xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ duchenne ở mức độ mrna và phát hiện (1)

1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)
là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các
chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai.
Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ,
biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu
thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại
vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối
loạn hô hấp [62], [146].
DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen
dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều
dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau. Đây là gen lớn
nhất của người được phát hiện cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA 14kb
và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin. Protein này có mặt ở
màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn
định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen
bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của
bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109].
Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định.
Dạng đột biến mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60%. Đột biến điểm
đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn,
khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiờn cứu cho thấy đột biến mất
đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung
tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì
vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến mất
đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho
19-25 exon trong vùng hay xảy ra mất đoạn [7], [20], [69].

2
Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử,
nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu
và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD. Tuy nhiên
ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến mất
đoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biến trong 2
vùng trọng điểm [1], [7], [10]. Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rải
rác khắp 79 exon. Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ở
những exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền
mRNA.
Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằng
phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phải
khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩa phải khuếch đại toàn bộ 79
exon để xác định đột biến. Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ với
các intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNA
người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon. Điều
này gây tốn kém cả về tài chính lẫn thời gian. Ngược lại, ở cấu trúc của
mRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau. Do vậy, để
khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon này, người ta chỉ cần
dùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả chiều dài đoạn gen
dystrophin [9], [77], [129]. Như vậy, việc xác định đột biến ở mức độ RNA
giúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa chất.
Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tử
vong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơ
Duchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặng
của gia đình cũng như của cộng đồng. Theo nhiều nghiờn cứu, 2/3 bệnh nhân
DMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến
mới phát sinh [66]. Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán

3

trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường và phòng bệnh bằng phương pháp
phá thai chủ động là sự lựa chọn được nhiều người đồng thuận, từ đó có thể
giảm tỉ lệ mắc bệnh DMD trong cộng đồng [93], [107].
Ở Việt Nam, năm 1996, Nguyễn Thị Trang và CS nghiên cứu về lâm
sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoán
người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu
có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Trong một nghiên cứu khác, năm
2006, Nguyễn Văn Quyệt cho rằng, phối hợp giữa phân tích phả hệ và định
lượng hoạt độ CK có thể phát hiện được 50% bà mẹ dị hợp tử [16]. Tuy
nhiên, những kết quả trên chỉ mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn
thương di truyền và chưa đủ sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền.
Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến mất đoạn gen
dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát
hiện người lành mang gen bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Xác định đột biến mất đoạn gen trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne ở mức độ mRNA.
2. Chẩn đoán người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong
gia đình bệnh nhân đã được xác định đột biến mất đoạn gen ở trên.
3. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những bà mẹ dị hợp tử.


4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD
- Tháng 12-1851, Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả chi tiết về
8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnh
loạn dưỡng cơ Duchenne. Ông cho rằng nguyên nhân của bệnh là do giảm các
yếu tố dinh dưỡng [49].

- Năm 1861, Duchenne, một nhà thần kinh học người Pháp đã có công
mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai. Năm
1868, Duchenne thực hiện một nghiên cứu quy mô về bệnh lý này, ông đưa ra
những tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh dựa trên kết quả giải phẫu bệnh và kích
thích điện. Duchenne nhận thấy có sự thay thế mô cơ bằng những mô xơ hoặc
mô liên kết trên tiêu bản sinh thiết cơ. Sau đó ụng đó sử dụng thủy trị liệu kết
hợp với xoa bóp để điều trị cho bệnh nhân và nhận thấy có sự cải thiện bệnh ở
một số bệnh nhân. Chính nhờ sự phát hiện quan trọng này mà sau đó bệnh
được mang tờn ụng [34].
- Năm 1879, Gowers đã thu thập bệnh án 220 bệnh nhân và mô tả một
cách kỹ lưỡng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết.
Ông cũng phát hiện một phụ nữ có những đứa con trai khác cha cùng bị bệnh.
Gowers nhận thấy rằng các trẻ mắc bệnh có một đặc điểm giống nhau khi
thay đổi tư thế từ nằm sang đứng. Từ đó, dấu hiệu này được xem là dấu hiệu
điển hình của bệnh DMD và được mang tên ông: dấu hiệu Gowers [62].
- Nếu tớnh từ thời Meryon thì bệnh DMD đã được biết hơn 150 năm.
Tuy nhiên, trong suốt một thời gian dài, bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở
mức độ lâm sàng và điều trị chỉ tập trung vào chăm sóc hỗ trợ trong quá trình
của bệnh [140].

5
- Trong những năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc
biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện
dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym CK, phục vụ cho điều trị và tư
vấn di truyền [58], [102].
- Năm 1981, Zatz và CS đã phát hiện ra gen dystrophin nằm ở vị trí
Xp21.1 nhờ quan sát những trẻ gái mắc bệnh DMD. Những bệnh nhân nữ này
mang chuyển đoạn giữa NST X và NST thường [140].
- Năm 1984-1987, Hoffman và CS đã phát hiện ra gen dystrophin và sản
phẩm protein tương ứng của gen này [38], [65].

- Những năm sau 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di
truyền phân tử phát triển mạnh giúp việc phát hiện đột biến gen dystrophin,
tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư
vấn di truyền nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ bị bệnh DMD [29], [38].
- Năm 1987-1988, các nhà nghiên cứu cho biết gen dystrophin gồm 60
exon.
- Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb [47].
- Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện
đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb [106], [112].
- Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng
được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ
lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng
nề do bệnh gây ra [92], [109].
1.2. Đặc điểm của bệnh DMD
1.2.1. Biểu hiện lâm sàng của DMD
Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp
ngã nhưng chưa có biểu hiện teo cơ.

6
- Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệu
Gowers rõ. Khi trẻ đang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốn
ngồi dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống
nạng đỡ lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lần
lượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các
động tác như vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến.
- Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi.
Sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được. Cuối cùng trẻ thường
tử vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96].
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng

1.2.2.1. Định lượng hoạt độ CK toàn phần
CK được Lohman phát hiện vào năm 1934. CK là enzym xúc tác sự tạo
năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong
tế bào cơ. Năm 1959, Ebashi và CS là những người đầu tiên áp dụng việc
định lượng hoạt độ CK huyết thanh trong chẩn đoán bệnh lý tổn thương cơ.
Các tác giả nhận thấy hoạt độ CK tăng cao gấp hàng chục lần ở bệnh nhân
loạn dưỡng cơ tiến triển. Manhoney (1977), Edward (1984) phát hiện CK tăng
trong máu của các thai nhi bị bệnh DMD [48], [104].
Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thanh thường tăng rất cao trước
khi có dấu hiệu lâm sàng, thậm chí tăng từ thời kỳ sơ sinh. Hoạt độ CK huyết
thanh ở bệnh nhân DMD khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường dưới
160 UI/L). Theo Matsuo (2002), hoạt độ CK huyết thanh bình thường có thể
loại trừ chẩn đoán DMD. Tuy nhiên, trong giai đoạn muộn của quá trình
bệnh, hoạt độ enzym này giảm thấp. Lý do của hiện tượng trên là vào giai
đoạn cuối, khối cơ còn lại quỏ ớt, mặt khác bệnh nhân giảm vận động nên
lượng cơ thoái hóa cũng ít đi [4], [91], [102].

7
1.2.2.2. Phương pháp thăm dò điện sinh lý cơ
Ghi điện cơ là phương pháp nghiên cứu hoạt động điện của cơ bằng
cách ghi lại điện thế hoạt động của các sợi cơ ở những trạng thái khác nhau.
Nhờ nghiên cứu của Kugelberg (1947), Buchtbal (1953), phương pháp
ghi điện cơ được ứng dụng để chẩn đoán sớm các bệnh loạn dưỡng cơ tiến
triển trước khi có biểu hiện lâm sàng. Năm 1979, Stalberg và Trontelj mô tả
chi tiết hình ảnh tổn thương trên điện cơ đồ ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ [103].
Trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, điện cơ đồ cho thấy những biến đổi
đặc trưng của bệnh lý cơ nhưng không đặc hiệu cho DMD, khụng có bằng
chứng của hiện tượng suy giảm phân bố thần kinh trong cơ, tốc độ dẫn truyền
thần kinh cảm giác và vận động bình thường [34].
1.2.2.3. Sinh thiết cơ

Vào thế kỷ 19, Meryon (1852) và Duchenne (1868) đã áp dụng phương
pháp sinh thiết cơ để chẩn đoán bệnh DMD [34]. Trong nhiều năm sau đó,
phương pháp này được xem là công cụ đắc lực để chẩn đoán xác định bệnh
DMD và chẩn đoán phân biệt với các bệnh lý khác.
Sinh thiết cơ có tác dụng chẩn đoán xác định dựa vào những thay đổi
đặc trưng trờn mụ sinh thiết. Biến đổi mô bệnh học đặc trưng bao gồm tăng
sinh tổ chức liên kết của mô bọc sợi cơ, các sợi cơ bị thoái hóa và tái sinh rải
rác. Mô bệnh học cũng cho thấy các ổ thâm nhiễm tế bào viêm đơn nhân, đõy
là hậu quả của phản ứng viêm được khởi động bởi quá trình hoại tử sợi cơ;
song song các sợi cơ có chức năng bình thường cũng biểu hiện những thay
đổi nhẹ về mặt cấu trúc. Ngoài ra, mô sinh thiết còn có rất nhiều sợi đậm đặc;
các sợi cơ co rút thái quá này có thể là hậu quả của sự hoại tử ở một vị trí
khỏc trờn chiều dài của sợi cơ, quỏ trình hoại tử này tạo điều kiện cho canxi
đi vào nội bào qua chỗ tổn thương của màng sợi cơ vân, luồng canxi đi vào sẽ
khởi động quá trình co rút của toàn bộ chiều dài sợi cơ [34]. Vị trí sinh thiết

8
thường sử dụng nhất trong lâm sàng ở cơ rộng ngoài của cơ tứ đầu đùi hoặc
cơ sinh đôi ngoài [62].
1.2.2.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (MDHQ)
Protein dystrophin định vị ở màng sợi cơ. Bởi vậy với phương pháp
miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản sinh thiết, đường viền các sợi cơ bình
thường xuất hiện sự phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; trong
khi đó ở tiêu bản sinh thiết cơ của những bệnh nhân DMD không có sự bắt
màu, không thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ, phản ánh sự vắng mặt của
protein dystrophin trên màng tế bào cơ của bệnh nhân DMD [62], [89].
Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker
(BMD). Triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân BMD xuất hiện muộn hơn so với
ở bệnh nhân DMD, mức độ biểu hiện nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm
hơn. Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể trên màng tế

bào sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD [28].





Người bình thường Bệnh nhân BMD Bệnh nhân DMD
Hình 1.1. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein dystrophin
(Nguồn: Matsuo, 2002)
1.2.2.5. Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến
Sự thành công của Kunkel và CS (1985) trong việc phát hiện sự mất
đoạn lớn của NST X ở 1 bệnh nhân nam DMD đã khởi đầu cho một loạt
những nghiên cứu xác định gen ở bệnh nhân DMD. Hiện nay, có rất nhiều kỹ
thuật sinh học phân tử giúp xác định đột biến gen dystrophin như kỹ thuật
PCR, Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR), Fluorescence in situ Hybridization

9
(FISH), Southern blot, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
(MLPA) [90], [91], [107]. Các kỹ thuật này sẽ được trình bày ở phần 1.4.
1.2.3. Tần số của bệnh
DMD là một bệnh di truyền phổ biến, có tần suất cao trong nhóm bệnh
loạn dưỡng cơ tuần tiến với tỉ lệ 1/3500 trẻ trai [34].
Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu rõ ràng về tần suất mắc bệnh DMD.
Theo Nguyễn Thu Nhạn và CS những năm 1981-1990 có 131 bệnh nhân vào
điều trị tại Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền, Bệnh Viện Nhi Trung Ương,
chiếm 0,6% trong tổng số bệnh nhân vào điều trị [13]. Theo Nguyễn Thị
Phượng, Vũ Chí Dũng giai đoạn 1991-1996 có 88 bệnh nhân DMD vào điều
trị tại viện Bệnh Viện Nhi Trung Ương, chiếm 19,4% trong các bệnh di
truyền của Khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền và chiếm khoảng 0,11%
trong tổng số bệnh nhân vào điều trị tại bệnh viện [14].

1.2.4. Di truyền học bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền đơn gen, tuân theo quy luật di truyền lặn liên
kết NST X không có alen tương ứng trên NST Y. Bệnh thường gặp ở trẻ trai
mà rất hiếm gặp ở trẻ gái. Trẻ trai chỉ cần nhận một gen bệnh trên NST X của
người mẹ mang gen (X
D
X
d
) là có biểu hiện bệnh, trong khi đó trẻ gỏi đòi hỏi
phải nhận 2 gen X mang bệnh, một gen bệnh từ mẹ và một gen bệnh từ bố
mới có khả năng biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, trẻ trai bị bệnh DMD thường chết
sớm ở tuổi từ 20 đến 25 nên không có khả năng lập gia đình. Do vậy, trong
sáu trường hợp ở bảng 1.1, khả năng thứ hai là hay gặp nhất, người mẹ mang
gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% số con trai và truyền gen bệnh
cho 50% số con gái của họ [96].
Trong một vài trường hợp, người nữ mang gen có biểu hiện bệnh khi
NST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen
bệnh sẽ biểu hiện bệnh [54], [56].

10
Bảng 1.1. Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con
Genotyp và phenotyp
của cha mẹ
Tần số con với các genotyp khác nhau
Trai
Gái
Cha
Mẹ
X
D

Y
lành
X
d
Y
bệnh
X
D
X
D

lành

X
D
X
d

lành mang
gen bệnh
X
d
X
d

bệnh
X
D
Y
lành

X
D
X
D

lành
1
0
1
0
0
X
D
Y
lành

X
D
X
d

lành mang
gen bệnh
1/2
1/2
1/2
1/2
0
X
D

Y
lành
X
d
X
d

bệnh
0
1
0
1
0
X
d
Y
bệnh
X
D
X
D

lành
1
0
0
1
0
X
d

Y
bệnh
X
D
X
d

lành mang
gen bệnh
1/2
1/2
0
1/2
1/2
X
d
Y
bệnh
X
d
X
d

bệnh
0
1
0
0
1

Theo nghiên cứu của White (2002), Hung (2006), khoảng 30% bệnh
nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình
đột biến mới phát sinh trong giai đoạn tạo giao tử ở bố hoặc mẹ. Khoảng 70%
bệnh nhân DMD là do nhận gen bệnh từ người mẹ [66], [137]. Phụ nữ mang
gen bệnh thường không có triệu chứng yếu cơ hoặc bất kỳ một dấu hiệu lâm
sàng nào của bệnh. Norman (1989) cho rằng khoảng 2/3 người lành mang gen
bệnh có hoạt độ CK huyết thanh tăng [99].
1.2.5. Điều trị bệnh DMD
Điều trị bệnh DMD vẫn còn là vấn đề khó khăn đối với nền y học. Hiện
tại, chưa có những biện pháp điều trị đặc hiệu cũng như ngăn cản sự tiến triển
của bệnh. Tuy nhiên, chúng ta vẫn có thể điều trị các triệu chứng, các biến
chứng của bệnh và nâng cao chất lượng sống cho đứa trẻ.

11
1.2.5.1. Điều trị nội khoa
Điều trị bệnh DMD chủ yếu phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi
chức năng nhằm trì hoãn sự tiến triển của bệnh. Các thuốc điều trị nội khoa
cho bệnh nhân DMD như prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm
steroid) hoặc aminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy
tế bào cơ. Vật lý trị liệu có tác dụng làm chậm lại các biến chứng thoái hóa,
co rút cơ [92].
1.2.5.2. Liệu pháp thay thế gen
Mục đích là đưa vào trong tế bào gen có khả năng tổng hợp ra protein
dystrophin và làm cho protein biểu hiện được ở màng tế bào cơ. Hai phương
pháp đã được thực nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ những plasmid chứa
đoạn gen dystrophin và sử dụng vật truyền trung gian. Tuy nhiên phương
pháp này gặp những khó khăn sau: (1) trở ngại khi tiến hành đưa một gen lớn
vào vật truyền trung gian, (2) đưa vào bộ máy di truyền ở bên trong tế bào cơ
sau phân bào, (3) sự tồn tại của gen đưa vào cơ thể và sự thải ghép của hệ
thống miễn dịch. Vì những trở ngại đú nờn hiện nay các phương pháp này vẫn

chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD ở người [53], [96].
Trong vài năm trở lại đây, một hướng điều trị gen mới đã thu được
nhiều thành quả, đó là việc chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹ
BMD. Ở bệnh nhân DMD, đột biến gen dystrophin đã tạo ra mã kết thúc sớm
hoặc làm thay đổi toàn bộ khung dịch mã, kết quả là protein dystrophin không
được sản xuất. Sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh nhõn, các nhà
khoa học đã chọn lọc xúa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị đột
biến nhằm tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen nhưng vẫn duy trì được
khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần. Phương pháp này đã
được áp dụng để điều trị trên người và thu được những kết quả ban đầu đáng
khích lệ [93], [144].

12
1.2.5.3. Liệu pháp điều trị tế bào
- Chuyển ghộp nguyờn bào cơ: kỹ thuật này được thực hiện bằng
cách nuôi cấy in vitro cỏc nguyên bào cơ lấy từ cơ trưởng thành của một
người thân không mắc bệnh DMD, thường là người cha. Các tế bào hình sao
hiện diện trong cơ được xem là những nguyên bào cơ có nguồn gốc phôi thai
nhưng ở trạng thái ngủ. Trong quá trình sửa chữa cơ bị tổn thương, dưới các
tác động khác nhau, tế bào hình sao sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào
cơ. Nguyên bào cơ nuôi cấy được tiêm vào cơ loạn dưỡng của người bệnh.
Các tế bào cơ không thiếu protein dystrophin sẽ thay thế các tế bào cơ bệnh
lý, nhờ đó chức năng của cơ được tái lập. Trước khi thực hiện chuyển ghộp
nguyờn bào cơ, bệnh nhân phải được điều trị ức chế miễn dịch để ngăn cản
phản ứng thải ghép tương tự như trong điều trị ghép tạng và vì vậy liệu pháp
này có thể có nhiều tác dụng phụ như nhiễm khuẩn, ung thư, [34]. Hiện nay,
phương pháp này vẫn chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD một cách
rộng rãi.
- Phương pháp sử dụng tế bào gốc: trong những năm gần đây, tế bào
gốc từ tủy xương được nghiên cứu rất nhiều do không gặp phải cản trở về vấn

đề đạo đức và nguồn cung cấp dễ dàng. Trong tủy xương, ngoài dòng tế bào
tạo mỏu cũn có nhiều dòng tế bào khác và các tế bào đó có khả năng biệt hóa
thành nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào cơ hệ vận động, tế bào cơ tim,
tế bào nội mạc, tế bào thần kinh, Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy, khi
tiêm trực tiếp tế bào tủy xương vào cơ sẽ có một lượng nhỏ sợi cơ được tạo ra
[143], [138].
1.2.6. Phòng bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền có tiên lượng nặng, làm hạn chế và mất khả năng
đi lại, dẫn đến tàn phế và chết trước tuổi trưởng thành. Hiện nay, chưa có
phương pháp điều trị bệnh hiệu quả. Những nhà khoa học quan tâm đến bệnh
DMD đều nhận định rằng, cho tới khi chưa tìm được phương pháp điều trị có
hiệu quả cho bệnh DMD thì việc nghiên cứu nhằm phát hiện những người

13
lành mang gen bệnh (mẹ và chị, em gái) trong gia đình bệnh nhân, hoặc chẩn
đoán trước sinh trên những bà mẹ có nguy cơ cao giúp tư vấn di truyền vẫn là
biện pháp cơ bản để phòng ngừa bệnh DMD [93], [107].
1.3. Cơ chế bệnh sinh và các dạng đột biến gen dystrophin
1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen dystrophin
1.3.1.1. Vị trí của gen dystrophin





Hình 1.2. Sơ đồ NST X và vị trí của gen dystrophin
(Nguồn: www.ghr.nlm.nih.gov/gene)
Gen dystrophin nằm trên NST X, nhánh ngắn vùng 2, băng 1, băng phụ 2.
1.3.1.2. Cấu trúc của gen dystrophin

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc của gen dystrophin (Nguồn: Yaffe, 2002)
Gen dystrophin là một phức hợp gồm:
- Bộ phận khởi động (promotor): cho phép gen hoạt động, khi đóng,
khi mở và sản xuất ra các sản phẩm protein đặc hiệu mô tương ứng. Có bảy




14
promotor đặc hiệu là: promotor não, promotor cơ, promotor tiểu não,
promotor Dp260, Dp140, Dp116, Dp71 [139].
- Các exon: gen dystrophin chứa 79 exon, đây là vùng của gen được
phiờn mó có mặt trong mRNA trưởng thành, chứa đựng thông tin di truyền để
tổng hợp ra protein tương ứng.
- Các intron: là những đoạn DNA của gen xen kẽ giữa những exon,
được sao mã thành mRNA tiền thân, nhưng bị loại bỏ trong quá trình tạo
mRNA trưởng thành [136], [139].
1.3.1.3. Chức năng của gen dystrophin
Gen dystrophin có chiều dài khoảng 2400 kb, gen sao mã ra mRNA
trưởng thành có chiều dài 14 kb. Phân tử mRNA này tổng hợp nên protein
tương ứng là dystrophin [136].
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của protein dystrophin
1.3.2.1. Cấu trúc của protein dystrophin

Là protein được mã hóa bởi gen dystrophin có trọng lượng phân tử 427
kD với khoảng 3685 acid amin. Protein dystrophin nằm ở màng bào tương
của tế bào cơ và được chia làm 4 vùng:
1. Vùng N-tận gồm 240 acid amin, là vùng gắn với actin.
2. Vùng trung tâm rod có 2700 acid amin.
3. Vùng giàu cystein gồm 280 acid amin
4. Vùng C-tận chứa 420 acid amin, có chức năng liên kết với màng tế bào.
Vùng 5’-tận, vùng giàu base cystein và vùng C-tận là những vùng
tương đối quan trọng đối với chức năng của dystrophin. Những vùng này là vị
trí bám của actin và phức hợp dystrophin-glycoprotein (Dystrophin-
Glycoprotein Complex-DGC). Trong khi đú vùng rod được coi là vựng ớt
chức năng nhất [65], [107].

15







Hình 1.4. Cấu trúc mô phỏng của protein dystrophin và một số protein
tương tác với nó (Nguồn: www.jennyndesign.com)
1.3.2.2. Chức năng của protein dystrophin
Protein dystrophin có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ xương, đúng
vai trò quan trọng trong cấu trúc của cơ. Nhiều protein màng tế bào liên kết
với protein dystrophin tạo thành phức hợp DGC (Dystrophin-Glycoprotein
Complex). Phức hợp này cho phép nối những sợi actin với khung xương
ngoài tế bào xuyên qua màng sợi cơ [109]. Đầu amin tận của protein
dystrophin gắn với F-actin và đầu carboxyl tận gắn với phức hợp DGC tại

màng sợi cơ (hình 1.4). Các thành phần quan trọng của phức hợp DGC bao
gồm dystroglycan, sarcoglycan, dystrobrevin, syntrophin và NOS. Sự đột biến
xảy ra ở bất cứ vị trí nào trong các thành phần này đều gây ra bệnh loạn
dưỡng cơ di truyền. Phức hợp DGC sẽ bị mất ổn định khi protein dystrophin
vắng mặt. Sự mất ổn định này dẫn đến hoại tử dần dần các sợi cơ và tổn
thương màng. Phức hợp DGC cũn có vai trò như một tín hiệu hóa học. Sự mất
tín hiệu này cũng góp phần gây bệnh [65], [109].
1.3.3. Cơ chế bệnh sinh của DMD
Sự thiếu hụt protein dystrophin làm mất tính ổn định của phức hợp
DGC, từ đó sẽ gây ra bất thường ở màng tế bào với rách màng tế bào khu trú,
tạo điều kiện cho ion Ca
++
đi vào tế bào. Ion Ca
++
vào tế bào sẽ hoạt hóa các
enzym protease, gây phân hủy các protein của sợi cơ và bộ khung tế bào. Do

Khung xương ngoài tế bào
Vùng N tận
Vùng giàu Cystein
Vùng C- tận
Cấu trúc xoắn
giống spectrin
Vùng nối
Phức hợp
Dystroglycan
Phức hợp
Sarcoglycan

Khung xương ngoài tế bào

Vùng N tận
Vùng giàu Cystein
Vùng C- tận
Cấu trúc xoắn
giống spectrin
Vùng nối
Phức hợp
Dystroglycan
Phức hợp
Sarcoglycan


16
vậy, màng tế bào bị tổn thương rộng hơn và ion Ca
++
lại ồ ạt đi vào tế bào tạo
ra một vòng luẩn quẩn và dẫn đến rối loạn cân bằng nội mô canxi. Hậu quả
cuối cùng là sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) và hoại tử tế bào [109].








Hình 1.5. Cơ chế bệnh sinh của DMD
(Nguồn: Rando, 2004)
1.3.4. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin
1.3.4.1. Đột biến mất đoạn gen dystrophin

Đột biến mất đoạn gen là dạng thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD,
chiếm khoảng 60-65% các dạng đột biến gây bệnh DMD. Những đột biến mất
đoạn làm lệch khung dịch mã của mRNA, tạo ra protein dystrophin không có
chức năng và gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng DMD. Những mất đoạn gen
khụng gây lệch khung dịch mã có thể tạo ra protein dystrophin bị cắt ngắn ở
giữa nhưng còn một phần chức năng và gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ hơn là
BMD. Tuy nhiên, khả năng gây lệch khung dịch mã được xác định trên 90% các
trường hợp có đột biến mất đoạn [90], [106].
Đột biến mất đoạn của gen dystrophin chiếm tỷ lệ 2/3 các trường hợp
DMD/BMD và tập trung chủ yếu ở hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm và
đầu 5’ của gen dystrophin [106]. Các đột biến mất đoạn gen được phát hiện
bằng phân tích Southern blot và hầu hết (90-95%) được phát hiện bởi phương
pháp PCR với việc sử dụng các cặp mồi tập trung vào hai vùng “hotspot” [63], [75].


17
1.3.4.2. Đột biến điểm
Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 25-30%. Hầu
hết đột biến điểm trong bệnh DMD tạo ra mã kết thúc sớm và gây thể bệnh
nặng. Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo ra trở ngại lớn trong
việc xác định đột biến. Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gen
dystrophin đã được xác định [106], [112].
1.4.3.3. Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn
Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn là nguyên nhân gây nên DMD trong hầu
hết các trường hợp còn lại. Prior (2005) cho rằng 80% đột biến lặp đoạn xảy
ra ở đầu tận 5’ và 20% ở vùng trung tâm [107]. Ngoài ra, một tỷ lệ nhỏ bệnh
nhân DMD có đột biến nhỏ rải rác khó phát hiện [107].
1.4. Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin
Có nhiều phương pháp sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để phát
hiện bất thường của gen dystrophin.

1.4.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis
phát minh vào năm 1985 [121].
1.4.1.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi
tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA
polymerase. Với nguyên liệu là bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerase
xúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi
hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu
của trình tự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba bước:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch
phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA

18
được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,
thường là 94
o
C-95
o
C trong vòng 30-60 giây.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40
o
C-70
o
C tuỳ thuộc Tm của
các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng

lên 72
o
C để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,
Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian
phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30
giây đến nhiều phút [121].
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng
làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản
phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đụi cú chiều dài
bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm
được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [94].










Hình 1.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR
(Nguồn: Vierstraete, 1999)


19
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA
ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi
lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ, một DNA đớch đó nhân bản
thành 2

n
bản sao. Đó là số lượng DNA đủ để có thể tách ra khi điện di và có
thể phát hiện được sau khi nhuộm, đủ để có thể tạo dòng hoặc giải trình tự
[6], [17], [81].
1.4.1.2. Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh DMD
* PCR đơn mồi (monoplex PCR): đõy là kỹ thuật PCR kinh điển nhất.
Mỗi phản ứng PCR sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại
một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA của tế bào [22], [138].
Trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen dystrophin, các tác giả đã sử
dụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của gen dystrophin bằng phản
ứng PCR, sau đó điện di sản phẩm trên gel agarose. Mẫu bệnh nhân được tiến
hành song song với mẫu đối chứng. Nếu mẫu đối chứng xuất hiện vạch DNA
tương ứng với kích thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫu bệnh
nhân không xuất hiện vạch thì bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon đó. Ở
Việt Nam, Nguyễn Đức Bách (2003), Đặng Thị Diễm Hồng (2004) đã sử
dụng phương pháp PCR đơn mồi để xác định đột biến mất đoạn gen ở bệnh
nhân DMD. Năm 2006, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã khuếch đại 22 exon (1, 3,
4, 6, 8, 11, 12, 13, 17, 19, 20, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 và 60) của
84 bệnh nhân DMD và phát hiện được 32 bệnh nhân (chiếm 38%) có đột biến mất
đoạn [1], [7], [8].
* PCR đa mồi (multiplex PCR): là phương pháp PCR sử dụng đồng thời
nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhõn cỏc đoạn DNA đặc trưng khác
nhau trên một phân tử DNA, hoặc trờn cỏc phân tử DNA khác nhau [114].
Điều quan trọng nhất là phải thiết kế các cặp mồi cú cựng nhiệt độ bắt cặp lên
DNA đích, đồng thời các mồi này không bắt cặp với nhau. Tuy nhiên, rất khó
để đạt được các điều kiện như vậy nên phương pháp PCR đa mồi có nhược
điểm là đôi khi cho kết quả không chính xác như PCR đơn mồi [41], [74].

20
Ứng dụng trong chẩn đoán DMD:

Do gen dystrophin có số lượng lớn exon (79 exon) nên để phát hiện đột
biến mất đoạn gen dystrophin, các tác giả thường sử dụng phương pháp PCR
đa mồi hơn là phương pháp PCR đơn mồi nhằm tiết kiệm thời gian, công sức
và hóa chất. Trước đây và cho đến hiện nay, phương pháp multiplex PCR vẫn
là phương pháp được ưu tiên sử dụng để phát hiện đột biến mất đoạn gen
dystrophin như trong nghiên cứu của Coutelle (1989), Lee (1993), Prior
(2005), Basak (2006), Sura (2008), Năm 2006, Trần Võn Khỏnh đó sử dụng
phương pháp này để phát hiện đột biến trên 85 bệnh nhân DMD. Kết quả cho
thấy tỷ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin của bệnh nhân DMD ở Việt Nam
là 38% [10], [32], [33], [43], [82], [125]. Hiện nay, phương pháp multiplex
PCR là một trong những phương pháp được sử dụng để chẩn đoán đột biến mất
đoạn gen dystrophin ở Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein của trường Đại học Y
Hà Nội.




Hình 1.7. Phản ứng multiplex PCR xác định đột biến mất đoạn gen
dystrophin (Trung tâm Nghiờn cứu Gen-Protein, Đại học Y Hà Nội)
* Kỹ thuật PCR lồng (nested PCR): nguyờn lý của kỹ thuật nested PCR là sử
dụng 2 cặp mồi có trình tự nucleotid lồng vào nhau để khuếch đại đoạn DNA đích,
nghĩa là cặp mồi thứ 2 có trình tự các nucleotid nằm bên trong cặp mồi thứ nhất.
Sản phẩm PCR được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho
phản ứng PCR lần thứ 2. Phương pháp này làm tăng chất lượng và độ đặc hiệu cho
phản ứng PCR [6], [18], [74].
* Kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR): trước hết, mRNA được chuyển
thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược. Mồi được sử dụng hoặc là
oligonucleotid oligodT (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), hoặc là các
Exon 42
Exon 47

Exon 68
Exon 77
Nước
Control BN1 BN2 BN3 BN4 BN5 BN6 BN7 Marker
Exon 42
Exon 47
Exon 68
Exon 77
Nước
Control BN1 BN2 BN3 BN4 BN5 BN6 BN7 Marker


21
hexanucleotid (trình tự gồm 6 nucleotid) để bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự
ngắn trên RNA. Sau đó, cDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzym
Taq polymerase [110].
Đối với bệnh DMD, RT-PCR đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá
trình xác định đột biến. Như đã trình bày gen dystrophin là một trong những
gen lớn nhất của cơ thể (dài 2400 kb), có cấu trúc gồm 79 exon, sao mã ra
phân tử mRNA dài 14 kb; trong cấu trúc DNA, các exon nằm xen kẽ với các
intron có kích thước rất lớn [26]. Do vậy, để khuếch đại 79 exon mang chức
năng mã hóa protein từ DNA, người ta phải thiết kế 79 cặp mồi; nhưng nhờ
phản ứng RT-PCR, phân tử mRNA được chuyển thành cDNA. Trên phân tử
cDNA, 79 exon nằm liên tục với nhau, không bị xen kẽ bởi các intron; vì thế,
chỉ cần thiết kế 15 cặp mồi và sử dụng 15 phản ứng nested PCR (trong đó có
5 cặp mồi dùng cho phản ứng PCR lần 1 và 10 cặp mồi thiết kế cho phản ứng
PCR lần 2), toàn bộ chiều dài của gen dystrophin sẽ được khuếch đại [129].
Với 10 cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR lần 2, 10 đoạn DNA chứa toàn bộ
79 exon được khuếch đại và mỗi đoạn có kích thước khoảng 1000-1400 bp.
Sau khi khuếch đại, các đoạn DNA được điện di trên agarose để xác định đột

biến mất đoạn gen. Mặt khác, 10 đoạn gen này có thể được tạo dòng và giải
trình tự để phát hiện các dạng đột biến khó xác định của gen dystrophin như
đột biến điểm, đột biến lặp đoạn Các tác giả Tay và Lai đã sử dụng phương
pháp này để xác định dạng đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD ở
Singapore [129]. Hiện nay, nhóm nghiên cứu của Tạ Thành Văn ở Trung tõm
Nghiờn cứu Gen-Protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội cũng ứng dụng kỹ
thuật RT-PCR để xác định đột biến điểm và đột biến mất đoạn gen dystrophin
ở mức độ mRNA.
1.4.2. Phương pháp Southern blot
1.4.2.1. Nguyên tắc
Trong phương pháp này, DNA được phân cắt bằng các enzym đặc hiệu.
Các đoạn DNA trong hỗn hợp sau đó được phân tách bằng điện di trên gel

22
agarose rồi chuyển sang màng lai. Bước tiếp theo, các đoạn DNA cần xác
định nằm trên màng được lai với các oligonucleic đặc hiệu có gắn chất đánh
dấu như phóng xạ, chất màu huỳnh quang, biotin Các phương pháp xác định
hình ảnh tương ứng được sử dụng để chỉ ra các vạch sản phẩm chứa các đoạn
DNA cần phát hiện lai với oligonucleotid đánh dấu trên màng. Phương pháp
này cho phép xác định được những đoạn DNA có kích thước lớn chỉ với một
nồng độ nhỏ trong hỗn hợp vốn khó có thể xác định được bằng các phương
pháp khác như nhuộm ethedium bromide [12], [126].
1.4.2.2. Ứng dụng trong chẩn đoán DMD
Ngoài việc phát hiện được đột biến xóa đoạn, Southern blot còn cho
phép xác định các đột biến lặp đoạn gen dystrophin. Ở bệnh nhân đột biến
mất đoạn, băng lai của các exon bị đột biến và đoạn dò đặc hiệu không xuất
hiện trên phim. Đối với các bệnh nhân đột biến lặp đoạn, có hiện tượng tăng
cường độ phát sáng của băng lai với exon bị lặp đoạn khi so sánh với mẫu đối
chứng. Ngoài ra, Southern blot còn được sử dụng để phát hiện người mẹ và
chị em gái của bệnh nhân ở dạng dị hợp tử. Prior (2005) đã sử dụng phương

pháp này để xác định đột biến mất đoạn ở một bệnh nhân DMD, đồng thời
phát hiện được mẹ và chị gái của bệnh nhân cũng là người mang gen bệnh [107].






Hình 1.8. Kỹ thuật Southern blot xác định đột biến gen dystrophin
(Nguồn: Prior, 2005)
Người mẹ (I-1) sinh một người con trai bị DMD (II-3) với đột biến mất đoạn exon 50 và 2
người con gái (II-1 và II-2). Phản ứng Southern blot được tiến hành với 2 exon, 1 exon bệnh nhân
không bị đột biến nhằm làm đối chứng nội là exon 19 và 1 exon mà bệnh nhân bị mất đoạn (exon
50). Để tránh sai số, Prior phân tích kết quả dựa vào tỷ lệ đậm độ băng lai của exon 50:19 và so
sánh tỷ lệ này của các thành viên với đối chứng nữ. Kết quả cho thấy ở mẹ bệnh nhân (I-1) và II-1
có tỷ lệ đậm độ exon 50:19 giảm 50% so với tỷ lệ này ở đối chứng nữ, như vậy hai người nữ này ở
dạng dị hợp tử. Còn người nữ II-2 thì tỷ lệ đậm độ exon 50:19 tương đương với chứng nữ, chứng tỏ
không mang gen bệnh.
I
II
1
1 2
3
Chứng
nữ
Exon 19
Exon 50
I
II
1

1 2
3
Chứng
nữ
Exon 19
Exon 50


23
1.4.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)
1.4.3.1. Nguyên tắc
Sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, được gọi là mẫu
DNA dò (probe DNA) để phát hiện một trình tự đớch. Cỏc mẫu DNA dò
được đánh dấu huỳnh quang và sẽ lai với DNA đớch trờn NST ở kỳ giữa hoặc
gian kỳ. Nhờ sự lai của mẫu DNA dò với trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện,
định vị được vị trí chuỗi DNA đặc hiệu qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh
quang [5].
1.4.3.2. Ứng dụng trong chẩn đoán DMD
FISH là một kỹ thuật giúp chẩn đoán hiệu quả các bệnh lý di truyền nói
chung và bệnh lý DMD nói riêng. Để chẩn đoán đột biến gen dystrophin,
Ligon (2000) đã sử dụng 2 loại probe:
- Các probe giúp xác định đột biến mất đoạn các exon của gen
dystrophin gọi là cosmid probe có gắn chất huỳnh quang digoxingenin. Khi có
hiện tượng lai đặc hiệu xảy ra, digoxingenin gắn trên probe sẽ phát ra màu đỏ.
- Loại probe thứ hai giúp định vị các NST X (vì gen dystrophin nằm
trên NST X), probe này có gắn biotin. Khi probe lai với NST X thì tâm động
của NST X phát ra màu xanh [84].
Kết quả của nghiên cứu của ba gia đình được thể hiện ở hình 1.9.

Hình 1.9. Hình ảnh xác định đột biến gen dystrophin nhờ phương pháp FISH
(Nguồn: Ligon, 2000)
(A). Bệnh nhân nam, sử dụng cosmid probe đặc hiệu cho exon 3-6. Kết quả cho thấy bệnh
nhân có 1 NST X (tâm động có màu xanh đặc hiệu). Trên NST X không xuất hiện tín hiệu màu
đỏ, chứng tỏ không có hiện tượng lai giữa probe và đoạn gen đặc hiệu, có nghĩa bệnh nhân bị
đột biến mất đoạn exon trong khoảng 3-6
(B). FISH sử dụng cosmid đặc hiệu cho exon 12, áp dụng cho con gái của 1 bệnh nhân nam
bị BMD. Kết quả cho thấy chỉ có 1 NST X phát tín hiệu màu đỏ và 1 NST X không xuất hiện
màu đỏ. Như vậy người con gái này ở dạng dị hợp tử, mang 1 gen đột biến mất đoạn exon 12.
A
B
C
AA
BB
CC


24
(C). FISH sử dụng cosmid đặc hiệu cho exon 44, xác định trên người chị của gia đình thứ
3. Kết quả cho thấy hiện tượng lai xảy ra ở cả 2 NST X, như vậy người chị này không mang
gen đột biến exon 44.
1.4.4. Phương pháp MLPA
Trong những năm gần đây, kỹ thuật MLPA được nhiều nhà khoa học sử
dụng để phát hiện các bệnh lý di truyền. Phương pháp này cho phép phát hiện
các tổn thương gen một cách nhanh chóng [78], [111].
1.4.4.1. Chuẩn bị probe

Trong phản ứng MLPA, vấn đề thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các
đoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Thông thường, mỗi probe
chứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau (hình 1.10):


Hình 1.10. Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA
(Nguồn: Schouten, 2002)
- Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:
+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai
với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 21-30
nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe.

Sản phẩm khuếch đại của các probe được phân tách bằng điện di, số lượng sản
phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản sao của đoạn DNA đích
Biến tính
PCR
Sản phẩm khuếch đại của các probe được phân tách bằng điện di, số lượng sản
phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản sao của đoạn DNA đích
Biến tính
PCR




25
+ Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid
của đoạn này giống nhau cho tất cả các probe. Đõy là vị trí gắn với mồi Y để
khuếch đại probe khi tiến hành phản ứng PCR.
- Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:
+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,

+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau cho
tất cả các probe. Đõy là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe,
+ Đoạn 3’ cũn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’
và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu
với DNA đớch nờn nú khụng gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác
nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau. Do
đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di [115], [117].
1.4.4.2. Các bước tiến hành phản ứng MLPA
- Mẫu DNA hòa với 5 μl TE được biến tính ở 98°C trong 5’.
- Cho hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe vào.
- Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong vòng 16 giờ (qua đêm). Hai đoạn lai
của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn với DNA đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau.
- Cho enzym ligase vào và ủ ở 54°C trong 15 phút, enzym lipase xúc
tác, nối hai đoạn oligonucleotid của probe lại với nhau (hình 1.10). Phản ứng
nối sẽ chấm dứt bởi sự tăng nhiệt độ lên 98°C trong 5 phút của phản ứng PCR
để khuếch đại các probe.
- Hai đầu 5’ và 3’ của các probe có trình tự nucleotid hoàn toàn giống
nhau, đây cũng là vị trí gắn mồi khi tiến hành phản ứng PCR. Do vậy, chúng
ta chỉ cần dùng duy nhất 1 cặp mồi nhưng khuếch đại được toàn bộ các probe
khác nhau có trong hỗn hợp.
- Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản
sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của
chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di
(thường sử dụng phương pháp điện di mao quản). Số lượng sản phẩm khuếch