Khảo sát một số đặc tính sinh học và đặc điểm enzyme phytase từ bacillus subtilis BC2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI





CÙ THU HÀ



KHẢO SÁT MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ðẶC ðIỂM
ENZYME PHYTASE TỪ BACILLUS SUBTILIS BC
2







CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN VĂN GIANG

HÀ NỘI – 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong báo cáo này
là trung th
ực và chưa hề ñược sử dụng trong bất kỳ một báo cáo khoa học nào.
Tôi xin cam
ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện báo cáo này ñã
ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong báo cáo này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2013
H
ọc viên thực hiện


Cù Thu Hà

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


ii

LỜI CẢM ƠN

Sau m
ột thời gian thực tập ñể hoàn thành luận văn nghiệp tại Bộ môn Sinh
h
ọc phân tử và Công nghệ vi sinh - trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, ngoài sự
c
ố gắng nỗ lực của bản thân, em ñã nhận ñược sự ñộng viên và giúp ñỡ của nhiều cá
nhân và t
ập thể.
L
ời ñầu tiên em xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS.
Nguy
ễn Văn Giang - Trưởng Bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ vi sinh thuộc
khoa Công ngh
ệ sinh học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình hướng

d
ẫn và ñịnh hướng cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Em xin chân thành c
ảm ơn các thầy cô giáo trong phòng, ban của khoa Công
ngh
ệ sinh học trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã truyền ñạt cho em những
ki
ến thức vô cùng quan trọng và quý báu trong suốt thời gian học tập và thực hiện
lu
ận văn.
Và cu
ối cùng, em xin gửi lời tri ân tới gia ñình và bạn bè, những người ñã
giúp
ñỡ, ñộng viên và tạo ñiều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện ñề tài này.

TÔI XIN CHÂN THÀNH C
ẢM ƠN!

Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2013
H
ọc viên thực hiện


Cù Thu Hà
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan
i
Lời cảm ơn
ii
Mục lục
iii
Danh mục bảng
vi
Danh mục chữ viết tắt
viii
Danh mục hình ix

ðẶT VẤN ðỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1 Giới thiệu về acid phytic và phytate
4
1.1.1 ðịnh nghĩa
4
1.1.2 Cấu trúc hóa học của acid phytic
4
1.1.3 Sự tồn tại của acid phytic và phytate trong tự nhiên
5
1.1.4 Chức năng sinh lý của acid phytic
6
1.1.5 Ảnh hưởng của acid phytic
6
1.2 Phytase

7
1.2.1 ðịnh nghĩa
7
1.2.2 Các nguồn thu nhận enzyme phytase
8
1.2.3 Phân loại
10
1.2.4 Các ñặc tính lý, hóa của phytase
13
1.2.6 Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy phân axit phytic của
phytase
18
1.2.7 ðộng học của phystase
19
1.2.8 Ứng dụng của enzyme phytase
19
1.3 Bacillus và phytase của Bacillus
21
1.3.1 Vài nét về Bacillus
21
1.3.2 Phân loại phytase của Bacillus
22
1.3.3 Cơ chất ñặc hiệu
23
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iv

1.3.4 Các ñặc tính lý hóa học của phytase từ Bacillus

23
1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
26
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
26
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
27
Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
29
2.1 Vật liệu
29
2.1.1 ðối tượng
29
2.1.2 Các môi trường ñược sử dụng trong ñề tài nghiên cứu
29
2.1.3 Hóa chất sử dụng cho ñề tài nghiên cứu
30
2.1.4 Máy móc thiết bị
30
2.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu
31
2.4 Phương pháp nghiên cứu
31
2.4.1 Phương pháp lấy mẫu.
31
2.4.2 Phân lập Bacillus spp. có khả năng tổng hợp phytase ngoại bào
31
2.4.3 Phương pháp giữ giống
32
2.4.4 Phương pháp nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh học của các chủng vi sinh

v
ật ñược chọn.
33
2.4.5 Phương pháp ñánh giá hoạt tính phân giải Na-phytate của các chủng
Bacillus spp. phân l
ập ñược (Phương pháp Fiske và Subbarow)
34
2.4.6 Phương pháp xác ñịnh ảnh hưởng của các ñiều kiện ñến khả năng sinh
t
ổng hợp phytase của chủng Bacillus ñã ñược tuyển chọn
37
2.4.7 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa ñến hoạt ñộ phytase.
38
2.4.8 Phương pháp xác ñịnh ảnh hưởng của các ñiều kiện ngoại cảnh ñến
kh
ả năng phân giải phytate của phytase
39
2.4.9 Phương pháp xác ñịnh nguồn gốc di truyền của vi sinh vật
40
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
41
3.1 Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phytate
41
3.2 ðặc ñiểm hình thái của các chủng vi sinh vật ñược tuyển chọn
42
3.3 Xây dựng ñường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD
và n
ồng ñộ mg/l của dung dịch H
3
PO

4
47
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


v

3.4 ðánh giá khả năng phân giải phytate bởi phytase của các chủng vi
sinh v
ật tuyển chọn
48
3.5 Phân tích di truyền của chủng BC
2
49
3.6 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng BC
2
theo thời
gian nuôi c
ấy
51
3.7 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường và một số ñiều kiện nuôi cấy ñến
quá trình sinh t
ổng hợp phytase của chủng BC
2
51
3.7.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến quá trình sinh tổng hợp phytase
c
ủa chủng BC
2
51

3.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến quá trình sinh
tr
ưởng tổng hợp phytase của chủng BC
2
53
3.8 Khảo sát khả năng sử dụng nguồn C, N khác nhau của chủng BC
2
54
3.8.1 Khảo sát khả năng sử dụng C từ các nguồn khác nhau
54
3.8.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ tinh bột ñến quá trình sinh tổng hợp
phytase c
ủa BC
2
55
3.8.3 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn N khác nhau ñến khả năng sinh
t
ổng hợp phytase của chủng BC
2
56
3.8.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ NH
4
NO
3
ñối với quá trình sinh tổng
h
ợp phytase của BC
2
57
3.8.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ Ca2+ ñến khả năng sinh tổng hợp

phytase c
ủa BC
2
58
3.9 Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa ñến hoạt ñộ chung của
phytase t
ừ chủng BC
2
59
3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH lên hoạt ñộ phytase của chủng BC
2
60
3.10.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt ñộ phytase từ chủng BC
2
60
3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt ñộ phytase từ chủng BC
2
61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
1 Kết luận 63
2 Kiến nghị 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vi

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.1 Hàm lượng phytate và phospho trong các sản phẩm cây trồng [2] 5
1.2 Các nguồn cung cấp phytase 10
1.3 trọng lượng phân tử một số phytase [31] 14
1.4 Nhiệt ñộ và pH tối ưu của một số phytase 16
3.1 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi sinh vật
tuy
ển chọn 42
3.2 Chỉ số OD của các nồng ñộ KH
2
PO
4
khác nhau. 47
3.3 Khả năng phân giải Na-phytate bởi phytase của 12 chủng vi sinh vật
kh
ảo sát 49
3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến khả năng sinh tổng hợp phytase
c
ủa chủng BC
2
51
3.5 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến quá trình sinh tổng hợp phytase
c
ủa chủng BC
2
52
3.6 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ñến khả năng sinh tổng hợp
phytase c

ủa chủng BC
2
53
3.7 Ảnh hưởng của các nguồn cung cấp C ñến khả năng sinh tổng hợp
phytase c
ủa chủng BC
2
54
3.8 Ảnh hưởng của các nồng ñộ tinh bột ñến khả năng sinh tổng hợp
phytase c
ủa chủng BC
2
55
3.9 Ảnh hưởng của các nguồn cung cấp N ñến khả năng sinh tổng hợp
phytase c
ủa chủng BC
2
56
3.10: Ảnh hưởng của các nồng ñộ NH
4
NO
3
ñến khả năng sinh tổng hợp
phytase c
ủa chủng BC
2
57
3.11 Ảnh hưởng của các nồng ñộ Ca
2+
ñến khả năng sinh tổng hợp phytase

c
ủa chủng BC
2
58
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vii

3.12 Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa ñến hoạt ñộ chung của phytase
t
ừ chủng BC
2
59
3.13 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt ñộ của phytase 60
3.14 Ảnh hưởng của pH lên hoạt ñộ của phytase 61

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


ATP Adenosine triphosphate
BPP
β-propeller phytase
EX Enzym ngo
ại bào

FDA Food and Drug Administration
HAPs axit histidin phosphatase
HIV Human immunodeficiency virus
IN Enzym n
ội bào
IN1 Enzyme n
ội bào ñược tổng hợp ở trong tế bào chất
IN2 Enzyme n
ội bào dược tổng hợp ở lưới nội chất
IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology
IUPAC - IUB International Union of Pure and Applied Chemistry –
International Union of Biochemistry
JCBN Joint Commission on Biochemical Nomenclature
KS K
ỹ sư
MR Methyl red
NCBI National Center for Biotechnology Information
NPY Neuropeptid Y
OD Optical density
PAP purple axit phosphatase
pHop pH tối ưu
3-phytase Myo-inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase
6-phytase Myo-inositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase
TS Ti
ến sĩ


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

ix

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic 4
1.2 Cấu trúc hóa học của phytate 4
1.3 Phản ứng thủy phân phytat bởi enzyme phytase 8
1.4 Phản ứng thủy giải liên kết ester tại vị trí C3, 4/6, và 5 của phytases trong
vòng inositol cho cấu hình D / L tương ứng (Kerovuo và cộng sự, 2000) 11

1.5 Cấu trúc không gian 3 chiều của acid phosphatase 12
1.6 Cấu trúc không gian 3 chiều của β – propeller phytase 12
1.7 Cấu trúc không gian 3 chiều của purple acid phosphatase 13
1.8 Các con ñường thủy phân acid phytic của enzyme phytase 25
3.1 Các chủng vi sinh vật phân giải phytate trên môi trường LB (trái) và môi
trường PSM (phải) 41

3.2 Khuẩn lạc chủng B1 43
3.3 Tế bào chủng B1 43
3.4 Khuẩn lạc chủng B2 44
3.5 Tế bào chủng B2 44
3.6 Khuẩn lạc chủng B3 44
3.7 Tế bào chủng B3 44
3.8 Khuẩn lạc chủng B6 44
3.9 Tế bào chủng B6 44
3.10 Khuẩn lạc chủng B9 45
3.11 Tế bào chủng B9 45
3.12 Khuẩn lạc chủng B11 45

3.13 Tế bào chủng B11 45
3.14 Khuẩn lạc chủng B12 45
3.15 Tế bào chủng B12 45
3.16 Khuẩn lạc chủng BC2 45
3.17 Tế bào chủng BC2 45
3.18 Khuẩn lạc chủng BC3 46
3.19 Tế bào chủng BC5 46
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


x

3.20 Khuẩn lạc chủng BC8 46
3.21 Tế bào chủng BC8 46
3.22 Khuẩn lạc chủng BC11 46
3.23 Tế bào chủng BC11 46
3.24 Khuẩn lạc chủng BC12 46
3.25 Tế bào chủng BC12 46
3.26 Sự tương quan tuyến tính giữa nồng ñộ phospho và giá trị OD700nm 48
3.28 Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn BC2 và các loài Bacillus có
quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen mã hóa rRNA 16S 50

3.29 Hình thái khuẩn lạc (trái) và hình thái tế bào (phải) của chủng BC2 50
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


1

ðẶT VẤN ðỀ

1.
ðặt vấn ñề
Ngành ch
ăn nuôi có vai trò cung cấp thực phẩm chất lượng cao cho con
ng
ười, cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, cung
c
ấp sức kéo, phân bón và thức ăn cho nuôi trồng thủy sản… Với quy mô chăn nuôi
công nghi
ệp như hiện nay thì sản phẩm thức ăn chăn nuôi công nghiệp có ảnh
h
ưởng rất lớn ñối với ngành chăn nuôi, là một trong những nguyên liệu sản xuất
chính c
ủa ngành chăn nuôi, ảnh hưởng trực tiếp ñến chất lượng sản phẩm chăn nuôi
và hi
ệu quả kinh tế của người sản xuất chăn nuôi. Nguyên liệu chính ñược sử dụng
trong ch
ế biến thức ăn chăn nuôi là các loại nông sản như gạo, ngô, khoai, sắn, khô
l
ạc, khô ñậu tương và cỏ…
Nh
ư chúng ta ñã biết, phospho là nguyên tố cần thiết cho sự tăng trưởng,
phát tri
ển và sinh sản của ñộng vật, nhưng phospho trong các nguyên liệu trên phần
l
ớn lại tồn tại dưới dạng phân tử axit phytic hoặc phytate. ðây là dạng khó hấp thụ
trong h
ệ tiêu hóa của ñộng vật dạ dày ñơn (lợn, gà, cá…) vì trong hệ tiêu hóa của
chúng thi
ếu enzyme phân giải phytate. Không chỉ không tận dụng ñược nguồn

phospho có s
ẵn, axit phytic còn ngăn cản sự hấp thụ một số chất khác như protein,
Fe
3+,
Mg
2+
, Ca
2+
, Zn
2+
… bởi sự tạo thành phức giữa axit phytic với các chất này,
gây nên hi
ện tượng kháng dưỡng. ðể bù ñắp cho sự thiếu hụt phospho, người ta
ph
ải bổ sung thêm phospho vô cơ vào thành phần thức ăn.
Cách làm này v
ừa lãng phí phospho có trong tự nhiên, vừa gây ô nhiễm môi
tr
ường do lượng phospho có trong phytate không ñược hấp thụ bị ñào thải ra môi trường
(Sharpley et al., 1994).
ðể khắc phục tình trạng này, hướng bổ sung enzyme thủy phân
axit phytic (phytase) vào th
ức ăn ñã và ñang ñược các nhà khoa học quan tâm.
Phytase là m
ột enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành
myo-inositol và m
ột số gốc phosphat vô cơ tự do. Các chất này dễ dàng ñược hấp
th
ụ bởi các ñộng vật dạ dày ñơn. Chính vì vậy, việc bổ sung phytase vào thức ăn
ch

ăn nuôi giúp tận dụng tối ña nguồn phospho trong các loại nguyên liệu chế biến,
ñồng thời nó còn giúp làm giảm chi phí bổ sung lượng phospho vô cơ cần thiết vào
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


2

thức ăn chăn nuôi. Hơn thế nữa, phytase còn giúp giảm thiểu ô nhiễm phospho vào
môi tr
ường do chất thải ñộng vật (Igbasan et al., 2001). Do có ý nghĩa to lớn như
v
ậy, phytase ñã ñược thương mại hóa cách ñây hơn 10 năm (Stefan Haefner et al.,
2005). Hi
ện nay, trên thị trường ñang có nhiều loại sản phẩm enzyme phytase thuộc
nhi
ều thế hệ khác nhau.Thế hệ phytase ñầu ñược sản xuất từ nấm Aspergillus, tiếp
ñó là Peniophora, thế hệ phytase mới nhất ñược sản xuất từ E. Coli. Kết quả nghiên
c
ứu ở Canada ñã cho thấy hiệu suất giải phóng P của phytase từ E. Coli cao hơn rõ
ràng so v
ới phytase sản xuất từ nấm khi sử dụng cùng liều lượng và trong cùng ñiều
kiện [3]
.
Ngoài ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn ñược sử dụng
cho th
ực phẩm, ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo ñất trồng. Bởi thế, việc
nghiên c
ứu sản xuất phytase ñã và hiện là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học [4].
V
ới ñặc ñiểm là một ñất nước có khí hậu nhiệt ñới gió mùa, có sự ña dạng

l
ớn về ñịa hình và hệ sinh thái tạo nên sự ña dạng phong phú của các loài vi sinh
v
ật, cũng như do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại,
chúng tôi
ñã tiến hành ñề tài “Khảo sát một số ñặc tính sinh học và ñặc ñiểm
enzyme phytase t
ừ Bacillus subtilis BC
2
” nhằm tìm kiếm vi sinh vật có khả năng
sinh enzyme phytase cao và là ch
ủng an toàn, ñáp ứng nhu cầu trong công nghiệp
ch
ế biến thức ăn chăn nuôi và thực phẩm.
2. M
ục ñích và yêu cầu
2.1. M
ục ñích
Nghiên c
ứu ñược ñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
sinh phytase và m
ột số ñặc ñiểm của enzyme thu ñược.
2.2.Yêu c
ầu
Phân l
ập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme
phytase cao.
Khảo sát các ñặc tính sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Kh
ảo sát một số ñặc tính của enzyme phytase sinh từ chủng vi khuẩn tuyển chọn.

N
ội dung nghiên cứu
• Phân lập Bacillus spp. từ các nguồn khác nhau và khảo sát khả năng sinh
t
ổng hợp phytase của các chủng Bacillus spp., chọn chủng có hoạt ñộ phytase cao nhất.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


3

• Xác ñịnh nguồn gốc di truyền của chủng vi khuẩn phân lập ñược.
• Kh
ảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym phytase theo thời gian nuôi cấy.
• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng sinh enzym phytase của
ch
ủng vi khuẩn tuyển chọn (nhiệt ñộ, pH, cơ chất, ion kim loại).
• Khảo sát các tác nhân tủa khác nhau ñến hoạt ñộ chung của phytase từ
ch
ủng Bacillus tuyển chọn (ethanol, aceton, (NH
4
)
2
SO
4
).
• Kh
ảo sát các yếu tố tối ưu cho hoạt ñộng của enzyme phytase từ chủng vi
khu
ẩn tuyển chọn (nhiệt ñộ, pH).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Gi
ới thiệu về acid phytic và phytate [6, 25, 26, 27]
1.1.1.
ðịnh nghĩa
Acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakis dihydrogen phosphate)
là ester của rượu inositol và axit phosphoric. Công thức tổng quát là C
6
H
18
O
24
P
6
)
(IUPAC – IUB, 1968).
Phytate là dạng muối của axit phytic với các cation kim loại, phytate ñược
coi là hình th
ức lưu trữ chính của phospho trong thực vật.
1.1.2. C
ấu trúc hóa học của acid phytic [6, 27]
N
ăm 1897, tên “inositol-phosphoric acid” ñược ñề xuất bởi Winterstein và
sau
ñó ñược sửa ñổi thành “myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis dihydrogen

phosphate” b
ởi IUPAC-IUB vào năm 1968.


Hình 1.1: C
ấu trúc hóa học của acid
phytic [18]
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của
phytate [19]

T
ừ cấu trúc trên cho thấy, acid phytic có nhiều mức ñộ tích ñiện khác nhau
trong m
ột phổ pH rộng vì mười hai nguyên tử hydro có khả năng phân ly với các
h
ằng số phân ly khác nhau, sáu nguyên tử có pKa 1,84 (phân ly mạnh), 2 nguyên tử
có pKa 6,3 (phân ly y
ếu) và 4 nguyên tử còn lại có pKa 9,7 (phân ly rất yếu). Tính
chất này khiến IP6 (inositol hexakisphosphate) là một tác nhân tạo phức rất mạnh.
Các
ñiện tích âm của IP6 có thể phức hợp với các thành phần tích ñiện dương của
Formatted: Font: Italic, Font color:
Blue
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


5

một số ion kim loại, peptide, protein và tinh bột.
Acid phytic có kh

ả năng kết hợp mạnh mẽ với các nguyên tố khoáng như
canxi, s
ắt, magiê, kẽm… trở thành một phức hợp khó hòa tan, không thể hấp thụ
ñược trong ñường tiêu hóa của con người hay ñộng vật dạ dày ñơn. Ngoài ra acid
phytic còn có kh
ả năng gắn kết với một số chất dinh dưỡng như protein, axit amin,
tinh b
ột và do ñó cũng làm giảm giá trị dinh dưỡng của các chất này, gây nên hiện
t
ượng kháng dưỡng (Pallauf và Rimbach., 1996). ðây chính là nguyên nhân dẫn
ñến suy dinh dưỡng, loãng xương, còi xương…
1.1.3. S
ự tồn tại của acid phytic và phytate trong tự nhiên
Acid phytic và phytate
ñược tìm thấy nhiều trong mô thực vật, ñặc biệt là
trong các lo
ại hạt của cây thuộc họ hòa thảo (lúa mì, lúa mạch …) và các loại hạt
c
ủa cây họ ñậu. Acid phytic là hình thức lưu trữ chủ yếu của phospho trong mô
th
ực vật nhưng phospho ở dạng này nói chung là không có vai trò dinh dưỡng với
con ng
ười và ñộng vật dạ dày ñơn vì thiếu enzyme tiêu hóa phytase (Mullaney EJ,
Daly CB, Ullah AH 2000).
B
ảng 1.1: Hàm lượng phytate và phospho trong các sản phẩm cây trồng [2]
Ngu
ồn
T
ỷ lệ phospho

t
ổng số ( % )

Hàm lượng
phospho trong
mu
ối phytate
(g/100g )
T
ỷ lệ % phospho
trong phytate
ñối với phospho
t
ổng số ( % )
ðậu Hà Lan 0.48 0.24 50
ðậu nành 0.61 – 0.65 0.39 60 – 61
H
ạt cải 1.18 0.70 59
H
ạt hướng dương 1.16 0.89 77
B
ắp vàng (dạng bột) 0.26 – 0.33 0.24 66 – 72
Lúa m
ạch 0.34 – 0.42 0.27 56 – 64
Lúa mi
ến 0.36 0.24 66
G
ạo 0.35 0.27 77
Lúa mì 0.30 – 0.35 0.27 67 – 77

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


6

Trong thực vật, 50-80% tổng lượng phosphorus (P) tồn tại dưới dạng phytate
hay acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexadihydrogenphosphate) r
ất khó tiêu
hoá và h
ấp thu (Harland và Morris, 1995).
Acid phytic t
ập trung nhiều trong các hạt ngũ cốc ở giai ñoạn chín. Trong
ng
ũ cốc, hàm lượng phytate ñược tìm thấy cao nhất là ở ngô (0,83 – 2,22%) và ở
các cây h
ọ ñậu thì trong ñậu dolique (5,92 – 9,15%) (Reddy et al, 1989).
1.1.4. Ch
ức năng sinh lý của acid phytic
Trong h
ạt ngũ cốc, axit phytic ñược biết ñến với các chức năng sinh lý sau:
là ngu
ồn dự trữ phospho, là nguồn cung cấp năng lượng cho hoạt ñộng sống của tế
bào, là ngu
ồn chứa ñựng các cation và myo-inositol, khởi ñộng quá trình ngủ nghỉ
c
ủa hạt.
Axit phytic có m
ột số vai trò quan trọng, Axit phytic ñóng vai trò như là một
ch
ất chống oxi hóa tự nhiên trong suốt quá trình ngủ của hạt giống (Graf et al.,

1987).
ðặc tính chống oxi hóa của axit phytic dựa trên giả ñịnh rằng, axit phytic
ng
ăn chặn sự hình thành các gốc hydroxyl sắt.
Axit phytic
ñã ñược chứng minh có tác dụng chống ung thư trực tràng và ung
th
ư vú ở một vài ñộng vật có vú. Sự hiện diện của axit phytic chưa bị phân giải
trong ru
ột kết có thể bảo vệ chống lại sự phát triển của ung thư trực tràng
(Dvorakova, 1998)
Các nghiên cứu trong cuối những năm 1980 ñã xác ñịnh vai trò của inositol
phosphat là ch
ất trung gian trong vận chuyển vật liệu vào trong tế bào. Vai trò của
các inositol phosphat,
ñặc biệt là của inositol triphosphat, có vai trò dẫn truyền tín
hi
ệu và quy ñịnh chức năng tế bào trong tế bào thực vật và ñộng vật (Wodzinski và
Ullah, n
ăm 1996).
1.1.5.
Ảnh hưởng của acid phytic [6, 24]
Theo Pallaurf và Rimbach (1996), axit phytic là m
ột chất ñối kháng dinh
d
ưỡng. Do cấu trúc ñặc biệt của axit phytic, 6 nhóm phosphat của axit phytic ñều
phân ly nên axit phytic có t
ổng cộng mười hai ñiện tích âm. Vì vậy, axit phytic có
kh
ả năng liên kết với các cation hóa trị khác nhau hình thành phức muối phytate

không hòa tan trong
ñường ruột, ngăn ngừa sự hấp thụ các chất khoáng, làm giảm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


7

giá trị dinh dưỡng của các chất khoáng ñó (Davies, 1982). Theo nghiên cứu của
Rimbach và Pallauf (1992) v
ề ảnh hưởng của axit phytic ñối với sự hấp thụ kẽm ở
chu
ột cho thấy, bổ sung axit phytic ñã có một ảnh hưởng tiêu cực rõ ràng ñến sự
h
ấp thụ kẽm và sự tăng trọng lượng ở chuột ñang phát triển.
Axit phytic t
ương tác với protein tạo thành phức hợp protein phytate. Phức
h
ợp protein phytate ñược hình thành bởi liên kết giữa các nhóm phosphat của axit
phytic v
ới các axit amin tích ñiện dương của protein (De Rham và Jost,1979;
Fretzdorff et al., 1995). B
ằng cách liên kết với protein, axit phytic làm giảm khả
n
ăng tiêu hóa protein của cơ thể ñộng vật, do ñó cũng làm giảm giá trị dinh dưỡng
c
ủa chúng.
Ngoài ra, axit phytic còn t
ương tác với các enzyme tiêu hóa như trypsin,
pepsin,
α-amylase và β-galactosidase, kết quả là làm giảm sự hoạt ñộng của các

enzyme này, kéo theo
ñó làm giảm sự hấp thụ các chất dinh dưỡng mà các enzyme
này phân gi
ải.(Deshpande and Cheryan, 1984; Singh and Krikorian, 1982; Inagawa
et al., 1987).
1.2. Phytase
1.2.1.
ðịnh nghĩa [ 23, 30, 34]
Phytase (myo – inositol hexakisphosphat phosphohydrolase) là enzyme xúc
tác cho phản ứng thủy phân liên kết monophosphoester của axit phytic hoặc muối
phytate, gi
ải phóng orthophosphat và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm
phosphat h
ơn hay các myo – inositol tự do, do ñó làm gia tăng giá trị dinh dưỡng
phospho trong th
ức ăn chăn nuôi (Mullaney EJ, Daly CB, Ullah AH 2000).
Ph
ản ứng thủy phân phytate của phytase:
Myo – inositol hexakisphosphat + H
2
O → D-myo-inositol 1,2,4,5,6-
pentakisphosphat + phosphat
Bổ sung phytase vào thức ăn cho vật nuôi có thể làm giảm nhu cầu bổ sung
ngu
ồn phospho vô cơ vào thức ăn chăn nuôi và giảm thấp sự bài tiết phospho vào
trong phân, t
ừ ñó hạn chế ñược ô nhiễm phospho vào trong ñất và nước ngầm. Ô
nhi
ễm phospho vào trong ñất và nước ngầm là vấn ñề ñang ñược các nhà môi
tr

ường học trên thế giới rất quan tâm và tìm nhều biện pháp ñể khắc phục.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


8


Hình 1.3 Phản ứng thủy phân phytat bởi enzyme phytase [17]

1.2.2. Các ngu
ồn thu nhận enzyme phytase [30, 34, 35]
1.2.2.1. Ngu
ồn vi sinh vật
N
ăm 1968, Sheh và Ware ñã tiến hành phân lập từ ñất hơn 2000 chủng vi
sinh v
ật có khả năng sinh phytase. Hầu hết các chủng ñược phân lập cho sản phẩm
enzyme n
ội bào, chỉ có khoảng 30 chủng ñã phân lập cho sản phẩm phytase ngoại
bào. T
ất cả các phytase ngoại bào ñều là sản phẩm của vi nấm, 28 chủng thuộc
Aspergillus, m
ột chủng thuộc giống Penicillium và một chủng thuộc giống Mucor.
Các nghiên c
ứu ñã khẳng ñịnh A. niger sinh tổng hợp phytase ngoại bào
t
ốt nhất.
Các nghiên c
ứu của Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992) cho thấy
Bacillus subtilis có kh

ả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào. ðến năm 1998, Kim
và các c
ộng sự nghiên cứu và chứng minh Bacillus amyloliquefaciens cũng có khả
n
ăng sinh tổng hợp phytase.
M
ột số nấm men cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase, trong ñó các
ch
ủng như Schwanniomyces castellii, Arxula adenivorans, Picchia spartinae và
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


9

Pichia rhodannesis cho sản phẩm phytase ngoại bào. Ngược lại, Saccharomyces
cerevisiae và Pichia anomala sinh t
ổng hợp phytase nội bào.
1.2.2.2. Nguồn thực vật
Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo, và từ
các loại ñậu như ñậu nành, ñậu trắng,… Phytase cũng ñược tìm thấy trong mù tạt,
khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, và phấn hoa huệ tây (Dvorakova, 1998). Trong
hạt ñang nảy mầm hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin (Greene
và cộng sự, 1975). Suzuki và cộng sự (1907) là những người ñầu tiên sản xuất chế
phẩm phytase từ cám gạo và lúa mì.
M
ột số nghiên cứu ñã tiến hành tinh sạch và xác ñịnh các ñặc tính của phytase
chi
ết tách từ hạt bắp vàng ñang nảy mầm. Rễ cây của một số loại thực vật cũng có
ch
ứa phytase , tuy hàm lượng thấp nhưng cũng ñã ñược nghiên cứu, xác ñịnh.

1.2.2.3. Nguồn ñộng vật
Collum và Hart (1908) ñã phát hiện thấy phytase từ thận và máu dê, phytase
cũng phát hiện trong máu các ñộng vật có xương sống bậc thấp hơn như chim, bò
sát, cá, rùa biển (Rapoport et al, 1914). Vì phytate hoạt ñộng như một nguyên tố
kháng dưỡng trong cơ thể ñộng vật nên các nhà khoa học ñã quan tâm và khảo sát
hoạt ñộng của phytase trong ñường tiêu hóa của nhiều loài ñộng vật. Phytase ñược
tìm thấy trong ñường ruột (Patwaradha, 1937) của heo, cừu, bò (Spitzer và Phillip,
1972). Tuy nhiên, phytase trong hệ ñộng vật không ñóng vai trò quan trọng trong
việc tiêu hóa phytate (Williams và Taylor, 1985).
Phytase ruột người có hoạt tính thấp 30 lần so với phytase từ ruột chuột và
cũng không có ý nghĩa trong việc tiêu hóa phytate, phytate ñược tiêu hóa trong hệ
tiêu hóa người nhờ lượng phytase trong thực phẩm (Frolich, 1990). ðộng vật nhai
lại tiêu hóa ñược phytate nhờ hoạt ñộng của phytase ñược sản xuất bởi hệ vi sinh
vật trong dạ cỏ. Lượng phosphate vô cơ giải phóng ra nhờ hoạt ñộng của phytase
lên phytate ñược cả hệ vi sinh vật ñường ruột và vật chủ sử dụng (Kerovuo et al.,
2000).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


10

Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase

Nguồn Vị trí enzyme Tài liệu tham khảo
Aspergillus niger RRL 3135 EX Shieh et al. (1969)
A.flavus EX Shieh and Ware (1968)
A.oryzae EX Shimizu (1993)
A.fumigatus EX Pasamontes (1997)
Mucor sp. EX Shieh and Ware (1968)
Nấm mốc

Rhizopus oligosporus EX và IN Sutadi and Buckle (1988)
Saccharomyces cerevisiae EX Nayini and Markakis (1984)
Schwanniomyces castelii EX Lambrechts et al. A91992)
Nấm men

Candida tropicalis EX EX Lambrechts et al. A91992)
Bacillus subtilis (nato) EX Shimizu (1992)
Bacillus amyloliquefaciens EX Kim et al., (1998)
Escherichia coli IN
1
Greiner et al., (1993)
Klebsiella aerogenes IN Tambe et al., (1994)
K.terrigena IN Greiner et al., (1997)
Pseudomonas sp. EX Irving and Cosgrove (1971)
Vi khuẩn

Enterobacter freundii EX Yoon et al., (1996)
Bắp vàng (ñã nảy mầm) IN Laboure et al., (1993)
Hạt ñậu nành IN Gibson and Ullah (1988)
Thực vật

Typha latifoila (phấn hoa) IN Hart et al., (1985)
Dịch nhờn trong ruột loài
gặm nhấm
IN
2

Yang et al., (1991)

Gan của loài gặm nhấm IN
2
Craxton et al., (1997)
ðộng vật

Paramecium IN
2
Freund et al., (1992)
Ghi chú:EX: enzym ngoại bào
1
: trong tế bào chất
IN: enzym nội bào
2
: trong lưới nội chất

1.2.3. Phân loại [22]
1.2.3.1. D
ựa trên vị trí của nhóm phospho ñầu tiên bị enzyme tác ñộng
Các t
ổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB, IUPAC-IUB, JCBN ñã
chia phytase thành 3 lo
ại:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


11

EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase (myo-inositolhexakisphosphat-3-
phosphohydrolase), Enzyme lo
ại này thủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 3 của

myo-inositolhexakisphosphat, cho s
ản phẩm là D-myo-inositol 1,2,4,5,6 –
pentakisphosphat và orthophosphate.
ðây là dạng thường gặp ñối với các phytase
có ngu
ồn gốc vi sinh vật.
EC 3.1.3.26: tên thông th
ường là 6-phytase (myo-inositolhexakisphosphat-
6-phosphohydrolase). Enzyme lo
ại này thủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 6 của
myo-inositolhexakisphosphat cho s
ản phẩm là D-myo-inositol 1,2,3,4,5 –
pentakisphosphat và orthophosphate. 6-phytase là d
ạng thường gặp ñối với phytase
có ngu
ồn gốc thực vật.
EC 3.1.3.72: tên thông th
ường 5-phytase là các phytase kiềm từ phấn hoa
lily. Enzyme này th
ủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 5 của myo -
inositolhexakisphosphat.

Hình 1.4: Phản ứng thủy giải liên kết ester tại vị trí C3, 4/6, và 5 của phytases
trong vòng inositol cho c
ấu hình D / L tương ứng (Kerovuo và cộng sự, 2000)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


12

1.2.3.2 Dựa trên sự khác biệt trình tự aminoacid thủy phân của phytase
Các nhà khoa h
ọc ở một số tổ chức nghiên cứu như Trung tâm thông tin
sinh h
ọc quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) và các tác giả Mullaney và Ullah (2007) ñã phân
loại phytase thành 4 nhóm:
Nhóm th
ứ 1 (HAP):axit phosphatase hoặc axit histidin phosphatase. ðặc
ñiểm chung có trung tâm hoạt ñộng là RHGXRXP và quá trình thủy giải
hosphomonoester gồm các bước giống nhau. Enzyme nhóm HAP ñược tìm thấy
trong bactertia nh
ư E. coli và một số loại nấm như Aspergillus niger và A.fumigatus.

Hình 1.5: C
ấu trúc không gian 3 chiều của acid phosphatase
Nhóm th
ứ 2 (BPP) là các β-propeller phytase, chủ yếu là các enzyme của
Bacillus. Không có trung tâm ho
ạt ñộng là RHGXRXP.Cho ñến nay, việc phân lập,
xác
ñịnh các gen ñiều khiển hoạt ñộng của phytase thuộc nhóm này chưa ñầy ñủ.
Các nghiên cứu cho thấy, hiện có hai loại phytase của Bacillus ñã ñược xác ñịnh, ñó
là phyC do Kerovuo và các c
ộng sự phát hiện vào năm 1998 và TS-phy do Kim và
các c
ộng sự phát hiện năm 1998.

Hình 1.6: C
ấu trúc không gian 3 chiều của β – propeller phytase
Nhóm th

ứ 3 (CP): CysCystein phosphatses có chuỗi acid amin khác nhau
ñó là HCXXGXXR (T / S). enzyme có thể ñược tìm thấy trong vi khuẩn kỵ khí ở dạ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


13

cỏ như Selenomonas ruminantium.
Nhóm th
ứ 4 (PAP): Có chứa các chuỗi acid amin khác nhau ñược DXG
GDXXY GNH (E, D) VXXH GHXH trong trung tâm ho
ạt ñộng. Bao gồm các
purple axit phosphatase Gm-phy ñược chiết tách từ lá mầm của ñậu nành nảy mầm
thu
ộc nhóm enzyme này.

Hình 1.7: C
ấu trúc không gian 3 chiều của purple acid phosphatase

1.2.4. Các ñặc tính lý, hóa của phytase [7, 34]
1.2.4.1 C
ấu tạo và trọng lượng phân tử
H
ầu hết các phytase ñã ñược xác ñịnh là các enzyme ñơn phân tử. Ví dụ như
phytase c
ủa vi nấm (Wyss và cộng sự, 1999, Ullah và Gibson, 1987; Dvorakova et
al, 1997), E.coli và Klebsiella terrigena (Greiner và c
ộng sự, 1993; Greiner và
cộng sự, 1997), Bacillus subtilis (Shimizu, 1992). Tuy nhiên, phytase của một số
ñộng, thực vật ñược hình thành từ nhiều tiểu ñơn vị. Phytase ñược hình thành trong

quá trình n
ảy mầm của hạt bắp ñược xác ñịnh là một enzyme gồm hai tiểu ñơn vị có
trọng lượng 38kDa (Laboure và cộng sự, 1993). Phytase ñược tinh sạch từ ruột của
chu
ột, qua kết quả ñiện di cho thấy có hai loại protein với kích thước là 70 và
90kDa (Yanget al.,1991b).
Phytase c
ủa Klebsiella aerogenes có hai dạng khác nhau, một là dạng
enzyme t
ự nhiên, có kích thước khá lớn, 70kDa, dạng còn lại cũng có ñầy dủ các
ph
ần ñẳm bảo cho hoạt ñộng của enzyme và có trọng lượng phân tử rất thấp, chỉ từ
10 – 13 kDa (Tambe và cộng sự,1940). Phytase của vi nấm hầu hết có trọng lượng
phân t
ử nhỏ hơn phytase của nấm. Theo tính toán lý thuyết, phytase của nấm có trọng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


14

lượng phân tử khoảng 50 Kda, kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho kết quả trong
kho
ảng 65 – 70 kDa, trong ñó phần nặng nhất là các gốc glycosyl hóa (Ullah., 1988).
Tr
ọng lượng và kích thước phân tử tính toán theo lý thuyết của các protein
hoàn ch
ỉnh và số lượng các tiểu ñơn vị của phytase từ nhiều nguồn khác nhau ñược
trình bày trong b
ảng sau:
Bảng 1.3: trọng lượng phân tử một số phytase [31]

Nguồn phytase
Trọng lượng
theo lý thuyết
(kDa)
Trọng lượng
thực nghiệm
(kDa)
Số lượng
tiểu ñơn
vị
Ghi chú
Aspergillus niger

48,423 64,89 1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
A.terreus 48,189 70,38 1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
A.gumigatus 48,276 70,74 1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
Bacillus subtilis
(natto)
- 38 1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
Bacillus subtilis - 36,5 1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS

Bacillus
amyloliquefaciens
39,230 44 1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
Klebsiella aerogenes - 700 1
Quá trình tinh scahj tạo
ra các mảnh protein có
kích thước 10-13kDa
K.terrigena - 40 1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
Escherichia coli 44.690 42 1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
Bắp - 76 2
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
ðậu nành - 59-60 1+1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
Dịch nhờn trong ruột
loài ngặm nhấm
- 70-90 1+1
Xác ñịnh bằng ñiện di
trên gel SDS
Paramecium - 240 6
Gan của loài gặm nhấm 50,643 - -
(-): chưa xác ñịnh