Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (lindera myrrha)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ VÀ
ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP HẮC TỐ
Ở LOÀI Ô DƯỢC (Lindera myrrha)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG
ThS. LÊ QUỲNH LOAN
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100730

: VÕ THỊ THUẬN
Lớp: 13DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan đề tài này là công trình nghiên cứu của
riêng người thực hiện đề tài dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoàng

Dũng và Ths. Lê Quỳnh Loan. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực. Mọi
tài liệu tham khảo dùng trong đề tài này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên
công trình, thời gian, địa điểm công bố.
Tất cả nội dung, sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung
thực, người thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
TP. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Võ Thị Thuận

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Công
Nghệ TP.HCM, Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ sinh học cùng thầy, cô bộ môn
Công nghệ sinh học trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã tận tình truyền đạt
những kiến thức quý báu và kĩ năng để em hoàn thành tốt quá trình học tập, hoàn
thành khóa luận này và làm nền tảng chuẩn bị cho công việc sau này.
Trong suốt khoảng thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Vi sinh - Viện
Sinh học Nhiệt đới. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến:
TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt
Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo cho em được làm đề tài
tại đây.
TS. Nguyễn Hoàng Dũng đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chi tiết công việc,
luôn theo sát chỉ dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt quá trình làm khóa luận.
ThS. Lê Quỳnh Loan đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt
thời gian làm đề tài tốt nghiệp. Thầy Ngô Đức Duy đã tạo điều kiện, hỗ trợ em làm

đề tài tốt nghiệp.
Em xin chân thàh cám ơn cô Nguyễn Hoài Hương, phòng Vi sinh, khoa Công
Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM
đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài.
Cám ơn tập thể lớp 13DSH02 đã cùng em trao đổi, cùng nhau học tập trong
suốt bốn năm tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, cám ơn tập thể phòng Vi
sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới đã động viên và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, con gửi lời cám ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi dạy con,
cám ơn anh chị trong gia đình luôn bên cạnh động viên em trong suốt quá trình học
tập và trưởng thành.

ii


Đồ án tốt nghiệp

Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề
tài này em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến
đóng góp từ phía quý Thầy Cô.
Tp. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm
2017
Sinh viên thực hiện

Võ Thị Thuận

iii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ..................................................................... ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
1.

Đặt

vấn

đề…………………………………………………………………1
2.

Tình

hình

nghiên

cứu……………………………………………………...2
3.

đích

Mục

nghiên

cứu……………………………………………………...3
4.

Nhiệm

vụ

nghiên

cứu……………………………………………………...3
5.

Phương

pháp

nghiên

quả

đạt

cứu………………………………………………….4
6.

Kết

được…………………………………………………………..4
7.

Ý

nghĩa

khoa

học

và

thực

tiễn

của

đề

tài………………………………….5
8.

Kết

Đồ

cấu

án

tốt

nghiệp……………………………………………….....5
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................6
1.1.

Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae)............................6

iv


Đồ án tốt nghiệp

1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae) ...........................................................6
1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học .................................................8
1.2.

Tổng quan về cây ô dƣợc ..................................................................9

1.2.1. Phân loại khoa học ..........................................................................9
1.2.2. Đặc điểm thực vật .........................................................................10
1.2.3. Thành phần hoá học ......................................................................12
1.2.4. Công dụng theo y học dân gian .....................................................12
1.3.

Tổng quan về quá trình tổng hợp sắc tố da ..................................12

1.3.1. Ảnh hưởng của tia cực tím (UV) trên người .................................12

1.3.2. Melanin .........................................................................................14
1.3.3. Vai trò của melanin .......................................................................15
1.3.4. Phân loại melanin ..........................................................................16
1.3.5. Con đường tổng hợp hoá học melanin ..........................................17
1.3.6. Các lại bênh liên quan đến sắc tố ..................................................19
1.3.7. Một số hoạt chất ức chế quá trình tổng hợp melanin ....................22
1.4.

Tổng quan về chiết xuất dƣợc liệu .................................................27

1.4.1. Chiết xuất dược liệu ......................................................................27
1.4.2. Phương pháp chiết xuất .................................................................29
1.4.3. Phương pháp Soxhlet ....................................................................31
1.5.

Hoạt tính kháng oxy hoá ................................................................31

1.5.1. Khái niệm về gốc tự do .................................................................31
1.5.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá .......................33
1.6.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ..................................................37

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............39
2.1.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................39

2.2.

Vật liệu nghiên cứu .........................................................................39

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................39
2.2.2. Dụng cụ - Thiết bị .........................................................................39
2.2.3. Hoá chất ........................................................................................39

v


Đồ án tốt nghiệp

2.3.

Quy trình thực hiện .........................................................................40

2.4.

Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................41

2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu .....................................................41
2.4.2. Quy trình chiết và thu nhận cao chiết ...........................................41
2.4.3. Phương pháp xác định thành phần hoá học ..................................43
2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay) .........47
2.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) .......................................49
2.4.6. Phương pháp xác định độc tính .....................................................49
2.4.7. Phương pháp xác định hàm lượng melanin ..................................49
2.4.8. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ............................50
2.4.9. Xử lý số liệu ..................................................................................51
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................52
3.1.

Kết quả thu nhận cao tổng methanol ô dƣợc................................52

3.2.

Định tính thành phần cao tổng methanol ô dƣợc.........................53

3.3.

Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao tổng methanol ô

dƣợc …………………………………………………………………………..54
3.4.

Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên độc tính của tế bào u sắc tố

B16F10………………………………………………………………………... 56
3.5.

Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên quá trình tổng hợp melanin ..57

3.6.

Kết quả chiết và thu nhận cao phân đoạn ....................................58

3.7.

Kết quả định tính thành phần hoá học cao phân đoạn ...............59

3.8.

Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết phân đoạn ...............61

3.9.

Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế

melanin của tế bào u sắc tố B16F10 ................................................................63
3.10. Kết quả xác định thành phần hoá học bằng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................................................................64
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................67
4.1.

Kết luận ............................................................................................67

4.2.

Đề nghị..............................................................................................68
vi


Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid
DHI

5,6-dihydroxyindole

DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid
DMSO Dimethyl sulfoxide
DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine
DPPH

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

HPLC

High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

IC50

Half maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ của một chất mà tại đó

nó
có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme)
MTT

3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide

PIH

Post-inflammatory hyperpigmentation

TRP-1

DHICA oxidation

TRP-2

DOPA chrome tautomerase

vii


Đồ án tốt nghiệp

UV

Ultraviolet (Tia cực tím).

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Dung môi khác nhau dung trong chiết xuất các nhóm hoạt chất trong
dược liệu. ...................................................................................................................28
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao tổng methanol ô dược
...................................................................................................................................53
Bảng 3.2. Kết quả xác định thành phần hoá học các mẫu cao phân đoạn ô dược ...59

viii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera ....................................................8
Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi Lindera ........8
Hình 1.3. Một số hợp chất alkaloids được xác định trong chi Lindera .....................9
Hình 1.4. Cây ô dược...............................................................................................11

Hình 1.5. Cấu trúc phân tử melanin (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) .......................14
Hình 1.6. Cấu tạo của da .........................................................................................14
Hình 1.7. Công thức hoá học của các loại melanin. ................................................17
Hình 1.8. Hai nhóm chính của melanin. ..................................................................17
Hình 1.9. Sơ đồ các con đường tổng hợp melanin ..................................................18
Hình 1.10. Các bệnh da tăng sắc tố. ........................................................................20
Hình 1.11. Các bệnh giảm sắc tố. ............................................................................21
Hình 1.12. Hydroquinone ........................................................................................23
Hình 1.13. Niacinamide (Vitamin B3) ....................................................................23
Hình 1.14. Arbutin (4-Hydroxyphenyl-α-D-glucopyranoside) ...............................24
Hình 1.15. Azelaic acid ...........................................................................................25
Hình 1.16. Kojic acid...............................................................................................26
Hình 1.17. Vitamin C ..............................................................................................26
Hình 1.18. Một số hợp chất ức chế quá trình tổng hợp melanin .............................27

ix


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.19. Bình ngấm kiệt ......................................................................................30
Hình 1.20. Dụng cụ chiết Soxhlet ...........................................................................31
Hình 1.21. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) ................................................34
Hình 1.22. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do)....35
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình và phương pháp thực hiện .............................................41
Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu ...............................................................................41
Hình 2.3. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do)......47
Hình 2.4. Sơ đồ điều kiện chạy sắc ký HPLC. ........................................................51
Hình 3.1. Mẫu ô dược ..............................................................................................52
Hình 3.2. Mẫu được chiết ngâm dầm với dung môi Methanol và mẫu cao thu được.

...................................................................................................................................53
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện khả năng kháng oxy hóa của ..........................................55
Hình 3.4. Tác dụng của cao methanol ô dược lên độc tính tế bào. .........................56
Hình 3.6. Tác dụng của cao methanol ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. .....57
Hình 3.5. Tế bào B16F10 melanoma thu nhận sau khi xử lý với cao methanol ô
dược ...........................................................................................................................57
Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện hiệu suất thu hồi (%) của các cao phân đoạn ô dược ...59
Hình 3.8. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxi hóa của các cao dịch chiết. .............61
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 của các phân đoạn cao ô dược ....................62
Hình 3.10. Tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào
u sắc tố B16F10 .........................................................................................................63
Hình 3.12. Phổ HPLC dịch cao chiết phân đoạn ethyl acetate ô dược....................65
Hình 3.11. Phổ HPLC dịch cao chiết methanol ô dược ..........................................65

x


Đồ án tốt nghiệp

xi


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Melanin là một hợp chất phenolic sinh học cao phân tử có vai trò quan trọng
trong việc tạo nên sắc tố da ở người. Các hắc tố (melanin) trong da được sản xuất
bởi tế bào hắc tố nằm trong lớp nền của biểu mô. Trong tế bào hắc tố, melanin được
tổng hợp trong một bào quan đặc biệt gọi là melanosome. Melanosome chứa nhiều

enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp melanin. Tuy nhiên, việc gia tăng lượng
melanin tổng hợp ở biểu mô sẽ gây ra hiện tượng đen da hoặc một số bệnh về da
như: nám da, tàn nhang và tăng sắc tố sau viêm do melanin được tích luỹ vượt mức
ở biểu mô. Những biểu hiện bên ngoài của những bệnh này có thể có tác động mạnh
đến tâm lý người bệnh cũng như làm giảm các hoạt động xã hội, hiệu quả trong
công việc hay tự kỷ. Do đó, có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành và rất nhiều
hoạt chất làm trắng da đang được sàng lọc. Tuy nhiên, tại nhiều quốc gia, các chất
làm trắng da như hydroquinone, corticosteroids, các hợp chất chứa thủy ngân vẫn
còn được sử dụng bất chấp tác dụng nguy hại của chúng. Một số chất khác như
arbutin, kojic acid, vitamin C cũng đươc sử dụng nhưng những chất này có nhược
điểm là hiệu quả không cao hoặc không bền.
Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những
hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương Đông mà
các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Nhiều hợp chất thứ
cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích
chữa bệnh và làm đẹp. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự
nhiên có hoạt tính sinh học tốt từ các loài thực vật làm mỹ phẩm đang ngày càng
thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là những
hợp chất có thể ức chế quá trình tổng hợp melanin nhưng không gây chết cho tế bào
và có nguồn gốc thiên nhiên độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể
hơn so với các dược phẩm tổng hợp.

1


Đồ án tốt nghiệp

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ
thực vật đa dạng và phong phú. Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ
lợi ích” của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN) thì nước ta có khoảng

gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng
làm thuốc. Trước kia, các cây thuốc dân gian đóng vai trò quan trọng trong việc
chữa bệnh cho con người. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
được phân lập từ thực vật đã được nghiên cứu và ứng dụng trực tiếp làm các chất
dẫn đường cho một loạt các hợp chất ứng dụng mới trong các ngành công nghiệp
như chữa bệnh, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm v.v… Do đó, việc tiếp tục nghiên
cứu tính chất và tác dụng của các hợp chất thiên nhiên vẫn đang là nhiệm vụ của rất
nhiều nha khoa học.
Trong thế giới thực vật muôn màu, đa dạng, cây ô dược (Lindera myrrha
Merr) là một loài thuộc chi Lindera, họ Long não (Lauraceae) được sử dụng để trị
bệnh một số bệnh trong y học cổ truyền như: đau bụng, nôn mửa, trị tiểu nhiều lần
hoặc đái dầm, trị chứng rối loạn tiêu hóa ăn không tiêu, và một số bệnh khác. Các
nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra sự có mặt của các lớp chất
alkaloid, tinh dầu…Nhiều hoạt chất trong số đó đã thể hiện nhiều hoạt tính sinh học
tốt như: Borneol, Linderane, Linderalactone. Tuy nhiên, khả năng kháng oxy hoá và
ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của ô dược chưa được nghiên cứu chuyên sâu. Do
vậy, đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc
tố từ loài ô dƣợc (Lindera myrrha Merr)” được thực hiện để tiến hành kiểm tra
khả năng ức chế quá trình tổng hợp melanin từ ô dược.
2. Tình hình nghiên cứu
 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Cho đến nay, những nghiên cứu về loài ô dược vẫn chưa được công bố nhiều.
Tuy nhiên, những nghiên cứu về những loài thuộc chi Lindera đã được công bố.
Năm 1925, lần đầu tiên Kondo và cộng sự đã xác định được hợp chất lindeneol
từ loài L. strychnifolia. Sau đó, năm 1964, takeda và cộng sự đã xác định được hơn
100 chất tương tự, những hợp chất này chủ yếu được phân lập từ L. strychnifolia, L.

2

Đồ án tốt nghiệp

chunii và L. aggregate. Trong đó có một số hợp chất có tính chống ung thư, chống
viêm và kháng vi – rút.
Năm 2011, Kim và cộng sự đa tìm ra các hợp chất flavonoids (có dạng một
phân tử flavone kết hợp với một hoặc hai nhóm p-methene) có tác dụng gây độc tế
bào và ức chế sự phóng thích LDH từ các tế bào thần kinh H9c2.
Chiết xuất L. aggregata thường được chỉ định để điều trị các bệnh về hệ tiết
niệu như đái tháo đường và đá tiểu và có tác dụng rõ rệt đến viêm dạ dày mãn tính
và viêm khớp mãn tính đã được Zang và Wang công bố năm 2000.
Năm 2002, Lee và cộng sự đã công bố hợp chất lucitone có độc tính tế bào với
các dòng tế bào ung thư B16 – F10, HT1080 và K562 với giá trị ED50 lần lượt là 2,2;
2,5 và 8,3 lg/ml.
 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Trong tài liệu những cây thuốc và vị thuốc ở Việt Nam, theo Đỗ Tất Lợi, loài ô
dược ở Việt Nam được sử dụng như một vị thuốc nam có rất nhiều công dụng chữa
bệnh như: trị đau bụng, chứng rối loạn tiêu hoá (ăn không tiêu, ợ hơi, ợ chua, buồn
nôn…), tiểu nhiều lần hoặc đái dầm.
Mặc dù loài ô dược đã được sử dụng trong y học cổ truyền, nhưng hiện nay ở
Việt Nam chưa có hoạt tính ức chế hắc tố nào về loài này. Việc nghiên cứu thành
phần hóa học và các hoạt tính sinh học sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần
hóa học cũng như các kinh nghiệm sử dụng dược liệu này trong dân gian và đặc thù
loài tại Việt Nam để định hướng cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.
3. Mục đích nghiên cứu
-

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ô dược.

-

Khảo sát khả năng ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết ô dược.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu
4.1. Giai đoạn 1
-

Tiến hành chiết, cô quay chân không và thu cao methanol.

-

Định tính thành phần hoá học từ cao methanol.

-

Thử hoạt tính kháng oxy hóa từ cao methanol thu được.

3


Đồ án tốt nghiệp

-

Khảo sát tác dụng của ô dược lên quá trình tổng hợp melanin.

-

Khảo sát tác dụng của ô dược lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10.

4.2. Giai đoạn 2

-

Từ cao tổng methanol, tiến hành chiết phân đoạn với các dung môi có độ
phân cực khác nhau (hexan, chloroform, ethyl acetate), cô quay chân không
và thu cao chiết.

-

Khảo sát tác dụng của các cao phân đoạn lên hoạt tính kháng oxy hóa của
các phân đoạn.

-

Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao chiết ô dược lên quá trình tổng hợp
melanin.

-

Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao chiết ô dược lên độc tính của tế bào u
sắc tố B16F10

4.3. Giai đoạn 3
Xác định thành phần hoá học cao ô dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao HPLC.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Nghiên cứu lý thuyết
-

Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, phương pháp
nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, thành phần hóa học và ứng dụng của loài ô

dược.

- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định thành phần
hóa học các chất từ thực vật.
- Tổng hợp tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học và ứng
dụng của loài ô dược.
 Nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp lấy và xử lí mẫu.
-

Phương pháp tách chiết các hợp chất hữu cơ bằng dung môi: phương pháp
chiết rắn – lỏng, chiết lỏng – lỏng.

4


Đồ án tốt nghiệp

-

Phương pháp xác định thành phần hoá: định tính và sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC).

-

Phương pháp sinh học thăm dò hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình
tổng hợp hắc tố của cao chiết.

-

Phương pháp xác định độc tính của cao chiết lên tế bào.

 Sử dụng phần mềm Sigma Plot version 10.0 và phần mềm Microsoft Excel
2010 để xử lý số liệu.
6. Các kết quả đạt đƣợc
Chiết mẫu ô dược với dung môi, hiệu suất thu hồi 12,46%. Từ cao tổng
methanol, chiết phân đoạn với bốn loại dung môi, hiệu suất thu hồi của phân đoạn
cao hexan là 3,42%, chloroform 10,57% và ethyl acetate 23,45%, nước 43,02%.
Định tính thành phần hoá học, kết quả cho thấy các mẫu cao đều chứa nhiều
hợp chất hoá học như: alkaloid, carbohydrate, flavonoid, chất béo, protein.
Cao methanol từ cây ô dược cho hiệu quả ức chế quá trình tổng hợp melanin
và không gây độc cho tế bào ở nồng độ 200 g/ml. Cao methanol có khả năng bắt
gốc tự do cao với IC50 = 58,89 g/ml.
Phân đoạn Ethyl acetate có khả năng bắt gốc tự do cao nhất trong các phân
đoạn với IC50 = 10,71 g/ml. Cho hiệu quả ức chế tổng hợp melanin và không gây
độc với tế bào ở nồng độ 200 g/ml.
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Những kết quả nghiên cứu sẽ góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa
học về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao ô dược, qua đó góp phần
nâng cao giá trị ứng dụng của cây ô dược trong ngành dược liệu.
8. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp
Kết cấu của đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương:
-

Chương 1: Tổng quan tài liệu

-

Chương 2: Vật liệu và phương pháo nghiên cứu

-

Chương 3: Kết quả và thảo luận

-

Chương 4: Kết luận và đề nghị.

5


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae)
1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae)
Chi Lindera thuộc họ Long não (Laraceae) hay còn gọi là Nguyệt quế, gồm
khoảng 100 loài, phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn
thế giới, đặc biệt là các nước Đông Nam Á và Brazil. Chúng chủ yếu là các loại
thân gỗ hay cây bụi có hương thơm (Võ Văn Chi, 1997). Cây gỗ có cành non màu
xanh, vỏ có mùi thơm, thường có chồi ngủ đông. Lá thường mọc cụm đầu cành, có
ba gân chính hay hệ gân đơn giản. Hoa mẫu ba, thường có nhị lép và tuyến mật ở
gốc chỉ nhị. Quả thường có đài dính liền, phát triển thành dạng đấu dưới quả (Phạm
Hoàng Hộ, 1991) (Hình 1.1).
Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” của Tổ chức Bảo
tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), Lindera không chỉ mang giá trị kinh tế cao mà
bên cạnh đó nó còn mang tính dược lý và sinh học như khả năng chống ung thư, cao
huyết áp, kháng viêm và được dùng làm thuốc giảm đau. Các nghiên cứu đã tìm ra
được khoảng 341 thành phần có trong cây bao gồm sesquiterpenoids, alkaloids,
butanolides, lucidones, flavonoids và phenylpropanoids. Butanolides và lucidones

quyết định khả năng chống ung thư, trong khi aporphine alkaloids lại quyết định
khả năng kháng viêm và giảm đau. Tuy vậy, những hợp chất này cần được đánh giá
thêm, thông qua các nghiên cứu chuyên sâu.
Cây thuộc họ Lauraceae mang giá trị kinh tế cao vì một số loài của chúng
được ứng dụng rộng rãi làm nguồn gia vị, dầu thơm và đặc biệt là dược liệu. Hơn
nữa, chúng còn đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái vì là loài cây chiếm ưu
thế trong các khu rừng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Gentry, 1988; Van der
Werff và Richter, 1996). Lindera, một chi chính trong họ Lauraceae, phân bố rất
rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ở Châu Á và Trung Tây Mỹ, bao
gồm khoảng 100 loài (Flora Republicae Popularis Sinicae, 1982).

6


Đồ án tốt nghiệp

Hầu hết các loài trong chi Lindera chứa một lượng dầu rất lớn, ứng dụng tốt
trong việc sản xuất xà phòng, chất bôi trơn và dùng để tách chiết acid lauric. Nhiều
loài khác thì được dùng trong việc sản xuất gia vị, nước hoa và vật liệu xây dựng.
Đáng nói nhất đó là tính dược liệu của chi. Những chiết xuất từ củ, thân, lá, rễ…có
công dụng ấm thận, giảm đau, chán nản (17 công thức trong “Dược điển Trung
Quốc”); điều trị các bệnh tiết niệu như đái dầm, sỏi thận và dùng để chữa trị viêm
khớp, viêm dạ dày mãn tính. Ngoài ra, lá của một số loài thuộc chi Lindera như L.
aggregate còn điều trị viêm vú, viêm tế bào da, mụn nhọt (Han và cộng sự, 2008).
Lá tươi xào với rượu gạo có thể điều trị bệnh thấp khớp. Chiết xuất của L.
aggregate tại Nhật Bản được dùng để điều trị bệnh đột quỵ và bệnh tả (Chou và
cộng sự, 2000).
Vỏ cây của loài L. obtusiloba dùng làm tan máu bầm, thông cổ. Rễ của L.
glauca điều trị mệt mỏi, viêm khớp (Zang và Wang, 2000). Rễ, vỏ cây và cành của
L. umbellata chữa loét dạ dày, đau bụng, bệnh tả, tê phù, chống co thắt (Tanaka và

cộng sự, 1985).

Lindera glauca

Lindera aggregate

Lindera myrhaa

Lindera obtusiloba

7


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera
1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học
Trong tổng thể, 341 chất chuyển hóa thứ cấp đã được cô lập và xác định từ chi
Lindera cho đến nay. Những thành phần chủ yếu gồm có bảy loại: sesquiterpenoids,
alkaloids, butanolides, lucidones, flavonoids, phenylpropanoids và các loại khác.
Trong đó, sesquiterpenoids và alkaloids là thành phần chiếm ưu thế (Hình 1.2, hình
1.3).
1.1.2.1. Sesquiterpenoids
Năm 1925, Kondo và cộng sự lần đầu tiên đã xác định được hợp chất lindeneol
từ loài L. strychnifolia. Năm 1964, Takeda và cộng sự đã xác định được hơn 100
chất tương tự. Nhìn chung, những hợp chất này được phân lập từ L. strychnifolia, L.
chunii, và L. aggregata. Một số hợp chất có đặc tính kháng ung thư, kháng viêm và

R1: OH

R1: OH

Lindeneol

Lindestrene

R2: H

R: H

R2: H
Linderene

Linderalactone

Lindenenone

1,4-Dimethyl-7-

Linderazulene

ethylazulene

Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi
Lindera
kháng vi-rút.

8

Đồ án tốt nghiệp

1.1.2.2. Alkaloids
Alkaloids là một trong những chất chuyển hoá thứ cấp phổ biến nhất và là
thành phần quan trọng trong chi Lindera. Đa số các hợp chất alkaloids có tác dụng
giảm huyết áp, chống viêm và giảm đau đáng kể.
Năm 2000, Chang và cộng sự đã xác định được những hợp chất alkaloids từ 10
loài Lindera như: aporphines, benzylinocinolines, isopavines, proaporphine.

R1: H
R2: OCH2O
R3: OCH2O
R4: H

R1: H
R2, R3: -CH2R4, R5: -CH2R6: H
Hernandonine

Lindechunine B

R1: H
R2: H
N-p-Coumaroyltyramine

Squamolone

R: H
Hernovine

Northalifoline

Hình 1.3. Một số hợp chất alkaloids được xác định trong chi Lindera
1.2. Tổng quan về cây ô dƣợc
1.2.1. Phân loại khoa học
Giới: Thực vật (Plantae)

9


Đồ án tốt nghiệp

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ: Long Não (Laurales)
Họ: Long não (Lauraceae)
Chi: Lindera
Loài: Lindera Myrrha Merr
Cây ô dược có tên khoa học là Lindera myrrha (Lour.) Merr. Ngoài ra còn
có các đồng danh khoa học là: Lindera myrrha (Lour.) Merr, Laurus myrrha Lour
(Hình 1.4).
Tại Việt Nam, cây ô dược còn được gọi là: thiên thai ô dược, bàng tỵ, bàng
kỳ, nuy chướng, nuy cước chướng, đài ma, phòng hoa, thai ô dược, thổ mộc hương,
tức ngư khương, kê cốt hương, bạch diệp sài, cây dầu đắng, ô dược nam (Lê Đình
Sáng, 2010).
1.2.2. Đặc điểm thực vật
Ô dược là một cây gỗ nhỏ:
Thân cao độ 1,3 - 1,4 m, cành non, gầy, màu đen nhạt, có long vàng hoe, khi
già trở nên nhẵn (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Lá mọc so le, hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 6 cm, rộng 2 cm, đầu lá thót
thành đuôi ngắn, gốc hơi tròn, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới có lông, có ba gân, hai

gân phụ bắt đầu từ điểm cách cuống lá 2 mm, dài ra chừng 2/3 lá, mặt trên lõm, mặt
dưới lồi lên. Cuống dài 7 - 10 mm, lúc đầu có lông, sau nhẵn, mặt trên hõm thành
rãnh (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Cụm hoa tán đơn tính, hợp thành tán nhỏ, mọc ở nách lá, không cuống,
đường kính 3 - 4 mm. Bao hoa 6 thùy, ở hoa đực, nhị hữu thụ 9, xếp 3 vòng, vòng
trong cùng mỗi nhị có 2 tuyến, nhị lép 3. Bầu gần hình cầu, có lông, vòi cong. Quả
mọng hình trứng khi chín có màu đỏ, một hạt (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Rễ ô dược đa số hình thoi, hơi cong, hai đầu hơi nhọn, phần giữa phình to
thành hình chuỗi dài khoảng 10 - 13 cm, đường kính ở chỗ phình to là 1 - 2 cm. Mặt
ngoài màu nâu vàng hoặc màu nâu nhạt vàng, có vết của rễ tơ đã rụng, có vằn nứt

10


Đồ án tốt nghiệp

ngang và nếp nhăn dọc. Cứng, khó bẻ gãy, mặt cắt ngang màu nâu nhạt, hơi hồng,
hơi có bột, ở giữa màu đậm hơn, có vằn tròn, và vằn hoa cúc. Mùi hơi thơm, vị hơi
đắng, cay (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Toàn cây có mùi thơm, vị đắng (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Mùa hoa nở rộ tháng 4, ở phía Nam mùa hoa sớm hơn. Cây tái sinh bằng hạt
(Lê Đình Sáng, 2010).

Hình 1.4. Cây ô dược

11


Đồ án tốt nghiệp

Ở Việt Nam, cây thường mọc hoang ở nhiều tỉnh toàn miền Bắc. Nhiều nhất
tại các tỉnh miền Trung như: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh. Tại Bắc Bộ, có ở Hòa
Bình, Hà Tây. Trên thế giới, cây mọc nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc (Đỗ Tất Lợi,
2000).
1.2.3. Thành phần hoá học
Trong ô dược, người ta xác định được các chất ankaloids như linderan
C8H10O2, linderen C8H14O2, rượu linderola C11H22O và axit linderic C15H18O3 và
este của rượu linderola. Ngoài ra, người ta còn xác định được một xeton với công
thức C15H18O2 và một chất linderazulen với công thức C14H16 (Đỗ Tất Lợi, 2000).
1.2.4. Công dụng theo y học dân gian
Trong y học cổ truyền, rễ cây ô dược được dùng làm dược liệu và được bào
chế bằng cách:
-

Hái thứ rễ bàng chung quanh có từng đốt nối liền nhau, bỏ vỏ, lấy lõi, sao
qua họăc mài (Lê Đình Sáng, 2010).

-

Đào rễ, cắt bỏ rễ con, rửa sạch, phơi khô. Nếu thái miếng thì rễ tươi lấy về,
cạo sạch vỏ ngoài (có khi không cạo) ngâm vào nước thỉnh thoảng thay nước
rồi thái thành từng miếng mỏng phơi khô (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Có tác dụng điều trị các triêu chứng như: trị đau bụng do trúng hàn khí trệ,

đau bụng kinh, tiểu nhiều lần hoặc đái dầm, chứng rối loạn tiêu hóa: ăn không tiêu
đầy bụng, ợ hơi, ợ chua, nôn, buồn nôn (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Ô dược có tác dụng hai mặt đối với cơ trơn bao tử và ruột, có tác dụng làm
tăng nhu động ruột, giúp ruột bài khí, đồng thời làm giảm trương lực của ruột thỏ cô
lập. Ô dược có thể làm tăng tiết dịch ruột (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Bột ô dược khô có tác dụng rút ngắn thời gian tái canxi hóa của huyết tương,

rút ngắn thời gian đông máu và có tác dụng cầm máu (Đỗ Tất Lợi, 2000).
1.3. Tổng quan về quá trình tổng hợp sắc tố da
1.3.1. Ảnh hưởng của tia cực tím (UV) trên người
Cuộc sống trên trái đất kể từ khi ra đời đã phụ thuộc vào một nguồn năng
lượng mặt trời. Trong quang hợp, sinh vật như vi khuẩn, tảo và các thực vật bậc cao

12


Đồ án tốt nghiệp

sử dụng chất diệp lục để thu năng lượng từ khu vực cụ thể của quang phổ của mặt
trời, cho phép nó được chuyển đổi thành năng lượng hóa học sử dụng trong các
hình thức của phân tử đường, với oxy phân tử như một sản phẩm phụ quan trọng.
Mặc dù chúng ta được hưởng rất nhiều tác dụng có lợi của năng lượng bức xạ mặt
trời, nhưng con người cũng rất nhạy cảm với những tác động có hại của một thành
phần của quang phổ: ánh sáng cực tím (Przemyslaw và Maja, 2006).
Tia cực tím hay tia tử ngoại, tia UV (Ultraviolet) là sóng điện từ có bước
sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài hơn tia X, có bước sóng từ 100 đến
400 nm. Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng từ 380 đến
200 nm) và tử ngoại xạ hay tử ngoại chân không (có bước sóng từ 200 đến 10 nm)
(Andrzej và John, 1988).
Khi quan tâm đến ảnh hưởng của tia cực tím lên sức khỏe con người và môi
trường, thì phổ của tia cực tím chia ra làm các phần: UVA (380 - 315 nm), hay gọi
là sóng dài hay "ánh sáng đen", UVB (315 - 280 nm) gọi là bước sóng trung bình và
UVC (ngắn hơn 280 nm) gọi là sóng ngắn hay có tính tiệt trùng. UV chân không
với bước sóng 100 - 200 nm và UVC (200 - 290 nm) có tác dụng gây đột biến và
gây chết người (Andrzej và John, 1988).


UVC: Do là vùng bức xạ có năng lượng cao nhất nên tia UVC có khả năng

gây tổn hại nhất cho đôi mắt và làn da. Tuy nhiên hiện nay do nhiều tác động, tầng
ozone bảo vệ trái đất đang ngày càng yếu (mỏng đi và có nhiều lỗ thủng) nên có khả
năng cho phép các bức xạ năng lượng cao UVC lọt xuống bề mặt trái đất, rất dễ gây
nên các vấn đề sức khỏe trầm trọng.


UVB: Các bức xạ UVB thì có thể đi xuyên qua tầng ozone (mặc dù cũng đã

được lọc một phần). Chúng chỉ chiếm khoảng 3% trong phổ tia UV do mặt trời
chiếu và đi xuống tới trái đất, và rất hiệu quả trong việc kích thích gây cháy nắng và
sắc tố của da người.


UVA: Đây là lượng bức xạ cực tím có nhiều nhất (chiếm tới 97%), do chúng

13