nghiên cứu tạo màng sinh học (biofilm) từ vi sinh vật nhằm định hướng ứng dụng trong xử lý nước bị ô nhiễm dầu

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆN HÀN LÂM KH & CN VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04/11-15

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TẠO MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) TỪ VI SINH VẬT
NHẰM ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ
NƯỚC BỊ Ô NHIỄM DẦU
MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC.04.TN05/11-15

Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài:
(ký tên) (ký tên và đóng dấu)




TS. Lê Thị Nhi Công

Hà Nội - 2013


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. Giới thiệu vắn tắt về đề tài 1
1.1. Sự hình thành đề tài 1
1.2. Mục tiêu, đối tượng, tính cấp thiết, phạm vi nghiên cứu, ý nghĩa khoa học và
thực tiễn của đề tài 1
1.2.1. Mục tiêu 1
1.2.2. Đối tượng 1
1.2.3. Tính cấp thiết của đề tài 2
1.2.4. Phạm vi nghiên cứu 2
1.2.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
1.3. Tổng quan tài liệu 3
1.3.1. Tình hình nghiên cứu 3
1.3.2. Thành phần và cấu trúc của biofilm 6
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm của vi sinh vật 7
1.3.4. Những vấn đề chưa được giải quyết mà đề tài lựa chọn để nghiên cứu 8
1.4. Mục tiêu hoàn thiện công nghệ, quy mô và trình độ của công nghệ cần đạt
được, tính khả thi và hiệu quả kinh tế của dự án 9

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10
CHƯƠNG I. Nguyên liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng 10
1.1. Nguyên liệu 10
1.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy 10
1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu 10
CHƯƠNG II. Phương pháp nghiên cứu 10
1.1. Lấy mẫu 10
1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ dầu 11
1.2. Sàng lọc các chủng tạo biofilm tốt 11
1.3. Phân loại và định tên 12
1.4. Quan sát tế bào vi khuẩn và nấm men dưới kính hiển vi điện tử 12
1.5. PCR-DGGE 13
1.6. Tách chiết, phân tích đánh giá khả năng phân hủy các thành phần
hydrocarbon 13
NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN 14


CHƯƠNG I. Nội dung 1 - Phân lập, tuyển chọn một số chủng VSV có khả năng
phân hủy tốt các thành phần dầu mỏ 14
1.1. Phân lập một số chủng VK có khả năng phân hủy các thành phần dầu mỏ 14
1.2. Phân lập một số chủng NM có khả năng phân hủy các thành phần dầu mỏ 16
CHƯƠNG II. Nội dung 2 - Sàng lọc các chủng có khả năng tạo biofilm từ các chủng
đã lựa chọn 19
2.1. Sàng lọc các chủng tạo biofilm tốt 19
2.1.1. Đánh giá khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn 19
2.1.2. Sàng lọc các chủng nấm men tạo màng sinh học tốt 20
2.2. Phân loại và định tên 23
2.2.1. Phân loại và định tên các chủng vi khuẩn tạo màng sinh học tốt 23
2.2.2. Phân loại và định tên các chủng nấm men tạo màng sinh học tốt 27
CHƯƠNG III. Nội dung 3: Tạo biofilm ở quy mô phòng thí nghiệm 30

3.1. Tối ưu hóa các điều kiện hóa lý như nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl,… để tạo
được biofilm 30
3.1.1. Ảnh hưởng của các điều kiện hóa lý như pH, nồng độ NaCl, nhiệt độ, …
lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn 30
3.1.2. Ảnh hưởng của các điều kiện hóa lý như pH, nồng độ NaCl, nhiệt độ, …
lên khả năng tạo biofilm của các chủng nấm men 34
3.2. Quy trình tạo biofilm từ hỗn hợp đa chủng ở quy mô phòng thí nghiệm 38
3.2.1. Sơ đồ quy trình 38
3.2.2. Tiêu chuẩn nguyên – vật liệu đầu vào 38
3.2.3. Các loại vật tư, thiết bị sử dụng 39
3.2.4. Phương pháp kiểm tra 39
CHƯƠNG IV. Nội dung 4: Nghiên cứu hiệu quả xử lý các thành phần hydrocarbon
no của biofilm đa chủng ở quy mô phòng thí nghiệm 43
4.1. Khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon no của MSH do các chủng
VK tạo ra 43
4.1.1. Khả năng phân hủy dầu DO của các chủng VK tạo MSH 43
4.1.2. Khả năng phân hủy dầu DO của MSH đa chủng 44
4.2. Khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon no của MSH do các chủng
NM tạo ra 45
4.2.1. Khả năng phân hủy dầu DO của các chủng NM tạo MSH 45
4.2.2. Khả năng phân hủy dầu DO của MSH đa chủng 46
CHƯƠNG V. Nội dung 5: Nghiên cứu hiệu quả xử lý các thành phần hydrocarbon
thơm của biofilm đa chủng ở quy mô phòng thí nghiệm 48
5.1. Khả năng phân hủy phenol của MSH do các chủng vi khuẩn tạo ra 48


5.1.1. Khả năng phân hủy phenol của các chủng vi khuẩn tạo MSH 48
5.1.2. Đánh giá khả năng phân hủy phenol của MSH đa chủng VK bằng phương
pháp phân tích dầu tổng số 49
5.1.3. Đánh giá khả năng phân hủy phenol của MSH đa chủng VK bằng phương

pháp HPLC 50
5.1.4. Đánh giá khả năng phân hủy PAHs của MSH đa chủng vi khuẩn 51
5.2. Khả năng phân hủy phenol của MSH do các chủng nấm men tạo ra 53
5.2.1. Khả năng phân hủy phenol của của các chủng nấm men tạo MSH 53
5.2.2. Đánh giá khả năng phân hủy phenol của MSH đa chủng NM bằng phương
pháp phân tích dầu tổng số 54
5.2.3. Đánh giá khả năng phân hủy phenol của MSH đa chủng NM bằng phương
pháp HPLC 55
5.2.4. Đánh giá khả năng phân hủy PAHs của MSH đa chủng nấm men 56
CHƯƠNG VI. Nội dung 6: Nghiên cứu hiệu quả xử lýdầu FO của biofilm đa chủng
ở quy mô phòng thí nghiệm 59
6.1. Đánh giá khả năng phân hủy dầu FO của MSH do các chủng vi khuẩn tạo ra59
6.1.1. Đánh giá khả năng phân hủy dầu FO của các chủng vi khuẩn tạo MSH
bằng phương pháp phân tích dầu tổng số 59
6.1.2. Đánh giá khả năng phân hủy dầu FO của MSH đa chủng bằng phương
pháp GCMS 60
6.2. Đánh giá khả năng phân hủy dầu FO của MSH do các chủng nấm men tạo ra
bằng phương pháp phân tích dầu tổng số 64
6.2.1. Đánh giá khả năng phân hủy dầu FO của các chủng nấm men tạo MSH
bằng phương pháp phân tích dầu tổng số 64
6.2.2. Đánh giá khả năng phân hủy dầu FO của màng sinh học đa chủng bằng
phương pháp GCMS 65
CHƯƠNG VII. Nội dung 7: Phân tích cấu trúc quần thể vi sinh vật của biofilm 69
7.1. Tách chiết DNA tổng số 69
7.2. Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR 69
7.3. Đánh giá sự biến động của các nhóm VSV trong các mô hình trước và sau khi
xử lý dầu bằng kỹ thuật DGGE 70
KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 72
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75
KẾT LUẬN 75

KIẾN NGHỊ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 81

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp
Base pair (cặp bazơ)
cs
Cộng sự
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DNA
Deoxyribonucleic acid
DO
Diesel Oil (dầu diesel)
FO
Fuel oil
GC
sắc ký khí
GCMS
sắc ký khí khối phổ
Gr, Gr(-), Gr(+)
Gram, Gram âm, Gram dương
h
Hour (giờ)
HPLC
sắc ký lỏng cao áp
kDa
Kilogram Dalton (≈1.66 ×10
−27

kg)
LB
Luria – Broth
MPA
Meat - Peptone – Agar
MSH
Màng sinh học
ng
Nanogam
nm
nanomet
NM
Nấm men
OD
Opitical Density (mật độ quang học)
PAH
Polycyclic aromatic hydrocarbon
PCR
Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
ppm
Parts per million (Đơn vị một phần triệu, mg/l)
RNA
Ribonucleic acid
rRNA
Ribosomal ribonucleic acid
TB
Tế bào
UV
Ultra violet – tia cực tím
VK

Vi khuẩn
VSV
Vi sinh vật
μl, ml, l
Microlit, mililit, lít
μm, mm
Micromet, milimet



DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1: Vai trò của mạng lưới ngoại bào trong biofilm
9
Bảng 1.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường Gost thạch
20
Bảng 1.2. Hình thái khuẩn lạc nấm men trên môi trường Gost thạch
23
Bảng 2.1. Đánh giá khả năng tạo biofilm sau 1 ngày nuôi tĩnh của một số
chủng vi khuẩn lựa chọn bằng phương pháp đo OD
27
Bảng 2.2. Đánh giá khả năng tạo biofilm sau 2 ngày nuôi tĩnh của một số
chủng vi khuẩn lựa chọn bằng phương pháp đo OD
27
Bảng 2.3. Đánh giá khả năng tạo biofilm sau 3 ngày nuôi tĩnh của một số
chủng vi khuẩn lựa chọn bằng phương pháp đo OD
27
Bảng 2.4. Đánh giá khả năng tạo biofilm sau 1 ngày nuôi tĩnh của một số
chủng nấm men lựa chọn bằng phương pháp đo OD

28
Bảng 2.5. Đánh giá khả năng tạo biofilm sau 2 ngày nuôi tĩnh của một số
chủng nấm men lựa chọn bằng phương pháp đo OD
28
Bảng 2.6. Đánh giá khả năng tạo biofilm sau 3 ngày nuôi tĩnh của một số
chủng nấm men lựa chọn bằng phương pháp đo OD
28
Bảng 2.7. Kết quả phân loại sơ bộ bằng Kit chuẩn sinh hóa API 50CH của
các chủng lựa chọn
30
Bảng 2.8. Kết quả phân loại sơ bộ bằng Kit chuẩn sinh hóa API 20 C AUX
của các chủng lựa chọn
35
Bảng 3.1. Thành phần môi trường nhân giống
48
Bảng 4.1. Đánh giá khả năng phân hủy dầu DO của các chủng vi khuẩn
lựa chọn bằng phương pháp phân tích khối lượng
55
Bảng 5.1. Đánh giá khả năng phân hủy phenol của các mô hình VK thí
nghiệm bằng phương pháp phân tích dầu tổng số
62
Bảng 5.2. Đánh giá khả năng phân hủy phenol của các mô hình NM thí
nghiệm bằng phương pháp phân tích dầu tổng số
69
Bảng 6.1. Thành phần hydrocarbon có trong dầu FO
74
Bảng 6.2. Đánh giá khả năng phân hủy dầu FO của MSH do các chủng VK
tạo thành bằng phương pháp phân tích dầu tổng số
75
Bảng 6.3. Khả năng phân hủy dầu FO (1%) của màng sinh học do các

chủng nấm men tạo thành
80



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang
Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc sau khi làm giàu lần 3
20
Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc và hình thái TB của các chủng vi khuẩn
22
Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái TB của các chủng nấm men
25
Hình 2.1. Khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn
26
Hình 2.2. Khả năng tạo màng của các chủng nấm men
28
Hình 2.3. Vị trí phân loại của chủng B2
32
Hình 2.4. Vị trí phân loại của chủng B8
33
Hình 2.5. Vị trí phân loại của chủng B15
33
Hình 2.6. Vị trí phân loại của chủng B16
34
Hình 2.7. Vị trí phân loại của chủng TH1
36
Hình 2.8. Vị trí phân loại của chủng TH4
36

Hình 3.1. Ảnh hưởng của các giá trị pH lên khả năng tạo màng của các
chủng vi khuẩn lựa chọn
38
Hình 3.2. Biofilm của chủng B2 ở pH khác nhau (48h)
39
Hình 3.3. Biofilm của chủng B8 ở pH khác nhau (48h)
39
Hình 3.4. Biofilm của chủng B15 ở pH khác nhau (48h)
39
Hình 3.5. Biofilm của chủng B16 ở pH khác nhau (48h)
39
Hình 3.6. Ảnh hưởng của NaCl lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi
khuẩn
40
Hình 3.7. Biofilm của chủng B2 ở các nồng độ NaCl khác nhau (48h)
40
Hình 3.8. Biofilm của chủng B8 ở các nồng độ NaCl khác nhau (48h)
41
Hình 3.9. Biofilm của chủng B15 ở các nồng độ NaCl khác nhau (48h)
41
Hình 3.10. Biofilm của chủng B16 ở các nồng độ NaCl khác nhau (48h)
41
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tạo biofilm của các chủng
vi khuẩn
42
Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH lên khả năng tạo biofilm của các chủng NM
43
Hình 3.13. Biofilm của chủng TH1 ở pH khác nhau (48h)
43
Hình 3.14. Biofilm của chủng TH4 ở pH khác nhau (48h)

43
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng tạo biofilm của các
chủng nấm men
44
Hình 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng tạo biofilm của các
chủng nấm men
45
Hình 3.17. Màng đa chủng tạo ra bởi các chủng lựa chọn: (a): VK; (b): NM
52
Hình 3.18. Cấu trúc hiển vi của biofilm tạo bởi các chủng vi khuẩn và cấu
52


trúc những kênh dẫn nước cho phép dòng nước chảy qua
Hình 3.19. Ảnh hiển vi quét cho thấy cấu trúc không đồng đều bên trong
biofilm tạo thành bởi các chủng nấm men
53
Hình 4.1. Kết quả phân hủy dầu DO của 4 chủng sau 5 ngày nuôi tĩnh
54
Hình 4.2. Khả năng phân hủy các thành phần n-alkane sau 5 ngày nuôi tĩnh
của biofilm đa chủng
56
Hình 4.3. Sắc ký đồ khả năng phân hủy dầu DO của biofilm do hỗn hợp
các chủng vi khuẩn tạo thành sau 5 ngày nuôi tĩnh: (a), biofilm đa chủng;
(b), đối chứng. Biphenyl được sử dụng làm chất chuẩn
56
Hình 4.4. Khả năng phân hủy các thành phần n-alkane sau 5 ngày nuôi tĩnh
của biofilm đa chủng
58
Hình 4.5. Sắc ký đồ khả năng phân hủy DO của màng sinh học tạo thành từ

các chủng nấm men TH1 và TH4: (a), đối chứng; (b), thí nghiệm. Biphenyl
được sử dụng làm chất chuẩn.
58
Hình 5.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn với hàm
lượng phenol sử dụng là 100ppm (a) và 150ppm (b)
60
Hình 5.2. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn với hàm
lượng phenol sử dụng là 200ppm
61
Hình 5.3. Màng đa chủng tạo ra bởi các chủng vi khuẩn lựa chọn
61
Hình 5.4. Mô hình bổ sung xơ dừa có sục khí (a) và không sục khí (b)
62
Hình 5.5. Đánh giá khả năng phân hủy phenol bằng phương pháp HPLC
sau 7 ngày: (a), đối chứng cơ chất; (b), đối chứng màng không có cơ chất;
(c), màng có cơ chất
64
Hình 5.6. Mô hình xử lý nước thải kho xăng Đỗ Xá, Hà Nội; (a): trước thí
nghiệm; (b): sau thí nghiệm
65
Hình 5.7. Sắc ký đồ các thành phần hydrocarbon có trong các mẫu thí
nghiệm; (a): đối chứng; (b): thí nghiệm sau 14 ngày
66
Hình 5.8. Khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon thơm sau 14
ngày nuôi tĩnh của biofilm đa chủng VK
67
Hình 5.9. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng NM với hàm lượng
phenol sử dụng là 150ppm (a) và 200ppm (b)
68
Hình 5.10. Màng đa chủng tạo ra bởi các chủng nấm men lựa chọn

68
Hình 5.11. Đánh giá khả năng phân hủy phenol bằng phương pháp HPLC
sau 7 ngày: (a), đối chứng cơ chất; (b), đối chứng màng không có cơ chất;
(c), màng có cơ chất
70
Hình 5.12. Sắc ký đồ các thành phần hydrocarbon có trong các mẫu thí
nghiệm; (a): đối chứng; (b): thí nghiệm sau 14 ngày
71
Hình 5.13. Khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon thơm sau 14
72


ngày nuôi tĩnh của biofilm đa chủng NM
Hình 6.1. Khả năng phân hủy dầu FO (1%) của màng sinh học do các
chủng vi khuẩn tạo thành: (a), đối chứng; (b), thí nghiệm
75
Hình 6.2. Khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon sau 14 ngày
nuôi tĩnh của biofilm đa chủng VK
76
Hình 6.3. Sắc ký đồ các thành phần hydrocarbon có trong các mẫu thí
nghiệm; (a): đối chứng; (b): thí nghiệm
78
Hình 6.4. Khả năng phân hủy dầu FO (1%) của màng sinh học do các
chủng nấm men tạo thành: (a), đối chứng; (b), thí nghiệm
79
Hình 6.5. Sắc ký đồ các thành phần hydrocarbon có trong các mẫu thí
nghiệm; (a): đối chứng; (b): thí nghiệm
83
Hình 7.1. DNA tổng số của mẫu trước và sau xử lý ở các mô hình khác
nhau

85
Hình 7.2. Điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA
86
Hình 7.3. Điện di biến tính với dải nồng độ 35% - 60%
87

1

MỞ ĐẦU
CHƯƠNG I. Giới thiệu vắn tắt về đề tài
1.1. Sự hình thành đề tài
Trong nghiên cứu gần đây, chúng tôi đã đánh giá khả năng tạo màng sinh học
(biofilm) một số chủng vi khuẩn và nấm men phân huỷ dầu, phân lập từ các mẫu nước
biển bị ô nhiễm dầu ở Thanh Hoá và Vũng Tàu. Kết quả, chúng tôi đã xác định được
các chủng như Candida, Acinetobacter, Bacillus là những chủng vừa tạo biofilm vừa
có khả năng phân huỷ và chuyển hoá các thành phần dầu mỏ rất tốt. Hơn thế nữa, sau
24 giờ nuôi cấy, ở dạng tạo biofilm chúng còn có khả năng phân huỷ dầu tốt hơn ở
dạng tế bào planktonic. Điều này cho thấy tiềm năng phong phú về chủng loại vi sinh
vật vừa tạo biofilm vừa phân huỷ và chuyển hoá hydrocarbon trong các mẫu đất và
nước bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam [6]. Do đó, chúng tôi đã đề xuất đề tài: “Nghiên cứu
tạo màng sinh học (biofilm) từ vi sinh vật nhằm định hướng ứng dụng trong xử lý nước
bị ô nhiễm dầu”.
1.2. Mục tiêu, đối tượng, tính cấp thiết, phạm vi nghiên cứu, ý nghĩa khoa học
và thực tiễn của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Mục tiêu tổng quát:
Tạo được biofilm ở quy mô phòng thí nghiệm từ các chủng vi sinh vật bản địa nhằm
định hướng ứng dụng trong xử lý nước bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam.
* Mục tiêu cụ thể: Chi tiết hoá mục tiêu tổng quát,
- Xác định được các chủng vi khuẩn và nấm men có các đặc tính mới như vừa tạo

biofilm vừa có khả năng phân huỷ và chuyển hoá các thành phần dầu mỏ từ các
mẫu thu thập ở các địa điểm bị ô nhiễm dầu mỏ tại Việt Nam.
- Tạo được biofilm từ đa chủng ở quy mô phòng thí nghiệm và quy trình tạo màng
để xử lý nước thải bị ô nhiễm dầu.
- Kiểm tra khả năng và hiệu quả xử lý các thành phần hydrocarbon dầu mỏ của các
màng sinh học (MSH) trong phòng thí nghiệm. Trên cơ sở kết quả thu được sẽ xây
dựng mô hình xử lý nước bị nhiễm dầu bằng công nghệ biofilm ở quy mô phòng
thí nghiệm.
1.2.2. Đối tượng
- Các mẫu đất và nước thu thập ở một số vị trí ven biển bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam
như Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, …
- Từ các mẫu này chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn
và nấm men vừa tạo biofilm vừa có khả năng phân hủy và chuyển hóa các thành
phần dầu mỏ.
2

1.2.3. Tính cấp thiết của đề tài
Biofilm là một tập hợp bao gồm nhiều tế bào vi sinh vật của một hoặc một số
loài được tạo thành trên một bề mặt hoặc mặt phân giới của môi trường nước và không
khí (ví dụ như mặt nước ao, hồ, biển,…). Biofilm đã được chứng minh là có thể được
cấu tạo từ sự liên kết của các tế bào với các polysaccharide, protein và nucleic acid của
chính các tế bào đó [27, 33]. Các ví dụ điển hình của các polysaccharide tạo màng
như: alginate, Pel và Psl ở Pseudomonas aeruginosa; cellulose ở Escherichia coli và
Salmonella typhimurium; chuỗi tetrasaccharide lặp lại của D-glucose, L-fucose và D-
gluconic acid ở Klebsiella pneumoniae và Enterobacter aerogenes; gellan ở
Sphingomonas sp.; và levan (β-D-fructan) ở Streptococci [5, 18, 31]. Đặc biệt, các vi
sinh vật tạo chất hoạt hoá bề mặt sinh học đã được chứng minh là có khả năng tạo
biofilm rất tốt. Đặc tính này có được là do các vi sinh vật thường có cấu tạo đặc biệt ở
màng tế bào và khả năng sinh trưởng trên môi trường bán lỏng. Hơn thế nữa, biofilm
do các sinh vật này tạo ra còn có thể giúp cho quá trình phân huỷ dầu mỏ diễn ra

nhanh và hiệu quả hơn [35].
Hiện nay trên thế giới, công nghệ biofilm đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực
xử lý ô nhiễm môi trường, tuy nhiên, chưa có nhiều công bố về ứng dụng công nghệ
biofilm để xử lý ô nhiễm dầu. Công nghệ biofilm đã chứng minh có khá nhiều ưu điểm
như: giá thành thấp, giá vận hành thấp, ít sử dụng hóa chất; Thiết kế linh động, có thể
thích nghi với mọi loại hình công nghiệp và diện tích xử lý; Hệ thống màng sinh học
cũng rất hiệu quả trong việc xử lý mùi hôi, các hợp chất hữu cơ bay hơi và các chất
độc. Hiệu suất xử lý thường lớn hơn 90 % đối với các khí thải có nồng độ các chất ô
nhiễm < 1000 ppm. Nhiều loại nguyên liệu lọc, vi sinh vật và điều kiện vận hành khác
nhau có thể áp dụng để đáp ứng nhu cầu xử lý [30].
Tuy nhiên, cho tới nay việc sử dụng biofilm từ các vi sinh vật nội tại là một
biện pháp xử lý ô nhiễm tương đối mới ở Việt Nam. Mặc dù, với đặc điểm là một
nước nhiệt đới gió mùa, nước ta được đánh giá là có khu hệ vi sinh vật tương đối đa
dạng. Chúng ta đã có nhiều nghiên cứu về các chủng vi sinh vật hữu ích có ý nghĩa
ứng dụng lớn trong việc xử lý ô nhiễm môi trường [15, 24, 25]. Do đó, Nghiên cứu tạo
màng sinh học (biofilm) từ vi sinh vật nhằm định hướng ứng dụng trong xử lý nước bị
ô nhiễm dầu là rất quan trọng và cần thiết.
1.2.4. Phạm vi nghiên cứu
Một số địa điểm bị ô nhiễm dầu như Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, …
1.2.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Hiện nay, trong nước ta chưa có các sản phẩm biofilm để ứng dụng trong lĩnh
vực xử lý nước bị ô nhiễm dầu. Còn trên thế giới thì công nghệ biofilm đã được ứng
dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản, xử lý mùi
3

hôi… Tuy nhiên, trong xử lý nước bị ô nhiễm dầu thì mới chỉ có các nghiên cứu trong
phòng thí nghiệm [26, 35]. Do vậy, trên cơ sở các tài liệu tham khảo cũng như từ các
điều kiện thực tế ở những vùng bị ô nhiễm dầu của nước ta và các kết quả nghiên cứu
gần đây của nhóm nghiên cứu, chúng tôi đã đề xuất thực hiện đề tài này nhằm định
hướng phát triển thành công nghệ biofilm từ các vi sinh vật nội tại xử lý nước ô nhiễm

dầu ở Việt Nam.
1.3. Tổng quan tài liệu
1.3.1. Tình hình nghiên cứu
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Vấn đề ô nhiễm môi trường do dầu mỏ và các sản phẩm của dầu mỏ gây ra đã
được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu từ lâu. Nhiều công nghệ xử
lý đã được xây dựng, chẳng hạn như công nghệ DARAMEND (số đăng ký bản quyền
Patent 5.618.427) của nhà cung cấp Adventus Remediation Technology, Mississauga,
Otario, Canada đã được ứng dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy
(POPs) và được thương mại hóa từ năm 2001; Công nghệ phân hủy bằng thực vật
(Phytoremediation) nhằm loại bỏ các chất ô nhiễm ra khỏi đất, nước, không khí, trầm
tích và nước bề mặt Trong số các công nghệ mới này, Công nghệ màng sinh học
(biofilm) được xem là một trong những công nghệ xử lý dầu ô nhiễm hiệu quả, chi phí
thấp, nên từ lâu đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu và ứng dụng.
Màng sinh học - biofilm là một cấu trúc liên kết phức tạp của các tế bào và các sản
phẩm của tế bào, chẳng hạn như các polymer ngoại bào [4], tạo thành các hạt lơ lửng
trong môi trường nuôi cấy [22] hoặc được gắn trên một bề mặt vật thể rắn [14].
Biofilm là một tập hợp bao gồm nhiều tế bào vi sinh vật của một hoặc một số loài
được tạo thành trên một bề mặt hoặc mặt phân giới của môi trường nước và không khí
(ví dụ như mặt nước ao, hồ, biển,…). Trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt, các
vi sinh vật sẽ hình thành biofilm. Nhờ đó, các cá thể trong biofilm có thể chịu được
các ảnh hưởng hoá, lý khắc nghiệt của môi trường. Thêm vào đó, nhờ quá trình hình
thành biofilm, các sinh vật này có thể hấp thụ được các chất dinh dưỡng tốt hơn, tạo
được mối liên hệ giữa các tế bào với nhau và hạn chế được sự cạnh tranh của các vi
sinh vật khác trong cùng điều kiện môi trường sống [20].
Biofilm có thể được hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi
sinh vật khác như nấm, tảo, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong biofilm các tế bào tập hợp
thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai trò qua trọng
trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là giai đoạn đầu bởi nó qui định đặc tính
hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất

ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hỗ trợ
cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể. Đặc biệt, các vi sinh vật tạo
4

chất hoạt hoá bề mặt sinh học đã được chứng minh là có khả năng tạo biofilm rất tốt.
Đặc tính này có được là do các vi sinh vật thường có cấu tạo đặc biệt ở màng tế bào và
khả năng sinh trưởng trên môi trường bán lỏng. Hơn thế nữa, biofilm do các sinh vật
này tạo ra còn có thể giúp cho quá trình phân huỷ dầu mỏ diễn ra nhanh và hiệu quả
hơn [35].
Người ta cũng đã chứng minh được rằng các vi sinh vật sẽ nhanh chóng gắn lên
các bề mặt kị nước và không phân cực chẳng hạn như trên bề mặt Teflon,
polypropyrene và polystyrol. Còn với các vật liệu thấm nước như các kim loại thì
chúng sẽ gắn chậm hơn [1, 32]. Trên cơ sở đó, người ta đã sử dụng một số loại vật liệu
dùng làm giá thể bám dính được như Polyvinyl Chlorua với thông số diện tích bề mặt
110 m
2
/m
3
, thể tích lỗ rỗng 99,2% hoặc sợi tổng hợp.
Tại Mỹ, Châu Âu (Hà Lan, Đức, ) và Nhật Bản hệ thống biofilm đã được ứng
dụng thành công và hiệu quả trong xử lý mùi. Đây là một phương pháp hấp dẫn để xử
lý các chất khí có mùi hôi và các hợp chất hữu cơ bay hơi có nồng độ thấp. Trong hệ
thống này, các vi sinh vật sẽ tạo thành một màng sinh học, đây là một màng mỏng và
ẩm bao quanh các nguyên liệu lọc. Trong quá trình lọc, khí thải được bơm chậm xuyên
qua hệ thống lọc, các chất ô nhiễm trong khí thải sẽ bị các vật liệu lọc hấp thụ. Các
chất khí gây ô nhiễm sẽ bị hấp phụ bởi màng sinh học, tại đây, các vi sinh vật sẽ phân
huỷ chúng để tạo nên năng lượng và các sản phẩm cuối cùng là khí carbonic và nước.
Hệ thống biofilm trước đây thường được thiết kế để xử lý mùi của các hệ thống xử lý
nước thải, các nhà máy tái chế, quá trình ủ phân compost. Sau đó nó được ứng dụng
phổ biển trong việc xử lý các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi và các hợp chất hữu cơ khác

[29, 30].
Gần đây, các nhà nghiên cứu tại Đại học Illinois đã phát triển một loại biofilm mới
dùng trong xử lý nước và phân tán thuốc. Các biofilm này có độ thấm cao hơn đáng kể
so với các màng thẩm thấu ngược đang dùng trong quá trình khử muối và làm sạch
nước. Đồng thời, các biofilm này rất bền và có thể chịu được áp suất rất lớn, đây là
những điều kiện rất cần thiết cho quá trình khử muối và làm sạch nước [30]. Bên cạnh
đó, biofilm còn được sử dụng để loại các yếu tố hữu cơ trong các ao cá, giúp cho
ngành nuôi trồng thuỷ sản tăng năng suất đáng kể [18]. Các biofilm còn được ứng
dụng để làm giảm số lượng các vi khuẩn khử sulfate nhờ đó hạn chế hiện tượng bị ăn
mòn của các đường ống dẫn dầu [21, 29, 33].
Đặc biệt, biofilm có khá nhiều ưu điểm như: giá thành thấp, giá vận hành thấp,
ít sử dụng hóa chất; Thiết kế linh động, có thể thích nghi với mọi loại hình công
nghiệp và diện tích xử lý; Hệ thống màng sinh học cũng rất hiệu quả trong việc xử lý
mùi hôi, các hợp chất hữu cơ bay hơi và các chất độc. Hiệu suất xử lý thường lớn hơn
90 % đối với các khí thải có nồng độ các chất ô nhiễm < 1000 ppm. Nhiều loại nguyên
5

liệu lọc, vi sinh vật và điều kiện vận hành khác nhau có thể áp dụng để đáp ứng nhu
cầu xử lý [30].
Tình hình nghiên cứu trong nước:
Ở Việt Nam hiện nay đã có nhiều loại chế phẩm vi sinh cũng như những công
nghệ được áp dụng để xử lý ô nhiêm môi trường trong đó có ô nhiễm dầu. Các công
nghệ này thường được sử dụng kết hợp với các phương pháp vật lý và hóa học do vậy
cho hiệu quả xử lý khá cao.
Nhóm nghiên cứu Lại Thuý Hiền và cộng sự (cs) (2010) đã nghiên cứu và tìm
kiếm ra được các chủng vi khuẩn biển thuộc chi Pseudomonas và Acinetobacter có
khả năng sản sinh ra các chất có hoạt tính sinh học làm tăng cường quá trình xử lý
nước thải nhiễm dầu ở Hải Phòng và Thanh Hóa [15]. Ở Nghiêm Ngọc Minh và cs
(2004, 2010) đã tiến hành một số nghiên cứu về khả năng phân hủy PAH cũng như sự
phân bố của các tập đoàn vi sinh vật tại các vùng sinh thái khác nhau. Các nghiên cứu

xử lý nước thải nhà máy giấy (có chứa các chất PAH) theo hướng phân hủy sinh học
tại quy mô phòng thí nghiệm và pilot cũng đã được thử nghiệm. Bên cạnh đó, tại các
điểm lấy mẫu ở vùng ngập mặn ven bờ Giao Thuỷ - Nam Định, Trần Đình Mấn và cs
(2009) đã phân lập được các chủng vi khuẩn có hoạt tính amylaza, xenlulaza,
proteinaza và kitinaza. Các chủng này có thể được xem là cơ sở để đánh giá khả năng
tự làm sạch môi trường của các vi khuẩn nội tại.
Về mặt công nghệ, hệ thống ứng dụng công nghệ khí-sinh học (Viện Công nghệ
mới - Viện Khoa học và Công nghệ quân sự, Bộ Quốc phòng) có khả năng xử lý nước
thải nhiễm dầu tại Tổng kho M90 (Cục Xăng dầu, Tổng cục Hậu cần) đã cho hiệu quả
khá cao (95 – 98%). Trong hệ thống này, quá trình oxi hóa sinh học các hợp chất hữu
cơ được tăng cường nhờ lớp màng đệm vi sinh trong bể lọc sau đó sẽ qua bể lắng, bể
lọc hấp phụ để làm trong và loại bỏ nốt cặn còn lại trước khi xả ra môi trường (vật liệu
lọc là cát vàng và than hoạt tính).
Sử dụng biofilm là một biện pháp xử lý ô nhiễm tương đối mới ở Việt Nam.
Năm 2009, Đỗ Khắc Uẩn và cs đã sử dụng thành công hệ thống màng lọc vật lý gồm
các đơn nguyên màng vi lọc (kích thước lỗ 0,22 µm) để xử lý nitơ, phốt pho và các
chất hữu cơ trong nước thải đô thị. Phạm Thị Hồng Đức và Lê Văn Cát (2010) đã sử
dụng màng lọc sinh học (biofilter) để loại bỏ nitơ trong hệ xử lý sinh học nhằm mục
đích tái sử dụng nước nuôi giống thủy sản. Các tác giả Đặng Thị Hồng và Đinh Thị
Kim Nhung (2007) đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn giấm từ các nguồn nguyên liệu
dùng cho lên men giấm là Acetobacter xylinum NH1 tạo màng sinh học (BC) và ứng
dụng thử nghiệm trong điều trị vết bỏng ở thỏ. Trong nghiên cứu gần đây, chúng tôi đã
đánh giá khả năng tạo biofilm một số chủng vi khuẩn và nấm men phân huỷ dầu, phân
lập từ các mẫu nước biển bị ô nhiễm dầu ở Thanh Hoá và Vũng Tàu. Kết quả, chúng
6

tôi đã xác định được các chủng như Candida, Acinetobacter, Bacillus, Rhodococcus
là những chủng vừa tạo biofilm vừa có khả năng phân huỷ và chuyển hoá các thành
phần dầu mỏ rất tốt. Hơn thế nữa, sau 24 giờ nuôi cấy, ở dạng tạo biofilm chúng còn
có khả năng phân huỷ dầu tốt hơn ở dạng tế bào planktonic. Điều này cho thấy tiềm

năng phong phú về chủng loại vi sinh vật vừa tạo biofilm vừa phân huỷ và chuyển hoá
hydrocarbon trong các mẫu đất và nước bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam [6]. Như vậy,
nghiên cứu về biofilm sẽ mở ra khả năng ứng dụng vai trò của các vi sinh vật đối với
các hệ sinh thái và đời sống con người.
1.3.2. Thành phần và cấu trúc của biofilm
Về cơ bản biofilm được cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một loài hay từ
các loài vi sinh vật khác, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm 2 – 5% tổng khối lượng
biofilm, 97% là nước, 3 – 6% còn lại là các hợp chất polymer ngoại bào (EPS) và ion
[1]. Một tế bào riêng lẻ có thể tạo ra vài thành phần ngoại bào khác nhau tùy thuộc vào
điều kiện môi trường, đặc tính của từng loài vi khuẩn cũng như cách thức khác nhau
hình thành biofilm.
Thành phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng biofilm và
điều kiện hình thành. Nhưng về cơ bản đều bao gồm các polysaccharide chiếm khoảng
40 – 95%, 1 – 60% là protein, 1 – 10% là acid nucleic, 1 – 40% lipid [9]. Các hợp chất
này thay đổi theo không gian và thời gian tồn tại của biofilm. Về cơ bản biofilm càng
dày và thời gian tồn tại càng lâu thì có hàm lượng EPS càng nhiều. Mật độ tế bào tập
trung cao nhất ở lớp đỉnh của biofilm và giảm dần theo độ sâu nhưng thành phần EPS
lại phong phú hơn ở vùng phía trong biofilm. Thành phần EPS trong hầu hết các
biofilm cũng khác biệt so với các vi khuẩn ở dạng sống tự do. Những thành phần chính
được xem xét trong một biofilm bao gồm polysaccharide, protein và DNA. Vai trò của
mạng lưới ngoại bào trong biofilm được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1: Vai trò của mạng lưới ngoại bào trong biofilm [10]
Hiệu quả của mạng lưới
ngoại bào
Thành phần
Vai trò trong biofilm
Kiến tạo
Polysaccharide
Amyloid
Cấu tạo nên cấu trúc biofilm

Hoạt hóa hóa
Enzyme ngoại bào
Phân hủy chất hữu cơ
Hoạt hóa bề mặt
Amphiplic
Tương tác giữa các bề mặt
Truyền tin
Lectin
Acid nucleic
Truyền thông tin giữa các tế
bào trong mạng lưới
Chất dinh dưỡng
Nhiều loại polymer
Nguồn cung cấp C, N, P
7

Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh
biofilm. Các polysaccharide có thể rất đa dạng về đặc tính sinh lý, sinh hóa thông qua
dạng liên kết glycosidic giữa các phân tử (β-1,4, β-1,3 hay α-1,6) hay đơn vị monomer
cấu tạo nên. Polysaccharide có thể là các đồng phân tử cấu tạo bởi một đơn phân
monosaccharide duy nhất như cellulose, dextran, curdlan hay dị phân tử cấu tạo bởi 2
đến 4 dạng đơn phân khác nhau như alginate, emulsan, gellen. Các monosaccharide
phổ biến trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-fucose. Nhóm acid
uronic như acid D-glucuronic, acid D-galacturonic. Thành phần các đường đơn có ảnh
hưởng đến đặc tính của polysaccharide và qua đó ảnh hưởng đến đặc tính của cả mạng
lưới biofilm [3].
Những phương pháp di truyền và chụp ảnh hiển vi cung cấp thông tin về việc
protein đóng vai trò như là một yếu tố kết nối tế bào – tế bào trong quá trình hình
thành biofilm bởi các loài vi khuẩn. Protein ngoại bào có khối lượng dao động từ 10
kDa đến 200 kDa với 40 – 60% thành phần là acid amin kị nước. Những thành phần

protein chính trong mạng lưới ngoại bào được nối với nhau bởi các ion hóa trị 2 là
Ca
2+
, Mg
2+
và một lượng nhỏ carbohydrate và acid nucleic.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm của vi sinh vật
Biofilm có thể được hình thành trên một loạt các bề mặt bao gồm: mô sống, các
dụng cụ y khoa, các hệ thống ống nước…, có cấu tạo từ những vật liệu khác nhau. Tuy
nhiên trong điều kiện tự nhiên để chuyển từ dạng sống tự do trong môi trường sang
dạng cấu trúc trong biofilm đòi hỏi một loạt những điều kiện nhất định [19].
Đặc tính bề mặt giá thể
Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của tế bào
bởi vậy mỗi loài vi khuẩn chỉ hình thành biofilm được trên một số bề mặt nhất định.
Diện tích bề mặt là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát triển
biofilm. Theo nguyên tắc diện tích bề mặt càng lớn càng làm tăng khả năng tiếp xúc
với tế bào, qua đó tạo điều kiện cho việc bám dính lên bề mặt giá thể. Các hệ thống
ống dẫn khác với hầu hết các môi trường tự nhiên (ao, hồ, sông, suối…) thường có
một diền tích bề mặt khá lớn tạo điều kiện cho việc tiếp xúc giữa tế bào vi khuẩn và bề
mặt.
Sự mở rộng của các vi khuẩn lạc trong biofilm cũng đã được chứng minh là có
sự tăng lên khi tăng mức độ thô ráp của bề mặt [10]. Điều này được giải thích là do ở
bề mặt thô ráp, lực tương tác giữa các tế bào với bề mặt bị giảm đi và diện tích tiếp
xúc tăng lên so với bề mặt nhẵn.
Các tính chất cấu tạo của bề mặt cũng ảnh hưởng mạnh đến tốc độ và mức độ
gắn kết tế bào lên bề mặt. Hầu hết các nghiên cứu nhận thấy rằng các vi sinh vật gắn
8

kết với một bề mặt kị nước, không phân cực như Teflon và nhựa nhanh hơn là so với
một vật liệu ưa nước như thủy tinh hay kim loại [2].

Điều kiện môi trường
Các đặc trưng hóa lý của môi trường nước như pH, mức độ dinh dưỡng, nồng
độ các ion, nhiệt độ có thể đóng vai trò quan trọng trong mức độ gắn kết vi sinh vật lên
bề mặt.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng bám dính của vi sinh vật và sự hình
thành màng sinh vật cũng chịu ảnh hưởng của nhịp điệu mùa ở các lưu vực nước khác
nhau [10]. Hiệu ứng này có được là do ảnh hưởng của nhiệt độ nước theo mùa lên các
thông số tăng trưởng của vi sinh vật. Fletcher và cộng sự [13] cũng đã chứng minh sự
gia tăng nồng độ của một số cation (Na
+
, Ca
2+
, Fe
3+
, La
+
) ảnh hưởng đến khả năng
bám dính của chủng Pseudomonas fluorescens lên bề mặt thủy tinh, bằng cách làm
giảm lực tương tác giữa các tế bào vi khuẩn với bề mặt kính. Nghiên cứu của Cowan
và cộng sự [8] cho thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng tỷ lệ thuận với số lượng
gắn kết của các tế bào vi khuẩn lên bề mặt.
Đặc tính tế bào
Mặc dù biofilm là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong môi trường tự
nhiên nhưng không phải vi sinh vật nào cũng có khả năng hình thành biofilm. Các đặc
tính của tế bào bao quanh các cấu trúc phụ trợ như lông roi, lông nhung, khả năng di
động, khả năng tạo các chất ngoại bào (protein, polysaccharide) ảnh hưởng lớn đến
việc hình thành biofilm [10]. Những vi sinh vật có lông roi, lông nhung sẽ giúp cho
việc di chuyển trong môi trường nước tốt hơn nên có hiệu quả tạo biofilm cao hơn.
Ngoài ra, chúng còn có ưu thế trong việc di chuyển đến một bề mặt giá thể xác định,
nơi có điều kiện thuận lợi cho việc hình thành biofilm, đồng thời giúp cho việc bám

dính ban đầu của tế bào với bề mặt.
Tuy nhiên một số loài không có phần phụ trợ tế bào nhưng vẫn có khả năng
hình thành biofilm mạnh dựa vào khả năng tự tổng hợp sẵn các chất ngoại bào như
lipopolysaccharide, glycoprotein tạo thành cấu trúc màng giáp (capsule), màng nhày
(slime) bao quanh tế bào. Đặc tính này tạo tính tự kết dính cho tế bào, đặc biệt là
những vi sinh vật gây bệnh như: Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius,
Xanthomonas, Bacillus anthracis. [7].
1.3.4. Những vấn đề chưa được giải quyết mà đề tài lựa chọn để nghiên cứu
Vấn đề thứ nhất là: Chưa có công bố nào ở Việt Nam về các chủng vi sinh vật
vừa có khả năng tạo biofilm vừa có khả năng phân huỷ và chuyển hoá các thành phần
hydrocarbon dầu mỏ
Các kết quả nghiên cứu của nhóm đề tài đã cho thấy nguồn vi sinh vật ở Việt
Nam vô cùng đa dạng và phong phú, đặc biệt có nhiều chủng đã được phân lập lần đầu
9

tiên ở Việt Nam chẳng hạn như Desulfovibrio vietnamensis sp.nov.[17] Tuy nhiên, các
nghiên cứu của nhóm đề tài lại chưa tập trung vào việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích
này để sản xuất các màng sinh học (biofilm).
Vấn đề thứ hai là: Trên thế giới chưa có nhiều công bố về các vi sinh vật tạo
biofilm có khả năng phân huỷ và chuyển hoá nhiều thành phần khó phân huỷ trong dầu
mỏ như các hợp chất đa vòng.
Trên thế giới đã có nhiều chứng minh về các vi sinh vật tạo biofilm, có khả
năng chuyển hoá các hợp chất nitơ, phôtpho; từ đó người ta đã xây dựng được các hệ
thống xử lý nước thải, nước nuôi trồng thuỷ sản,… một cách có hiệu quả. Đồng thời,
có nhiều tác giả cũng đã công bố về các chủng có khả năng phân huỷ và chuyển hoá
các hợp chất khó phân huỷ trong dầu mỏ. Tuy nhiên, cho tới nay, chưa có nhiều công
bố về các chủng vi khuẩn và nấm men tạo biofilm có khả năng phân huỷ và chuyển
hoá các thành phần khó phân huỷ trong dầu.
Vấn đề thứ ba là: Chưa có công bố nào ở Việt Nam về việc sử dụng Công nghệ
biofilm để xử lý ô nhiễm dầu mỏ

Trong khi đó, biofilm đã được các nước trên thế giới sử dụng hiệu quả trong các
lĩnh vực xử lý môi trường và các ngành công nghiệp khác. Do đó, nghiên cứu sự hình
thành biofilm từ các vi sinh vật hữu ích là vấn đề mang tính cấp thiết. Kết quả thu
được không chỉ đảm bảo việc bảo vệ, giữ gìn môi trường trong sạch và bền vững mà
còn có thể mang lại hiệu quả kinh tế thiết thực cho ngành dầu khí nước ta. Trên cơ sở
đó đưa ra giải pháp khai thác sử dụng có hiệu quả và bảo tồn nguồn tài nguyên vi sinh
vật hữu ích ở nước ta.
1.4. Mục tiêu hoàn thiện công nghệ, quy mô và trình độ của công nghệ cần đạt
được, tính khả thi và hiệu quả kinh tế của dự án
Mục tiêu của đề tài là: xây dựng được quy trình tạo biofilm ở quy mô phòng thí
nghiệm xử lý các thành phần hydrocarbon có trong dầu mỏ và dầu công nghiệp. Đồng
thời chứng minh hiệu quả xử lý các thành phần đó qua các phương pháp phân tích sắc
ký khí (GC), sắc ký khí khối phổ (GCMS) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Kết quả
nghiên cứu này của đề tài sẽ mở ra cho những nghiên cứu tiếp theo về việc xây dựng
và phát triển Công nghệ sử dụng biofilm để xử lý ô nhiễm dầu mỏ ở Việt Nam. Công
nghệ biofilm trong xử lý ô nhiễm môi trường nói chung đã được các nước trên thế giới
khẳng định là ngành công nghệ mới, có hiệu quả xử lý ô nhiễm cao, chi phí
thấp,…Tuy nhiên, chưa có nhiều công bố về việc ứng dụng công nghệ này trong xử lý
nước ô nhiễm dầu. Do đó, nghiên cứu sự hình thành biofilm từ các vi sinh vật hữu ích
là vấn đề mang tính cấp thiết.
10

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
CHƯƠNG I. Nguyên liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng
1.1. Nguyên liệu
Mẫu đất và nước thải được thu thập tại các địa điểm:
- Các vị trí ô nhiễm dầu ven biển ở Hải Phòng, Quảng Ninh và Thanh Hóa.
- Khu công nghiệp vừa và nhỏ Từ Liêm, Hà Nội.
- Cửa xả sản xuất vào bể lọc dầu của nhà máy Cốc Hóa, phường Cam Giá, thành
phố Thái Nguyên.

- Cống thoát nước thải sông Kim Giang gần nhà máy sơn Đại Bàng công ty
nhông xích Mạnh Quang, Thanh Xuân, Hà Nội.
- Kho xăng Đỗ Xá, Thường Tín, Hà Nội.
1.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy
Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là hóa chất nhập ngoại của các
hãng trên thế giới như Sigma, Merk, Fermantas, Biobasic,
Môi trường
Môi trường nuôi cấy ở dạng lỏng (nuôi dịch) và dạng rắn (có bổ sung agar 18 -
20 g/l). Môi trường trước khi sử dụng được khử trùng ở 121
o
C (không có glucose) và
ở 115
o
C (có glucose), 1 atm trong 30 phút. Bao gồm:
- Các môi trường nuôi cấy đặc trưng cho vi khuẩn: Môi trường Luria - Bertani (LB),
Hiếu khí tổng số (HKTS).
- Môi trường kiểm tra khả năng tạo màng: Môi trường Meat- Peptone-Agar (MPA), LB.
- Môi trường kiểm tra khả năng phân hủy các thành phần dầu mỏ: Môi trường muối khoáng
Gost.
1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính
xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm
trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen - Viện Công nghệ sinh học bao gồm: kính hiển
vi, cân kỹ thuật, tủ cấy vô trùng Laminar của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc
ở các nhiệt độ khác nhau, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm eppendorf và falcon 50, máy
PCR, bàn soi UV, máy đo mật độ quang học (máy OD), máy điện di Bio - Rad, máy
chụp ảnh Gel - Doc, tủ lạnh các loại ở 4
o
C, (-20

o
C) và (-80
o
C), lò vi sóng, pipet man,
CHƯƠNG II. Phương pháp nghiên cứu
1.1. Lấy mẫu
Các đất và nước bị ô nhiễm dầu tại một số vùng biển ở Việt Nam như Hải Phòng,
Quảng Ninh, Thanh Hóa, sẽ được thu thập vào các túi nilong và dụng cụ lấy mẫu
11

chuyên dụng. Các mẫu sẽ được giữ ở 4
o
C để phục vụ cho các bước thí nghiệm tiếp
theo.
1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ dầu
- Đối với các mẫu đất ô nhiễm dầu, cân 1g đất cho vào các bình tam giác có chứa
10ml môi trường muối khoáng có bổ sung dầu thô hoặc các thành phần dầu mỏ khác
để nuôi trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 24 – 30
o
C. Sau 7 ngày, lấy
10ml dịch nuôi lắc này cấy truyền sang 100ml môi trường muối khoáng mới có bổ
sung dầu thô hoặc các thành phần dầu mỏ khác để nuôi tương tự như trên. Sau 3 lần
lặp lại, hút 1ml dịch nuôi lắc để phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường MPA
(meat-pepton-agar), nấm men trên môi trường Hansen.
- Đối với các mẫu nước ô nhiễm dầu, lấy trực tiếp 1ml mẫu để phân lập các
chủng vi khuẩn trên môi trường MPA, nấm men trên môi trường Hansen.
1.2. Sàng lọc các chủng tạo biofilm tốt
Sử dụng phương pháp đánh giá sự hình thành màng sinh học của O’Toole và Kolter
(1998) và Morikwa và cs (2006).
Nuôi qua đêm để làm tươi mới chủng tạo biofilm:

- Cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường MPA dịch. Sau 14 - 16h nuôi cấy, đem
ly tâm loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4000 vòng/phút - đối với vi khuẩn hoặc
6000 vòng/phút - đối với nấm men, 4
o
C trong vòng 10 phút và rửa nước cất 2 lần với
thể tích tương ứng). Bổ sung nước cất sau lần ly tâm cuối cùng và đánh tan sinh khối.
Tiến hành pha loãng tới hạn và do OD ở bước sóng 600 nm, pha loãng dịch sinh khối
bằng nước cất để đạt OD là 0,3. Bổ sung 1% dịch này vào các eppendorf chứa 297 μl
môi trường MPA. Bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi trong 3 ngày. Các mẫu
được nuôi ở tủ ấm 30
o
C và đánh giá khả năng tạo biofilm sau 24, 48 và 72 h.
- Kiểm tra khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn
Nguyên lý:
- Thành tế bào vsv trong biofilm có khả năng bắt giữ tím tinh thể sau khi nhuộm
cố định ở nhiệt độ phòng. Khi bổ sung dung dịch axít acetic 33% sau nhuộm có
tác dụng loại bỏ tím tinh thể ra khỏi thành tế bào vi khuẩn, lúc này các tím tinh
thể sẽ được giải phóng và hòa tan trong dung môi. Giá trị OD ở bước sóng 570
nm thể hiện độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch tím tinh thể và tỷ lệ với lượng
tím tinh thể được cố định, tức đặc trưng cho mật độ tế bào trong cấu trúc
biofilm hay nói cách là khả năng tạo màng sinh học của chủng vsv tương ứng.
Tiến hành:
12

- Cứ sau 24 h lấy các eppendorf chứa mẫu nuôi, mỗi chủng tương ứng với 3
eppendorf cho mỗi ngày và tiến hành kiểm tra khả năng tạo biofilm theo các
bước sau:
- - Dùng pipetman hút dịch nuôi cấy nhè nhẹ ra (không làm vỡ màng)
- - Rửa nhẹ nhàng màng sinh học bằng 500 μl nước cất rồi hút ra lặp lại lần nữa.
- - Cho 300 μl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào các eppendorf

- - Đợi 10 phút để cố định, ở nhiệt độ phòng
- - Hút bỏ dung dịch tím tinh thể
- - Rửa bằng 500 μl nước cất, 2 lần
- - Bổ sung 300 μl dung dịch axit axetic 33%
- - Đảo trộn hỗn hợp này, pha loãng tới hạn rồi đo OD ở bước sóng 570 nm.
- Công thức tính giá trị màng tạo thành: Y = X x số lần pha loãng x 10/3
Trong đó: X là giá trị đo OD thu được
10/3 là chỉ số các tác giả đã tính toán để quy đổi từ giá trị OD sang giá
trị hấp thụ tím violet của màng tạo thành.
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
1.3. Phân loại và định tên
Các chủng lựa chọn sẽ được phân loại sơ bộ bằng các Kít chuẩn sinh hoá API, sau đó
sẽ được phân tích trình tự ADN 16S và 26S để định tên chi, loài theo phương pháp
tách chiết DNA tổng số theo mô tả của Zhou và cs (1996) và phương pháp PCR của
Mullis (1990). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch và được gửi xác định trình tự trên máy
đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer theo phương pháp của
Sanger. Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3.100 Avant Data
Collection v 1.0 và trình tự DNA đó được so sánh với trình tự của các vi khuẩn đã
được công bố trong gân hàng gen thế giới.
1.4. Quan sát tế bào vi khuẩn và nấm men dưới kính hiển vi điện tử
Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng lỏng có chứa nguồn cơ
chất thích hợp. Sau hai ngày tiến hành quan sát: Sinh khối được lọc qua giấy lọc vô
trùng rồi đem ly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút, rửa tách lấy tế bào. Tế bào vi
khuẩn được hòa tan trong glutaraldehyt 2,5% trong đệm photphat natri 100 mM (pH
7,2) trong 30 phút. Lấy một giọt tế bào đã xử lý (khoảng 10
6
- 10
8
tế bào/ml) đưa lên 1
tấm phim mỏng và để 1 phút để cho mẫu bám được vào lưới vàng. Rửa nhẹ nhàng với

vài giọt nước cất và mẫu được làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100%, chuyển qua T -
butyl. Sau đó mẫu được làm khô bằng máy đông khô và phủ bằng vàng. Mẫu được
quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV. Hình thái tế bào vi khuẩn được
chụp ảnh và đo kích thước. Cố định mẫu và soi kính được thực hiện tại Viện 69, Bộ tư
lệnh Lăng Hồ Chí Minh.
13

1.5. PCR-DGGE
Phương pháp điện di biến tính được thực hiện trên hệ thống phân tích Bio-Rad DCode
Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Laboratories, Munich, Germany). Các
sản phẩm PCR (khoảng 150 ng) sẽ được sử dụng trực tiếp trên gel polyacrylamide 8%
(w/v) trong đệm 1× TAE buffer [40 mM Tris-acetate (pH 7.4), 20mM sodium acetate,
1mM disodium EDTA] có chứa một gradient biến tính của urea và formamide từ 40
đến 60 %. Bản gel được chạy 16 h tại nhiệt độ 60
o
C và điện áp là 65 V. Sau khi điện
di, các bản gel sẽ được nhuộm 30 phút trong SYBR Green I (Invitrogen, CA, U.S.A.)
và được chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím nhờ hệ STORM apparatus (Amersham
Pharmacia Biotech, Munich, Germany). Các kết quả DGGE profiles sẽ được phân tích
nhờ máy GelCompar II 4.06 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium).
1.6. Tách chiết, phân tích đánh giá khả năng phân hủy các thành phần
hydrocarbon
Các chủng vi khuẩn và nấm men được nuôi tĩnh trên môi trường hiếu khí tổng
số để tạo màng sinh học. Sau 48h, dịch nuôi cấy được hút nhẹ nhàng ra khỏi bình nuôi
cấy, tránh làm vỡ màng. Rửa màng bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó, bổ sung môi
trường muối khoáng nghèo dinh dưỡng và 2% dầu diesel hoặc các thành phần dầu
khác. Sau 5 ngày nuôi tĩnh, dịch nuôi cấy được phân tích để xác định hàm lượng dầu
còn lại bằng cách lấy toàn bộ dịch nuôi cấy ra, tách chiết bằng dung môi hữu cơ:
aceton (1:3), ethyl acetate (chiết 3 lần). Dịch tách chiết được đem đi phân tích hóa học
trên các máy sắc kí như sắc kí khí (GC), sắc kí khí khối phổ (GCMS), sắc ký lỏng cao

áp (HPLC) hoặc phân tích dầu tổng số nhằm đánh giá khả năng phân hủy và chuyển
hóa các thành phần hydrocarbon của màng đa chủng thu được. Phân tích khả năng
phân hủy dầu diesel được thực hiện với sự phối hợp của Viện Hóa công nghiệp, Bộ
Công thương.
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Qui trình chuẩn bị mẫu để phân tích các thành phần có trong dầu FO trên
cơ sở phương pháp US EPA method 610:
Lấy 60ml CH
2
Cl
2
cho vào 500ml nước thải đựng trong phễu chiết, lắc đều, để
lắng chờ hỗn hợp tách thành hai pha. Tách pha CH
2
Cl
2
(bên dưới) ra.
Tiếp tục thêm 60ml CH
2
Cl
2
vào pha nước, làm tương tự như trên (chiết 3 lần).
Gom toàn bộ dịch chiết CH
2
Cl
2
, làm khan bằng Na
2
SO
4

, lọc, cô quay dung môi
dưới áp suất giảm đến khi còn 10ml.
Cho dịch chiết này qua cột chiết pha rắn florisil, rửa giải bằng 3ml n-hexan
Hút 1ml dịch n-hexan đi phân tích GC/MS. Bơm 0,2µl mẫu vào máy GCMS
Máy hệ GCMS Agilent 6980-5973N. Cột sử dụng phân tích là HP-5MS.
Chương trình nhiệt độ 50 - (3 phút) - 80- (8 phút) - 200 (15 phút) - 250 (7 phút).
14

NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN
CHƯƠNG I. Nội dung 1 - Phân lập, tuyển chọn một số chủng VSV có khả năng
phân hủy tốt các thành phần dầu mỏ
1.1. Phân lập một số chủng VK có khả năng phân hủy các thành phần dầu mỏ
Sau khi tiến hành làm giàu lần 3. Các mẫu được pha loãng tới hạn (như đã mô
tả ở phần phương pháp) rồi cấy gạt trên môi trường muối khoáng có bổ sung 100ppm
hỗn hợp PAH, phenol hoặc dầu diesel. Sau 2 ngày, trên đĩa thạch xuất hiện các loại
khuẩn lạc với các hình dạng khác nhau (Hình 1.1).


Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc sau khi làm giàu lần 3
Tập đoàn vi khuẩn trên đĩa môi trường khoáng thạch được chúng tôi tiến hành
tạch sạch riêng từng chủng và quan sát hình thái khuẩn lạc (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường Gost thạch
TT
Kí hiệu chủng
Hình thái khuẩn lạc
1
B2
Khuẩn lạc tròn, gọn, bề mặt hơi lồi, đỏ cam nhạt, đường
kính 1-2mm
2

B5
Khuẩn lạc tròn, gọn, bề mặt hơi lồi, đỏ cam nhạt, đường
kính 1-2mm
3
B6
Khuẩn lạc tròn, dẹt, bề mặt xù xì, trắng đục, đường kính
3-5mm
4
B8
Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, bề mặt ướt, trắng trong, đường
kính 1-2mm
5
B13
Khuẩn lạc tròn, có mép, dẹt, bề mặt khô, trắng đục,
đường kính 3-5mm
6
B15
Khuẩn lạc tròn, lồi, bề mặt ướt, trắng đục, đường kính 1-
2mm
7
B16
Khuẩn lạc tròn, gọn, bề mặt hơi lồi, đỏ cam nhạt, đường
kính 1-2mm
15

Trong các chủng vi khuẩn được phân lập, chúng tôi nhận thấy 07 chủng trên có
khả năng phát triển nhanh nhất (sau 24h) do vậy chúng tôi đã lựa chọn các chủng là
những chủng đại diện để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử
Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của 1 số chủng vi khuẩn được thể hiện ở hình

1.2.
TT
Hình thái khuẩn lạc
Hình thái tế bào
B2


B5


B6


B8


16

B13


B15


B16


Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc và hình thái TB của các chủng vi khuẩn
Dưới độ phóng đại 5000 lần, tế bào các chủng vi khuẩn đều có dạng hình que,
kích thước lần lượt từ: (0,4–0,46) m x (1–1,7) m; còn khuẩn lạc chủng B13 và B6

có màu trắng đục, đường kính từ 3 - 5mm, kích thước tế bào từ (0,39-0,46) m x
(2,59-2,86) m. Khuẩn lạc của các chủng B2, B5 và B16 có hình tròn, màu đỏ cam
nhạt, lồi trên mặt thạch, có đường kính khoảng 1:2mm tiết ra sắc tố có mầu vàng. Dưới
kính hiển vi điện tử quét, tế bào chủng B2 và B16 có hình que ngắn, kích thước từ 0,8-
1,2µm; tế bào chủng B5 có dạng que dài, kích thước 1,6-2,0µm.
1.2. Phân lập một số chủng NM có khả năng phân hủy các thành phần dầu mỏ
Sau khi tiến hành làm giàu lần 3. Các mẫu được pha loãng tới hạn (như đã mô
tả ở phần phương pháp) rồi cấy gạt trên môi trường muối khoáng nấm men có bổ sung
100ppm hỗn hợp PAH, phenol hoặc dầu diesel. Sau 4 ngày, trên đĩa thạch xuất hiện
các loại khuẩn lạc với các hình dạng khác nhau và chúng tôi đã lựa chọn được 05
chủng nấm men với các hình thái tế bào như sau (Bảng 1.2):