Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng trọng xử lyus nước thải hữu cơ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYM
NHẰM ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngư ời hư ớng dẫn k hoa h ọc: TS. Ng u yễ n Th ế Trang

Hà Nội, tháng 12 năm
2014
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

1



Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Đà, Phạm Thị Thu Phương, Lê
Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thúy Nga, Lê Quang Sáng, Phạm Văn Duy (2014).
Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại một số chủng vi khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp xenlulaza phân lập từ nước thải sau hầm biogas. Tạp chí
Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30,6S.
2. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thúy Nga, Phạm Văn Duy (2014). Ứng
dụng một số chủng vi khuẩn xử lý nước thải giàu hữu cơ sau hầm biogas, Tuyển
tập báo cáo khoa học, Hội thảo khoa học quốc tế “Năng lượng và tăng trưởng
xanh khu vực ASEAN”, Hà
Nội 2014. Nhà xuất bản Khoa học tư nhiên và Công nghệ.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

2

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


MỞ ĐẦU
Cùng với sư phát triển của các nhà máy chế biến nông sản (đồ hộp từ dứa, dưa
chuột bao tử, cà chua, ngô ngọt ...) một vấn đề đang làm bức xúc các nhà sản xuất đó
là: nước thải, phế thải từ các quá trình chế biến. Chất thải của các nhà máy chế biến đồ
hộp rau quả có hàm lượng các chất hữu cơ rất cao (các loại đường đơn, axit hữu cơ,
protein, xenluloza …), đây là nguồn dinh dưỡng thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật sinh
trưởng. Sư sinh trưởng của các vi sinh vật trong môi trường nước thải giàu hữu cơ từ
nông sản khi không có sư kiểm soát của con người thường tạo ra các sản phẩm có mùi hôi
thối tác động xấu tới môi trường sinh thái. Do vậy, các chất thải cần phải được xử lý
trước khi thải ra môi trường tư nhiên. Có nhiều phương pháp xử lý nước thải hữu cơ

khác nhau như: Phương pháp cơ học, hóa học, hóa lý và sinh học. Đối v ới nước thải hữu
cơ thì phương pháp xử lý sinh học sẽ có hiệu quả hơn, thân thiện với môi trường hơn, có
nhiều ưu điểm cả về hiệu quả kinh tê và ky thuật . Trong các nghiên cứu xử lý nước thải
thì việc dùng biện pháp sinh học đang là ưu tiên hàng đầu. Viêc phân huy chât hưu cơ
dưa trên cac vi sinh vât tư nhiên co săn trong nươc thai con găp nhiêu han ch ế như thời
gian phân hủy lâu, quá trình phân huy chưa triêt đê. Do đo, cân tuyên chon nhưng chung
vi sinh vật (VSV) thích hợp bổ sung vào bên cạnh những VSV có sẵn để có thế giúp cho quá
trình xử
lý đạt kết quả tốt hơn [1]. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số
chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng trong
xử lý nước thải hữu cơ” được thưc hiện là cần thiết.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

3

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1 . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU XỬ LÝ NƢỚC THẢI HỮU CƠ TRÊN THẾ
GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
1.1.1. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ trên thế giới
Sư phát triển của phương pháp thứ cấp để xử lý nước thải trong những năm đầu
thế kỷ XX được cho là cải tiến đáng kể nhất đối với y tế công cộng và môi trường trong
suốt thời gian này, đó là việc phát minh ra "bùn hoạt tính" cho quy trình xử lý nước
thải. Gilbert Fowler và cộng sư tại Đại học Manchester được tiến hành tại Trạm Thí
nghiệm Lawrence ở Massachusetts liên quan đến việc sục khí vào nước thải trong bình

đã được phủ một lớp tảo. Các đồng nghiệp của Fowler, Edward Ardern và William Lockett,
những người đã triển khai nghiên cứu cùng với Văn phòng công ty đường sông
Manchester ở công trình xử lý nước thải Davyhulme. Thí nghiệm trên được thưc hiện
trong một lò phản ứng bằng cách hút ra và thu vào, việc xử lý cho hiệu quả cao hơn. Họ
sục khí liên tục cho nước thải trong khoảng một tháng và kết quả đạt được là nitrat hóa
hoàn toàn các nguyên liệu mẫu. Điều đó chỉ ra rằng bùn đã hoạt hóa các chất (một cách
tương tư như than hoạt tính) quá trình được đặt tên là bùn hoạt tính. Kết quả đã được
công bố trong công trình tại Hội thảo 1914, và lần đầu tiên một hệ thống quy mô đầy đủ
với dòng chảy liên tục được lắp đặt tại Worcester hai năm sau đó. Do hậu quả của chiến
tranh thế giới thứ nhất phương pháp xử lý mới được truyền bá nhanh chóng, đặc biệt là
Hoa Kỳ, Đan Mạch, Đức và Canada [26]. Vào cuối những năm 1930, việc xử lý nước thải
bằng bùn hoạt tính là quá trình chủ yếu được sử dụng trên toàn thế giới. Trong bùn hoạt
tính có nhiều chi vi sinh vật khác nhau
Bacterium,

Corynebacterium,

: Actinomyces, Arthrobacer, Bacillus,

Desulfotomacillium,

Micrococcus,

Pseudomonas, Sarcina … Chúng oxy hóa rượu , axit beo , paraffin, hydrocacbon va các
hợp chất khác.
Ở Mỹ, hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 ÷
85 mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 ÷ 35 mg/l, hàm lượng NH3
từ 12 ÷ 50 mg/l. Hàm lượng photphat trong nguồn nước không ô nhiễm nhỏ hơn 0,01
mg/l. Theo quy định của Hà Lan, tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

4

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


photphate trong nước uống không được vượt quá 6 mg/l. Theo tiêu chuẩn của cộng đồng
chung châu Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphat không được vượt quá 2,18
mg/l [4].
Xử lý nước thải của quá trình chế biến rau quả các nhà khoa học Thái Lan đã sử
dụng chủng nấm men Candida utlis CBS1517 có khả năng đồng hóa tốt các loại đường và
axit hữu cơ có nhiều trong thành phần nước thải, kết quả thu được cho thấy sau 96 giờ
xử lý trong điều kiện phòng thí nghiệm là COD giảm 89,9 % và pH tăng từ 3,5 lên 8,5 [36].
Môt sô kêt qua nghiên cưu xư ly nươc thai chăn nuôi lơn băng qua trinh SBR hoăc tương
tư đươc tông hơp : Trong nghiên cứu của Bortone G. (1992) hiệu quả xử lý COD và T-N
của quá trình SBR cấp nước một lần đạt khá cao, tương ứng là khoảng 93 % và 88 ÷ 93 %.
Tải trọng COD và T-N cũng đạt cao
3
3
lần lượt là 0,37 kg/(m .ngày) và 0,13 kg/(m .ngày) [28]. Nghiên cứu của Chang
Won Kim (2000) hiệu quả xử lý COD ở chế độ cấp nước một lần đạt 57 ÷ 87 %. Tải trọng
3
3
COD và T-N lần lượt là 1,0 kg/(m .ngày) và 0,2 kg/(m .ngày) [29]. Quá trình sục khí luân
phiên cấp nước liên tục trong nghiên c ứu của Jiang Cheng (2011) cho hiệu quả xử lý khá
cao, của COD là 57 %, T-N là 91 % [31]. Nghiên cứu của Mohammad N. (2011) với quá
trình SBR cấp nước một lần cho hiệu quả xử lý COD và T-N lần lượt là 80,3 % và 61 % [34].
Trong nghiên cứu của Zang và đồng tác giả (2006) cho hiệu quả xử lý cao hơn cả, đối với

cả COD và T-N tương ứng là 96,3 % và 97,5 %; tải trọng COD và T-N cũng đạt rất cao lần
3
lượt là 2,1 kg/(m .ngày) và
3
0,28 kg/(m .ngày), nước thải trong nghiên cứu này có COD và tỉ lệ COD/T-N rất
cao và các tác giả đã đưa thêm các giai đoạn kỵ khí vào trước và giữa các giai đoạn thiếu
khí/hiếu khí, do đó đã nâng cao được tải trọng xử lý COD. Mặt khác, các tác giả đã thưc
nghiệm ở thời gian lưu tương đối lớn, tỉ lệ COD/T-N và tỉ lệ lưu nước (n=9) rất cao, vì vậy
cũng đã nâng cao được hiệu suất xử lý T-N [38].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu xử lý nƣớc thải hữu cơ ở Việt Nam
Xử lý nước thải hiện nay luôn là vấn đề thời sư nóng bỏng và nổi cộm ở Việt Nam
hiện nay, theo dư báo của Tổ chức Kinh tế thế giới thì Việt Nam sẽ là một trong những
nước có tốc độ phát triển kinh tế vào loại nhanh trên thế giới với tốc độ
tăng trưởng được dư báo là 7 % trong thập kỷ tới. Tuy nhiên, việc tăng trưởng kinh
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K16

5

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


tế một cách nhanh chóng và mạnh mẽ cũng đồng thời tạo nên những thách thức áp lưc
tác động về mặt môi trường, trong đó, tác động của chất thải rắn và nước thải đang là vấn
đề nổi cộm ở Việt Nam.
Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ở Việt
Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Theo báo cáo môi trường Quốc gia năm 2010
của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm môi trường nước
mặt ở tất cả các chỉ số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theo QCVN 40:2011/BTNMT.
Các chỉ số COD, BOD đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 ÷ 10 lần. Hàm lượng NH4

+

trong môi

trường nước mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông Cầu đều vượt quy chuẩn cho phép
QCVN 40:2011/BTNMT cho nước mặt phù hợp với việc bảo tồn động thưc vật thủy sinh là
là 0,2 mg/l [17].
Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn nước.
Hàm lượng nitơ tổng số nước thải chăn nuôi nằm trong khoảng từ 512 ÷ 594 mg/l, trong
đó NH3 từ 304 ÷ 471 mg/l, hàm lượng photpho tổng số từ 13,8 ÷ 62 mg/l [6]. Ngày
nay, cùng với sư phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một gia tăng, nước rỉ rác từ
các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của người dân
xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm quanh khu vưc. Tổng hàm
lượng nitơ trong nước thải rỉ rác dao động trong khoảng từ 200 ÷ 2000 mg/l, hàm lượng
amoni cao, trung bình 200 mg/l, trong khi đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l [11].
Với xu hướng hội nhập nền kinh tế quốc tế, đặc biệt từ khi Việt Nam gia nhập
WTO, cùng với sư phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghiệp hoá đất nước, chất
thải công nghiệp cũng đang ngày một gia tăng về khối lượng, đa dạng về chủng loại và
đang là vấn đề cấp bách của xã hội, đòi hỏi phải có nhận thức đúng đắn và đầu tư thích
đáng cho vấn đề xử lý nước thải. Hiện nay công nghệ xử lý nước thải bị ô nhiễm các
hợp chất hữu cơ trên thế giới và Việt Nam chủ yếu là sử dụng các biện pháp sinh học,
trong đó phương pháp xử lý hiếu khí và xử lý kị khí là phổ biến nhất, với nguồn nước thải
có mức độ ô nhiễm cao thông thường người ta xử lý kết hợp kị khí và hiếu khí. Kết quả
nghiên cứu của Vũ Thúy Nga và các cộng
sư cho thấy có thể cải thiện chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

6

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


phẩm vi sinh vật. Để nhằm khắc phục tình trạng ô nhiễm do nước thải chế biến tinh bột
sắn, công trình nghiên cứu tập trung tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có hoạt tính sinh
học cao, sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để nâng cao hiệu quả xử lý nước thải
sau biogas của nhà máy chế biến tinh bột sắn. Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được 3
chủng vi sinh vật gồm Bacillus velezensis, Streptomyces fradiae và Nitromonas sp. có khả
năng chuyển hóa tốt hợp chất hữu cơ trong nước thải chế biến tinh bột sắn [15]. Nghiên
cứu về ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly- photphat trong xử lý nước thải của Lê Quang
Khôi và các cộng sư cho thấy các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được tuyển chọn có hiệu
suất loại bỏ photphat hòa tan cao. Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens
TGT013L và Kurthia
sp.TGT025L có hiệu quả loại bỏ PO4
giờ thí nghiệm. Sư loại bỏ PO4

3-

3-

cao nhất trong môi trường tổng hợp sau 25

được thưc hiện bởi hoạt động của gen ppk 1 dạng IIA

trong quá trình chuyển hóa photphat thành dạng poly-P tích lũy trong tế bào. Kết quả
nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P trên để xử
lý photpho hòa tan trong nước thải chăn nuôi [14].
Với mục đích nghiên cứu phát triển công nghệ xử lý hiệu quả đồng thời hữu cơ và

chất dinh dưỡng trong nước thải ngành chăn nuôi lợn, trong nghiên cứu của Phạm Thị
Hải Thịnh và đồng tác giả, đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện vận hành
như tỷ lệ COD/T-N (tỉ lệ giữa nhu cầu oxy hóa học và tổng nitơ) và chế độ sục khí đến
hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR đối với nước thải chăn nuôi đã qua xử lý
kị khí. Với chế độ hai chu trình thiếu - hiếu khí thích hợp, hiệu quả xử lý COD và T-N đạt
khá cao, tương ứng là khoảng 90 % và 80 ÷
85 % [12]. Tuy nhiên nồng độ T-N trong nước thải chăn nuôi lợn là rất cao và thay đổi
trong khoảng khá rộng, vì vậy nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lý nitơ của quá trình
nhằm đáp ứng một cách ổn định các quy chuẩn xả thải là rất cần thiết. Theo Phan Đỗ
Hùng và cộng sư cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cấp nước thải đến hiệu quả xử lý của quá
trình SBR hai chu trình thiếu - hiếu khí cấp nước hai lần và so sánh với chế độ cấp nước
một lần. Với quá trình SBR hai chu trình thiếu-hiếu khí, cấp nước hai lần là một giải pháp
để nâng cao hiệu quả xử lý T-N của quá trình. Thưc
nghiệm cho thấy, khi tăng tỉ lệ cấp nước (tỉ lệ giữa lượng nước thải cấp lần thứ nhất
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

7

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


và tổng lượng nước thải xử lý trong một mẻ), lúc đầu hiệu suất xử lý T-N sẽ tăng, tuy
nhiên đến một giới hạn nhất định hiệu suất xử lý T-N sẽ giảm trở lại. Hiệu suất xử lý T-N ở
cả ba tỉ lệ cấp nước nghiên cứu đều khá cao, trong đó ở tỉ lệ 2/3 đạt cao nhất, trong
khoảng 85 ÷ 90 %. Hiệu suất xử lý T-N thưc nghiệm ở các tỉ lệ cấp nước thấp 1/2 và
2/3 khá phù hợp với hiệu suất lý thuyết. Hiệu suất xử lý COD ở chế độ cấp nước hai lần
cũng khá cao, 85 ÷ 90 % ở tỉ lệ cấp nước 2/3, xấp xỉ với trường hợp cấp nước một lần [5].
1.2. THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA NƢỚC THẢI HỮU CƠ

1.2.1. Xenluloza trong nƣớc thải
Trong nước thải hữu cơ hàm lượng chiếm xenluloza là thành phần chủ yếu của các
tổ chức thưc vật. Trong xác thưc vật (nhất là trong thân và rễ) thành phần hữu cơ chiếm
tỷ lệ cao nhất bao giờ cũng là xenluloza. Hàm lượng xenluloza trong thưc vật thường thay
đổi trong khoảng 30 ÷ 80 % (tính theo trọng lượng khô), trong sợi bông hàm lượng này
thường vượt trên 90 % [30].
Xenluloza là polysaccarit rất bền vững, được cấu tạo bởi rất nhiều gốc
anhydroglucoza, liên kết với nhau nhờ dây nối β-1,4-glucozit. Mỗi phân tử
xenluloza thường chứa từ 1.400 đến 10.000 gốc glucoza. Khối lượng phân tử xenluloza
rất khác nhau phụ thuộc vào từng loại thưc vật (ở bông 150.000 ÷
1.000.000, ở sợi gai lên tới 1.840.000). Trên mỗi chuỗi glucan đơn vị lặp lại không phải là
glucoza mà là xenlobioza. Mỗi phân tử glucoza có dạng “ghế bành”, phân tử này quay
o
180 so với phân tử và vị trí β của các nhóm hydroxyl đều ở mặt phẳng nằm ngang của
phân tử.
Xenluloza có cấu trúc lớp sợi song song, các phân tử và các chuỗi xenluloza gắn với
nhau nhờ mạng lưới liên kết hydro, còn các lớp gắn với nhau nhờ lưc Van- der-Van. Trong
tư nhiên, các chuỗi glucan của xenluloza có cấu trúc dạng sợi, đơn vị sợi nhỏ nhất có
đường kính khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có đường kính từ 10 ÷ 40
nm, những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Toàn bộ lớp sợi này có một lớp vỏ hemixenluloza và
lignin rắn chắc bao bọc bên ngoài. Phân tử xenluloza có cấu trúc không đồng nhất
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

8

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

gồm hai vùng: Vùng kết tinh có trật tư cao, rất bền vững và vùng vô định hình kém trật tư
và bền vững hơn. Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn vùng kết tinh
mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sư trương này. Xenluloza có cấu trúc đặc, bền
chắc cùng với sư có mặt của lớp vỏ hemixenlulo-lignin khiến cho sư xâm nhập của enzym
vào cấu trúc hết sức khó khăn và làm tăng tính kỵ nước của chuỗi β-1-4-glucan, làm cản
trở tốc độ của phản ứng thủy phân.
Xenluloza là hợp chất cacbon chiếm tỷ lệ trọng lớn nhất (50 %) trong tổng số
hydratcacbon tư nhiên và là thành phần hữu cơ chủ yếu của rác, trong giấy, gỗ, thân cây,
cành cây, lá cây, rơm rạ, sợi đay, vải bông, vv…

Hình 1.1. Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza [30]
Mầu nâu - cacbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro
Xenluloza có cấu trúc rất bền vững. Không tan trong nước, không bị tiêu hóa trong
đường tiêu hóa của người và động vật. Trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất có
nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải được xenluloza.
1.2.2. Hemixenluloza trong nƣớc thải
Trong tế bào thưc vật hemixenluloza đứng thứ hai về khối lượng. Trong thành
phần của hemixenluloza có nhiều loại đường khác nhau, chính vì vậy tên của chúng
thường được gọi theo tên của một loại đường chủ yếu nào đó có trong thành phần của
chúng. Khối lượng phân tử của hemixenluloza nhỏ hơn rất nhiều so với xenluloza, thường
chúng chỉ có khoảng 150 gốc đường. Các gốc đường đơn này được nối với nhau bằng các
liên kết β-1-4, β-1-3, β-1-6 glucozit. Các hemixenluloza thường tạo mạch ngắn và phân
nhánh, so với xenlulo thì hemixenluloza có cấu trúc không chặt chẽ dễ bị phân giải bởi
axit yếu và kiềm yếu, đôi khi còn bị phân giải
trong nước nóng [30].
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

9

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


1.2.3. Protein trong nƣớc thải
Protein là hợp chất cao phân tử chứa nitơ (15 ÷ 17 % tính theo trọng lượng khô).
Protein là thành phần quan trọng của cơ thể động, thưc vật. Sư phân giải protein trải qua
các quá trình thuỷ phân protein thành các polypeptit, sau đó là các axit amin, tiếp theo là
các quá trình amon hoá, nitrat hoá và phản nitrat hoá. Quá trình amon hoá là quá trình
chuyển hoá các hợp chất nitơ hữu cơ thành nitơ dạng khoáng. Quá trình nitrat hoá là quá
trình chuyển hoá các chất ammoniac ban đầu thành axit nitơ sau đó thành axit nitric. Quá
trình khử nitrat thành nitơ gọi là phản nitrat hoá[ 16].
1.2.4. Tinh bột trong nƣớc thải
Tinh bột là một cacbonhyđrat cao phân tử bao gồm các đơn vị D-glucoza nối với
nhau bởi liên kết α-glucozit. Công thức phân tử gần đúng là (C6H10O5)n trong đó n có
giá trị từ vài trăm đến khoảng mười nghìn. Tinh bột có dạng hạt màu trắng tạo bởi hai loại
polyme là amiloza và amilopectin. Amiloza là polime mạch thẳng gồm các đơn vị Dglucoza liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucozit. Amilopectin là polime mạch nhánh,
ngoài chuỗi glucoza thông thường còn có những chuỗi nhánh liên kết với chuỗi chính
bằng liên kết α-1,6-glucozit.
Trong tư nhiên, tinh bột là thành phần chủ yếu của các loại ngũ cốc, củ, quả.
Hàm lượng tinh bột có trong hạt và củ là 40  70 %, trong các phần khác của cây là
4  25 %. Chúng đóng vai trò là nguồn dư trữ năng lượng cho quá trình nảy mầm của
hạt, và là nguồn lương thưc chủ yếu của con người. Enzym thủy phân tinh bột phân hủy
chủ yếu liên kết α-glucozit. Nhóm enzym này gồm các enzym: α-amylaza, β-amylaza,
glucoamylaza, dextrinaza [16].
1.2.5. Một số vi sinh vật gây bệnh khác trong nƣớc thải
Các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong nước thải: Salmonella spp., một vài loài
Salmonella có thể hiện hiện trong nước thải đô thị, kể cả S. typhi (gây bệnh thương
hàn). Doran và cộng sư cho rằng số lượng 700 Salmonella/l; khoảng chừng đó Shigellae

và khoảng 1.000 Vibrio cholera/l thường phát hiện trong nước thải đô
thị của khu vưc nhiệt đới. Shigellae và Vibrio cholera nhanh chóng chết đi khi thải
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

10

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


ra môi trường. Do đó nếu chúng ta sử dụng một biện pháp xử lý nào đó để loại được
Salmonella thì cũng có thể bảo đảm là phần lớn các vi khuẩn kia đã bị tiêu diệt.
Enteroviruses: Có thể gây các bệnh nguy hiểm như sởi, viêm màng não. Số lượng của
chúng tương đối thấp hơn enteroviruses. Người ta đã chứng minh được rằng việc loại bỏ
các loài vi rút có quan hệ mật thiết với việc loại bỏ các chất rắn lơ lửng. Ngoài vi sinh vật
gây bệnh còn có một số ký sinh trùng: thường thì các bệnh ký sinh trùng chủ yếu là do
Ascaris lumbricoides, trứng của loài ký sinh trùng này có kích thước lớn (45  70 m  35
 50 m).
1.3. VI SINH VẬT PHÂN GIẢI NƢỚC THẢI HỮU CƠ
1.3.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza
Xenlulaza đươc thu tư nhiêu nguôn nguyên liêu khac nhau như đông vât (các
nhóm thân mềm, lơn, bò, gà); thưc vât (trong hat ngu côc nay mâm la đai mach , yên
mạch, lúa mì, mạch đen ) và vi sinh vật (nâm sơi , nâm men , xạ khuẩn và vi khuẩn ). Tuy
nhiên, vi sinh vât la nguôn thu enzym chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đươc nhiêu
lân trong năm va chu đông sư dung nguôn nguyên liêu re tiên đê
dàng điều khiể n co đinh hương nguôn enzym

nuôi cũng như dễ

hoăc gia tăng lương enzym. Có rất nhiều

chủng vi khuẩn , xạ khuẩn , nâm môc va môt sô loai nâm men có khả năng sinh tổng hợp
xenlulaza .
Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lân ki khi đêu co kha năng sinh xenlulaza như Bacillus
subtlis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis, Acidothermus cellulobutcus. Ngoài
ra còn có các loài ưa kiềm như Cephalosporium sp.RYM-202 [9].
1.3.2. Vi sinh vật phân giải hemixenluloza
Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza. Các vi sinh vật có
khả năng phân giải xenluloza khi sản sinh ra xenlulaza thường sinh ra hemixenlulaza. Một
số loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza như: Bacillus, Aspergillus,
Clostridium, Streptomyces ...

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

11

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


1.3.3. Vi sinh vật phân giải protein
Dưới tác dụng của các vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành các axit
+
amin. Các axit amin này lại được một số nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3 hoặc NH4
gọi là nhóm vi khuẩn amin hóa. Quá trình này gọi là sư khoáng hóa chất
+
hữu cơ vì qua đó, nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng. Dạng NH4 sẽ được
chuyển hóa thành dạng NO3 nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa.

Nhóm vi khuẩn nitrat hóa bao gồm bốn chi khác nhau: Nitrosomonas,
Nitrozocystc, Nitrozolobus và Nitrosospira, chúng đều thuộc loại dị dưỡng bắt buộc
[3].
1.3.4. Vi sinh vật phân giải tnh bột
Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột, đó là vi khuẩn Bacillus,
Pseudomonas, Athrobacter, Achromobacter, Agrobacterium … Một số vi sinh vật có khả
năng tiết ra các loại enzym trong hệ enzym amylaza. Ví dụ như một số vi nấm bao gồm
một số loại trong các chi Aspergillus, Fusarium ... Xạ khuẩn cũng có một số chỉ có khả
năng phân hủy tinh bột. Đa số các vi sinh vật đều không có khả năng tiết ra một hoặc vài
enzym trong hệ đó, chúng chỉ có khả năng tiết ra môi trường [3].
1.4. THÔNG SỐ CƠ BẢN ĐÁNH GIÁ NƢỚC BỊ Ô NHIỄM
Để đánh giá chất lượng nước cũng như mức độ ô nhiễm của nước nói chung thì có
rất nhiều các thông số. Tuy nhiên, mỗi loại nước với thành phần các chất có trong đó mà
ta chọn những thông số thích hợp nhất rồi so sánh với tiêu chuẩn cho phép về thành
phần hóa học và sinh học đối với từng loại nước sử dụng cho các mục đích khác nhau.
Các thông số cơ bản để đánh giá chất lượng nước thải hữu cơ là: pH, độ đục, các chất
rắn lơ lửng, oxy hòa tan … Đặc biệt hai chỉ số BOD và COD có ý nghĩa rất quan trọng.
Theo QCVN 40:2011/BTNMT - Quy chuẩn ky thuật quốc gia về nước thải công nghiệp, một
số thông số ô nhiễm trong nước thải công
nghiệp (bảng 1.1).

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

12

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Bảng 1.1. Một số thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp [9]
Thông số

QCVN 40:2011/BTNMT

Đơn vị

Cột A

Cột B

o
C
-

40

40

6÷9

5,5 ÷ 9

Màu

Pt-Co

50

150

Chất rắn lơ lửng

mg/l

50

100

COD

mg/l

75

150

BOD5

mg/l

30

50

Tổng nitơ

mg/l

20

40

Tổng photpho

mg/l

4

6

NH4(N)

mg/l

5

10

Coliform

MPN/100ml

3000

5000

Nhiệt độ
pH

 Màu sắc
Nước bình thường không có màu, nước trong các ao hồ có thể có màu tùy thuộc
vào các chất có mặt trong đó. Nước thải thường có màu nâu đen, đỏ hoặc đỏ nâu. Màu
sắc của nước là do các chất hữu cơ, vô cơ có mặt trong nước gây nên. Màu sắc của
nước ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm khi sử dụng nước có màu trong sản xuất [16].
Màu của nước là do:
+ Các chất hữu cơ và phần chết của thưc vật gọi là màu thưc vật, màu này rất
khó xử lý được bằng phương pháp đơn giản. Ví dụ rong tảo làm nước có màu xanh.
+ Các chất vô cơ là những hạt rắn có màu gây ra, màu này có thể xử lý.
Có nhiều phương pháp xác định màu của nước, nhưng thường dùng ở đây là
phương pháp so màu với các dung dịch chuẩn là Chlophantinat coban. Cường độ màu
của nước xác định theo phương pháp so màu khi lọc bỏ các chất vẩn đục [16].
 Mùi của nước
Nước tư nhiên sạch không mùi, nước thải và nước ô nhiễm thường có mùi khó
chịu từ nhẹ đến hôi thối.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

13

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Có thể xác định mùi của nước theo phương pháp đơn giản sau: Mẫu nước chứa
trong bình có nắp đậy kín, lắc trong khoảng 10 ÷ 20 giây, sau đó mở nắp, ngửi mùi và đánh
giá: không mùi, mùi nhẹ, trung bình, nặng và rất nặng. [16]
 Độ pH
pH cua nươ c thai có một ý nghĩa quan trọng trong quá trình xử lý . Các công trình

xử lý nước thải áp dụng các quá trình sinh học làm việc tốt khi pH nằm trong giơi han tư 7
÷ 7,6. Môi trương thuân lơi nhât đê vi khuân phat triên l à môi trường có pH từ 7 ÷ 8. Các
nhóm vi khuẩn khác nhau có giới hạn pH hoạt động khác nhau . Ví dụ vi khuẩn nitrit phát
triển thuận lợi nhất với pH từ 4,8 ÷ 8; còn vi khuẩn nitrat vơi pH tư 6,5 ÷ 9,3. Vi khuân
lưu huynh co th ể tồn tại trong môi trường có pH từ 1
÷ 4. Ngoài ra pH còn ảnh hưởng đến quá trình tạo bông cặn của các bể lắng bằng cách
tạo bông cặn bằng phèn nhôm [21].
Nươc thai sinh hoat co pH tư 7,2 ÷ 7,6.
 Nhu cầu oxy sinh hóa - BOD
BOD là nhu cầu oxy sinh hóa hay nhu cầu oxy sinh học, là lượng oxy cần thiết để
oxy hóa các chất hữu cơ dễ phân hủy có trong nước bằng VSV (chủ yếu là vi khuẩn) hoại
sinh, hiếu khí [19].
Chỉ tiêu BOD là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất để xác định mức ô
nhiễm của nước. Nó chỉ biểu thị lượng chất hữu cơ có thể bị phân hủy bởi VSV.
Trong thưc tế không thể xác định lượng oxy cần thiết để VSV oxy hóa hoàn toàn
chất hữu cơ có trong nước, mà chỉ cần xác định lượng oxy cần thiết khi ủ ở nhiệt độ 20
o
C trong 5 ngày ở phòng tối để tránh quá trình quang hợp, khi đó có khoảng 70 ÷ 80 % nhu
cầu oxy được sử dụng và kết quả được biểu thị là BOD5 [19].
 Nhu cầu oxy hóa học - COD
COD là nhu cầu oxy cần thiết để oxy hóa toàn bộ chất hữu cơ và các chất khử
có trong nước thành CO2 và H2O [19].
 Hàm lượng các chất rắn

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K16

14

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Các chất rắn có trong nước là: Các chất vô cơ là dạng các muối hòa tan hoặc không
tan như đất đá ở dạng huyền phù lơ lửng. Các chất hữu cơ như xác các vi sinh vật, tảo,
động vật nguyên sinh, động vật phù du …, các chất hữu cơ tổng hợp như phân bón, các
chất thải công nghiệp.
Chất rắn ở trong nước gồm có: Tổng chất rắn (TS) được xác định bằng trọng
lượng khô phần còn lại sau khi cho bay hơi nước trên bếp cách thủy rồi sấy khô ở
o
105 C cho đến khi trọng lượng không đổi. Đơn vị tính bằng mg (hoặc g/l). Chất rắn lơ
lửng ở dạng huyền phù (SS). Hàm lượng các chất huyền phù là trọng lượng khô của chất
rắn còn lại trên giấy lọc sợi thủy tinh. Chất rắn hòa tan (DS). Hàm lượng chất rắn hòa tan
chính là hiệu số của tổng chất rắn với huyền phù: DS = TS – SS. Đơn vị tính bằng g (hoặc
mg) [22].
 Hàm luợng nitơ
+
Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni (NH4 ), nitrat
(NO3 ), ít hơn ở dạng nitrit (NO2 ) và trong một số hợp chất hữu cơ khác. Thành phần
được xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu cho môi
trường là khí nitơ (N2).
Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạng khác
đều được tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy năng lượng hoặc
để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sư phát triển của chúng. Các dạng nitơ
hữu cơ từ nguồn động thưc vật sau khi chết được các vi khuẩn amoni hóa chuyển hóa
+
+
thành dạng NH4 ; sau đó NH4 được chuyển hóa thành NO2 nhờ vi
khuẩn nitrit hóa; NO2 sinh ra được nhóm sinh vật nitrat hóa chuyển hóa thành NO3;
cuối cùng nitrat được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ quá trình
khử nitrat.

Hiện nay, kết hợp phương pháp sinh học trong xử lý đối với cả nitơ, photpho trong
nước ô nhiễm đang là một hướng nghiên cứu mới. Trong nghiên cứu của Jorgensen và
Pauli, một số chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho cũng có khả năng khử nitrat
[18].
 Hàm lượng photpho
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K16

15

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Các hợp chất chứa photpho trong tư nhiên thường khó phân giải [7]. Các nguồn
nước thải chăn nuôi, biogas...thường có hàm lượng photpho cao. Theo tiêu chuẩn Việt
Nam về nước thải, hàm lượng photpho trong nước thải vượt quá 6 mg/l có thể dẫn đến
hiện tượng phú dưỡng (dư thừa các chất dinh dưỡng), gây tác động trưc tiếp đến động
vật, thưc vật và gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Việc xử lý nước thải giàu
photpho thường khó thưc hiện bằng còn đường sinh học do trong tư nhiên số lượng loài
vi sinh vật phân giải chuyển hóa photpho không nhiều. Một số chủng vi sinh vật phân lập
trong tư nhiên có khả năng tích lũy photphat cao thuộc các chi: Acinetobacter,
Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, … [8,9]. Kết quả nghiên cứu của Bao và
cộng sư về khả năng thu nhận tích lũy photpho của các chi vi khuẩn cho thấy sau 20 giờ vi
khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng thu nhận 14,34 mg/l khi tiến hành ở điều
kiện yếm khí, chi Enterobacteriaceae có khả năng thu nhận 8,91 mg/l, chi Alcaligenes là
6,43 mg/l, Staphylococcus là 6,23 mg/l, Bacillus là 4,41 mg/l ở điều kiện hiếu khí [8]. Sư
tích lũy photphat cung cấp nguồn năng lượng cho vi sinh vật phát triển. Trong cơ thể vi
sinh vật, photpho tích lũy ở dạng chủ yếu là photphat. Photphat chiếm đến 12 % trọng
lượng tế bào đối với vi khuẩn có hoạt tính tích lũy photphat, trong khi ở vi khuẩn không
tích lũy photphat chỉ có khoảng 1 ÷ 3 %. Xử lý nước thải có chứa các hợp chất

photpho bằng phương pháp sinh học dưa trên khả năng của một số nhóm vi sinh vật tích
lũy lượng photpho nhiều hơn mức cơ thể chúng cần trong điều kiện hiếu khí. Thông
thường hàm lượng photpho trong vi sinh vật chiếm từ 1,5 ÷ 2,5 % khối lượng tế bào khô,
một số loài có khả năng hấp thu cao hơn, từ 6 ÷ 8 % [3], [14].
Nghiên cứu Van Bethum và cộng sư, cho thấy photpho trong cơ thể vi sinh vật được
tích lũy dưới dạng chủ yếu là photphat. Trong cơ thể của chúng, photphat có thể chiếm
đến 12 % trọng lượng tế bào đối với vi khuẩn có tích lũy polyphotphat, và với vi khuẩn
không tích lũy polyphotphat, chỉ chiếm khoảng 1÷ 3 % trọng lượng tế bào [3].
 Chỉ số vệ sinh (E. coli)
Nước làm lan truyền các nguồn bệnh và trong thưc tế các bệnh lây lan qua môi
trường nước là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh có thể dẫn đến tử
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

16

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


vong, nhất là ở các nước đang phát triển. Các tác nhân gây bệnh thường được bài tiết
ra trong phân của người và động vật bị bệnh, bao gồm các nhóm chính sau: Các vi khuẩn,
virus, động vật đơn bào, giun kí sinh. Chất lượng về mặt vi sinh của nước thường được sử
dụng rộng rãi nhất là chỉ số E. coli [20].
1.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SƢ SINH TRƢƠNG CUA VI SINH VÂT TRONG QUA
TRINH XƢ LY NƢƠC THAI
1.5.1. Ảnh hƣơng cua nƣơc va nông đô cac chât dinh dƣơng
Nươc đong vai tro rât quan trong trong hoat đông sông cua vi sinh vât . Nươc hòa
tan các chất dinh dưỡng nhờ đó mà chất dinh dưỡng dễ dàng

thâm thâu qua màng tế

bào để cho vi sinh vật sử dụng . Nông đô cac chât dinh dương trong nươc thải phải phù
hợp với đặc điểm sinh lý của tế bào . Nông đô cac chât dinh dương cao quá mức giới hạn
tế bào sẽ mất nước, nguyên sinh chât trong tê bao bi keo tu lai lam hoạt động trao đổi
chất bị ngưng trệ . Ngươc lai, trong nươc cât tê bao bi trương lên do xay ra hiên tương
thâm thâu cua nươc qua mang tê bao lam cho tê bao bi vơ . Tỉ lê cac chât dinh dương co
anh hương lơn đên hoat đông sông cua vi sinh vât . Môi loài vi sinh vật cũng có nhu cầu
khác nhau về tỷ lệ các chất dinh dưỡ ng. Tỷ lệ C : N
: P phô biên cho nhiêu loai la 100 : 10 : 1.
1.5.2. Ảnh hƣởng của nhiêt đô
Môi loai vi sinh vât co đô giơi han nhiêt đô sinh trưởng thích hợp khác nhau . Đối
với mỗi loại vi sinh vật có các giới hạn nhiệt độ sinh trưởng tôi thiêu, nhiêt đô phát triển
tối đa và nhiệt độ

sinh trưởng thích hợ p. Phân lơn vi khuân co nhiệt độ sinh trưởng

o
o
thích hợp 30 ÷ 37 C, có nhiều loài vi khuẩn có nhiệt độ sinh trưởng thâp 10 ÷ 20 C
(vi sinh vât ưa lanh ) và có nhiều loài nhiệt độ sinh trưởng khá cao
o
50 ÷ 60 C (vi sinh vât ưa nhiêt ). Trong xư ly nươc thai hâu như viêc điêu chinh
nhiêt đô không thê thưc hiên đươc ma thương xư ly ơ nhiêt đô tư nhiên cua môi
trương. Vì vậy, ngươi ta thương chon cac loai vi sinh vât co săn trong tư nhiên cua
khu vưc đê chung co kha năng thich nghi vơi nhiêt đô môi trương tư nhiên [27].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

17

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


1.5.3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng
Cũng tương tư như nhiệt độ , pH môi trường ban đầu cũng là yếu tố ảnh
hương lơn đên tôc đô sinh trương cua vi sinh vât . Phân lơn ca c vi sinh vât co pH sinh
trưởng tôi ưu tư 5,5 ÷ 7,5 có một số loài sinh trưởng tôi ưu ơ pH thâp (< 4,5) và môt sô
loai sinh trưởng tôi ưu ơ pH kiêm . Ở pH không thich hơp hê enzym của vi sinh vât hoat
đông yêu hoăc bi bât hoa t do đo anh hương trưc tiêp đên qua trinh trao đôi chât cua vi
sinh vât . Đê vi sinh vât sinh trương tôt cân duy tri pH thich hơp trong suôt thơi gian nuôi
cây.
1.5.4. Ảnh hƣởng của oxy hòa tan
Môi quan hê cua vi sinh vât đôi vơi o xy rât khac nhau . Vi sinh vât hiêu khi cân oxy
đê sinh trương . Vi sinh vât yêm khi oxy lai la tac nhân gây đôc . Nhóm vi sinh vât trung
gian giưa hai nhom nay la nhom hiêu khi tuy tiên .
Trong xư ly nươc thai ơ cac bê a eroten cân cung câp đu oxy đê vi sinh vât hiêu
khi oxy hoa cac chât hưu cơ co trong nươc thai

. Còn xử lý yếm khí thì tiến hành trong

các bể kín để oxy không tan được vào trong nước thải gây ức ch ế các vi sinh vât yêm khi
[23].
1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ NƢỚC THẢI GIÀU HỮU CƠ
Có nhiều biện pháp xử lý nước thải: Xử lý cơ học, xử lý hóa học, xử lý sinh
học, xử lý cơ-lý-hóa, và xử lý nhờ kết hợp các biện pháp sinh học và cơ-lý-hóa.
Trong các phương pháp trên thì phương pháp xử lý sinh học được sử dụng nhiều
với hiệu quả cao, đặc biệt là đối với nước thải chứa nhiều chất hữu cơ dễ bị phân hủy,

nhưng không mang hiệu quả đối với nước thải công nghiệp có chứa các chất vô cơ độc hại
(kim loại nặng, axit, kiềm) hoặc các chất hữu cơ bền vững (các clobenzen, phenol …) và ít
hiệu quả đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh. Trong các trường hợp này phải kết hợp
phương pháp xử lý sinh học với các phương pháp
xử lý cơ-lý-hóa [29].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

18

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


1.6.1. Phƣơng pháp xử lý cơ học
Phương pháp cơ học thường sử dụng ở giai đoạn xử lý sơ bộ, dùng để loại các
vật rắn có kích thước lớn và các tạp chất rắn không tan trong nước. Các chất này có thể ở
dạng vô cơ hoặc hữu cơ. Các phương pháp xử lý cơ học thường dùng: lọc qua song chắn
hoặc lưới, lắng, lọc qua lớp cát và quay ly tâm.
1.6.2. Phƣơng pháp xử lý hóa học
Phương pháp hóa học dưa trên cơ sở là các phản ứng hóa học, các quá trình hóa lý
diễn ra giữa chất ô nhiễm với các hóa chất bổ sung vào. Các phản ứng xảy ra có thể là
phản ứng oxy hóa khử, các phản ứng tạo chất kết tủa hoặc các phản ứng phân hủy. Do
vậy, có 3 phương pháp xử lý hóa học thường được sử dụng đó là: Phương pháp trung
hòa, phương pháp oxy hóa-khử, phương pháp điện hóa học.
1.6.3. Phƣơng pháp xử lý sinh học
Phương pháp phổ biến và kinh tế nhất để xử lý nước thải giàu chất hữu cơ là
phương pháp sinh học. Phương pháp này dưa trên cơ sở sử dụng hoạt động của các vi
sinh vật để phân hủy các chất hữu cơ gây ô nhiễm trong nước thải.

Các vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ và một số khoáng chất làm nguồn dinh
dưỡng và tạo năng lượng. Trong quá trình phát triển, chúng nhận các chất dinh dưỡng để
xây dưng tế bào, sinh trưởng và sinh sản nên sinh khối của chúng được tăng lên. Quá
trình phân hủy các chất hữu cơ nhờ vi sinh vật gọi là quá trình oxy hóa sinh hóa [8].
Nước thải có thể xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bởi chỉ tiêu
COD hoặc BOD. Để có thể xử lý bằng phương pháp này, nước thải cần không chứa các
chất độc và tạp chất, các muối kim loại nặng hoặc nồng độ của chúng không được vượt
quá nồng độ cưc đại cho phép, đồng thời thỏa mãn: BOD/COD ≥
0,5.
1.7. TIÊU CHÍ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ LÝ NƢỚC THẢI HỮU CƠ
Xư ly nươc thai băng phương phap sinh hoc chu yêu dưa vao hoat đông sông của
các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng phâ n giai chât hưu cơ . Các vi sinh vật dị
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

19

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


dương co t hê chia thanh ba nhom nho : Vi sinh vât hiêu khi , vi sinh vât yêm khi va vi sinh
vât tuy nghi . Khu hê vi sinh vât sư dung trong qua trinh xư ly nươc thai gôm vi khuân ,
nâm me n, nâm môc , xạ khuẩn ... Trong đo , vi khuân chiêm sô lương lơn nhât. Trong cac
bê xư ly sinh hoc , vi khuân đong vai tro quan trong hang đâu vi no chịu trách nhiệm phân
hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải . Do vây, bên cạnh viêc lơi dụng nhưng tính
năng ưu viêt của các loài vi sinh vât thì chúng ta cân phải lưa chọn nhưng chủng vi sinh
vât thích hơp vưa có khả năng làm sạch, vưa tạo đô kêt lăng tôt vưa không gây đôc hại
cho môi trương. Các tiêu chí đươc xét: Có hoạt tính sinh học cao: Có phức hệ enzym phân
giải hữu cơ cao, ổn định. Sinh trưởng tốt trong điều kiện thưc tế của nước thải hữu cơ,

cạnh tranh được với vi sinh vật có sẵn trong nước thải. Nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng tốt
trong môi trường tư nhiên, thuận
lợi cho quá trình nhân giống thu sinh khối.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

20

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng được tuyển chọn: Vi khuẩn NT01, NT03 và NT05 được lưu giữ trong Bộ
sưu tập giống Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nước thải sau hầm biogas tại hộ gia đình ông Bùi Vinh Nghê, xóm Văn
Miếu, thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng, huyện Đan Phượng, thành phố Hà Nội.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất
2.1.2.1. Thiết bị chính
Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD (Nhật Bản); máy đo pH, Metter
Toledo (Thụy Sỹ); cân điện tử AB 204, Metter Toledo (Thụy Sỹ); máy lắc ổn nhiệt (Hàn
Quốc); các loại pipetman Gilson, Biohit; nồi khử trùng ướt (Trung Quốc); tủ sấy khô
(Sellab - Mỹ); tủ lạnh, Hàn Quốc; máy đo OD; lò vi sóng; ống đong: 100 ml, 500 ml, 1.000
ml; cốc đong: 100 ml, 200 ml, 1.000 ml, 2.000 ml; máy sục khí; các dụng cụ khác …
2.1.2. Thiết bị và hóa chất
Cao thịt (Merck- Đức); cao nấm men (Merck - Đức); pepton (Merck - Đức); thạch

(Merck- Đức); bột xenlulo (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại đường: D- glucoza,
saccaroza, D-fructoza, …(Merck- Đức); các hóa chất vô cơ khác: NaCl, KH2PO4,
MgSO4.7H2O, KNO3 …
+ Bộ Kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB
đ
+ Bộ kit TOPO TA Cloning bao gồm các thành phần cần thiết cho quá trình tách
đ
đ
dòng: Vectơ pCR 2.1-TOPO , enzym, tế bào khả biến chủng TOP 10, và dung dịch đệm
cho từng loại enzym.
+ Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tư, sử dụng bộ
sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit [2].
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

21

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


+ Cặp mồi cho phân loại vi khuẩn:
Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Pr16R:
TACGGTTACCTTGTTACCGACTT
- Cặp mồi tổng hợp gene 16S rARN được đặt tổng hợp tại hãng GENSET
(Singapore BioTech pte, Ltd).
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất 1.000 ml; pH
7.
Môi trường Winogradsky (g/l): NaNO21; K2HPO4

0,5; MgSO4.7H2O 0,3;

Na2CO3 1; NaCl 0,5; FeSO4 0,1; nước cất 1.000 ml
Môi trường Pikoskaya (g/l): Glucoza 10; Ca3(PO4)2 5; (NH4)2SO4 0,5; NaCl
0,2; MgSO4.7H2O 0,1; KCl 0,2; Cao nấm men 0,5; MnSO4 vết ; FeSO4. 7H2O vết;
nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2.
Môi trường xenlulo (g/l): NH4NO3
MgSO4.7H2O 0,3; CaCO3

0,2; ure 0,1; cazein 0,2; KH2PO4

0,2;

0,2; FeSO4.7H2O 0,05; bột giấy 20; cao nấm men 0,1;

cazamino axit 0,1; agar 20; nước cất 1.000; pH 7.
Môi trường xenlulo Glovina (g/l): CMC1,5; KNO3 0,5; KH2PO4 0,85; MgSO4.7H2O
0,0625; cao nấm men 0,025; nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2.
o
Môi trường Gelatin: Môi trường MPA + 0,4 % gelatin; khử trùng ở 121 C
trong 20 phút.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng phap nghiên cƣu vi sinh vât
2.2.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chun
̉ g vi khuẩn
 Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái tê bao c ủa vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện tử và
được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủ
tịch Hồ Chí Minh.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K16

22

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


 Nhuộm Gram vi khuẩn [3]
Xác định các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ vào màu thuốc
nhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn. Nếu vi khuẩn bắt màu hồng là Gr (-), màu tím là Gr
(+).
 Đặc điểm sinh lý, sinh hoa
 Khả năng sinh tổng hợp enzym
Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung thêm
o
1 % tinh bột. Nuôi ở nhiệt độ 30 C trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi
khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vi
khuẩn sinh trưởng [3].
Thủy phân xenlulo: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1 % bột giấy.
o
Nuôi ở nhiệt độ 30 C trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi khuẩn có
khả năng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vi khuẩn
sinh trưởng.
Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng, nuôi ở nhiệt
o
o
độ 30 C, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4 C để trong 2 giờ. Sau 2 giờ môi trường
trong ống nghiệm không bị đông thì chủng đó có khả năng làm loãng gelatin.
 Khả năng sư dung cac nguôn cacbon

Nuôi vi sinh vât trên môi trương co bô sung 1 % nguôn đương, cacbon. Xác đinh
kha năng phat triên cua chung.
 Khả năng chịu NaCl, chịu nhiệt, pH
Thay đôi nông đô NaCl và nuôi ở các thang nhiệt độ , pH khac nhau . Theo
dõi khả năng sinh trưởng của chúng.
*

Phương pháp phân tích nitơ tổng số
Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng

vô cơ và hữu cơ về dạng nitrat nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ở bước
sóng 220 nm [9].
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K16

23

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


*

Phương pháp phân tích hàm lượng amoni NH4

+

Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn được phân tích dưa trên nồng
độ amoni trong môi trường theo các khoảng thời gian nuôi. Phản ứng của NH4

+

và

hypochlorit với sư có mặt của xúc tác phenol tạo thành hợp chất indophenol blue.
So màu ở bước sóng 640 nm [9].
*

Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrit

Khả năng chuyển hóa nitrit (NO2 ) thành nitrat (NO3 ) của các chủng được đánh
giá thông qua sư giảm nồng độ nitrit trong môi trường nuôi cấy. Phản ứng giữa nitrit
và hỗn hợp sulfanylamit với naphtylendiamin tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bước
sóng 540 nm [9].
*

Đánh giá khả năng tch lũy photpho

Đánh giá khả năng tích lũy photpho của vi sinh vật thông qua hàm lượng photphat
còn lại trong môi trường. Hàm lượng photphat được đánh giá dưa trên nguyên tắc tạo
phức giữa gốc phosphat, amonium molypdat và kali antimon tatrat thành một phức chất
màu xanh đậm và được đo ở bước sóng 710 nm [11].
2.2.1.2. Phương pháp đánh giá tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn
Đối kháng giữa các chủng vi khuẩn: Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy giao
o
nhau trên môi trường MPA, nuôi ở 37 C sau 24 giờ quan sát sinh trưởng của các chủng ở
các đường giao nhau [3].
2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn
+ Ảnh hưởng của thời gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay đổi môi
trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sư thay đổi của các tế bào vi sinh vật. Vì vậy,
sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng thời điểm lượng enzym

sinh ra cũng khác nhau. Tiến hành thí nghiệm bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi
o
trường MPA, nuôi ở 37 C, điều kiện lắc 200 vòng/phút trong 60
giờ. Cứ sau 6 giờ lấy mẫu một lần, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm) [4].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K16

24

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


+ Ảnh hưởng của nhi ệt độ: Để nghiên cứu sư sinh trưởng của các chủng vi khuân
ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể. Sau đó, cấy các chủng vi sinh
vật trong các ống nghiệm chứa môi trường đã vô trùng và để ở các thang nhiệt độ: 25;
30; 35; 45 và 55. Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm).
+ Ảnh hưởng của pH : Sử dụng môi trường MPA có pH ban đầu là: 3; 4; 5;
o
6; 7; 8; và 9. Cấy vi sinh vật, nuôi ở 37 C, sau 48 giờ xác định khả năng sinh trưởng
bằng cách đo OD620 nm.
+ Ảnh hưởng của nồng độ NaCl: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường MPA sau đó
bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1; 3; 5; 7 và 9 và 11 nuôi ở 37
o
C trong 48 giờ. Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số (OD620nm).
+ Ảnh hưởng của ngu ồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh
trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn trên các
nguồn cơ chất khác nhau. Trên môi trường cơ sở có bổ sung tinh bột, CMC-Na, glucoza,
saccaroza, lactoza, rỉ đường. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ.
Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sư sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm).

+ Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi trường cơ sở
có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao thịt, KNO3 và (NH4)2SO4.
Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra
sư sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm).
2.2.1.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym
Phương pháp đường khử : Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ: 0.5; 1;
1.5; 2 và 3 (mg/ml). Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ đến khi xấp xỉ
nồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng bằng 1 ml). Bổ sung 1 ml cơ
o
chất, mix đều và ủ ở 37 C trong 10 phút, sau đó thêm 3 ml DNSA, mix đều rồi đun sôi các
mẫu enzym, đường chuẩn, EB và S cùng nhau (khoảng 30 phút). Sau đó làm lạnh bằng
cách ủ vào đá rồi đo OD (540 nm). Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫu
tiếp.
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

K16

25

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật