xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real time rt-pcr

1

PHẦN MỞ ĐẦU
Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN TÍNH KÍCH THÍCH
MIỄN DỊCH CỦA MỘT SỐ CHẤT BẰNG REAL-TIME RT-PCR
Chủ nhiệm đề tài: Trần Quốc Vũ
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng
Kinh phí được duyệt: 80 triệu
Kinh phí đã cấp: 80 triệu theo TB số : TB-SKHCN ngày / /
Mục tiêu: Xây dựng, hoàn chỉnh quy trình in vitro xác định khả năng tăng cường
miễn dịch của hợp chất tự nhiên.
Nội dung:
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Nội dung 1: Xây dựng và hoàn chỉnh
quy trình real-time RT-PCR đo sự thay
đổi biểu hiện mRNA của hai loại
cytokine IL-2 và TNF-α trong 2 dòng tế
bào.
Tối ưu hóa một số điều kiện phản ứng,
xây dựng và hoàn chỉnh được quy trình
real-time RT-PCR.
Nội dung 2: Áp dụng real-time RT-PCR
để phát hiện khả năng kích thích miễn
dịch của một số chất.
Kết quả về tác động của một số hợp
chất trên sự biểu hiện mRNA IL-2 và
TNF-α.

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
Hệ miễn dịch của con người có thể bảo vệ cơ thể chống lại tác hại do các vi
sinh vật xâm nhiễm gây ra. Hệ miễn dịch bao gồm miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch
đặc hiệu. Trong đó, các tế bào giết tự nhiên (NK-nature killer), hệ thống bổ thể, đại
thực bào, các tế bào trình diện kháng nguyên và bạch cầu trung tính tạo thành hệ
miễn dịch bẩm sinh, chúng đáp ứng ngay lập tức, không đặc hiệu với tác nhân gây
bệnh. Nếu tác nhân gây bệnh (như vi khuẩn, virus) vượt qua hàng rào đầu tiên này,
hệ miễn dịch đặc hiệu, bao gồm miễn dịch dịch thể và trung gian tế bào sẽ bắt đầu
hoạt động. Các kháng nguyên (nấm, virus, vi khuẩn, độc tố…) bị xử lý và được các
tế bào trình diện kháng nguyên trình diện với tế bào T hỗ trợ (T
H
có mang protein
bề mặt CD4), qua đó hoạt hóa sự tiết cytokine. Ngoài các cơ chế tự nhiên, có những
yếu tố bổ sung có khả năng kích thích và ức chế miễn dịch của cơ thể. Tính kích
thích miễn dịch sẽ nâng cao khả năng miễn dịch tổng thể của cơ thể và phản ứng
miễn dịch không đặc hiệu chống lại các tác nhân gây bệnh của vi sinh vật. Các tác
nhân kích thích miễn dịch cũng hoạt động để nâng cao đáp ứng miễn dịch dịch thể
và tế bào, bằng cách tăng cường tiết cytokine, hoặc bằng cách trực tiếp kích thích tế
bào lympho T và B.
Cytokine là các peptide và glycoprotein có nhiều tác động, có nhiều nguồn,
nhiều mục tiêu, và nhiều chức năng. Chúng điều khiển các đáp ứng miễn dịch thông
qua khả năng kích thích hoặc ức chế các hoạt động của tế bào thể hiện qua sự hoạt
hóa, tăng sinh, biệt hóa tế bào cũng như điều hòa sự tiết của các kháng thể hoặc các
cytokine khác. Trong đáp ứng miễn dịch, cytokine bám lên các thụ thể đặc hiệu trên
màng của tế bào đích và khởi sự các con đường truyền tín hiệu dẫn đến thay đổi sự
biểu hiện gene ở tế bào đích và các phân tử cytokine có thể tác động theo kiểu tự
tiết, cận tiết hoặc nội tiết. Vì vậy, cytokine rất quan trọng trong phản ứng viêm bẩm
sinh và thích ứng. Trong đó, các tế bào chính tiết cytokine là tế bào T
H
và đại thực

bào. Cytokine do tế bào T
H
tiết ra sẽ tác động trở lại làm biệt hóa các tế bào T
H

thành tế bào T
H1
và T
H2
. Hoạt động của tế bào T
H1
liên quan đến sự hoạt hóa các đại
3

thực bào, đồng thời cũng liên quan đến con đường miễn dịch qua trung gian tế bào;
trong khi các tế bào T
H2
lại có ảnh hưởng đến sự tạo và tiết kháng thể. Một loại tế
bào T khác là tế bào T gây độc (có mang protein CD8 trên bề mặt) lại cảm ứng
apoptosis ở các tế bào của cơ thể mang kháng nguyên lạ (Tan & cs, 2004;
Oppenheim, 2001) .
TNF-α là một trong các cytokine chính trong đáp ứng miễn dịch, do đại thực
bào hoặc tế bào T tạo ra khi đáp ứng viêm với vi khuẩn hay các tác nhân kích thích.
TNF-α hoạt động như một yếu tố dẫn dụ hóa học, lôi kéo đại thực bào hay các tế
bào bạch cầu đến vị trí viêm. Ngoài ra, TNF-α còn cho thấy có khả năng tăng
cường đáp ứng kháng ung thư. Trong khi đó, IL-2 được coi như là một yếu tố tăng
trưởng tế bào T, thúc đẩy sự tăng sinh, sự hoạt hóa và biệt hóa tế bào T, B. IL-2 có
thể kích thích tế bào NK và các tế bào gây viêm như tế bào mono/đại thực bào và
các tế bào trung tính. Bên cạnh đó, IL-2 còn có tác động lên sự sản xuất các
cytokine khác như IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α. Người ta chú ý đến ứng dụng lâm sàng

của IL-2 do khả năng hoạt hóa tế bào NK và tăng cường đáp ứng kháng tế bào ung
thư. Các liệu pháp dựa trên IL-2 đã được FDA cho phép tiến hành trong điều trị ung
thư thận suốt 2 thập niên qua (McDermott & cs, 2004)
Thảo dược đã được sử dụng để điều trị bệnh từ lâu đời. Hiện nay, người ta ước
tính rằng khoảng 50% các loại thuốc tổng hợp có nguồn gốc từ chất hóa học thực
vật. Các nghiên cứu khoa học gần đây đã chứng minh rằng nhiều loại thảo mộc có
khả năng giúp tăng cường hệ thống miễn dịch bằng cách kích thích các tế bào bạch
cầu và cũng như điều hòa biểu hiện các cytokine quan trọng trong hoạt động miễn
dịch của cơ thể (Tan & cs, 2004). Một số nghiên cứu tiêu biểu như: Melanin, được
chiết từ Nigella sativa L. cảm ứng sự biểu hiện của TNF-α, IL-6 và VEGF mRNA
của monocyte, tế bào đơn nhân ngoại vi, dòng tế bào THP-1; ở mức độ protein,
melanin cảm ứng sự tạo thành TNF- α, IL-6 (El-Obeida & cs, 2006). LZ-8, một
protein từ Ganoderma lucidum có khả năng kích thích các tế bào lympho ngoại vi
tạo IL-2, đồng thời làm tăng sự biểu hiện của thụ thể của IL-2 (Hsu & cs, 2008).
4

Các cycloartane phân lập từ Astragalus melanophrurius (Fabaceae) có hoạt tính
điều hòa miễn dịch trên các tế bào lympho người được phân lập. Các nhà nghiên
cứu nhận thấy rằng dùng astrasieversianins II, X; astragalosides I, II, IV, và VI;
cyclocanthosides E, G ở các nồng độ từ 0,01 đến 10 µg/mL có thể kích thích sự
tăng sinh của các tế bào lympho người. Trong khi đó oleanolic acid and
echinocystic acid phân lập từ Luffa cylindrica (Cucurbitaceae) làm tăng chỉ số thực
bào, kích thích đại thực bào, làm gia tăng đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch
qua trung gian tế bào (Ríos & cs, 2010).
Các nghiên cứu về sự biểu hiện cytokine khi bị cảm ứng bởi các tác nhân gây
kích thích rất đa dạng, với nhiều kỹ thuật được áp dụng cùng với các mô hình động
vật, tế bào. Sau đây là những phương pháp tiêu biểu:
+ Kỹ thuật phát hiện protein cytokine:
- Phương pháp ELISA: dùng để đo hàm lượng cytokine do các tế bào thuộc
hệ thống miễn dịch (tế bào lympho, đại thực bào…) tiết ra sau khi được cảm ứng

với các hợp chất. Trong phương pháp này, kháng thể kháng cytokine sơ cấp gắn
trên bề mặt giếng của đĩa 96 giếng sẽ bắt giữ những cytokine tương ứng hiện diện
trong mẫu (dịch nuôi cấy tế bào). Những kháng thể kháng cytokine thứ cấp đã được
đánh dấu biotin được bổ sung sau đó sẽ gắn vào những cytokine nói trên.
Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) gắn với biotin sẽ phân cắt cơ chất tạo
sản phẩm hiện màu hoặc phát huỳnh quang của HRP. Cường độ của những tín hiệu
này phản ánh khả năng cảm ứng tạo cytokine của chất thử nghiệm. Phương pháp
này còn cho phép đo được lượng cytokine có trong máu của người sử dụng thuốc.
- Phương pháp ELISPOT: cũng tương tự như ELISA, nhưng tế bào được
gây cảm ứng sẽ phát triển trong giếng đã gắn sẵn kháng thể sơ cấp kháng cytokine.
Cytokine do tế bào tiết ra đều được các kháng thể sơ cấp bắt giữ. Sau đó, những
kháng thể kháng cytokine thứ cấp đã được đánh dấu biotin được bổ sung sau đó sẽ
gắn vào những cytokine nói trên. Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) gắn
5

với biotin sẽ phân cắt cơ chất tạo những đốm màu. Số lượng đốm màu tạo thành sẽ
được quan sát và định lượng bằng kính hiển vi và phần mềm xử lý hình ảnh
(Christian & cs, 2008).
- Phương pháp flow cytometry: phát hiện ra sự thay đổi thành phần tế bào
trong quần thể tế bào miễn dịch cũng như hàm lượng cytokine do chúng tiết ra.
Trong kỹ thuật này, các tế bào được thu nhận từ máu toàn phần hay tế bào máu đơn
nhân ngoại vi sẽ được ủ với các kháng thể của các marker bề mặt đặc trưng cho
từng loại tế bào (CD3, CD14, CD15, CD69…). Sau đó, các tế bào trải qua xử lý sẽ
được đưa vào máy flow cytometry để phát hiện và phân tách thành các quần thể tế
bào khác nhau (Christian & cs, 2008).
+ Kỹ thuật phát hiện sự biển hiện gene cytokine:
- Phương pháp RT-PCR và real-time RT-PCR: đây là phương pháp phản
ánh mức độ biểu hiện của gene mã hóa cho cytokine ở mức phiên mã. Những năm
gần đây real-time RT-PCR ngày càng được sử dụng nhiều để định lượng mRNA
của cytokine mục tiêu. Điều này cho thấy tiềm năng của việc định lượng sự biểu

hiện mRNA nhằm xác định sự đáp ứng của các tế bào miễn dịch trong các thử
nghiệm về thuốc hay các hợp chất tự nhiên. Tuy nhiên, mức độ phiên mã không
phải lúc nào cũng phản ánh chính xác cytokine được tiết ra. Do đó, để đánh giá
chính xác ảnh hưởng của chất cảm ứng lên các tế bào miễn dịch cần có sự phối hợp
của các phương pháp trên (Christoph & cs, 2001; Prescilla, 2008; Stephan & cs,
2008).
Nguồn tế bào được sử dụng để thử nghiệm chất cảm ứng kích thích miễn
dịch là các tế bào thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể: tế bào mono, tế bào lympho
T, Phương pháp phổ biến để phân lập các tế bào này từ máu là sử dụng ly tâm
trên đệm Ficoll nhằm tách chúng khỏi hồng cầu, tiều cầu và huyết tương. Theo
nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau, các tế bào miễn dịch sẽ được tiếp tục xử lý
6

để thu nhận được các nhóm tế bào thuần nhất hơn, ví dụ chỉ sử dụng tế bào mono,
hoặc chỉ sử dụng quần thể tế bào lympho T (CD4, CD8) (Christian & cs, 2008).
Hiện nay, ngoài việc phân lập các tế bào miễn dịch từ máu cho các thí
nghiệm đo ảnh hưởng của các chất cảm ứng, việc sử dụng máu toàn phần (không
loại bỏ hồng cầu, huyết tương ) cũng được áp dụng rộng rãi. Ưu điểm của phương
pháp này là khi lượng mẫu máu nhỏ không đủ để tách bằng Ficoll; hạn chế các tế
bào miễn dịch bị biến đổi về mặt sinh lý do quá trình tách chiết và ảnh hưởng của
hóa chất; đồng thời việc sử dụng máu toàn phần nhằm tạo ra điều kiện tương tự với
điều kiện tự nhiên của cơ thể. Tuy nhiên, việc sử dụng các tế bào máu từ những
người tình nguyện đòi hỏi phải có sự quản lý chặt chẽ về hồ sơ sức khỏe cũng như
những biến động do khả năng đáp ứng khác nhau đối với chất thử nghiệm
(Christoph & cs, 2004; Prescilla, 2008; Stephan & cs, 2008).
Bên cạnh đó, một số dòng tế bào của người cũng được sử dụng cho các nghiên
cứu ảnh hưởng của thuốc hay các hợp chất tự nhiên lên khả năng biểu hiện và sản
xuất cytokine. Các dòng tế bào được sử dụng gồm có: dòng tế bào Jurkat (tế bào
lympho T) có khả năng biểu hiện và tiết cytokine IL-2 ; U937 (dòng tế bào mono)
có khả năng biểu hiện và tiết cytokine TNF-α, hay dòng THP1 (dòng tế bào

mono)… Việc sử dụng các dòng tế bào này đã được sử dụng trong các nghiên cứu
trên thế giới về cơ chế điều hòa miễn dịch, cơ chế điều hòa biểu hiện gene cytokine
thông qua NF-kB (El-Obeida & cs, 2006; Grzanna & cs, 2006; Hsu & cs, 2008).
Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến tăng cường hệ miễn dịch từ cây
thuốc đã được công bố trong thời gian gần đây. Một số công trình sử dụng mô hình
chuột được gây suy giảm miễn dịch bằng cách chiếu xạ, kết quả cho thấy một số
cao chiết từ thảo dược có tác dụng làm phục hồi đáng kể tổn thương các mô lympho,
tăng chức năng đại thực bào và tỷ lệ tế bào lách tạo quầng dung huyết, tăng chuyển
dạng tế bào lympho ở lách chuột. Ngoài ra, thử nghiệm in vitro cho thấy làm tăng
chuyển dạng tế bào lympho của máu ngoại vi người khỏe mạnh, tăng khả năng thực
bào, khả năng tiết nitric oxide của bạch cầu đa nhân trung tính người (Nguyễn Thị
7

Thư & cs, 2008). Có sản phẩm chiết xuất từ cây thuốc đã được thương mại hóa
như Phylamin chiết từ loài Azolla microphylla có tác dụng hoạt hoá các đại thực
bào và các lympho bào, do đó tăng cường khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư
(Trần Công Yên & cs, 2005).
Trong khi đó, những nghiên cứu của trung tâm Sâm và dược liệu TP.HCM về
tính kích thích miễn dịch của các hợp chất chiết xuất từ các cây thuốc thuộc họ
Nhân sâm cho thấy cao chiết Đinh lăng có tính năng tương tự như zymosan (một
chất kích thích khả năng thực bào), có khả năng làm gia tăng chỉ số thực bào của
chuột bình thường và chuột đã được gây suy giảm miễn dịch. Đặc biệt các nghiên
cứu về sâm Ngọc Linh và hợp chất majonosid-R2 chiết xuất từ sâm Ngọc Linh cho
thấy có hoạt tính làm gia tăng chỉ số thực bào in vivo của đại thực bào ở chuột,
tương tự như chất kích thích sự thực bào điển hình zymosan – A. Các thử nghiệm
trên chuột gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid cho thấy bột chiết sâm
vẫn duy trì được lượng bạch cầu, làm tăng trọng lượng lách và tuyến ức, gia tăng
chỉ số thực bào (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007).
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để phát hiện
những thay đổi ở mức độ biểu hiện gene của các cytokine quan trọng trong hoạt

động miễn dịch. Vì real-time RT-PCR đang được sử dụng rộng rãi để định lượng
cytokine từ tế bào, dịch thể, mô và sinh thiết. Đây là phương pháp mạnh và nhạy,
có thể dùng để xác định các mức độ biểu hiện mRNA của cytokine, thường biểu
hiện rất thấp trong các mô nghiên cứu. Phương pháp này cho phép phát hiện trực
tiếp sản phẩm PCR trong pha tăng trưởng của phản ứng nhờ vào việc sử dụng các
mẫu dò huỳnh quang (Taqman probe). Sự biểu hiện các cytokine được kiểm soát ở
nhiều cấp độ nhưng sự phiên mã gene là bước đầu tiên, quan trọng trong quá trình
tạo thành protein cytokine. Do đó, chúng tôi sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR,
nhằm mục đích phát hiện những thay đổi của tế bào khi cảm ứng với hợp chất tự
nhiên ở mức phiên mã gene, từ đó có thể phát hiện khả năng kích thích miễn dịch
của các hợp chất đó. Ngoài ra, trong phạm vi đề tài này, chi phí cho việc xây dựng
8

qui trình real-time RT-PCR nhằm phát hiện sự biểu hiện cytokine thấp hơn nhiều so
với việc sử dụng các bộ kit ELISA phát hiện protein cytokine (giá thành bộ kit
ELISA cho từng loại cytokine với khoảng 192 phản ứng là 25-30 triệu đồng). Vì
vậy, nếu dùng ELISA để nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất tự nhiên lên sự
biểu hiện nhiều loại cytokine sẽ không có lợi về kinh tế. Trong khi đó, chi phí đặt
mua mồi và mẫu dò cho một gene mã hóa cytokine thì thấp, nên có thể phát triển
cho nhiều loại cytokine với mục đích sàng lọc. Những hợp chất có tiềm năng sẽ
được lựa chọn cho các nghiên cứu chuyên sâu về sau ở mức độ biểu hiện protein
hay lâm sàng.
Mô hình tế bào mà chúng tôi sử dụng trong đề tài này là 2 dòng tế bào ung
thư: dòng tế bào Jurkat, đại diện cho tế bào lympho T và dòng tế bào U937 đại diện
cho tế bào mono/đại thực bào trong các thí nghiệm cảm ứng với các hợp chất tự
nhiên. Chúng tôi chọn hai dòng tế bào này vì đây là dòng tế bào của người, đặt mua
từ ATCC, có khả biểu hiện cytokine IL-2 (Jurkat), TNF-α (U937) khi được kích
thích với các phytohaemagglutinin (PHA), lipopolysaccharide (LPS); ngoài ra, các
thí nghiệm trên dòng tế bào cho phép chúng tôi kiểm soát được tính biến động của
tế bào so với việc dùng tế bào máu ngoại vi hay máu toàn phần thu từ nhiều người

khác nhau. Bên cạnh đó, thử nghiệm với 2 dòng tế bào này cũng cho phép chúng tôi
đánh giá được tác động của từng hợp chất tự nhiên lên hai loại tế bào miễn dịch là
tế bào lympho T và mono/đại thực bào một cách riêng rẽ. Vì vậy, đây là mô hình
phù hợp để xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của các hợp chất
tự nhiên thông qua sự biểu hiện gene IL-2 và TNF-α.
Sau khi xây dựng và tối ưu hóa quy trình real-time RT-PCR xong, chúng tôi
sử dụng chứng dương là phytohaemagglutinin (PHA) và lipopolysacchride (LPS)
để thử nghiệm quy trình trước tiên. Hai chất này đã được chứng minh là có khả
năng kích thích biểu hiện gene IL-2, TNF-α ở các tế bào lympho T và tế bào mono
/ đại thực bào (Dupuis & cs, 1988).
9

Ở giai đoạn thử nghiệm quy trình, chúng tôi chọn 2 hợp chất được chiết xuất
từ sâm Việt Nam là majonosid-R2 và ginsenosid-Rg1 làm chất gây cảm ứng; đây là
những hợp chất đã được Trung tâm Sâm và dược liệu TP.HCM nghiên cứu, cho
thấy có khả năng gây kích thích miễn dịch, làm tăng chỉ số thực bào khi thử nghiệm
trên chuột (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007). Ngoài ra, nhiều công trình trên thế
giới cũng cho thấy ginsenosid-Rg1 có một số ảnh hưởng nhất định đối với hoạt
động miễn dịch. Theo Qu và cộng sự (2011), khi tiêm chuột với hỗn hợp Rg1 và
kháng nguyên Toxoplasma gondii SAG1 tái tổ hợp làm gia tăng đáng kể đáp ứng
miễn dịch với kháng nguyên này ở chuột. Trong khi đó, nghiên cứu của Sun và
cộng sự (2008) cho thấy một mình Rg1 có thể nâng cao đáng kể việc sản xuất
isotypes IgG chuyên biệt kháng nguyên và sự tiết IL-5 và IFN-γ (Qu & cs, 2011;
Sun & cs, 2008). Trong khi đó, majonosid-R2 có khả năng ức chế đáng kể lượng
TNF-α có trong huyết thanh của khi chuột được tiêm bằng DGaIN/LPS. Mặt khác,
majonosid-R2 cũng có khả năng bảo vệ tế bào gan chuột nuôi cấy sơ cấp bằng cách
ức chế quá trình apoptosis cảm ứng bằng D-GalN/TNF-alpha in vitro (Tran & cs,
2002).
Đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số
chất bằng real-time RT-PCR” sẽ tạo ra một công cụ hữu ích trong việc phát hiện

những hợp chất (đặc biệt là những chất có nguồn gốc từ tự nhiên) có tác dụng kích
thích đối với hệ miễn dịch thông qua sự biểu hiện các cytokine quan trọng (IL-2,
TNF-α) của tế bào T, monocyte; qua đó góp phần đưa những hợp chất có trong cây
cỏ vào các nghiên cứu ứng dụng về sau.

10

CHƯƠNG II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số
chất bằng real-time RT-PCR” có hai nội dung nghiên cứu chính:
- Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch
- Áp dụng quy trình với một số chất thử nghiệm
2.1 Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch
Mục tiêu: thiết lập các thông số cần thiết cho quy trình phát hiện tính kích
thích miễn dịch
2.1.1 Nuôi cấy tế bào
- Tế bào Jurkat và U937 được nuôi cấy trong môi trường RPMI1640-
Glutamax (Gibco) có bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1%
Penicillin/Streptomycin (Gibco) ở 37
o
C, 5% CO
2
.
- Sau đó, ly tâm thu sinh khối ở 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o
C.
- Rửa lại bằng PBS, tiếp tục ly tâm thu sinh khối ở 5.000 vòng / phút trong 5
phút ở 4
o
C.

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare).
- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng
reverse transcriptase (Khoa Thương).
- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20
o
C cho các thí
nghiệm tiếp theo.
2.1.2 Kiểm tra hoạt động của các cặp mồi và mẫu dò
Chúng tôi thu nhận trình tự các cặp mồi và mẫu dò cho IL-2, TNF-α và β-
actin trên các công trình đã công bố trước đây [28] . Sau đó, chúng tôi sử dụng các
phần mềm chuyên dùng cho việc thiết kế mồi như Annhyb 4.943 và Oligo analyzer
11

(IDT) để chọn ra các cặp mồi và probe thích hợp. Khả năng bắt cặp đặc hiệu của
cặp mồi, mẫu dò được kiểm tra bằng công cụ BLAST trên trang web của NCBI.
Bảng 2.1 : Trình tự các cặp mồi và mẫu dò
Ký hiệu
mồi và mẫu dò
Trình tự mồi, mẫu dò (5’  3’)
tnfa-F TCTTCTCGAACCCCGAGTGA
tnfa-R CCTCTGATGGCACCACCAG
tnfa-p FAM-TAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCT
il2-F GAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTC
il2-R TGTTGAGATGATGCTTTGACAAAA
il2-p FAM-CTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAA
bactin-F CCTGGCACCCAGCACAAT
bactin-R GCCGATCCACACGGAGTACT
bactin-p HEX- ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC
Các cặp mồi cùng mẫu dò được lựa chọn sẽ được tổng hợp và kiểm tra lại
bằng PCR trên mẫu cDNA thu nhận từ tế bào Jurkat, U937.

o Thành phần phản ứng PCR:
Thành phần Thể tích
h-Taq polymerase 2,5 U/µL 0,5 µL
Hỗn hợp dNTP 10 mM 0,5 µL
MgCl
2
5 mM 2,5 µL
Mồi 25 µM 1,0 µL
Dung dịch đệm h-Taq polymerase, 10X 2,5 µL
Bản mẫu 1,0 µL
Nước cất 2 lần 17,0 µL
Tổng 25,0 µL
12

o Chương trình PCR:
Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian
95
o
C 15 phút
45
95

o
C 30 giây
60
o
C 30 giây
72

o

C 30 giây
72

o
C 5 phút

2.1.3 Tối ưu hóa các thông số trong phản ứng real-time PCR phát hiện sự
biểu hiện mRNA của các gene mục tiêu
cDNA thu nhận từ hai dòng tế bào Jurkat và U937 ở mục 2.1.1 được dùng để
tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng real-time PCR. Đầu tiên chúng tôi sử dụng
các cặp mồi il2-F/R, tnfa-F/R, bactin-F/R để nhân bản các trình tự cytokine mục
tiêu và gene chứng nội β-actin ở cả hai dòng tế bào Jurkat và U937 trong các phản
ứng monoplex trước, sau đó mới tiến hành phản ứng multiplex.
2.1.3.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng monoplex real-
time PCR
Nhiệt độ bắt cặp được khảo sát trên gradient các nhiệt độ từ 50
o
C đến 65
o
C.
Các phản ứng của 3 cặp mồi được thực hiện riêng rẻ. Khoảng cách giữa các nhiệt
độ khảo sát do máy tự điều chỉnh, bao gồm các nhiệt độ sau: 65
o
C, 62,3
o
C, 59,5
o
C,
53
o

C, 50
o
C.
o Thành phần phản ứng PCR:
Thành phần Thể tích
h-Taq polymerase 2,5U/µL 0,5 µL
Hỗn hợp dNTP 10 mM 0,5 µL
MgCl
2
5 mM 2,5 µL
Mồi F/R 25 µM 1,0 µL
13

Mẫu dò 25 µM 0,5 µL
Dung dịch đệm h-Taq polymerase, 10X 2,5 µL
Bản mẫu 1,0 µL
Nước cất 2 lần 16,5 µL
Tổng 25,0 µL
o Chương trình PCR:
Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian
95
o
C 15 phút
45
95

o
C 30 giây
65
o

C - 50
o
C 30 giây
72

o
C 30 giây
72

o
C 5 phút

2.1.3.2 Kiểm tra phản ứng multiplex real-time PCR với nhiệt độ đã chọn
Nhiệt độ bắt cặp tối ưu từ mục 2.1.3.1 được dùng cho thí nghiệm này. Chúng
tôi so sánh kết quả của 2 phản ứng monoplex và multiplex PCR để xác nhận nhiệt
độ bắt cặp phù hợp dùng cho các phản ứng multiplex PCR về sau.
Phản ứng multiplex sử dụng 2 cặp mồi cho mỗi phản ứng : il2-F/R với bactin-
F/R ; tnfa-F/R với bactin-F/R. Trong đó bactin-F/R được dùng để phát hiện sự biểu
hiện của gene chứng nội là β-actin.
o Thành phần phản ứng PCR :
Thành phần Thể tích
h-Taq polymerase 2,5U/µL 0,5 µL
Hỗn hợp dNTP 10 mM 0,5 µL
MgCl
2
5 mM 2,5 µL
il2-F/R hoặc tnfa-F/R 25 µM 1,0 µL
bactin-F/R 25 µM 1,0 µL
14

il2-p hoặc tnfa-p 25 µM 0,5 µL
bactin-p 25 µM 0,5 µL
Dung dịch đệm h-Taq polymerase, 10X 2,5 µL
Bản mẫu 1,0 µL
Nước cất 2 lần 15,0 µL
o Chương trình PCR :
Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian
95
o
C 15 phút
45
95

o
C 30 giây
62,3
o
C 30 giây
72

o
C 30 giây
72
o
C 5 phút

 Sản phẩm cần đạt :
Quy trình real-time RT-PCR có thể phát hiện thay đổi biểu hiện gene của các
cytokine mục tiêu trên các dòng tế bào tương ứng.
2.2 Áp dụng quy trình với một số chất thử nghiệm

Mục tiêu : kiểm tra khả năng phát hiện sự biểu hiện gene IL-2 và TNF-α bằng
kỹ thuật real-time RT-PCR vừa xây dựng.
2.2.1 Sự biểu hiện gene IL-2 ở tế bào Jurkat khi cảm ứng với PHA
- Tế bào Jurkat được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax có bổ
sung 10% FBS, 1% HEPES, 1% Penicillin/Streptomycin. Tế bào được nuôi cấy
trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1 x 10
6
tế bào / mL.
- Các tế bào được xử lý với PHA ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL, 5 µg/mL và
10 µg/mL.
- Ủ ở điều kiện 5% CO
2
, 37
o
C trong 6 giờ.
- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o
C.
15

- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare).
- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng
reverse transcriptase (Khoa Thương).
- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ bảo quản ở -20
o
C cho đến khi
sử dụng.
- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR như mục 2.1.3.2 với 2 cặp
mồi il2-F/R, bactin-F/R và mẫu dò il2-p, bactin-p.
- Sự tăng/giảm biểu hiện gene trong phản ứng multiplex real-time PCR được

tính dựa vào công thức sau (Livak & cs, 2001):
Mức độ tăng tương đối biểu hiện gene = 2
–∆∆Ct

Trong đó: ∆∆Ct = ∆Ct
cảm ứng
– ∆Ct
không cảm ứng

∆Ct = Ct
gene mục tiêu
– Ct
gene chứng nội

- Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism 5.
2.2.2 Sự biểu hiện gene TNF-α ở tế bào U937 khi cảm ứng với LPS
- Tế bào U937 được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax (Gibco) có
bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin
(Gibco). Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1 x 10
6
tế bào
/ mL.
- Các tế bào được xử lý với LPS ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL, 5 µg/mL và
10 µg/mL. Ủ ở điều kiện 5% CO
2
, 37
o
C trong 6 giờ, 12 giờ.
- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o

C.
- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare).
- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng
reverse transcriptase (Khoa Thương).
- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20
o
C cho đến
khi sử dụng.
16

- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR như mục 2.1.3.2 với 2 cặp
mồi tnf-F/R, bactin-F/R và mẫu dò tnf-p, bactin-p.
- Sự tăng/giảm biểu hiện gene trong phản ứng multiplex real-time PCR được
tính như mục 2.2.1
2.2.3 Sự biểu hiện IL-2 ở tế bào Jurkat khi cảm ứng với majonosid-R2
- Tế bào Jurkat được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax (Gibco)
có bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin
(Gibco). Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1 x 10
6
tế bào
/ mL.
- Tế bào được xử lý với majonosid-R2 ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL, 5
µg/mL và 10 µg/mL.
- Ủ ở điều kiện 5% CO
2
, 37
o
C trong 6 giờ và 12 giờ.
- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o

C.
- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare).
- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng
reverse transcriptase (Khoa Thương).
- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20
o
C.
- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR và tính toán sự tăng/giảm
biểu hiện gene như mục 2.2.1
2.3.4 Sự biểu hiện TNF-α ở tế bào U937 khi cảm ứng với majonosid-R2
- Tế bào U937 được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax (Gibco) có
bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin
(Gibco). Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1x10
6
tế bào /
mL.
- Các tế bào được xử lý với majonosid-R2 ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL, 5
µg/mL và 10 µg/mL.
- Ủ ở điều kiện 5% CO
2
, 37
o
C trong 6 giờ và 12 giờ.
17

- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o
C.
- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare).
- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng

reverse transcriptase (Khoa Thương).
- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20
o
C.
- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR và tính toán sự tăng/giảm
biểu hiện gene như mục 2.2.2
2.3.5 Sự biểu hiện IL-2 ở tế bào Jurkat khi cảm ứng với ginsenosid-Rg1
- Tế bào Jurkat được nuôi trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10%
FBS, 1% HEPES, 1% Penicillin/Streptomycin. Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6
giếng với mật độ tế bào là 1x10
6
tế bào / mL.
- Các tế bào được xử lý với ginsenosid-Rg1 ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL,
5 µg/mL và 10 µg/mL.
- Ủ ở điều kiện 5% CO
2
, 37
o
C trong 6 giờ và 12 giờ.
- Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o
C.
- Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare).
- Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng
reverse transcriptase (Khoa Thương).
- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20
o
C.
- Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR và tính toán sự tăng/giảm
biểu hiện gene như mục 2.2.1

2.3.6 Sự biểu hiện TNF-α ở tế bào U937 khi cảm ứng với ginsenosid-Rg1
-
Tế bào U937 được nuôi trong môi trường RPMI1640-Glutamax (Gibco) có
bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin
(Gibco). Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 1x10
6
tế bào /
mL.
18

-
Các tế bào được xử lý với ginsenosid-Rg1 ở các nồng độ cuối là 0 µg/mL,
5 µg/mL và 10 µg/mL.
-
Ủ ở điều kiện 5% CO
2
, 37
o
C trong 6 giờ và 12 giờ.
-
Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o
C.
-
Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare).
-
Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng
reverse transcriptase (Khoa Thương).
- cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20
o

C cho đến
khi sử dụng.
-
Thực hiện phản ứng multiplex real-time PCR và tính toán sự tăng/giảm
biểu hiện gene như mục 2.2.1
 Sản phẩm cần đạt :
Kết quả về tác động của PHA, LPS, majonosid-R2 và ginsenosid-Rg1 trên sự
biểu hiện mRNA IL-2 và TNF-α ở dòng tế bào Jurkat, U937.

19

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
3.1 Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch
Các bước xây dựng quy trình được tiến hành theo lưu đồ sau :









3.1.1 Nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào Jurkat (tế bào lympho T) có khả năng biểu hiện và tiết cytokine
IL-2 (Hsu & cs, 2008), trong khi U937 (dòng tế bào mono) lại có khả năng biểu
hiện và tiết cytokine TNF-α (Garrelds & cs, 1999). Do đó, chúng tôi sử dụng cả hai
dòng tế bào này để xây dựng quy trình phát hiện khả năng kích thích miễn dịch
thông qua sự biểu hiện IL-2 và TNF-α.
Các dòng tế bào được giải đông và nuôi trong môi trường RPMI1640-

Glutamax có bổ sung 10% FBS, 1% HEPES, 1% Penicillin/Streptomycin. Ủ ở điều
kiện 5% CO
2
, 37
o
C. Sau vài thế hệ cấy chuyền, các tế bào được cấy trong đĩa 6
giếng với mật độ tế bào là 1 x 10
6
tế bào / mL. Thu nhận tế bào bằng cách ly tâm
5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o
C. Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin
Nuôi cấy tế bào và thu nhận tế bảo
Tách chiết RNA và chuyển thành cDNA
Kiểm tra hoạt động của mồi và mẫu dò
- BLAST
- PCR
- Giải trình tự
Tối ưu hóa các thông số trong phản ứng real-time PCR
20

Mini (GE Healthcare). Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành
cDNA bằng reverse transcriptase. cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ bảo
quản ở -20
o
C cho đến khi sử dụng.
3.1.2 Kiểm tra hoạt động của các cặp mồi và mẫu dò
Bảng 3.1 : Đặc tính của mồi và mẫu dò
Mồi – mẫu dò Chiều
dài

Giá trị
Tm (
o
C)
%GC Kích thước sản
phẩm PCR (bp)

il2-F 27 54,4 37
111
il2-R 24 53,6 33,3
il2-p 34 60 38,2
tnfa-F 20 57,7 55
151
tnfa-R 19 58.1 63,2
tnfa-p 29 63,3 48,3
bactin-F 18 58,6 61,1
70
bactin-R 20 59,1 60
bactin-p 27 62,4 51,9

Chúng tôi sử dụng phần mềm OligoAnalyzer (IDT) để phân tích các đặc tính:
chiều dài, thành phần GC, Tm… của từng cặp mồi và kiểm tra độ đặc hiệu của từng
cặp mồi. Kết quả, cho thấy các cặp mồi đều có thông số phù hợp với thỏa các điều
kiện (Bartlett & cs, 2003). Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm BLAST (NCBI) để
kiểm tra mồi, mẫu dò với các trình tự đã được công bố trên NCBI. Kết quả cho thấy
các cặp mồi, mẫu dò đều có khả năng bắt cặp đặc hiệu đối với trình tự mục tiêu
(xem phụ lục 1 và 2).
Sau khi kiểm tra in silico, chúng tôi chúng tôi tiếp tục làm thực nghiệm, kiểm
tra hoạt động của các cặp mồi trên mẫu cDNA thu được từ tế bào bằng phản ứng
PCR và điện di sản phẩm.

21


Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ mẫu cDNA của tế bào Jurkat
và U937
A. Giếng 1: sử dụng cặp mồi IL-2 nhân bản cDNA từ tế bào Jurkat; giếng 2:
thang 100 bp; giếng 3: chứng âm.
B. Giếng 1: sử dụng cặp mồi TNF-α nhân bản cDNA từ tế bào U937; giếng 2:
thang 100 bp; giếng 3: chứng âm.
C. Giếng 1: sử dụng cặp mồi β-actin nhân bản cDNA từ tế bào Jurkat; giếng
2: sử dụng cặp mồi β-actin nhân bản cDNA từ tế bào U937; giếng 3: thang 100 bp;
giếng 4: chứng âm.
Kết quả (hình 3.1) cho thấy chứng âm của các mẫu cDNA của tế bào Jurkat,
U937 không cho sản phẩm PCR, đồng thời ở các giếng xuất hiện các vạch sản
phẩm với kích thước khoảng 111 bp (IL-2), 151 bp (TNF-α), 70 bp (β-actin). như
vậy, các cặp mồi có khả năng nhân bản các trình tự cDNA mục tiêu tạo thành các
sản phẩm có kích thước theo dự đoán.
Cuối cùng, chúng tôi lấy các sản phẩm PCR tạo thành đem đi giải trình tự. Kết
quả giải trình tự cũng cho thấy các sản phẩm tạo thành có trình tự đúng với trình tự
mRNA IL-2, TNF-α và β-actin.
22


Hình 3.2: Kết quả giải trình tự các sản phẩm PCR của 3 cặp mồi IL-2 (A),
TNF-α (B) và β-actin (C)

3.1.3 Tối ưu hóa các thông số trong phản ứng real-time PCR phát hiện sự
biểu hiện mRNA của các gen mục tiêu
Trong phản ứng real-time PCR, Ct (chu kỳ ngưỡng) được định nghĩa là số
chu kỳ PCR mà tại đó tín hiệu huỳnh quang vượt qua mức độ phát hiện tối thiểu

(Patel & cs, 2008). Ở đây chúng tôi dùng giá trị Ct để đánh giá hiệu quả của sự tối
ưu hóa. Mục tiêu của tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là đạt được giá trị Ct nhỏ
nhất cho mỗi điều kiện khảo sát.
A
B
C
23

Trong đề tài này, chúng tôi xác định số lần tăng/giảm biểu hiện của một gene
ở mẫu thực nghiệm và mẫu chứng bằng cách so sánh giá trị Ct của hai mẫu này. Để
đảm bảo sự khác biệt giá trị Ct là do tăng/giảm biểu hiện gene chứ không phải bắt
nguồn từ sự khác biệt hàm lượng RNA ban đầu cho vào phản ứng, chúng tôi đo
thêm giá trị Ct của những house-keeping gene vốn có biểu hiện ổn định. Như vậy,
phản ứng real-time PCR này là phản ứng multiplex với 2 cặp mồi (mồi của IL-
2/TNF-α và mồi β-actin), trong đó β-actin đóng vai trò là house-keeping gene. Tuy
nhiên, trong phản ứng multiplex real-time PCR, việc tối ưu hóa các điều kiện phản
ứng trở nên khó khăn hơn trong phản ứng monoplex, điều này là do các tương tác
phức tạp giữa các cặp mồi sử dụng cũng như do động học khác biệt giữa các phản
ứng sử dụng các cặp mồi khác nhau. Vì vậy, chúng tôi tiến hành định lượng sự biểu
hiện của từng gene trong phản ứng monoplex trước để tìm điều kiện thích hợp cho
phản ứng ; sau đó, chúng tôi tiếp tục khảo sát các điều kiện tương tự đối với phản
ứng multiplex. Các giá trị Ct trong phản ứng multiplex sẽ được so sánh với giá trị
Ct của từng phản ứng monoplex, giá trị Ct cho một mục tiêu trong monoplex và
multiplex không được khác nhau đáng kể, nếu giá trị này quá khác nhau sẽ cần tối
ưu hóa phản ứng (Bartlett & cs, 2003).
3.1.3.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu cho phản ứng
monoplex real-time PCR
Nhiệt độ bắt cặp mồi phù hợp rất quan trọng đối với phản ứng PCR. Nếu nhiệt
độ bắt cặp quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến hiệu quả nhân bản các trình tự
mục tiêu. Từ kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của 3 cặp mồi (bảng 3.2) cho thấy

giá trị Ct thấp nhất ở nhiệt độ 62,3
o
C đối với cặp mồi β-actin (Ct = 20,04) và TNF-α
(Ct = 29,17); trong khi đó, giá trị Ct thấp nhất của cặp mồi IL-2 lại ở nhiệt độ 53
o
C
(Ct = 32,51), tuy nhiên giá trị đó lại không khác biệt so với ở nhiệt độ 62,3
o
C (Ct =
32,56). Ở đây, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa
các giá trị Ct của các nhiệt độ khảo sát của 3 cặp mồi. Vì vậy, để thuận tiện cho việc
thiết lập phản ứng, chúng tôi sử dụng nhiệt độ 62,3
o
C làm nhiệt độ bắt cặp sử dụng
24

chung cho các phản ứng multiplex real-time-PCR giữa các cặp mồi il2-F/R và
bactin-F/R, tnf-F/R và bactin-F/R.
Bảng 3.2: Giá trị Ct của các phản ứng real-time monoplex PCR ở các
nhiệt độ bắt cặp khác nhau
Nhiệt độ
(
o
C)
β-actin IL-2 TNF-α
Ct Ct trung bình Ct Ct trung bình Ct Ct trung bình
65
22,05
21,70 ± 0,736
a,b

33,17

33,11 ± 0,057
a

30.94

31,95 ± 1,005
a

21,72 33,09

32.95

21,33 33,06

31.95

62,3
20,59
20,04 ± 0,648
a,b
33,13

32,56 ± 0,715
a

28.65

29,17 ± 0,596
a,b

18,84 32,8 29.82

20,68 31,76

29.04

59,5
20,69
20,69 ± 0,356
a
33,2
33,23 ± 0,242
a

31.23

30,61 ± 0,884
a

20,92 33,01

29.98

20,47 33.49


53

20,68
20,58 ± 0,403
a

32,81

32,51 ± 0,316
a

30.83

31,56 ± 0,751
a

20,72 32,54

31.53

20,35 32,18

32.33

50
21,28
21,25 ± 0,177
a

33,6
33,40 ± 0,206
a

31.77

33,60 ± 1,616
a,b
21,41 33,19

34.84

21,06 33,42

34.18

Chứng âm -

-

-
a, b: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
25

3.1.3.2 Kết quả kiểm tra phản ứng multiplex real-time PCR với nhiệt độ
đã chọn
 IL-2 và β-actin
Trong thí nghiệm này, chúng tôi thiết lập phản ứng multiplex với 2 cặp mồi
il2-F/R và bactin-F/R. Nhiệt độ bắt cặp là 62,3
o
C như trong các phản ứng monoplex.
Bảng 3.3: Giá trị Ct của phản ứng real-time multiplex PCR giữa IL-2 và
chứng nội (β-actin) ở nhiệt độ tối ưu

IL-2 β-actin
Ct Ct trung bình Ct Ct trung bình
32,98
32,62 ± 0,426
20,73
20,74 ± 0,095
32,15 20,65
32,73 20,84
Chứng âm - Chứng âm -

Kết quả multiplex real-time PCR giữa IL-2 và β-actin (bảng 3.3) cho thấy ở
nhiệt độ 62,3
o
C, giá trị Ct trong phản ứng multiplex PCR không khác biệt so với
các phản ứng monoplex real-time PCR; giá trị Ct trung bình của cặp mồi IL-2, β-
actin trong phản ứng multiplex lần lượt là 32,62 và 20,74 so với giá trị Ct là 32,56
và 20,04 của monoplex. Do đó, chúng tôi sử dụng nhiệt độ này cho các phản ứng
multiplex real-time PCR nhằm phát hiện sự biểu hiện giữa gene IL-2 với gene
chứng nội β-actin.
 TNF-α và β-actin
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiếp tục thiết lập phản ứng multiplex với 2
cặp mồi là tnfa-F/R và bactin-F/R và vẫn giữ nguyên nhiệt độ bắt cặp là 62,3
o
C như
trên.