Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) tại Lâm Đồng bằng kỹ thuật sinh học phân tử

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






NGUYỄN THỊ NGỌC TUYẾT




NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
QUẦN THỂ THÔNG ĐỎ (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.)
TẠI LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT
SINH HỌC PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Di Truyền Học
Mã số: 60 42 70


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. TRẦN THU HOA



TP. HỒ CHÍ MINH – 2009

Em muốn dành lời đầu tiên của quyển luận văn này để gởi lời cảm ơn sâu sắc tới
cô, PGS. TS. Trần Thu Hoa vì tất cả những gì cô đã dành cho em trong suốt
những năm tháng qua. Cám ơn cô đã định hướng, giúp đỡ và hỗ trợ em trong học
tập, nghiên cứu và cả trong cuộc sống.
Con cảm ơn ba mẹ vì công ơn sinh thành, dưỡng dục và mọi sự quan tâm, ủng hộ,
động viên con hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh, Công Nghệ Sinh Học trường
Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM về những kiến thức chuyên ngành mà thầy
cô đã trau dồi cho em trong suốt những năm đại học và cao học.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dược,
Đại học Y Dược Tp.HCM đã tạo điều kiện tốt nhất để em được thực hiện công tác
nghiên cứu cho khóa luận này.
Em chân thành cảm ơn thầy, TS. Trần Công Luận, Giám đốc Trung Tâm Sâm và
Dược Liệu Tp.HCM và Ths. Vương Chí Hùng, Vimedimex về sự hỗ trợ nguyên liệu,
kinh phí và ý kiến chuyên môn cho công tác nghiên cứu đề tài này.
Và xin gởi lời cảm ơn đến các em Tố Nhi, Lữ Tâm, Phương Anh, Ngọc Ẩn thuộc
phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM vì
mọi sự giúp đỡ, động viên của các em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin
cảm ơn Ts. Lê Quang Nguyên đã dành thời gian góp ý cho việc hoàn chỉnh khóa
luận này.
-i-

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH v
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1. TỔNG QUAN 3
1.1 Thông đỏ Lâm Đồng - Taxus wallichiana Zucc. (Himalayan Yew) 3
1.1.1 Đặc điểm sinh học 3

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái 3
1.1.1.2 Đặc điểm tái sinh 3
1.1.1.3 Điều kiện sinh thái 4
1.1.2 Phân bố 4
1.1.3 Hệ thống phân loại 5
1.1.4 Giá trị sử dụng 6
1.1.5 Vấn đề bảo tồn và nhân giống thông đỏ tại Việt Nam 7
1.2 DNA lục lạp (cpDNA) ở thực vật 9
1.2.1 Bộ gen lục lạp 9
1.2.2 Vùng giữa hai gen trnL-trnF trong nghiên cứu di truyền quần thể 10
1.3 Sự đa dạng di truyền 10
1.3.1 Biến dị di truyền và cấu trúc di truyền 11
1.3.2 Dòng chảy của gen 12
1.3.3 Đặc điểm của các loài cây rừng 12
1.3.4 Ý nghĩa của sự đa dạng di truyền 13
1.4 Marker phân tử trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 14
1.4.1 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) marker 15
1.4.2 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker 16
1.4.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) marker 17
1.4.4 SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeat) marker 17
2. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1 Vật liệu, hóa chất & trang thiết bị 19
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19
2.1.2 Dụng cụ & thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu: 19
-ii-
2.1.2.1 Dụng cụ 19
2.1.2.2 Thiết bị 19
2.2 Phương pháp 21
2.2.1 Chiết tách và tinh sạch DNA 21
2.2.2 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phương pháp RAPD (Random

Amplified Polymorphic DNA) 22
2.2.2.1 Phản ứng RAPD-PCR 22
2.2.2.2 Phân tích kết quả đa hình từ RAPD-PCR 24
2.2.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phương pháp RFLP-PCR vùng giữa
hai gen trnL-trnF của DNA lục lạp 24
2.2.3.1 Phản ứng PCR khuyếch đại vùng trnL-trnF lục lạp 24
2.2.3.2 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 26
2.2.3.3 Phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn – RFLP 26
2.2.3.4 Giải trình tự đoạn giữa hai gen trnL-trnF 28
3. KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 29
3.1 Đa dạng di truyền thông đỏ Lâm Đồng qua khảo sát bằng kỹ thuật RAPD 29
3.1.1 Kết quả đa hình thu được sau phản ứng RAPD-PCR 29
3.1.1.1 Sàng lọc mồi 29
3.1.1.2 Kết quả khuyếch đại DNA với mồi ngẫu nhiên 29
3.1.2 Tương quan di truyền giữa các mẫu khảo sát dựa trên hệ số tương ứng đơn giản (SM
coefficient) 35
3.1.3 Phân nhóm di truyền các mẫu thông đỏ khảo sát 36
3.1.4 Tính đa dạng và cấu trúc di truyền của các quần thể được khảo sát 39
3.2 Đa dạng di truyền của thông đỏ Lâm Đồng qua khảo sát bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên vùng
trnL-trnF của DNA lục lạp (cpDNA) 40
3.2.1 Kết quả PCR-RFLP vùng giữa hai gen trnL-trnF 40
3.2.2 Trình tự vùng giữa hai gen trnL-trnF của DNA lục lạp thông đỏ 41
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
4.1 Kết luận 46
4.2 Đề nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

-iii-
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
bp Base pair
cpDNA Chloroplast DNA
CTAB Cetyltrimethylamonium bromide
DNA Deoxyribonucleic acide
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
EtOH Ethanol
H
2
O Dihydrogen monoxide (nước)
ORF Open Reading Frame
PCR Polymerase Chain Reaction
PVP Polyvinylpyrolidol
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RAPD Randomly amplified polymorphic DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
T. chinensis Taxus chinensis
T. fuana Taxus fuana
T. wallichiana Taxus wallichiana
Tag Thermus aquaticus
TE Tris- HCl + EDTA
U Unit
UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic mean




-iv-
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Danh sách các mẫu vật liệu 20

Bảng 2.2: Các mồi ngẫu nhiên đã được chọn cho phản ứng RAPD-PCR 22
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng RAPD-PCR 23
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt trong phản ứng RAPD-PCR 23
Bảng 2.5: Điều kiện điện di sản phẩm RAPD-PCR trên gel polyacrylamide 23
Bảng 2.6: Ba mồi đặc hiệu dùng khuyếch đại vùng trnL-trnF lục lạp. 24
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR vùng trnL-trnF 25
Bảng 2.8: Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR vùng trnL-trnF 25
Bảng 2.9: Enzyme cắt giới hạn được dùng trong phản ứng RFLP 27
Bảng 2.10: Thành phần phản ứng cắt với enzyme XbaI 27
Bảng 2.11: Thành phần phản ứng cắt với enzyme ApoI 27
Bảng 3.1: Kết quả RAPD của 50 mẫu thông đỏ với tám mồi chọn lọc. 30
Bảng 3.2: Sự phân nhóm di truyền của 50 mẫu khảo sát 37
Bảng 3.3: Các hệ số đa dạng di truyền dựa trên phân tích Nei về sự đa hình trong và
giữa các quần thể thông đỏ. 39
Bảng 3.4: Kết quả BLAST với NCBI 45


-v-
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cành lá và quả thông đỏ Lâm Đồng. 3
Hình 1.2: Sơ đồ phân bố của quần thể thông đỏ tại Lâm Đồng. 5
Hình 1.3: Thông đỏ được nhân giống bằng kỹ thuật giâm hom tại Vimedimex 8
Hình 1.4: Sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường trong việc quy định kiểu hình
cá thể sinh vật 11
Hình 3.1: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPA-07 31
Hình 3.2: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPA-12 31
Hình 3.3: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC-06 32
Hình 3.4: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPN-09 32
Hình 3.5: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPP-04 33
Hình 3.6: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-04 33

Hình 3.7: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-14 34
Hình 3.8: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-15 34
Hình 3.9: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan về di truyền giữa 50 mẫu thông
đỏ trên cơ sở kiểu gen 38
Hình 3.10: Sản phẩm khuyếch đại vùng trnL-trnF trên cpDNA thông đỏ 41
Hình 3.11: Sản phẩm cắt với enzyme cắt giới hạn ApoI (A) và XbaI (B) 41
Hình 3.12: Sự sắp xếp chuỗi nucleotide vùng trình tự trnL-trnF 44


-1-
Đặt vấn đề

ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.), tên tiếng anh là Himalayan Yew, là cây thân
gỗ có giá trị kinh tế cao, hiện đang được công nghệ dược phẩm rất quan tâm vì đây
là nguồn thiên nhiên cung cấp các hợp chất taxane, sử dụng trong hóa trị ung thư
như: ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư đầu và cổ, và một số
dạng di căn của ung thư da [37].
Do có giá trị kinh tế cao, thông đỏ đang bị lạm dụng khai thác ở hầu hết các nơi trên
thế giới. Thêm vào đó, thông đỏ là loài có khả năng tái sinh tự nhiên rất thấp, nên
nguồn nguyên liệu thiên nhiên này ngày càng trở nên quý hiếm. Ở Việt Nam, thông
đỏ được xem là loài có khả năng tuyệt chủng và được ghi vào sách đỏ với 2 loài:
thông đỏ bắc – Taxus chinensis Z (Pilg.) Rehd., và thông đỏ nam – Taxus
wallichiana Zucc. Cả hai loài đều có số lượng rất ít, chỉ khoảng vài trăm cá thể mỗi
loài. Lâm Đồng là tỉnh có các quần thể thông đỏ nam được biết đến nhiều nhất ở
nước ta với các quần thể tại Xuân Trường, Bidoup, Hồ Tiên, Núi Voi
Với số lượng quần thể ít, số cá thể trong mỗi quần thể cũng không cao, do đó có thể
tính đa dạng trong quần thể thông đỏ tại Việt Nam là một điều rất đáng quan tâm
đối với lĩnh vực bảo tồn và khai thác hợp lý nguồn tài nguyên này. Mức đa dạng di
truyền của quần thể càng cao thì quần thể càng có khả năng sống sót trước những

biến đổi của điều kiện môi trường. Tính đa dạng cao của quần thể còn giúp cho các
nhà nhân giống có nhiều lựa chọn hơn trong việc chọn ra nguồn giống có khả năng
sinh tổng hợp lượng hợp chất taxane cao. Vì vậy cần nghiên cứu đánh giá tính đa
dạng di truyền ở mức độ quần thể tạo cơ sở để lựa chọn những giống tốt phục vụ
cho nhu cầu sản xuất và có hướng bảo tồn hợp lý.
Các nghiên cứu về tính đa dạng di truyền ở các loài thực vật nói chung và thông đỏ
nói riêng đã được tiến hành ở nhiều nơi, sử dụng các marker phân tử như allozyme,
RAPD, AFLP, RFLP, microsatelite Trong số các marker phân tử kể trên thì các
-2-
Đặt vấn đề
marker RAPD được xem là đơn giản và rẻ tiền nhất để nghiên cứu về đa dạng di
truyền. RAPD đã được dùng trong nghiên cứu về chi Taxus để nhận định loài có
nhiều taxane của Taxus chinensis var. mairei [24], để ước lượng liên hệ cây sinh
loài của Taxaceae [62], để khảo sát sự đa dạng di truyền trong quần thể Taxus
canadensis [53], Taxus cuspidata var. Nana [43], Taxus wallichiana Zucc. vùng
đông bắc Ấn Độ [56] và Taxus wallichiana Zucc. khu vực Hi mã lạp sơn [45].
Bên cạnh đó, PCR-RFLP cũng được dùng để phân tích các marker trên DNA lục lạp
(cpDNA) của Taxus để phát hiện rõ các biến đổi giữa các loài [26], hay phân tích
mối quan hệ di truyền giữa các quần thể Taxus wallichiana Zucc. ở Trung Quốc và
phía bắc Việt Nam [33].
Dựa vào những kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền trên thông đỏ kể trên, chúng
tôi bước đầu chọn 2 phương pháp RAPD và cpDNA PCR-RFLP để khảo sát tính đa
dạng di truyền của quần thể thông đỏ Lâm Đồng thông qua đề tài với tên gọi là
“Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể thông đỏ (Taxus wallichiana
Zucc.) tại Lâm Đồng bằng kỹ thuật sinh học phân tử”.
Mục tiêu của đề tài:
1. Khảo sát mối quan hệ di truyền giữa một số cá thể thông đỏ được thu thập từ
khu vực Lâm Đồng bằng kỹ thuật RAPD:
o Khảo sát mức độ tương quan di truyền giữa các cá thể.
o Khảo sát mức đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của các quần thể

thông đỏ (khu vực) khác nhau thuộc Lâm Đồng.
2. Khảo sát mối quan hệ di truyền giữa một số cá thể thông đỏ được thu thập từ
khu vực Lâm Đồng bằng kỹ thuật PCR-RFLP trên vùng trình tự giữa hai gen
trnL-trnF của DNA lục lạp.
3. Bước đầu khảo sát trình tự vùng giữa 2 gen trnL-trnF trên DNA lục lạp của
thông đỏ Lâm Đồng.
-3-
Tổng quan

1. TỔNG QUAN
1.1 Thông đỏ Lâm Đồng - Taxus wallichiana Zucc. (Himalayan Yew)
1.1.1 Đặc điểm sinh học
1.1.1.1 Đặc điểm hình thái [1]
Thông đỏ là thực vật hạt trần, thuộc loại gỗ thường xanh, cao đến 20m. Thân có vỏ
màu hồng xám, phân nhiều cành mảnh, khi non màu lục. Lá mọc so le, thường xếp
2 dãy như 1 lá kép. Lá có hình dải rất hẹp, dáng cong, dài 2,5 - 3,5 cm, rộng 2 - 3
mm, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên lõm như lòng thuyền, mặt dưới có hai dãy lổ
khí. Thông đỏ có nón đực và nón cái khác gốc, mọc ở kẽ lá. Hột thông đỏ hình
trứng, vỏ cứng, được bao bọc bởi áo màu đỏ để hở đầu.

Hình 1.1 Cành lá và hột thông đỏ Lâm Đồng.
1.1.1.2 Đặc điểm tái sinh [22]
Thông đỏ có mùa ra hoa từ tháng 8 - 12 và đến tháng 6,7 năm sau thì tạo hột và hột
chín từ tháng 9 đến tháng 12, đôi khi hột còn tồn tại đến tháng 2,3 năm sau. Hột
thường chín rộ trong khoảng một tháng. Hột chín mọng có màu đỏ rực rỡ, thịt mềm
nhiều nước, hấp dẫn nhiều loại côn trùng và động vật, nhất là các loài chim, sóc,
khỉ, Khi chín, hột rụng xung quanh gốc cây mẹ một khoảng cách không xa lắm 5
– 30 m và nẩy mầm khi có điều kiện thuận lợi.
-4-
Tổng quan

1.1.1.3 Điều kiện sinh thái [22]
Thông đỏ Lâm Đồng phân bố ở nơi có biên độ nhiệt độ bình quân từ 19,1
o
C đến
22,3
o
C và lượng mưa bình quân khoảng 1600 – 1800 mm/năm với mùa mưa bắt đầu
từ tháng 4 đến tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau. Ẩm độ không
khí bình quân/tháng dao động từ 71 đến 86%. Tổng số giờ nắng bình quân khoảng
2.328 giờ/năm. Về thổ nhưỡng, các quần thể thông đỏ thường mọc trên các loại đất
nâu vàng phát triển trên đá đaxit, đất vàng đỏ trên đá granit hay phiến thạch hoặc
đất nâu đỏ trên nền Bazan.
1.1.2 Phân bố
Taxus wallichiana Zucc. (T. wallichiana Zucc.) phân bố hẹp, ở các dãy phía đông
Himalaya đến Tây nam Trung Quốc (Đông Nam Tibet, Sichuan, Yunnan), Đông và
Trung Nepal, Tây bắc Ấn Độ (Assam, Manipur, Khasia Hills, Tây Bengal),
Myanmar, Bhutan [55], Đài Loan, Indonesia, Philippines, Việt Nam [33].
Tại Lâm Đồng, thông đỏ được tìm thấy ở một số địa điểm sau:
 Thành phố Đà Lạt: thông đỏ phân bố ở Xuân Trường, cao độ 1428 – 1454 m,
độ dốc 20 - 45°, nằm cách trung tâm thành phố 17 km về hướng Đông, giáp
huyện Đơn Dương. Thông đỏ còn được tìm thấy tại khu vực Bang Bi cách
trung tâm thành phố 5 km về hướng Tây-Bắc ở độ cao khoảng 1.450 m, độ
dốc > 25°.
 Huyện Lạc Dương thông đỏ phân bố ở khu vực Cổng Trời, Lán Tranh và
Klong Lanh thuộc các tiểu khu 101, 102, 103, 124, 125 (Ban Quản lý rừng
đặc dụng Bi Đoup- Núi Bà), có cao độ từ 1.508 – 1.713 m, độ dốc > 25°,
cách Đà Lạt khoảng 35 km.
 Huyện Đức Trọng thông đỏ phân bố ở khu vực Núi Voi - Cần Reo-Tuyền
lâm thuộc tiểu khu 277, 269 (Ban Quản lý rừng Hiệp Thạnh- Huyện Đức
Trọng), có cao độ từ 1298 – 1402 m, độ dốc 15 –25°, cách Đà Lạt khoảng 20

km và cách quốc lộ 19 khoảng 5 km về hướng Tây-Nam.
-5-
Tổng quan
 Huyện Đơn Dương thông đỏ phân bố ở khu vực Hồ Tiên thuộc tiểu khu 324,
325 (Ban Quản lý rừng Công An Huyện Đơn Dương), có cao độ 1.450 –
1.520 m, độ dốc >15
o
, cách Đà Lạt 39 km về hướng Đông nam và cách khu
vực Núi Voi, Cần Reo khoảng 5 km đường chim bay.

Hình 1.2: Sơ đồ phân bố của quần thể thông đỏ tại Lâm Đồng.
1.1.3 Hệ thống phân loại [46]
 Ngành: Pinophyta
o Lớp: Pinopsida
 Bộ: Pinales
 Họ: Taxaceae
 Chi: Taxus
 Loài: Taxus wallichiana Zucc.
-6-
Tổng quan
Taxus có bốn loài ở Bắc Mỹ (Taxus brevifolia Nutt., Taxus canadensis Willd.,
Taxus floridana Nutt., Taxus globosa Schlecht.), một loài tại Châu Âu và Đông Á
(Taxus baccata L.) và rất nhiều loài khác phân bố dọc Đông và Đông Nam Á.
Việc phân loại các loài Taxus ở khu vực Đông và Đông Nam Á khá phức tạp và vẫn
chưa thống nhất. Theo De Laubenfels (1988), ngoại trừ Taxus cuspidata Siebold &
Zucc. thì tất cả các thông đỏ có ở Trung Quốc và Đông Dương đều là Taxus
sumatrana (Miq.) de Laub. Tuy nhiên, hệ thống phân loại này không nhận được sự
ủng hộ của các tác giả khác.
Các tác giả Li và Fu (1997) đã phân loại các mẫu thông đỏ mà họ thu thập được từ
Xizang (Tibet) và từ khu vực trung Nepal về hướng tây, đến Pakistan và

Afghanistan là Taxus fuana Nan Li & R. R. Mill.
Trong một nghiên cứu khác sau đó với các mẫu thông đỏ từ Trung Quốc, nhóm tác
giả Fu, Li và Mill (1999) đã xác định thêm loài T. wallichiana Zucc. với ba thứ
khác nhau là T. wallichiana var. wallichiana, T. wallichiana var. chinensis (Pilg.)
Florin and T. wallichiana var. mairei (Lemée and H. Lév.) L. K. Fu & Nan Li.
1.1.4 Giá trị sử dụng
Các loài thông đỏ nói chung đều có giá trị kinh tế cao. Gỗ thông đỏ là gỗ quý,
thường dùng làm đồ gỗ gia dụng. Trong dân gian, các bộ tộc thiểu số người Mỹ sử
dụng gỗ của cây thông đỏ làm cung, nêm, dùi cui, chèo, lưỡi cày, rìu, cán lao, giáo,
khung trống, điêu khắc và nhiều công cụ hữu ích khác [22]. Tại Pakistan, người ta
còn dùng gỗ thông đỏ để đóng quan tài vì loại gỗ này có khả năng chống lại sự thối
rữa [67].
Trong y học dân gian Trung Quốc, thông đỏ được coi là có tác dụng tiêu tích, thông
kinh mạch, giảm đau, hạ sốt. Trong y học cổ truyền Ấn Độ, cao lá khô và cao vỏ
thông đỏ được dùng trị hen. Ở Thổ Nhĩ Kỳ, thông đỏ được dân gian dùng để chữa
bệnh tim [1].
-7-
Tổng quan
Tuy thông đỏ đã được sử dụng từ rất lâu trên thế giới, nhưng mãi cho đến những
năm 1960, khi hợp chất Taxol chiết xuất từ vỏ cây Pacific yew (Taxus brevifolia)
cho thấy có khả năng gây độc tế bào, thì chúng mới được các nhà khoa học, đặc biệt
là trong lĩnh vực dược phẩm, quan tâm. Ngày nay, Taxol từ thông đỏ được biết đến
như một hoạt chất có khả năng chống nhiều loại ung thư như ung thư buồng trứng,
ung thư vú, ung thư gan, phổi và máu [44].
Tuy nhu cầu cao, nhưng hiệu suất chiết xuất Taxol lại rất thấp. Để thu được 1kg
Taxol, người ta phải sử dụng đến 10,000 kg vỏ thông đỏ Taxus brevifolia; và để có
được một liều thuốc taxol, người ta phải sử dụng toàn bộ vỏ của 6 cây này [58].
Điều này rất dễ dẫn đến sự khai thác quá mức nguồn tài nguyên thông đỏ trên thế
giới. Thực tế đó thúc đẩy các nhà khoa học đi tìm giải pháp thay thế cho việc sử
dụng taxol nguyên thủy từ thông đỏ. Ngày nay, khoa học đã chứng minh taxol có

thể được bán tổng hợp từ các tiền chất taxoid. Do đó, bên cạnh Taxol, giờ đây giới
khoa học còn tập trung nghiên cứu nhằm chiết xuất ra những tiền chất trong con
đường sinh tổng hợp Taxol như baccatin III, 10-acetylbaccatin III (10-DAB)…
Tại Việt Nam, Taxol và tiền chất 10-DAB là hai hợp chất được nghiên cứu chiết
xuất nhiều nhất từ lá Taxus wallichiana Zucc. với hàm lượng trong khoảng dao
động từ 0.007% - 0.013% [22] và có thể cao đến 0.02% - 0.03% [9].
1.1.5 Vấn đề bảo tồn và nhân giống thông đỏ tại Việt Nam
Thông đỏ có giá trị sử dụng cao, nhu cầu lớn, nhưng khả năng tái sinh tự nhiên thì
rất thấp, do đó chúng được xếp vào nhóm có nguy cơ tuyệt chủng “CR C2a” ở nước
ta. Theo khảo sát của nhóm tác giả Lê Đình Khả (2006) thì thông đỏ Lâm Đồng chỉ
còn khoảng 200 cây [4]. Thông đỏ Lâm Đồng, Taxus wallichiana Zucc., còn được
ghi rõ trong nghị định 32/2006/NĐ-CP của chính phủ là “Thực vật rừng nguy cấp,
quý hiếm, cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại”.
Mặc dù quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng, nhưng loài thực vật này chỉ được ghi
nhận và bảo tồn tại một nơi duy nhất là vườn quốc gia Bidoup. Trong khi đó, những
-8-
Tổng quan
quần thể thông đỏ khác như Núi Voi thì vẫn chưa được quan tâm bảo tồn đúng mức
và đang phải chịu cảnh lâm tặc hoành hành.
Tuy nhiên, cũng như thế giới, nhiều nhà khoa học Việt Nam đã và đang quan tâm
rất nhiều đến các quần thể thông đỏ trong nước. Nhiều công trình khoa học tập
trung nghiên cứu vấn đề tái sinh, nhân giống nhằm bảo tồn và tạo nguồn nguyên
liệu ly trích taxol và 10-DAB cho ngành dược phẩm.
Tại trung tâm nghiên cứu lâm sinh Lâm Đồng, Trung tâm trồng và phát triển cây
thuốc Đà Lạt – Vimedimex, các nhà khoa học bước đầu đã thành công trong việc
nhân giống thông đỏ bằng kỹ thuật giâm hom. Ngoài ra, những điều kiện về sinh
thái, dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của thông đỏ cũng như thời gian thu hái
thích hợp cũng được quan tâm nghiên cứu tại các trung tâm trên.

Hình 1.3: Thông đỏ được nhân giống bằng kỹ thuật giâm hom tại Vimedimex

Viện sinh học nhiệt đới với nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Văn Minh, Phân
viện sinh học Đà Lạt với nhóm nghiên cứu của TS Dương Tấn Nhật, Khoa Sinh –
-9-
Tổng quan
Trường đại học KHTN Tp.HCM với nhóm nghiên cứu của PGS. TS Bùi Trang Việt
là đại diện cho một số nơi đang nghiên cứu về những vấn đề nhân giống in-vitro cây
thông đỏ Lâm Đồng.
Bên cạnh việc tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến tái sinh, nhân giống,
giới khoa học trong nước cũng nghiên cứu song song các vấn đề liên quan đến sự
định lượng, ly trích taxol và 10-DAB từ nguồn dược liệu này. Có thể kể ra đây là
nhóm nghiên cứu của TS. Trần Công Luận, thuộc Trung tâm sâm và dược liệu
Tp.HCM với những nghiên cứu xung quanh vấn đề xây dựng quy trình định lượng
taxol và 10-DAB từ lá thông đỏ, hay khảo sát sự biến động hàm lượng taxol và 10-
DAB trong lá thông đỏ theo sự khác biệt về quần thể nơi thu hái, về loài, về tuổi và
về thời gian thu hái…
1.2 DNA lục lạp (cpDNA) ở thực vật
1.2.1 Bộ gen lục lạp [54]
DNA lục lạp, ký hiệu là cpDNA (Chloroplast DNA), là DNA sợi đôi, có chiều dài
trong khoảng 35-217 kb tùy loài thực vật, trong đó phần đông các loài có DNA dài
khoảng 115-165 kb. Chỉ một phần trên bộ gen lục lạp có dạng vòng như mô tả trước
đây. Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1,000 – 10,000 bản sao cpDNA.
Các gen thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có thể được chia thành 3 nhóm như
sau: Nhóm một là các gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang hợp như
phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB ), cytochrome b6f (petA, petB ), ATP
synthase (atpA, atpB ) Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenase (ndhA,
ndhB ); Nhóm hai là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5 ), trnA (trnH,
trnK ), RNA polymerase (rpoA, rpoB ), ribosomal subunit genes (rps2, rps3 );
Và nhóm ba gồm các khung đọc mở ORF gọi là ycfs (chưa rõ chức năng), và các
gen mã hóa protein như matK, cemA
-10-

Tổng quan
1.2.2 Vùng giữa hai gen trnL-trnF trong nghiên cứu di truyền quần thể
Trên cpDNA có rất nhiều gen và vùng giữa hai gen được xem như những marker
tiến hóa quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về hệ thống phát
sinh loài hay khoảng cách di truyền giữa các quần thể. Điển hình là các gen rbcL,
ndhF, matK, atpB, rpl16 và vùng không mã hóa trnL intron hay khoảng giữa hai
gen trnL-trnF [54].
trnL là gen mã hóa cho tRNA (UAA), trnF là gen mã hóa cho tRNA (GAA).
Khoảng giữa hai gen trnL–trnF thường được dùng cho mục đích tái thiết lại những
giả thuyết về các mối quan hệ di truyền ở các mức phân loại khác nhau. Liên quan
tới thông đỏ, ở cấp họ, vùng này được sử dụng trong phân tích mối quan hệ giữa hai
họ taxodiaceae và cupressaceae [40]; ở cấp loài, vùng này được sử dụng trong việc
định danh phân loại các loài Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus cuspidata
[26] hay trong việc phân tích sự phát sinh loài của Taxus wallichiana thuộc Trung
Quốc và miền bắc Việt Nam [33].
1.3 Sự đa dạng di truyền [21]
Sự đa dạng di truyền trong loài thường bị ảnh hưởng bởi những tập tính sinh sản
của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối với nhau
để sản sinh ra các thế hệ con cái hữu thụ. Một quần thể có thể chỉ vài cá thể đến
hàng triệu cá thể.
Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gen khác nhau, dù chỉ là rất ít. Gen là
một đơn vị di truyền. Những dạng khác nhau của một gen được gọi là allen. Tập
hợp một nhóm allen trên một vùng nhiễm sắc thể (NST) được gọi là một hallotype.
Sự khác nhau giữa các allen của cùng một gen thường là do đột biến.
Tổng các gen và allen trong một quần thể là nguồn gen của quần thể và những tổ
hợp của các allen mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu di truyền. Kiểu hình của mỗi cá
thể được thể hiện bằng các tính chất về hình thái, sinh lý, hóa sinh và được đặc
trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trường nhất định.
-11-
Tổng quan

Số lượng khác biệt nhau về gen trong một quần thể được xác định bởi số gen trong
vốn gen đó mà có nhiều hơn một allen (được gọi là các gen đa hình) và số các allen
cho mỗi một gen đa hình. Sự tồn tại của các gen đa hình cho phép các cá thể trong
quần thể có thể có kiểu gen dị hợp tử, điều đó có nghĩa là các cá thể có thể nhận
được những allen khác nhau từ các gen trong mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gen cho
phép các loài thích ứng được với sự thay đổi của môi trường. Nói chung, những loài
quý hiếm thường đơn điệu về gen hơn so với những loài phổ biến, phân bố rộng và
hậu quả là những loài quý hiếm thường rất nhạy cảm với sự biến đổi môi trường và
dễ bị tuyệt chủng.

Hình 1.4: Sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường trong việc quy định kiểu hình
cá thể sinh vật.
1.3.1 Biến dị di truyền và cấu trúc di truyền
Biến dị di truyền là một trong những đặc điểm phổ biến của hầu hết các sinh vật.
Mục tiêu chính của việc bảo tồn sinh học là sự duy trì về đa dạng di truyền trong
quần thể. Đa dạng di truyền có vai trò rất quan trọng trong sự sống còn của quần thể
Cùng kiểu
gen

Khác kiểu
gen

Môi trường giống
nhau

Kiểu hình khác nhau
Môi trường khác nhau Kiểu hình khác nhau
-12-
Tổng quan
bởi vì nó giúp cho quần thể phát triển và thích nghi trước những thay đổi của môi

trường. Do đó, biến dị di truyền là nền tảng cho quá trình tiến hóa.
Cấu trúc di truyền là sự phân bố tỉ lệ của các dạng di truyền như là số allen hay kiểu
hình trong quần thể. Bất cứ sự thay đổi nào về cấu trúc di truyền của một quần thể
đều liên quan đến ít nhất một vị trí của gen và điều này được xem như là điều kiện
của sự tiến hóa. Tác nhân làm thay đổi cấu trúc di truyền của một quần thể được gọi
là nhân tố tiến hóa, bao gồm: đột biến, dòng chảy và sự di chuyển của gen, sự phân
mảnh di truyền, chọn lọc tự nhiên và hệ thống giao phối. Nói một cách khác, các
nhân tố tiến hóa có tác động phối hợp với nhau lên cấu trúc di truyền của tất cả các
cá thể sinh vật trong quần thể.
Sự biến đổi về cấu trúc di truyền không thể tìm thấy ở một cá thể riêng lẻ mà nó chỉ
xảy ra ở cấp độ quần thể. Từ thông tin di truyền của một sinh vật có thể truyền cho
con cháu của chúng tạo nên nhiều kiểu hình khác nhau. Việc theo dõi về cấu trúc di
truyền trong một quần thể hay vài quần thể đòi hỏi phải điều tra nghiên cứu về hệ
thống di truyền và tiến hóa.
1.3.2 Dòng chảy của gen
Hệ thống dòng chảy của gen được mô tả bằng sự trao đổi của các thông tin di truyền
ở trong và giữa các quần thể. Vì thực vật không di chuyển được, nên cơ quan giao
tử cái cũng ở dạng cố định. Do đó, có hai hướng nghiên cứu cơ bản quan trọng cho
sự biến động của gen chủ yếu là sự di chuyển của hạt phấn và hạt giống. Dòng chảy
của gen về sự di chuyển của hạt phấn có ý nghĩa hạn hẹp, còn sự di chuyển của cả
hạt phấn và hạt giống thì có ý nghĩa rất lớn. Điều này như là một nhân tố thiết yếu
cho không gian cấu trúc di truyền của sự phân bố các loài trong một khu vực.
1.3.3 Đặc điểm của các loài cây rừng
Cây rừng đóng vai trò quan trọng về di sản và di truyền do có độ đa dạng di truyền
cao và là nơi bảo tồn các nguồn gen quý. Các loài cây rừng đặc trưng bởi tần suất
các dị hợp tử và mức đa dạng sinh học rất cao. Chúng được ghi nhận cho quá trình
tái sinh diễn ra rất lâu khoảng hàng trăm năm. Một trong những đặc điểm quan
-13-
Tổng quan
trọng cho việc cải thiện nguồn di truyền là quá trình trưởng thành về mặt giới tính

để có thể sinh sản được thì diễn ra rất là chậm. Việc tạo ra cơ quan sinh dục khó có
thể diễ ra sau vài chục năm. Nếu ta quan tâm đến gỗ và chất lượng gỗ thì loài đó
phải diễn ra về mặt trưởng thành sẽ kéo dài vài chục năm.
1.3.4 Ý nghĩa của sự đa dạng di truyền
Sự đa dạng di truyền giúp cho một loài sinh vật cụ thể có khả năng đáp ứng lại
những biến đổi của điều kiện môi trường sống và tồn tại theo thời gian. Đánh giá sự
đa dạng di truyền của một quần thể là một trong những việc làm cần thiết giúp
chúng ta phác thảo ra những chiến lược bảo tồn in situ và ex situ. Hiểu biết về sự đa
dạng di truyền của quần thể còn giúp chúng ta có hướng khai thác nguồn tài nguyên
di truyền một cách phù hợp.
Sự đa dạng di truyền ở những loài cây có giá trị sử dụng cao là điều mong mỏi của
các nhà lai tạo vì như thế họ có thể tạo ra một nguồn nguyên liệu phong phú cho
công cuộc tạo ra những giống mới hoặc cải tiến một số đặc tính của một loài nào
đó. Do đó, việc bảo tồn nguồn gen cũng đồng nghĩa với việc bảo vệ nguồn nguyên
liệu sống cho việc sử dụng trong một thời gian dài nhằm tạo ra thực phẩm, thuốc
men, quần áo, nhiên liệu cũng như những sản phẩm công nghiệp khác cho cuộc
sống.
Đối với ngành dược phẩm, thông đỏ nói chung, Taxus wallichiana Zucc. nói riêng,
là loài cây rất có giá trị nhờ khả năng cung cấp Taxol và những tiền chất của taxol
cho hóa trị ung thư. Tuy nhiên, một số nghiên cứu ban đầu [37] cho thấy khả năng
tích trữ taxol của các loài khác nhau trong cùng một chi Taxus là khác nhau, thậm
chí khả năng này còn khác nhau giữa các cây trong cùng một loài [9, 22, 35]. Do
đó, việc chọn được đúng dòng mẹ ban đầu có khả năng sinh taxol cao dùng để nhân
giống làm nguồn nguyên liệu cung cấp taxol cho ngành dược phẩm là việc làm tối
cần thiết. Quần thể với tính đa dạng di truyền cao sẽ cung cấp nhiều lựa chọn hơn
cho nhà nhân giống trong việc lựa chọn dòng mẹ ban đầu. Ngoài ra, việc xác định
-14-
Tổng quan
được marker di truyền đối với những dòng có khả năng sinh taxol cao cũng giúp
cho việc xác định đúng nguồn dược liệu mong muốn.

1.4 Marker phân tử trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Marker di truyền đóng góp vào lĩnh vực nghiên cứu sự đa dạng quần thể thực vật
bằng cách cung cấp các kỹ thuật để phát hiện những biến đổi di truyền giữa các cá
thể, quần thể và loài. Trước đây, khi sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền chưa
phát triển, thì marker hình thái thường được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng này.
Tuy nhiên, các marker này có nhiều điểm hạn chế như: 1) các biến đổi hình thái
không phát hiện được ở một số loài; 2) các nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình thái
nói chung thường giới hạn trong một locus; 3) nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể
quan sát được vào cuối chu kỳ sống; 4) nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà
liên tục và chồng lấp giữa các loài gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa
dạng di truyền của quần thể.
Trong những năm gần đây, khi sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền phát triển
mạnh mẽ, thì nhiều marker di truyền dựa trên DNA cũng được phát triển và mở ra
một kỷ nguyên mới cho ngành sinh học quần thể và bảo tồn. Các marker này giúp
chúng ta hiểu và từ đó có biện pháp quản lý và sử dụng sự đa dạng của quần thể một
cách tốt hơn.
Các kỹ thuật như sequencing, MHC (major histocompatibility complex),
minisatellite, microsatellite, RFLP (restriction fragment length polymorphisms) và
một số kỹ thuật mới đây dựa vào PCR như RAPD (random amplified polymorphic
DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphisms), ISSR (intersimple
sequence repeat polymorphisms) giúp phân tích tinh vi hơn cấu trúc di truyền của
quần thể và các sự kiện khác trong quá trình sinh học tiến hóa của chúng. Sự phát
triển mạnh mẽ cùng với số lượng nhiều các kỹ thuật phân tử trên đã giúp chúng ta
giải quyết được nhiều vấn đề liên quan đến sự di truyền cũng như bảo tồn các quần
thể thực vật. Các kỹ thuật này cho phép khảo sát để thu lượng lớn dữ liệu về sự biến
-15-
Tổng quan
đổi trong quần thể và loài nghiên cứu. Marker phân tử đầu tiên được phát triển là
RFLP (1980), tiếp đến là RAPD (1990).
1.4.1 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) marker [57, 66]

RAPD ra đời vào năm 1990 do nhóm nghiên cứu của William và cộng sự. Theo
William, từ RAPD là từ viết tắt của “Random amplified polymorphic DNA” và
được phát âm là “rapid” (ra – bít), nghĩa là “đa hình DNA khuyếch đại ngẫu nhiên”.
Một kỹ thuật tương tự cũng được phát triển đồng thời với kỹ thuật này là AP-PCR
(abitrarily primed polymerase chain reaction) do nhóm nghiên cứu độc lập của
Welsh và McClelland.
RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, sử dụng những mồi ngẫu nhiên, ngắn (khoảng 9-10
nucleotide) nhằm nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA tạo ra sự đa hình. Theo
nguyên tắc, khi có đột biến làm thay đổi, mất đi hay thêm vào một hoặc một vài
nucleotide ngay tại hoặc giữa các vị trí gắn mồi sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các
đoạn khuyếch đại khác nhau. Theo nguyên tắc này, DNA của những cá thể khác
nhau với những khác nhau về chủng loại cũng như trật tự sắp xếp các nucleotide
hoặc những cá thể khác nhau do mang những đột biến khác nhau trong quá trình
tiến hóa… thì khi được khuyếch đại với cùng điều kiện, sử dụng các mồi ngẫu
nhiên ngắn, sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn khuyếch đại khác nhau, và do
đó tạo ra sự đa hình.
Hầu hết các mồi sử dụng trong kỹ thuật RAPD đều được thiết kế giàu G-C (trên
40%) và không chứa trình tự palindrom. Do sử dụng các mồi ngắn nên nhiệt độ bắt
cặp của phản ứng thường dưới 40
o
C. Sự bắt cặp mồi trong phản ứng RAPD về cơ
bản là bắt cặp bổ sung một cách hoàn toàn. Đoạn khuyếch đại thường có chiều dài
trong khoảng 200 – 2000 bp.
RAPD là marker di truyền trội, dựa trên kỹ thuật PCR nhưng không cần biết trước
trình tự của DNA bản mẫu, do đó được xem là một marker di truyền đơn giản và
kinh tế trong việc lập bản đồ gen, hay trong các ứng dụng của ngành lai tạo giống,
-16-
Tổng quan
trong việc xác định dấu vân tay DNA và đặc biệt là rất hữu dụng trong ngành di
truyền học quần thể.

Mười chín năm sau khi được phát minh (1990 – 2009), RAPD đã được sử dụng
trong hàng ngàn nghiên cứu về đa dạng di truyền của rất nhiều loài trên thế giới.
Riêng đối với thực vật, tại Việt Nam, RAPD đã được sử dụng vào nghiên cứu đa
dạng di truyền ở loài Lim xanh [18], Dứa cayen [12], Cà chua [20], Gõ đỏ [7], Lan
kiếm [3], Tràm [21] Riêng với thông đỏ, RAPD đã được dùng trong nghiên cứu
về chi Taxus để nhận định loài có nhiều taxane của Taxus chinensis var. mairei [24],
để ước lượng liên hệ cây sinh loài của Taxaceae [62], để khảo sát sự đa dạng di
truyền trong quần thể Taxus canadensis [53], Taxus cuspidata var. Nana [43],
Taxus wallichiana Zucc. vùng đông bắc Ấn Độ [56] và Taxus wallichiana Zucc.
khu vực Hi mã lạp sơn [45].
1.4.2 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker
RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn. RFLP
biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng
các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong
các bào quan khác.
RFLP là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Nguyên tắc của kỹ thuật
này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn (RE) đối với vị trí nhận biết
của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới
hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA
(được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt
giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.
RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và
dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra
nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp,
nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA
yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này.
-17-
Tổng quan
Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp
mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó

đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di và phân tích trên gel
nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. RFLP-PCR bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ
hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP.
Tại Việt Nam, trên cây rừng, RFLP-PCR vùng DNA lục lạp được dùng để khảo sát
mối quan hệ di truyền của một số loài thuộc chi Dipterocarpaceae - cây họ Dầu
[6,14], phân tích đa dạng di truyền loài Sao lá hình tim [8], phân tích mối quan hệ di
truyền của xuất xứ Lim xanh [18].
1.4.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) marker
AFLP được định nghĩa là đa dạng chiều dài các đoạn DNA được nhân bản chọn lọc,
là phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR. Ở đây sản phẩm PCR là kết quả của quá
trình nhân bội các đoạn DNA sau khi đã được cắt bằng enzyme giới hạn. Nguyên lý
của kỹ thuật này như sau: trước khi làm phản ứng PCR người ta gắn các đoạn DNA
ngắn (adaptor) vào hai đầu của mảnh DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn sau
đó thiết kế các primer theo các đoạn DNA ngắn có gắn thêm một hoặc một số
nucleotide và tiến hành phản ứng PCR. Khi thay đổi số lượng và trật tự các
oligonucleotid được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn DNA
được nhân bản khác nhau. Sản phẩm được phân tích trên gel polyacrymide, kết quả
thu được thường là 50 - 100 băng DNA trên mẫu thí nghiệm.
Kỹ thuật AFLP là phương pháp xác định đa hình cao, tiết kiệm thời gian, dễ dàng
lập lại và có thể sử dụng để phân tích DNA ở bất kỳ mức độ nào do đó được đánh
giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng di truyền ở cây
trồng như lúa, lạc. Tuy nhiên, AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành đắt nên
phần nào hạn chế sử dụng.
1.4.4 SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeat) marker
Marker microsatellite bao gồm một chuỗi mã gốc (core sequence) được lập lại
nhiều lần, và phân tán rộng khắp trong genome, trên nhiều loci, mỗi locus chứa alen
-18-
Tổng quan
thích ứng với mỗi dạng khác nhau về số lần lập lại của nó (core repeat), và nó rất
nhạy cảm. Được gọi với thuật ngữ chuỗi mã đơn giản lập lại nhiều lần (Simple

sequence repeats= SSR) chiều dài thường 1 – 100 bp. Do đó SSR có thể khuếch đại
trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với phát triển của primer theo miền của 2
bên trên một locus. Kết quả dựa vào độ dài và số lượng của các đoạn lập lại DNA
khác nhau giữa các động vật, thực vật và vi sinh vật để xác định được mức độ đa
dạng di truyền của các mẫu so sánh.
Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội (codominant) có khả năng phát hiện đa hình rất cao
và có khả năng tự động hoá trong quá trình thực nghiệm. Tuy nhược điểm của chỉ
thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một
loài. Nhưng marker SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các
vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền.