Khảo sát khả năng sản xuất cellulase ở một số chủng Trichoderma reesei sau xử lý đột biến

iii


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp
đỡ và góp ý kiến tận tình của quý thầy cô trƣờng Đại học Bách khoa Thành phố Hồ
Chí Minh.
Trƣớc hết em xin cảm ơn đến quý thầy cô trƣờng Đại học Bách khoa Thành phố
Hồ Chí Minh đặc biệt các thầy cô thuộc bộ môn Công nghiệ sinh học đã tận tình dạy
bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng và tạo điều kiện tốt nhất cho em
thực hiện và hoàn thành luận văn.
Em xin giửi lời biết ơn sâu sắc đến thạc sĩ Hoàng Mỹ Dung đã dành rất nhiều
thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp HC06BSH đã luôn sát cánh
giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng và quá trình làm luận văn.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình yêu quý luôn bên cạnh, theo sát từng bƣớc đi
trong quá trình học tập và trƣởng thành của em.
Mặc dù em đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và
năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận
đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn.








iv

TÓM TẮT
Enzyme cellulase đƣợc ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, thực phẩm, thức
ăn gia súc, các ngành công nghiệp giấy, bột giấy. Nấm Trichoderma reesei đã đƣợc
nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong việc sản xuất enzyme cellulase. Việc nghiên cứu
cải tiến giống nguyên thủy là một bƣớc quan trọng trong mọi quy trình lên men. Sự cải
tiến có thể đạt đƣợc bằng cách tạo đột biến, lựa chọn hoặc tái tổ hợp gen.
Đề tài “Khảo sát khả năng sản xuất cellulase ở một số chủng Trichoderma
reesei sau xử lý đột biến” cũng nhằm mục đích nghiên cứu cải tiến giống nguyên thủy
bằng phƣơng pháp đột biến gen.
Chủng Trichoderma reesei đƣợc xử lý đột biến bằng tác nhân vật lý là tia UV
và vi sóng. Sau khi sàng lọc và khảo sát hoạt tính CMCase, bƣớc đầu đã khẳng định
tạo đƣợc chủng T3 có hoạt tính CMCase cao hơn chủng nguyên thủy.










v

MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH viii
DANH MỤC BẢNG ix
MỞ ĐẦU x

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1
1.1. Giới thiệu enzyme cellulase 1
1.1.1. Phân loại và danh pháp quốc tế 1
1.1.2. Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase 3
1.1.3.1. Giới thiệu cellulose cơ chất của cellulase 3
1.1.3.2. Cấu tạo cellulose 4
1.1.3.3. Tính chất chung của cellulose 5
1.1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase 6
1.2. Giới thiệu chung về nấm mốc Trichoderma reesei 7
1.2.1. Vị trí phân loại 7
1.2.2 Nguồn gốc 7
1.2.3. Đặc điểm hình thái 7
1.2.4. Đặc điểm sinh lý 8
1.3. Giới thiệu các phƣơng pháp xử lý đột biến 11
1.3.1. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân hóa học 11
1.3.2. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lý 12
1.3.3. Gây đột biến bằng tác nhân sinh học 12
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Nguyên liệu 15
2.1.1. Giống vi sinh vật 15
2.1.2. Thành phần môi trƣờng 15
2.1.3. Hóa chất sử dụng 15
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị 16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 16

vi

2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 16
2.2.1.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và giữ giống 16

2.2.1.2. Phƣơng pháp gieo cấy nấm mốc 16
2.2.1.3. Phƣơng pháp xác định số tế bào vi sinh vật 17
2.2.1.4. Phƣơng pháp trải đĩa 17
2.2.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính CMCase 18
2.3. Phƣơng pháp thiết kế thí nghiệm 20
2.3.1. Tạo chủng đột biến Trichoderma reesei 21
2.3.1.1. Xử lý đột biến bằng tia UV 21
2.3.1.2. Xử lý đột biến bằng microwave 22
2.3.2. Khảo sát khả năng phân giải cellulose 22
2.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng
hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc 23
2.3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của
trên môi trƣờng bán rắn các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc 23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 24
3.1. Xử lý đột biến 24
3.1.1. Xử lý đột biến bằng tia UV 24
3.1.1.1. Tỷ lệ sống sót sau khi xử lý đột biến bằng tia UV 24
3.1.1.2. Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử
lý đột biến bằng tia UV. 25
3.1.2. Xử lý đột biến bằng microwave 25
3.1.2.1. Tỷ lệ sống sót sau khi xử lý đột biến bằng microwave 25
3.1.2.2. Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử
lý đột biến bằng microwave 26
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp
cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc 27
3.3. Kiểm tra tính ổn định của chủng đột biến 31

vii

3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase của chủng

đột biến trên môi trƣờng bán rắn 33
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40
PHỤ LỤC



















viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian của cellulase 2
Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc cellulase 3
Hình 1.3: Cấu tạo phân tử D-glucose 4

Hình 1.4: Liên kết β-1,4 glucozit giữa các gốc glucose 4
Hình 1.5: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử cellulose 5
Hình 1.6: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 6
Hình 1.7: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase 7
Hình 1.8: Trichoderma reesei dƣới kính hiển vi 8
Hình 1.9: Tính đối kháng với nấm bệnh của Trichoderma reesei 9
Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm 21
Đồ thị 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV 25
Đồ thị 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave .
……………………………………………………………………………………… 26
Hình 3.1: Đƣờng kính vòng phân giải của chủng T3 và Tc 27
Đồ thị 3.3: Lƣợng sinh khối thu đƣợc sau 7 ngày nuôi cấy 28
Hình 3.2: Dịch enzyme thô thu đƣợc khi nuôi trên môi trƣờng lỏng 29
Đồ thị 3.4: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến nuôi cấy trên
môi trƣờng lỏng 31
Hình 3.3: Canh trƣờng lên men sau 2 ngày 31
Hình 3.3: Dịch enzyme thô thu đƣợc từ môi trƣờng lên men bán rắn 33
Hình 3.4: Sự phát triển cuả Trichoderma reesei môi trƣờng bán rắn sau 2 ngày lên men.
33
Đồ thị 3.5: Hoạt tính CMCase của Tc, T3 trên môi trƣờng bán rắn 34




ix


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Bảng phân loại cellulase 1
Bảng 1.2: Tác động của việc xử lý đột biến lên sự phát triển của chủng nấm 13

Bảng 1.3: Một số chủng đột biến Trichoderma reesei 14
Bảng 2.1: Môi trƣờng sử dụng 15
Bảng 2.2: Dụng cụ và thiết bị 16
Bảng 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV 24
Bảng 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng
microwave………… 26
Bảng 3.3: Kết quả thu sinh khối lên men lần 1 (mg/ml) 28
Bảng 3.4: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến nuôi cấy trên
môi trƣờng lỏng (UI/g) 30
Bảng 3.5: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 4 32
Bảng 3.6: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 9 32
Bảng 3.7: Hoạt tính CMCase (UI/g) của Tc, T3 trên môi trƣờng bán rắn 34










x

MỞ ĐẦU
Trichoderma reesei là loài nấm mốc đã có lịch sử lâu đời trong nền công nghiệp
sản xuất enzyme. Các ứng dụng của enzyme cellulase, xylanlase sản xuất bởi enzyme
này đƣợc tìm thấy trong thực phẩm, thức ăn gia súc, dệt may, dƣợc phẩm và các ngành
công nghiệp giấy và bột giấy. Nấm Trichoderma reesei không gây bệnh cho ngƣời.
Trong những năm gần đây các kỹ thuật di truyền cũng đã đƣợc sử dụng để cải thiện

các chủng sản xuất công nghiệp của nấm Trichoderma reesei và ngoài ra nhiều kinh
nghiệm trong việc sử dụng an toàn chủng tái tổ hợp Trichoderma reesei đã đƣợc tích
lũy. Vì vậy T. reesei có thể đƣợc coi không chỉ là một sinh vật sản xuất an toàn
enzyme tự nhiên của nó mà còn là chủng an toàn cho sản xuất các gen vô hại khác.
Khóa luận nhằm mục đích tạo đƣợc chủng Trichoderma reesei đột biến có khả
năng sản xuất enzyme cellulase cao hơn chủng gốc.

Chƣơng 1: Tổng quan

1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu enzyme cellulase
Trong thiên nhiên enzyme cellulase nằm trong một phức hệ các enzyme
hemicellulase, pentozanase và có một tên chung là xitolase. Enzyme này đƣợc vi sinh
vật tổng hợp đặc biệt là nấm mốc sản sinh hệ enzyme có hoạt lực cao. Cho tới nay
ngƣời ta vẫn chƣa tách đƣợc riêng cellulase ra khỏi hệ enzyme để sản xuất theo quy
mô công nghiệp. Đây là một loại enzyme có ý nghĩa thực tiễn rất lớn trong công
nghiệp rƣợu bia và các thức uống lên men từ dịch chiết trái cây, trong công nghiệp sản
xuất thức ăn cho gia súc và một hƣớng sử dụng mới trong xử lý rác thải, phế phụ liệu
nông nghiệp.
1.1.1. Phân loại và danh pháp quốc tế
Bảng 1.1: Bảng phân loại cellulase [17, 8]
Cellulase
Cơ chất
Cơ chế
Sản phẩm
Endo-cellulase:
E.C.3.2.1.4:
CAS 9012-54-8

Cellulose kết tinh
Cellulose vô định
hình
Cắt liên kết giữa các
chuỗi cellulose
Chuỗi đơn
cellulose
Exo-cellulase
(cellobiohydrolase):
E.C.3.2.191: CAS
37329-65-0
Chuỗi đơn cellulose
Cellulose kết tinh
Cắt liên kết nội
chuỗi (1 vị trí cắt sau
2-4 glucose)

Tetrasaccharides,
disaccharides
Cellobiase:
E.C.3.2.1.21: CAS
9001-22-3
Tetrasaccharides,
disaccharides
Cắt liên kết
glycoside giữa 2
glucose
Monosaccharide

Ban đầu enzyme cellulase đƣợc phân chia thành 2 loại dựa trên khả năng phân

hủy cellulose của enzyme: endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiohydrolase (EC

Chƣơng 1: Tổng quan

2
3.2.1.91). Trong đó, cellobiohydrolase có khả năng phân hủy mạnh cellulose kết tinh
so với endoglucanase [20]. Tuy nhiên hiện nay tồn tại một hệ thống phân loại cellulase
thành 3 nhóm theo cơ chế xúc tác của enzyme [17].
1.1.2. Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian

Hình 1.1: Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian của cellulase [26]
Cellulase có bản chất là protein đƣợc cấu tạo từ các đơn vị axit amin bởi liên kết
peptit –CO-NH, tuy nhiên trong cấu trúc có gắn kết những phần phụ khác. Cấu trúc
không gian cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần
đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhƣng đƣợc gắn thêm vùng glycosil hóa và
cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose. Vùng gắn kết cellulose có cấu tạo khác với
liên kết thông thƣờng –CO-NH- của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng
glycosil hóa có ảnh hƣởng đến hoạt tính xúc tác của ezyme.
Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản ứng.
Thông thƣờng cellulose chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một số trƣờng
hợp đặc biệt.
Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose. Đơn
vị chức năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hƣớng cơ chất là cellulose
đến trung tâm xúc tác của cellulase. Bên cạnh đó, một số cellulose cũng tham gia vào
quá trình xúc tác bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng tinh thể. Một số
khác lại có xu hƣớng liên kết với cellulose vô định hình thay vì cellulose dạng tinh thể
[4].

Chƣơng 1: Tổng quan

3
Trung tâm tạo liên kết với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc trƣng
cho enzyme thủy phân cellulose mà nó còn cấu thành tiểu đơn vị xúc tác cấu trúc
cellulosome.
Trung tâm tạo liên kết với cellulose liên kết thuận nghịch với cellulose nên nó
đƣợc ứng dụng trong công nghệ sản xuất protein [20].

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc cellulase
A. Cellulase ở nấm và một số vi khuẩn chỉ chứa 1 trung tâm tạo liên kết với
cellulose
B. Cellulase ở một số vi khuẩn chứa 2 trung tâm tạo liên kết với cellulose
C. Sơ đồ cấu trúc cellulosome (cấu trúc gồm nhiều enzyme, hoạt động
ngoài tế bào)
Vùng không xúc tác giữ vai trò cầu nối giữa trung tâm tạo liên kết với
cellulose và trung tâm xúc tác. Đây chính là vùng đại diện cho sự tƣơng tác giữa
protein – protein và giữa protein – đƣờng trong quá trình tổng hợp enzyme [6].
1.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase
1.1.3.1. Giới thiệu cellulose cơ chất của cellulase
Cellulose rất phổ biến trong tự nhiên. Hàng năm lƣợng cellulose do thực vật tạo
nên là 10
11
tấn. Nếu nhƣ sự tân tạo ra cellulose là do cây xanh thì sự phân hủy

Chƣơng 1: Tổng quan

4
cellulose lại chủ yếu do vi sinh vật. Do đó mà quá trình phân hủy cellulase bằng
enzyme từ vi sinh vật có một ý nghĩa lớn về lý thuyết cũng nhƣ về thực tế.
Cellulose là polysacharit chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông nó
chiếm khoảng 90% còn trong gỗ hơn 50%. Các đơn vị cấu tạo cellobiose gắn với nhau

nhờ liên kết glucozit. Phân tử cellulose chứa từ 1400 đến 10000 gốc glucose. Phân tử
lƣợng của các cellulose thu đƣợc từ các nguồn khác nhau xê dịch trong giới hạn khá
rộng rãi (từ 5.10
4
tới 1.10
6
hoặc cao hơn nữa). Dùng phƣơng pháp phân tích của tia
Rontgen, ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng phân tử cellulose có dạng sợi. Các dạng
sợi của cellulose lại gắn với nhau nhờ liên kết hydro tạo nên cấu trúc mixen của
cllulose.
1.1.3.2. Cấu tạo cellulose
Cellulose là một loại homocellulose gồm nhiều đơn vị β-D-glucose và đƣợc nối
với nhau bởi liên kết β-D-1,4 glucozit. Mức độ polyme hóa của phân tử cellulose thay
đổi nhiều từ vài chục đến vài vạn đơn vị β-D-glucose.

Hình 1.3: Cấu tạo phân tử D-glucose [14]
.
Hình 1.4: Liên kết β-1,4 glucozit giữa các gốc glucose [28]

Chƣơng 1: Tổng quan

5
Phân tử cellulose kéo thành chuỗi dài, nhiều chuỗi nằm song song với nhau và
chúng gắn kết với nhau thông qua liên kết hydro. Nhƣ vậy cầu nối hydro có thể tạo
nên giữa hai chuỗi cellulose trong cùng một lớp và giữa hai chuỗi cellulose ở hai lớp
khác nhau.
Ở những vùng tinh thể có mạch cellulose kết tinh với nhau theo một trật tự đều
đặn nhờ liên kết hydro nối với nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm
hydroxyl thứ 3 của mạch khác nhƣng vùng vô định hình thì các mạch tập hợp lại với
nhau bằng lực hút Vanderwaal.

Hình 1.5: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử cellulose [29]
1.1.3.3. Tính chất chung của cellulose
Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền, không tan trong nƣớc
nhƣng có thể hút nƣớc và trƣơng nở lên. Cellulose có cấu tạo từ các đơn vị C
6
H
10
O
5

nhƣng cấu tạo phức tạp hơn rất nhiều so với tinh bột và cho màu nâu với iod. Trong tế
bào thực vật cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin, ligin. Điều này ảnh
hƣởng rất lớn đến sự phân hủy cellulose của enzyme. Dạng kết tinh vô định hình dễ bị
phân hủy bởi enzyme vi sinh vật, nhƣng dạng kết tinh thì có cấu trúc rất chặt chẽ nên
khó bị phân hủy. Ở các loại gỗ càng có nhiều vùng kết tinh thì gỗ càng chắc. Muốn
phá hủy hoàn toàn cellulose thì trƣớc tiên phải chuyển chúng sang dạng vô định hình
nhờ các loại enzyme khác có ở vi sinh vật.

Chƣơng 1: Tổng quan

6
1.1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase
Ban đầu endocellulase sẽ cắt liên kết giữa các chuỗi cellulose để hình thành các
monomer. Sau đó exocellulase cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành
cellobiose (tetrasaccharides, disaccharides). Sau cùng cellobiase còn đƣợc gọi là β-
glucosidase, tham gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose.

Hình 1.6: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase [30]
Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase đối với cơ chất có thể đƣợc cụ thể hóa

theo sơ đồ 1.7. Ban đầu vùng xúc tác kết nối với vùng liên kết nhờ tác nhân liên kết
linker (bƣớc 1). Phức hợp hình thành thực hiện chức năng định vị chuỗi kết thúc. Sau
đó phức hệ enzyme – cơ chất đƣợc hình thành (bƣớc 3). Thủy phân liên kết β-
glycosidic để tạo thành sản phẩm cellobiose nhờ β- glucosidase là một phần nhỏ trong
số các protein ngoại bào do T.reesei tiết ra (bƣớc 4).

Chƣơng 1: Tổng quan

7

Hình 1.7: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase [11]
1.2. Giới thiệu chung về nấm mốc Trichoderma reesei
1.2.1. Vị trí phân loại
Trichoderma reesei thuộc giới Fungi, nhóm Ascomycota, ngành Pezizomycotina,
lớp Sordariomycetes, bộ hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma, loài T.
reesei.
1.2.2 Nguồn gốc
Trichoderma đƣợc tìm thấy khắp mọi nơi trừ ở những vĩ độ cực Nam và cực
Bắc. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu
rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết,
hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J.
Samuels, 2004). Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí
sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm
khác nhau.
1.2.3. Đặc điểm hình thái
Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ
khuẩn ty.
Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối
nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn,
không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình

cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng
đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng của Trichoderma có tốc độ

Chƣơng 1: Tổng quan

8
phát triển nhanh,
chúng có thể đạt đƣờng kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi
cấy ở 20
0
C.
Khuẩn lạc tăng trƣởng nhanh (5 – 9 cm). Sự hình thành khuẩn lạc kết lại thành
chùm hoặc tỏa rộng ra hơn, màu xanh xám. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc màu
vàng nhạt. Cuống bào tử thƣờng không phân nhánh rộng và thƣờng có sự sắp xếp lỏng
lẻo. Nhánh thƣờng ở dạng đôi, đơn hoặc mọc vòng, thƣờng ngoằn nghèo.
Bào tử hình cầu tới elip, màu hơi xanh tới xanh đậm, kích thƣớc từ (4 – 4,8) x
(3,5 – 4) µm. Sợi nấm màu trắng, khuẩn lạc màu xanh.

Hình 1.8: Trichoderma reesei dƣới kính hiển vi (nguồn bởi G.B.Sharples)
1.2.4. Đặc điểm sinh lý
Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2.5 đến 9.5.
Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ƣu thƣờng là 25 –
30
0
C. Một vài chủng phát triển tốt ở 35
0
C. Một số ít phát triển đƣợc ở 40
0
C. Hình
thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau.

Ở 35
0
C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thƣờng với sự hình thành bào tử nhỏ và ở
mép bất thƣờng, ở 37
0
C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.
Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme nhƣ chitinolytic
(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2 enzyme
chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với
Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy
nhiên cơ chế của tác động này chƣa đƣợc biết rõ [24].
Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tƣợng đột

Chƣơng 1: Tổng quan

9
biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác
động của điều kiện môi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng
trong kiểu gen cũng nhƣ kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra
những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là
những chủng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng nhƣ trong việc tạo chế phẩm sinh
học kiểm soát mầm bệnh thực vật.
Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng
Nấm Trichoderma đƣợc sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại nấm
Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis spp.,
Fusarium spp. và Crinipellis spp. gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở
cam quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng nhƣ tiêu, bông, nho, bắp, đậu
nành, mận, táo, cà rốt, hành, rau diếp do có tính đối kháng với các nấm hại này bằng
cách cạnh tranh dinh dƣỡng, kí sinh với nấm hại hoặc tiết kháng sinh, enzym (chitinase,
β-1,3-glucanase) phân hủy vách tế bào nấm gây bệnh cây trồng [14].

Hình 1.9: Tính đối kháng với nấm bệnh của Trichoderma reesei [ 32]
Tiết kháng sinh: T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự
phát triển của các loài Rhizoctonia solani và Pythium spp. Isonitriles đƣợc sản xuất bởi
T. hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của
nấm bệnh. Ở một vài loài T. atroviride và T. reesei tiết 6-pentyl alpha-pyrone (α –
pyrones) có hƣơng dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy
mầm của những noãn bào tử nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của
Botrytis cinnerea. Peptaibols do T. polysporum, harzianum, koningii sản xuất giúp

Chƣơng 1: Tổng quan

10
ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời
hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ thành tế bào ngăn chăn sự phát triển của mầm bệnh
và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. T. virens, koningii, viride sản xuất
sesquiterpenes và polyketides đƣợc T. harzianum sản xuất. Steroids (viridin) là một
độc tố thực vật có hiệu lực nhƣ một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của
bào tử, đƣợc sản xuất bởi T. virens.
Ký sinh: Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hƣớng hóa
chất, nó ký sinh phân nhánh hƣớng về những nấm đã đƣợc định trƣớc (do những nấm
này tiết ra các hóa chất). Ngoài ra, vật kí sinh và vật đối kháng đƣợc Trichoderma
nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự nhiên hay hóa học (qua trung
gian là pectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời,
Trichoderma kí sinh vào và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các
dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease. Những
enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây
thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. Không
những thế, Trichoderma còn có khả năng tiết các enzyme phân giải nhƣ chitinase,
glucanase, protease giúp bào mòn thành tế bào sau khi kí sinh và cuộn quanh nấm gây

bệnh đối kháng với nó. Khi kí sinh vào cây T. asperellum tiết cellulase, cho phép nó
tấn công những nấm nhƣ Phytophthora spp. và Pythium spp. khi chúng bám vào cây
trồng.
Cạnh tranh: Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng,
làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dƣỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng
những bào tử chống chịu (chlamydospores). Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô
già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập
vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào
những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ,
bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đƣờng xâm nhiễm của nấm
Botrysis spp. và Sclerotina spp Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch
tiết của cây với nấm Phytium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc
thành khuẩn ty của những túi bào tử Phytium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm
vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Phytium spp. bằng cách sử dụng

Chƣơng 1: Tổng quan

11
dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Phytium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn
đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh
vào những vị trí bị thƣơng, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh.
Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng cải tạo đất trồng, làm tăng độ phì nhiêu
cho đất vì thế làm tăng năng suất cây trồng nhờ khả năng phân giải phospho khó tan có
rất nhiều trong đất mà cây không hấp thụ đƣợc và khả năng tiết các enzyme phân hủy
chất hữu cơ nhƣ cellulase, glucanase thành các dạng dễ hấp thu. Bên cạnh đó,
Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ nhƣ loại bỏ mầm bệnh, làm tăng sự
sinh trƣởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm mà Trichoderma tác động đến sẽ
kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzyme bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ
đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh.
1.3. Giới thiệu các phƣơng pháp xử lý đột biến

Các tác nhân làm tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên đƣợc gọi là tác
nhân đột biến (mutagen). Các tác nhân vật lý nhƣ phóng xạ, tia X, tia tử ngoại gây đột
biến. Nhiều hóa chất là tác nhân gây đột biến nhƣ các đồng đẳng của các base nitric,
HNO
2
(nitrous acid), các chất alkyl hóa mạch… các đột biến này gọi là đột biến nhân
tạo hay đột biến cảm ứng (induced mutation). Ngoài ra ngày nay kỹ thuật phân tử đang
rất phổ biến để gây đột biến chọn lọc.
1.3.1. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân hóa học
Một số chất hóa học có khả năng gây ra đột biến điểm trong gen. Các chất đó
đƣợc chia làm 4 nhóm sau [1]:
- Nhóm oxy hóa khử: nhóm này bao gồm HNO
2
, H
2
O
2
, aldehide,
hydroxylanime. Cơ chế chuyển hóa của các nhóm này là chúng có khả năng tác động
trực tiếp vào các base và chuyển hóa chúng sang một chất khác.
- Các chất ức chế tổng hợp base nitơ trong cấu trúc DNA nhƣ coffein, ethyl
methane…
- Các chất đồng đẳng với base nitơ nhƣ 5-bromuracil.
- Các chất alkyl hóa làm đứt mạch DNA. Các tác nhân hóa học thƣờng gây ra
những biến đổi sâu sắc trong DNA nhƣng các biến đổi thu đƣợc thƣờng không có định
hƣớng.


Chƣơng 1: Tổng quan

12
1.3.2. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lý
Tia X, các tia phóng xạ α, β, γ, χ, các chùm tia neutron hoặc proton tia tử ngoại
đều là tác nhân gây đột biến. Trừ tia tử ngoại có khả năng xuyên thấu yếu nên chỉ tác
động nên các sinh vật đơn bào và giao tử, các tia khác đều có tác dụng gây đột biến lên
tất cả các dạng ở sinh vật [1]. Tác dụng đột biến của tia phóng xạ có hai đặc điểm:
- Không ngƣỡng tác dụng tức không có liều lƣợng vô hại
- Số lƣợng đột biến tỉ lệ thuận với liều lƣợng chiếu xạ
Phóng xạ ion hóa: các tia phóng xạ nhƣ: α, β, γ, χ, các chùm tia neutron hoặc
proton làm bắn các điện tử gây ion hóa và biến đổi DNA.
Phóng xạ không ion hóa: tia tử ngoại UV hoặc nhiệt làm tăng mức năng lƣợng
nguyên tử. Tia tử ngoại có bƣớc sóng dài (10
-6
– 10
-5
cm) nên khó tạo ion có lẽ chỉ tác
động nên chất hấp thu nó trực tiếp. Trong tế bào, các chất hữu cơ có mạch vòng chủ
yếu nhƣ purin và pirimidine hấp thu trực tiếp tia tử ngoại. Tia tử ngoại thƣờng tạo
dimer thymine gắn hai thymine kề nhau của một mạch. Sự phát minh ra các tác nhân
gây đột biến vật lý và hóa học làm tăng đáng kể nguồn đột biến phục vụ cho nghiên
cứu và chọn giống. Bài luận này sử dụng tác nhân vật lý để gây đột biến vì phƣơng
pháp này phổ biến, dễ thực hiện, không gây độc hại và hiệu quả tƣơng đối cao.
1.3.3. Gây đột biến bằng tác nhân sinh học
Ngày nay kỹ thuật phân tử đƣợc sử dụng rất rộng rãi và ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực khác nhau nhƣ nông nghiệp, sinh học, y học. Đột biến gây bởi kỹ thuật phân
tử là đột biến có tính chọn lọc, hiệu quả cao nhƣng đòi hỏi máy móc, trang thiết bị hiện
đại và kỹ thuật cao. Để nâng cao khả năng sản xuất cellulase, ngƣời ta dựa vào hệ gen
quy định sản xuất cellulase có sẵn trong Trichoderma reesei, tăng số bản sao gen biểu
hiện và chèn promotor mạnh vào gen đó.
Có thể tóm tắt các tác nhân gây đột biến, các đột biến mà nó gây ra, ảnh hƣởng

của chúng trên DNA nhƣ bảng 1.2

Chƣơng 1: Tổng quan

13
Bảng 1.2: Tác động của việc xử lý đột biến lên sự phát triển của chủng nấm
[22]
Tác nhân đột biến
Đột biến gây ra
Ảnh hƣởng lên DNA
Mức độ
Bức xạ
Bức xạ ion hóa
1. Tia X, γ

Bƣớc sóng ngắn
2. Tia UV

Hóa chất tác động lên
base
3. 5-chlorouracil
5-bromouracil
4. 2-aminopurin
5. NH
2
OH
6. HNO
2

Tác nhân alkylating

7. N-Methyl-N”-nitro
N-nitroguanidine
8.ethyl methanesufonate
Tác nhân intercalating
10. Ethydium bromide,
acrydinedys
Sinh học
11. Phage, plasmid, đảo
đoạn DNA


Bẻ gãy 1 hoặc 2 đoạn
DNA

Biến đổi pyrimidine và bẻ
gãy liên kết trong DNA


Lỗi trong bắt cặp

Lỗi trong sao chép DNA
Diamin hóa cytosin
Diamination A, C, G


Methyl hóa, pH cao
Ankyl hóa A và C
Ankyl hóa base A, C

Gắn xen vào giữa 2 base

Thay thế base, gãy đoạn


Phá vỡ cấu trúc, cấu trúc thay
đổi

Bẻ gãy, làm mất, thay đổi cấu
trúc, chyển GC AT


AT GC, GC AT
AT GC, GC AT

GC  AT
Điều khiển dịch mã, loại bỏ AT
 CG và /hoặc GC  AT

GC  AT
GC  AT
GC  AT

Biến đổi cấu trúc, mất plasmid


Mất đoạn, nhân đôi, sự chèn vào


Cao

Trung bình



Thấp
Thấp
Thấp
Thấp
Trung bình


Cao
Cao
Cao

Thấp


cao


Chƣơng 1: Tổng quan

14

Một số chủng đột biến Trichoderma reesei sản xuất enzyme cellulase cao đã
đƣợc nghiên cứu:
Bảng 1.3: Một số chủng đột biến Trichoderma reesei [16,18, 24]

Chủng gốc – xuất
xứ
Chủng đột biến
Xuất xứ
Tác nhân
QM9414 – MỸ
M-B1
ĐÀI LOAN
UV, microwave
M-B2
M-B3
M-B5
M-B7
VTT-D-78085 –
PHẦN LAN

VTT-D-79124
PHẦN LAN
Either-N-methyl-
N’-nitro-N-
nitrosoguanidine
(NG)
Tia γ
VTT-D-79125
VTT-D-80130
VTT-D-80131
VTT-D-80132
VTT-D-80133
ALK02221 – MỸ
ALK0376

MỸ
Plasmid pALK496
ALK03862
ALK03761

Chất lƣợng giống là một trong những tiêu chí luôn luôn phải đƣợc hoàn thiện và
nâng cao. Trong các công nghệ lên men hiện đại ngƣời ta phải sử dụng các giống đã
đƣợc biến đổi nguồn gốc di truyền để nâng cao khả năng chuyển hóa vật chất của
chúng đồng thời nhằm mục đích ổn định chất lƣợng và nâng cao năng suất sản phẩm.
Khóa luận này cũng nhằm mục đích tạo ra chủng có khả năng sản xuất cellulase cao.

Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

15

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Giống vi sinh vật
Giống Trichoderma reesei nhận từ nguồn giống Bộ môn Công nghệ sinh học
trƣờng Đại học Bách khoa thành phố HCM.
2.1.2. Thành phần môi trƣờng
Các môi trƣờng đặc thù ở từng thí nghiệm sẽ đƣợc nêu rõ ở thí nghiệm đó.
Thành phần các môi trƣờng tham khảo phụ lục 1 Sau đây là các loại môi trƣờng sử
dụng trong luận văn và mục đích sử dụng của chúng.
Bảng 2.1: Môi trƣờng sử dụng
STT
Môi trƣờng
1
PGA: môi trƣờng giữ và nhân giống

2
Môi trƣờng CMC: thử khả năng phân giải cellulose (MT2)
3

Môi trƣờng dịch khoáng: lên men lỏng, xác định hoạt tính
CMCase (MT3)
4
Môi trƣờng bán rắn (MT4): lên men bán rắn, xác định ảnh
hƣởng của thời gian đến khả năng sản xuất enzyme cellulase
2.1.3. Hóa chất sử dụng
Hóa chất sử dụng phải rõ ràng về nguồn gốc xuất xứ, thành phần, thời hạn sử
dụng.
Hóa chất làm môi trƣờng và hóa chất dùng trong phân tích tham khảo phụ lục 2.

Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

16
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.2: Dụng cụ và thiết bị
1. Erlen 250 mL
12. Cân phân tích 4 số lẻ
2. Erlen 500 mL
13. Cân 2 số lẻ
3. Bercher 50, 100, 250, 500 mL
14. Bể ổn nhiệt
4. Ống hút các loại
15. Máy đo độ ẩm
5. Đũa khuấy
16. Máy đo pH
6. Các chai lọ đựng hóa chất

17. Máy ly tâm
7. Phễu lọc
18. Máy khuấy từ
8. Bình định mức các loại
19. Máy đo mật độ quang
9. Tủ sấy
20. Kính hiển vi quang học
10. Tủ ấm
21. Buồng đếm hồng cầu
11. Tủ lạnh
22. Máy xay sinh tố
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật
2.2.1.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và giữ giống
Sử dụng môi trƣờng PGA (Potato Glucose Agar), thành phần môi trƣờng PGA,
cách làm môi trƣờng tham khảo phụ lục 1.
Môi trƣờng sau khi đã qua pha chế, sử dụng que cấy mốc đã thanh trùng cấy
chuyền theo từng điểm hay gõ vào thành ống cho bào tử bung ra khắp bề mặt thạch.
Giống sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong thời gian 5 ngày, sau
đó bảo quản ở 4
0
C. Sau thời gian 2 tháng cấy chuyền giữ giống 1 lần để đảm bảo
nguồn dinh dƣỡng cho vi sinh vật.
2.2.1.2. Phƣơng pháp gieo cấy nấm mốc
Cho 10 ml nƣớc cất thanh trùng vào ống nghiệm, dùng que cấy đã thanh trùng
mài nhẹ trên mặt thạch để tách bào tử, cho chúng hoàn toàn nằm trong nƣớc nhƣ các

Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

17

dịch huyền phù. Sau đó đổ toàn bộ nƣớc chứa bào tử vào trong môi trƣờng nuôi cấy
(hay còn gọi là môi trƣờng nhân giống) và trộn kỹ. Mục đích của việc trộn kỹ là làm
cho các bào tử phân phối đều trong toàn bộ môi trƣờng nuôi cấy.
2.2.1.3. Phƣơng pháp xác định số tế bào vi sinh vật [2]
Xác định số tế bào vi sinh vật bằng phƣơng pháp pha loãng tới hạn. Ở thời điểm
cấy chuyền từ môi trƣờng nhân giống sang môi trƣờng sản xuất, lấy 1ml giống pha với
9 ml nƣớc cất vô trùng nhƣ vậy mẫu đã đƣợc pha loãng 10 lần. Cứ tiếp tục lấy 1 ml
của dung dịch mẹ pha với 9 ml nƣớc cất thì lại đƣợc một dung dịch khác có độ pha
loãng là 10 lần. Tƣơng tự nhƣ thế ta có đƣợc một loạt các dung dịch có độ pha loãng từ
cao cho đến thấp 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
,… Dùng buồng đếm hồng cầu để đếm bào tử
nấm mốc. Số tế bào trong 1 g mẫu nghiên cứu đƣợc tính bằng công thức sau:


Trong đó:
a: số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ)
b: số ô nhỏ trong 5 ô lớn (16 x 5 = 80 ô nhỏ)
400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm
0.1: thể tích dịch tế bào (tính bằng mm
3
) chứa trên ô trung tâm
10
3

: chuyển từ mm
2
sang ml (1000 mm
2
= 1 ml)
10
n
: độ pha loãng mẫu
Số tế bào đếm đƣợc trong 5 ô lớn phải trên 200 mới bảo đảm sự chính xác của
các phƣơng pháp.
2.2.1.4. Phƣơng pháp trải đĩa
Khi đã có dung dịch pha loãng, dùng pipetman hút 0,1 ml từ độ pha loãng bất
kỳ trong dãy pha loãng cấy vào trong môi trƣờng PGA đã chuẩn bị sẵn cho từng nhóm,
hoặc từng giống vi sinh vật định phân tích. Mỗi nồng độ ít nhất phải cấy 3 – 5 lần lặp
lại (số lần lặp lại càng nhiều thì kết quả tin cậy càng cao). Cần cấy ít nhất ở 3 nồng độ
Số tế bào/mL
=
a x 400/ 0.1 x 10
3
x 10
n

b