc Hiến, 1999) có nghiên cứu
thu nhận các oligoalginate tách ra từ rong biển ñể sử dụng trong nông nghiệp.
Sau ñó, (Nguyễn Quốc Hiến, Phạm Thị Lệ Hà, 1999) cũng nghiên cứu chế tạo
chitosan oligomer bằng kỹ thuật bức xạ gamma. Tuy nhiên, phương pháp này
còn có nhiều nhược ñiểm so với phương pháp enzyme là giá thành cao, các
phân ñoạn oligomer có khối lượng phân tử không tập trung, vì vậy hoạt tính
sinh học thường thấp.
Ngoài ra, ở Việt nam chitosan còn ñược nghiên cứu trong bảo quản trái
cây như chuối, vải thiều, cà chua, dưa chuột (Châu Văn Minh, 1996). Sản
phẩm ñược bảo quản lâu hơn, màu sắc tươi tự nhiên hơn so với ñối chứng.
+ Thuốc bảo vệ thực vật sinh học
Chitosan và chitosan oligomer có hoạt tính kích thích tăng trưởng thực
vật, tăng số lượng vi sinh vật có lợi và hạn chế các nấm gây hại trong ñất,
hoạt hóa tăng cường hệ thống ñề kháng của thực vật.


12

(Suwalee, 2002) thử nghiệm phun chitosan cho cây ngô ñể trị bệnh bạc
lá, kết quả cho thấy nếu sử dụng nồng ñộ 80 ppm thì chitosan hiệu quả hơn và
an toàn hơn so với các loại thuốc bảo vệ thực vật trên thị trường. (Nguyễn
Anh Dũng, 2006)[62] nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer và chitosan
oligomer cải biến ñể kháng nấm Fusarium, vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho
lạc Pseudomnas solanacerum và tuyến trùng ký sinh Meloidogine incognita,
số lượng tuyến trùng ký sinh giảm từ 6-8 lần sau khi tưới chitosan oligomer 3
tháng. (Rabea, 2004) cũng nghiên cứu tổng hợp alkyl và aryl-chitosan sử
dụng làm thuốc trừ nấm và trừ sâu.
+ Bảo quản nông sản
Trong bảo quản thực phẩm, chitosan không những phát huy khả năng
kháng khuẩn và nấm, mà còn giúp ñiều chỉnh môi trường bên trong rau quả
thông qua kiểm soát quá trình trao ñổi khí giữa rau quả và môi trường
(Nguyễn Anh Dũng và các cộng sự, 1999). Dung dịch chitosan ñã ñược dùng
ñể tạo lớp màng bảo quản hoa quả và rau củ chống vi khuẩn và nấm. Ở Nhật,
dung dịch chitosan cũng ñược phun lên táo và cam cho mục ñích này. Nghiên
cứu của (André Bégin, 2003)[77] cũng ñề xuất quy trình bảo quản dâu bằng
chitosan. Chitosan còn ñược sử dụng ñể làm bao bảo vệ chống sương giá
(Andreu, 2003)[14].
(Ghaouth, 1996) nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế các
loại nấm gây hại sau thu hoạch rau quả như Rhizopus, Colletotrichum,
chitosan bảo quản dâu tươi và các loại trái cây khác lâu hơn do hạn chế nấm
gây hư thối và ức chế hô hấp. (Fajado, 1994) cho thấy chitosan ức chế nấm
mốc sinh ñộc tố A. flavus trên lạc, ñậu tương.
Sử dụng chitosan ñể bảo quản trái cây cũng rất ñược chú ý. Chitosan ñã
ñược sử dụng ñể bảo quản xoài, cam, dâu tây (Piyabutr, 2002; Varaporn,
2002; Chucheep, 2002). Sử dụng chitosan bao trái cây (coating) có thể kéo
dài thời gian bảo quản 15 ngày ở nhiệt ñộ phòng so với ñối chứng.

13

(Hong Kyoon No, Na Young Park, Samuel P. Meyers, 2002) cho thấy
chitosan có hoạt tính kháng khẩn cao hơn chitosan oligomer. Chitosan ñã ức
chế sự sinh trưởng của hầu hết các loại vi khuẩn và có hiệu quả kháng khuẩn
ñối với vi khuẩn gram dương cao hơn vi khuẩn gram âm. Chitosan ñược xem
như là một chất phụ gia thực phẩm ở Hàn Quốc và Nhật Bản trước năm 1995
và 1983. Chitosan với hoạt tính kháng khuẩn cao sẽ ngăn chặn những thực
phẩm bị hỏng do vi khuẩn hoặc kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm.
(Devlieghere, 2004) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và
ứng dụng trong bảo quản rau quả và thực phẩm. Chitosan nghiên cứu có mức
ñộ deacetyl hóa 95%, khối lượng phân tử 43 kDa. Kết quả cho thấy chitosan
có khả năng kháng mạnh ñối với vi khuẩn gram âm, chỉ số MIC là < 60 ppm,
trong khi ñó nấm men và vi khuẩn gram dương là 100 ppm.
• Ứng dụng của chitosan trong lĩnh vực sinh học và y học
Đã có rất nhiều thử nghiệm ñã ñược tiến hành ñể xác nhận tính an toàn
của chitosan như: thử nghiệm khả năng gây ñột biến; khả năng gây ñộc cấp
tính; bán cấp tính và mãn tính; khả năng gây sốt; làm tan máu và gây dị ứng
(Antoni, 2005).
Số liệu ghi nhận trên thỏ, gà mái và gà giò khi ñược cho ăn chitosan với
liều lượng 0,7- 0,8g/kg khối lượng cơ thể/ngày trong 239 ngày là không có
triệu chứng bất thường nào. Khả năng tiêu hoá chitosan biểu kiến ở thỏ là 28-
38% còn ở gà mái, gà giò là hoàn toàn. Khi tiêm chitosan và các phân ñoạn
chitosan vào thỏ với liều lượng 4,5mg/kg khối lượng cơ thể/ ngày trong 7-11
ngày, không phát hiện ñược biểu hiện bất thường nào (Antoni, 2005). Trong
nghiên cứu kéo dài 12 tuần trên người, không có triệu chứng lâm sàng nào
ñược ghi nhận ở những người uống chitosan trong so với những người uống
thuốc giả. Chỉ có 2,6 – 5,4% ñối tượng có triệu chứng buồn nôn và táo bón
tuy nhiên rất nhẹ và tạm thời (Lin, 2004). Với tất cả các bằng chứng trên, việc