nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu sao việt nam (cervus nippon pseudaxis)

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

I

BÁO CÁO NGHIỆM THU
Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu
sao Việt Nam (Cervus nippon Pseudaxis)
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Tiến Bằng
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng
Kinh phí được duyệt: 80.000.000
Kinh phí đã cấp: 72.000.000 theo TB số : 224 TB-SKHCN ngày 02/ 12 /2010
Mục tiêu:
Mục tiêu ngắn hạn: Nuôi cấy và nhân sinh khối in vitro thành công tế bào gốc nhung hươu sao.
Mục tiêu dài hạn: Thu nhận những hoạt chất sinh học quý từ tế bào gốc nhung hươu sao nuôi
cấy in vitro và ứng dụng để tổng hợp thực phẩm chức năng.
Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt và hợp đồng đã ký)
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế
bào đơn từ nhung hươu sao
Nghiên cứu thu nhận và nuôi cấy in vitro tế
bào đơn từ nhung hươu sao
Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên
Khảo sát tính gốc của tế bào gốc ứng viên Khảo sát tính gốc của tế bào gốc ứng viên

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

II

LỜI CẢM ƠN
Khi nhìn thấy những tế bào gốc nhung hươu đầu tiên phát triển trong điều kiện in

vitro, chúng tôi, nhóm nghiên cứu trẻ phòng thí nghiệm Tế bào gốc, đã vỡ òa sung sướng.
Mặc dù đây chỉ là bước đầu tiên trong chương trình nghiên cứu lâu dài và khó khăn,
nhưng nó có ý nghĩa rất quan trọng. Để đạt được thành quả ban đầu này nhóm nghiên cứu
xin chân thành cảm ơn tất cả những thầy cô, cơ quan, tổ chức đã tham gia thực hiện cũng
như góp ý xây dựng đề tài. Chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
 Sở khoa học thành phố Hồ Chí Minh, chương trình Vườn ươm sáng tạo Khoa học
và Công nghệ trẻ đã cấp kinh phí thực hiện đề tài.
 Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ trẻ đã đứng ra chủ trì đề tài.
 Các thầy cô và cán bộ nghiên cứu Phòng thí nghiệm Tế bào gốc trường Đại học
Khoa học Tự nhiên TpHCM.
 Trang tại chăn nuôi hươu nai Trường Thịnh, Long Thành, Đồng Nai.
Cuối cùng nhóm nghiên cứu xin gửi lời tri ân đến các thành viên hội đồng xét
duyệt, phản biện và nghiệm thu đã đóng góp nhiều ý kiến tích cực và giúp đề tài thực
hiện thành công.
Tp. Hồ Chí Minh, 04/06/2012
Chủ nhiệm đề tài


ThS. Nguyễn Tiến Bằng
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

III

LỜI GIỚI THIỆU
Sự phát triển hằng năm của nhung hươu là trường hợp tái sinh duy nhất ở động vật
hữu nhũ, một loài mà khả năng tái sinh lại các phần bị mất là rất hạn chế. Ở một số loài
hươu, tốc độ tái tạo nhung có thể đạt được 2cm/ngày. Do vậy, sự tái sinh của nhung hươu
thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà khoa học. Các nhà nghiên cứu cho rằng đây có
thể là một hiện tượng tế bào gốc. Các tế bào nhung hươu có thể được thu nhận và nuôi
cấy trong môi trường DMEM/F12, 10% FBS. Sau khoảng 10 ngày nuôi cấy, các tế bào

nhung hươu tăng sinh mạnh và chiếm khoảng 70 – 80% diện tích bề mặt nuôi cấy. Tiếp
đó, các tế bào nhung hươu được tiến hành cấy chuyền bằng Trypsin – EDTA 0,25%
nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho sự phát triển của chúng. Các tế bào
nhung hươu thu nhận được thể hiện tính đa năng giống tế bào gốc. Trong môi trường có
tác nhân biệt hóa thích hợp, các tế bào nhung hươu có khả năng biệt hóa thành tế bào
xương, tế bào mỡ…
INTRODUCTION
The annual regeneration of deer velvets is a unique developmental event in
mammals, which as a rule possess only a very limited capacity to regenerate lost
appendages. Some deer species, velvet regenerate rate achieves 2 cm/day. Thus, velvet
regeneration attract the scientists's attention very much. Researchers said that velvet
regeneration is a stem cell – based process. The cells derived from dapple deer velvet
have been collected and cultured with DMEM/F12 plus 10% FBS (fetal bovine serum).
About 10th day, those cells strongly expand and cover with 70 – 80% Roux’s surface. At
that time, the cells derived from dapple deer velvet are subcultured by using
trypsin/EDTA 0,25% to provide nutrients and surface for development. The cells derived
from dapple deer velvet is multipotial like stem cells. They could be differentiated to
osteocytes in DMEM/F12, 10% FBS medium plus dexamethasone, glycerol phosphate,
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

IV

ascorbate, acid ascorbic; to adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutyl-
methylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin.
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

V

MỤC LỤC
BÁO CÁO NGHIỆM THU I

Lời cảm ơn II
Lời giới thiệu III
Mục lục V
Danh sách bảng VIII
Danh sách hình IX
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1. Nhung hươu và ứng dụng của nó 1
1.1.1. Khái niệm 1
1.1.2. Các giai đoạn phát triển của sừng hươu 1
1.1.3. Thành phần hóa học chính trong nhung hươu 2
1.1.4. Một số tác dụng dược lý của nhung hươu 3
1.1.4.1. Tác dụng đối với bệnh viêm xương khớp 3
1.1.4.2. Tác dụng đối với các bệnh thấp khớp 3
1.1.4.3. Tác dụng kích thích miễn dịch 4
1.1.4.4. Tác dụng làm giảm huyết áp 4
1.1.4.5. Tác dụng chống sốc 4
1.2. Khái quát về tế bào gốc 4
1.3. Tế bào gốc nhung hươu – lược sử nghiên cứu và tiềm năng ứng dụng 5
1.3.1. Thế giới 5
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

VI

1.3.2. Việt Nam 10
1.4. Tính cấp thiết của đề tài 11
1.5. Ý nghĩa và tính mới về khoa học thực tiễn 11
CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13
2.1. Vật liệu nghiên cứu và tiến trình nghiên cứu 13
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 13
2.1.2. Tiến trình nghiên cứu 13

2.2. Dụng cụ và thiết bị 14
2.3. Hóa chất 15
2.4. Các phương pháp thực nghiệm 19
2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu 19
2.4.2. Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 20
2.4.3. Nuôi cấy tế bào đơn 21
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền 22
2.4.4.1. Quy trình cấy chuyền tế bào 22
2.4.4.2. Phương pháp xác định các chỉ số tế bào dựa trên phần mềm xCELLigence
(phối hợp thực hiện với đại diện của Công ty Roche ở Việt Nam) 23
2.4.5. Chứng minh các tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu biểu hiện đặc điểm của
tế bào gốc 23
2.4.5.1. Kiểm chứng khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới 23
2.4.5.2. Kiểm chứng khả năng biệt hóa 24
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Kết quả thu nhận mẫu mô nhung hươu 28
3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 29
3.3. Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào nhung hươu 31
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

VII

3.4. Kết quả cấy chuyền và nuôi cấy tăng sinh tế bào nhung hươu 35
3.5. Kết quả chứng minh tính gốc của các tế bào thu nhận được từ mẫu mô nhung hươu
42
3.5.1. Khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới 42
3.5.2. Khả năng biệt hóa 42
3.5.2.1. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo xương 42
3.5.2.2. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo mỡ 45
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

4.1. Kết luận 54
4.2. Đề nghị 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

VIII

DANH SÁCH BẢNG
SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG
2.1. Danh mục các dụng cụ sử dụng trong đề tài 14
2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 14
2.3 Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài 15
3.1 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi 29
3.2 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu đông
lạnh
30
3.3 Số lượng mẫu nuôi sơ cấp 31
3.4 Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào thu nhận từ nhung hươu 34
3.5 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào nhung hươu 39

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

IX

DANH MỤC HÌNH
SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG
1.1. Mặt cắt vùng đỉnh đang tăng trưởng của nhung hươu 6
1.2. Các tế bào STRO – 1+ trong những vùng khác nhau của
cuống [25]
9

2.2. Mẫu mô nhung hươu sao 14
2.3. Phần ngọn của nhung hươu 19
3.1. Phần ngọn của nhung hươu đã xử lý 28
3.2. Mẫu mô nhung hươu được cắt thành những mảnh nhỏ 28
3.3. Các mảnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm
2
29
3.4. Các tế bào đơn thu nhận từ mô nhung hươu (X100 30
3.5. Tế bào nhung hươu sau 24 giờ nuôi cấy (X40) 32
3.6. Tế bào nhung hươu sau 48 giờ nuôi cấy (X40) 32
3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy (X40) 33
3.8. Tế bào nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy (X40) 33
3.9. Tế bào nhung hươu sau 7 ngày nuôi cấy (X40) 34
3.10 Tế bào nhung hươu sau 10 ngày nuôi cấy (X40) 34
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

X

3.11. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 0 giờ (X100) 36
3.12. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 24 giờ (X40) 36
3.13. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 (cấy chuyền
lần 1) (X40)
37
3.14. Tế bào nhung hươu qua 2 lần cấy chuyền (X40) 37
3.15. Tế bào nhung hươu qua 3 lần cấy chuyền (X40) 38
3.16. Tế bào nhung hươu qua 4 lần cấy chuyền (X40) 38
3.17. Tế bào nhung hươu qua 5 lần cấy chuyền (X100) 39
3.18. Các tế bào nhung hươu trước khi bắt đầu cảm ứng biệt hóa
(X40)
43

3.19. Các tế bào nhung hươu sau 15 ngày nuôi cấy trong môi
trường biệt hóa thành tế bào tạo xương (X200)
44
3.20. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi
trường biệt hóa thành tế bào tạo xương (X200)
44
3.21. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi
trường biệt hóa thành tế bào tạo xương dương tính với thuốc
nhuộm Alizarin Red S (X40)
45
3.22. Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ trong tế bào chất sau
15 ngày nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế
47
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

XI

bào tạo mỡ (X100)
3.23. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi
trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X40)
47
3.24. Các giọt mỡ tích tụ trong tế bào chất của tế bào nhung hươu
sau khi nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế
bào tạo mỡ (X200)
48
3.25. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy trong môi
trường biệt hóa thành tế bào tạo mỡ dương tính với thuốc
nhuộm Oil Red O (X40)
48
3.26. Tế bào nhung hươu thu nhận bởi Berg và cs [4] hay bởi Rolf

và cs [25]
49
3.27. Tế bào nhung hươu do đề tài thu nhận (X200 và X40) 49
3.28. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo xương của
đề tài (A) so với tế bào AP (B) của Berg và cs [4]
50
3.29. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ của đề
tài (A, C) so với tế bào Stro – 1
+
(B, D) của Rolf và cs [25]
51
3.30. Tế bào nhung hươu của đề tài (A, B) , tế bào AP (C) và tế
bào Stro – 1
+
(D) sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ cho kết
quả dương tính với nhuộm Oil Red O
52

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhung hươu và ứng dụng của nó
1.1.1. Khái niệm
Nhung hươu là sừng non của con hươu. Thông thường, sừng chỉ hình thành ở
hươu đực. Hằng năm, vào cuối mùa hạ, sừng cũ rụng đi; mùa xuân năm sau sừng mới
sẽ mọc lại. Sừng hươu khi mới mọc rất mềm, mặt ngoài được bao phủ bởi một lớp lông
tơ màu nâu nhạt, trong chứa rất nhiều mạch máu. Vì sừng non mềm và sờ mịn như
nhung nên được gọi là nhung hươu.

1.1.2. Các giai đoạn phát triển của sừng hươu
Sừng hươu được thay thế hàng năm. Nếu không bị cắt, nhung hươu sẽ tiếp tục
phát triển tạo thành sừng; đến mùa xuân, cặp sừng này rụng đi và cặp nhung mới hình
thành. Nếu bị cắt, phần gốc của nhung hươu sẽ hình thành chiếc đế bằng sừng; vào
mùa rụng sừng thì chiếc đế này rụng (hiện tượng đổ đế). Vào thời kì rụng sừng, các tế
bào xung quanh gốc sừng phát triển mạnh, đẩy sừng cũ bật ra khỏi đế. Sau khi sừng cũ
rụng, quá trình hình thành nhung và tạo sừng mới sẽ bắt đầu. Quá trình này được hoàn
thành trong khoảng ba tháng rưỡi với hai thời kỳ: thời kỳ hình thành nhung và thời kỳ
hình thành sừng. Thời kỳ hình thành nhung diễn ra trong khoảng hai tháng, được chia
thành ba giai đoạn:
Giai đoạn bong lớp váng trên bề mặt gốc sừng: sau khi đổ đế, trên bề mặt gốc
sừng tạo thành lớp váng mỏng; sau 4 – 5 ngày, lớp váng này bong dần ra và nhung
hươu bắt đầu nhú lên.
Giai đoạn nhung có dạng hình quả đào: phần sừng non lồi dần lên là một khối
mềm, mọng, có màu hồng, phình to dần và có hình quả đào (bướu thứ nhất), bên trên
có phủ lớp lông trắng xám rất mịn.
Giai đoạn nhung có dạng hình yên ngựa: nhung hình quả đào bắt đầu phân
nhánh lần thứ nhất tạo thành hai phần phát triển độc lập. Phần trước phát triển thành
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

2

nhánh trán, phần sau là thân nhung. Khi nhánh trán đã phát triển hoàn thiện, phía đầu
thân nhung lại phình to lần nữa (bướu thứ hai) và chuẩn bị phân nhánh lần thứ hai. Lúc
này, nhung bắt đầu có dạng hình yên ngựa.
Sau giai đoạn hình yên ngựa, thân nhung tiếp tục phát triển để phân nhánh lần thứ hai.
Cùng với quá trình này là sự hóa sừng dần của nhung theo chiều từ gốc đến ngọn, từ
trong ra ngoài – thời kỳ hình thành sừng. Thời kỳ này cũng gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn phân nhánh lần thứ hai: đỉnh thân nhung hình thành rãnh nhỏ và thân
nhung phân nhánh lần thứ hai. Khi nhánh thứ hai phát triển hoàn thiện, bướu thứ ba lại

được hình thành trên thân nhung.
Giai đoạn phân nhánh lần thứ ba: trên bướu thứ ba tạo thành rãnh nhỏ và tiếp
tục phân nhánh giống như giai đoạn phân nhánh lần thứ hai để tạo thành cặp sừng ba
nhánh.
Giai đoạn bong lớp da ngoài sừng: sau khi cặp sừng hươu có dạng ba nhánh, lớp
da có lông tơ bao bọc xung quanh sừng thoái hóa dần. Quá trình hóa sừng vẫn tiếp tục
diễn ra. Khi kết thúc quá trình hoá sừng, hươu bắt đầu cọ sừng vào cây, mô đất… làm
bong lớp da bao bọc bên ngoài. Cặp sừng mới này sẽ tồn tại cho đến mùa rụng sừng
năm sau.
1.1.3. Thành phần hóa học chính trong nhung hươu
Thông thường, thành phần hóa học của nhung hươu khô bao gồm 34% tro thô,
12% nước và 54% chất hữu cơ. Thành phần này có sự thay đổi tùy thuộc vào từng loài
hươu, độ tuổi của sừng, cũng như là vùng sừng (đỉnh, trên, giữa và gốc) được khảo sát.
Nhung hươu đang phát triển chứa nhiều loại tế bào khác nhau như nguyên bào sợi,
nguyên bào sụn, tế bào sụn, tế bào xương. Đỉnh của nhung hươu chứa các tế bào tiền
thân trung mô. Những tế bào này được chuyển đổi dần thành sụn. Sau đó, sụn sẽ
chuyển thành xương dưới tác động của testosterone. Sự vôi hóa này diễn ra một cách tự
nhiên trong suốt quá trình tạo sừng. Ngoài ra, nhung hươu còn chứa những hợp chất có
hoạt tính sinh học như collagen, glycosaminoglycan (GAG), polysacharide, các
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

3

hormon tăng trưởng (insulin – like growth factor – 1 & 2), prostaglandin. Đây đều là
những hợp chất quý, thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu.
1.1.4. Một số tác dụng dược lý của nhung hươu
Nhung hươu đã được dân gian sử dụng từ rất lâu. Trong Đông y, nhung hươu
được coi là vị thuốc bổ dùng trong các trường hợp mệt nhọc, thần kinh suy nhược, mụn
nhọt độc, làm điều hòa huyết mạch, chữa khớp xương bị sưng phù. Khoảng những năm
40 của thế kỷ XX, các nhà nghiên cứu phương Tây cũng bắt đầu công cuộc tìm hiểu

công dụng của nhung hươu. Mặc dù các cơ chế sinh học của những công dụng này vẫn
chưa được giải thích một cách rõ ràng, nhưng bước đầu có thể thấy rằng nhung hươu
có nhiều công dụng quý đối với sức khỏe con người.
1.1.4.1. Tác dụng đối với bệnh viêm xương khớp
Viêm xương khớp là bệnh của mô sụn. Bệnh xuất hiện cùng với các triệu chứng:
hàm lượng proteoglycans giảm, sụn bị hư hại, nền sụn và xương bị thoái hóa. Các
peptide glycosaminoglycan có thể ngăn chặn sự mất sụn và xương thông qua việc bổ
sung proteoglycan cho cơ thể. Vì vậy, khi chỉ định liệu pháp điều trị cho bệnh xương
khớp, glucosamine sulfate (GS) hay GAG khác – đặc biệt là chondroitin sulfate (CS) –
được thêm vào bên cạnh các thuốc giảm đau và tác nhân kháng viêm. Tuy chưa xác
định được cơ chế nhưng nhung hươu – một sản phẩm có chứa cả GS và CS – sẽ là một
giải pháp thích hợp cho bệnh viêm xương khớp.
1.1.4.2. Tác dụng đối với các bệnh thấp khớp
Ở bệnh thấp khớp, màng hoạt dịch của nhiều khớp xương bị viêm, nguyên bào
sợi trong màng hoạt dịch tràn ra làm hư hại cả sụn và xương. Ngoài ra, các tế bào T hỗ
trợ cũng làm tăng đáp ứng viêm. Tế bào T hỗ trợ bị ức chế bởi interleukin (IL) 4, IL –
b, và nhân tố tăng trưởng biến đổi beta (TGF – beta). Nhưng khi có mặt của kháng
nguyên phù hợp, tế bào T hỗ trợ lại tăng tiết và tích lũy các nhân tố ức chế. Như là một
kháng nguyên, collagen type II thành công trong việc kháng lại bệnh viêm khớp dạng
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

4

thấp. Vì thế, nhung hươu – một nguồn collagen type II quan trọng – có thể được sử
dụng để điều trị bệnh thấp khớp.
1.1.4.3. Tác dụng kích thích miễn dịch
Bạch cầu đơn nhân là một nhân tố cần thiết cho chức năng miễn dịch của hệ bạch
huyết, lách, tủy xương và mô liên kết lỏng. Sự gia tăng hàm lượng bạch cầu đơn nhân
có tác dụng nâng cao chức năng miễn dịch. Một số nghiên cứu chứng minh rằng hàm
lượng bạch cầu đơn nhân ở chuột cống tăng lên khi cho chúng dùng dịch chiết nhung

hươu, hay khả năng thực bào và hàm lượng globulin miễn dịch của chuột nhắt được
nâng cao khi tiêm pantocrin vào màng bụng.
1.1.4.4. Tác dụng làm giảm huyết áp
Theo những nghiên cứu đã công bố, các sản phẩm nhung hươu có tác dụng làm
giảm huyết áp. Tuy nhiên, mỗi sản phẩm lại có tác động khác nhau phụ thuộc vào quy
trình chế tạo ra sản phẩm đó. Nhưng nhìn chung, các nhà nghiên cứu đều đồng ý rằng
chính phức hợp cholin là tác nhân làm giảm huyết áp.
1.1.4.5. Tác dụng chống sốc
Theo kết quả nghiên cứu của Kang, sau khi bị đặt ở nhiệt độ khắc nghiệt và bị sốc
điện, chuột được cho ăn nhung hươu có thời gian hồi phục nhanh hơn so với con đối
chứng. Sự thoái biến của tuyến ức và chứng phì đại của tuyến thượng thận do tác động
của stress cũng được ngăn chặn nếu các đối tượng thí nghiệm được cho ăn nhung hươu.
Ngoài ra, nhung hươu còn có nhiều tác dụng về mặt sinh lý như kháng loét, kháng
nhiễm độc, giảm hàm lượng cholesterol, điều trị các bệnh viêm gan và thận, gia tăng
quá trình sản sinh hồng cầu, giảm sự phát triển của khối u, tăng tỉ lệ sống sót của đối
tượng ung thư, chống lại sự lão hóa…
1.2. Khái quát về tế bào gốc
Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa của cơ thể. Những tế bào này có khả
năng tự làm mới và biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng riêng biệt.
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

5

Khác với các loại tế bào khác của cơ thể, tất cả các tế bào gốc nói chung đều có hai đặc
điểm:
 Tự làm mới (self – renewal): có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ
phân bào mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa.
 Tiềm năng không giới hạn (unlimited potency): có khả năng biệt hóa thành bất
kỳ loại tế bào trưởng thành nào.
Tuy nhiên, trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với tế bào gốc toàn năng hoặc vạn

năng. Các tế bào gốc đa năng hay tế bào tiền thân chỉ có thể giới hạn biệt hóa thành
một số loại tế bào trưởng thành nhất định.
Một số động vật bậc thấp có thể tái sinh một phần cơ thể bị mất thông qua sự khử
biệt hóa các tế bào đã chuyên hóa thành các tế bào tiền thân. Những tế bào vừa được
khử biệt hóa này sẽ tăng sinh và hình thành các tế bào chuyên hóa mới của cơ quan tái
sinh. Tuy nhiên, hầu hết các hoạt động sửa chữa mô ở động vật có vú được thực hiện là
do sự biệt hóa của tế bào gốc thành các tế bào chức năng chứ không phải do sự khử
biệt hóa. Do đó, động vật có vú chỉ có thể sửa chữa những tổn thương nhỏ xảy ra cục
bộ ở mô hay cơ quan, không thể tái sinh những phần lớn cơ thể bị mất.
1.3. Tế bào gốc nhung hươu – lược sử nghiên cứu và tiềm năng ứng dụng
1.3.1. Thế giới
Bên cạnh các hoạt chất quý, nhung hươu còn được các nhà khoa học chú ý do
hiện tượng tái sinh đặc biệt của chúng – hiện tượng tái sinh duy nhất xuất hiện ở động
vật có vú. Ở một số loài hươu, nhung có thể phát triển thêm 2 cm mỗi ngày. Do vậy,
nhiều nhà nghiên cứu cho rằng đây là một quá trình được điều hòa bởi tế bào gốc. Tuy
nhiên, cơ chế của nó vẫn chưa được hiểu rõ. Các nghiên cứu về tế bào gốc nhung hươu
bắt đầu bằng việc nuôi cấy các tế bào được thu nhận từ vùng mô đang tăng sinh, khảo
sát tác động của các nhân tố tăng trưởng lên sự phát triển của các tế bào này trong điều
kiện in vitro. Bên cạnh đó, các nghiên cứu mô học của nhung hươu được tiến hành để
từ đó tìm ra và đánh dấu những vùng chứa các tế bào có vai trò điều hòa quá trình tăng
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

6

sinh. Tiếp theo, các tế bào tiềm năng sẽ được thu nhận và tiến hành đánh giá tính gốc.
Cuối cùng là việc khảo sát vai trò của tế bào gốc trong sự tăng sinh cũng như tái sinh
của nhung hươu. Việc xác định được cơ chế của sự tái sinh sẽ mang lại một ý nghĩa hết
sức to lớn cho lĩnh vực y học phục hồi nói chung. Khởi đầu cho các nghiên cứu này,
năm 1994, hai nhóm nghiên cứu do Sadighi M. và do Price J.S. đứng đầu đã chứng
minh rằng IGF – I và IGF – II có tác động định hướng đến sự phát triển các tế bào

nhung hươu nuôi cấy in vitro. Trong khi đó, các nhân tố này cũng thể hiện chức năng
điều khiển sự phát triển in vivo của nhung hươu. Năm 2001, Allen S.P. và cộng sự tìm
thấy vai trò của retinoic acid đối với sự biệt hóa tế bào để hình thành xương trong quá
trình tái sinh của sừng hươu [1]. Các tác giả này cho rằng có ba receptor (α, β, γ) cho
cả RAR (retinoic acid receptor) và RXR (retinoid X receptor) được biểu hiện ở các
phần khác nhau trong quá trình phát triển của nhung, như trong sụn và phần đã hóa
xương. Năm 2003, khi nghiên cứu hoạt động phân bào trong nhung hươu đang phát
triển, Matich J. và các cộng sự thấy rằng hoạt động phân bào của các tế bào mỡ và
xương thường diễn ra ở vùng ngoại vi hơn là trung tâm của lõi xương. Trong khi đó, sự
phát triển của biểu bì hầu như chỉ xảy ra ở phần đỉnh. Và để phục vụ cho những nghiên
cứu này, Li C. và Suttie J.M. đã đưa ra các phương pháp thu nhận mô nhung hươu [20].
Theo đó, mô nhung hươu được chia làm ba phần chính: thân, mầm và trung tâm phát
triển. Mỗi phần trên được thu nhận theo một cách khác nhau.

Hình 1.1. Mặt cắt vùng đỉnh đang tăng trưởng của nhung hươu
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

7

(S – da – skin, P – màng sụn – perichondrium, B – xương xốp – spongy bone, C – sụn
chưa bị khoáng hóa – non – mineralised cartilage, MC – sụn đang bị khoáng)
Năm 2006, Clark D.E. và cộng sự nghiên cứu sự hình thành mạch trong quá trình
phát triển của nhung hươu. Với tốc độ tăng trưởng có thể đạt tới 2 cm mỗi ngày, việc
phát triển cùng lúc của các mạch trong thời gian này là một điều hết sức thú vị. Dựa
vào hình thái của các mạch được quan sát, các tác giả này cho rằng, sự hình thành
mạch là do sự kéo dài của các mạch đã có sẵn hay sự đâm chồi để phát sinh các bó
mạch nhỏ.
Tiếp theo, các nghiên cứu về mặt mô học của nhung hươu đã được tiến hành.
Năm 2003, Kierdorf U. và cộng sự công bố kết quả nghiên cứu mô học của sự hình
thành xương trong sự phục hồi của cuống xương và giai đoạn sớm của sự tái sinh [15].

Theo đó, thành phần xương của phần phụ sọ tái sinh của hươu có nguồn gốc từ màng
xương cuống. Dựa vào sự khám phá trên các hệ xương khác, họ cho rằng tế bào gốc –
các tế bào có liên quan đến sự biệt hóa tạo xương và sụn – có mặt ở vùng màng xương
cuống này. Và những nghiên cứu của các nhóm tác giả khác như nhóm Li C. và Suttie
J.M., nhóm Kierdorf U. và Kierdorf H., nhóm Li C.… cũng cho kết quả tương tự. Kế
đó, năm 2007, Kierdorf U. và cộng sự đã đưa ra giả thuyết về sự tái sinh của sừng hươu
[16]. Theo các tác giả này, sự thay thế theo chu kỳ của sừng hươu là một hiện tượng tái
sinh khác thường ở động vật có vú, loài không có khả năng tái sinh lại những phần cơ
thể đã mất. Trước đây, sự tái sinh của sừng hươu được cho là một quá trình tái sinh các
bộ phận bị mất giống với sự tái sinh các chi ở lưỡng cư - sự phản biệt hóa. Tuy nhiên,
những nghiên cứu gần đây lại cho thấy không giống như sự tái sinh các phần đã mất ở
lưỡng cư, sự tái sinh ở sừng hươu liên quan đến sự biệt hóa tế bào. Nghiên cứu này cho
rằng sự tái sinh sừng hươu là một hiện tượng dựa vào tế bào gốc, và phụ thuộc vào sự
hoạt động theo chu kỳ của các tế bào gốc nằm trong màng xương của cuống. Cũng
trong năm 2007, Berg D.K. và cộng sự đã tiến hành nhân bản hươu đỏ từ tế bào gốc
nhung hươu và các tế bào con cháu của chúng. Dòng tế bào cho được phân lập từ màng
xương cuống, các tế bào này (antlerogenic periosteum – AP) là chưa biệt hóa hay đã
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

8

được cảm ứng bằng hóa chất thành tế bào tạo xương hay tạo mỡ. Và họ thấy rằng,
không có sự khác biệt của phôi khi dùng các loại tế bào khác nhau để chuyển nhân [4].
Cuối cùng, năm 2008, Rolf H.J. và cộng sự tại trường Đại học Goettingen
(Goettingen, Đức) đã đưa ra những bằng chứng quan trọng về sự tồn tại của các tế bào
gốc nhung hươu [25]. Theo đó, họ tìm thấy sự hiện diện của các tế bào dương tính với
marker tế bào gốc trung mô STRO – 1 trong các vùng khác nhau của sừng tái sinh và
nguyên phát cũng như trong cuống của sừng hươu. Phân tích FACS chứng minh nuôi
cấy tế bào sơ cấp từ màng xương cuống hươu đực thu được quần thể tế bào dương tính
với STRO – 1, CD271, CD133. Kết quả nghiên cứu mà nhóm Rolf H.J. và cộng sự thu

được hoàn toàn phù hợp với giả thuyết sự tái sinh sừng được xây dựng từ các tế bào
gốc hoặc tế bào tiền thân trung mô nằm ở lớp trong màng xương của sừng. Các tác giả
này cho rằng ổ tế bào gốc nằm ở lớp trong màng xương của sừng và sự tái sinh sừng
phụ thuộc vào sự hoạt động có tính chu kỳ của các tế bào gốc đó. Trong cuống sừng,
các tế bào STRO – 1+ cũng luôn nằm cạnh các sợi mô cơ (mô cơ xương trán). Trong
quá trình tái sinh sừng, các tế bào STRO – 1+ được tìm thấy trong nội mô mạch và
màng xương, trong mô dưới da của cuống và cả trong vùng sụn. Bên cạnh đó, nhuộm
hóa mô miễn dịch cũng thấy các tế bào dương tính với marker tế bào gốc CD271 cũng
nằm ở các vị trí tương tự trong sừng đang tái sinh. CD271, thụ thể nhân tố tăng trưởng
thần kinh ái lực yếu (LNGFR), là marker chung trong phân lập tế bào gốc trung mô
trực tiếp từ dịch tủy xương. Đến nay, chức năng của LNGFR trong tế bào tiền thân
trung mô vẫn chưa được làm rõ, nhưng nó có thể đóng vai trò đặc trưng hình thái trong
quá trình phát triển của khoang tủy xương người và các cơ quan khác. Nhuộm kép
STRO – 1 và CD271 cho thấy các tế bào trong màng xương sừng hươu có thể dương
tính với cả hai marker.
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

9


Hình 1.2. Các tế bào STRO – 1+ trong những vùng khác nhau của cuống [25]
(a) mẫu cuống (hình (b) và (c)) được cố định bằng Methylmetacrylate, nhuộm HE, E
(biểu mô), D (chân bì), SC (mô bề mặt dưới da – dấu hoa thị), Mf (phần mô cơ xương
trán), Fa (mô bị xé mỏng trong suốt quá trình mô học), CP (lớp trong màng xương), B
(xương cuống); (b) cuống trái và nhung nguyên phát của con đực hoang dại một năm
tuổi (Dama dama), sừng được cắt dưới khúc lồi để thu nhận cuống; (c) mặt cắt của
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

10

cuống ở trong hình (b), hình chữ nhật trắng đánh dấu vùng chỉ ra trong hình (a); đối với
các hình d – m: kháng thể STRO – 1 kết hợp với kháng thể thứ cấp chuột IgM gắn
thuốc nhuộm huỳnh quang, nhuộm nhân với Hoechst 33342; (d, e) các tế bào STRO –
1+ trong lớp lưới của chân bì, định vị trong các sợi collagen dày; (d) chỉ tế bào STRO –
1+ phát huỳnh quang, (f) kiểm soát âm, tương tự như trong (e), các đốm xanh nhỏ là
hồng cầu được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang; (g) các tế bào STRO – 1+
liên kết với thành mạch trong mô dưới da; (h) kiểm soát âm giống trong (g); (i – k) các
tế bào STRO – 1+ giữa các sợi của mô cơ trán; (i) nhuộm huỳnh quang kết hợp với
kháng thể thứ cấp; (j) chỉ tế bào STRO – 1+ phát huỳnh quang, giống trong (i); (k)
kiểm soát âm tương tự trong (i); (l) các tế bào STRO – 1+ trong lớp trong màng xương;
(m) kiểm soát âm, tương tự trong (l).
1.3.2. Việt Nam
Ở Việt Nam, nhung hươu đã được sử dụng từ lâu, chủ yếu dưới dạng lát khô hoặc
cao chiết theo kinh nghiệm dân gian. Gần đây, một số công trình nghiên cứu về thành
phần hóa học và tác dụng dược lý của nhung hươu đã được thực hiện.
Năm 1993, Đái Duy Ban và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần các acid
amin tự do trong nhung hươu nuôi bán tự nhiên ở Ba Vì. Thông qua việc sử dụng các
phương pháp sắc ký và điện di, các tác giả đã bước đầu xác định nhung hươu chứa hơn
17 loại acid amin và có tất cả các loại acid amin thiết yếu.
Năm 1996, Phó Đức Thuần và các cộng sự chứng minh nhung hươu dạng lát khô
có tác dụng tốt đến hoạt động tim và não của động vật thí nghiệm.
Năm 2000, tác giả Quan Vân Hùng đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng bổ
huyết của nhung nai trên bệnh nhân ung thư. Theo nghiên cứu, tình trạng thiếu máu
được cải thiện trên đại đa số bệnh nhân có sử dụng nhung nai, kết quả này phù hợp với
kinh nghiệm của y học cổ truyền khi sử dụng nhung nai giải quyết tình trạng thiếu máu
do suy tủy xương. Các hoạt chất sinh học trong nhung nai đã kích thích tủy xương bị
suy yếu vì nhiễm độc hóa chất tái hoạt động để sản xuất hồng cầu một cách nhanh
chóng. Hầu hết bệnh nhân có sử dụng nhung nai cảm thấy khỏe hơn, các rối loạn chức
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

11

năng liên quan đến thiếu máu và việc ăn ngủ được cải thiện, đặc biệt là chưa phát hiện
tác dụng phụ.
Mặc dù ở nước ta nhung hươu đã được sử dụng từ lâu đời, và đây là nguồn tài
nguyên quý hiếm, nhưng cho đến nay việc nghiên cứu chuyên sâu tế bào nhung hươu
đặc biệt là tế bào gốc nhung hươu để hiểu rõ hơn về nhung hươu nhằm nâng cao khả
năng ứng dụng còn khả mới mẻ và chưa được quan tâm đúng mức.
1.4. Tính cấp thiết của đề tài
Khi chất lượng cuộc sống được nâng cao, nhu cầu về dinh dưỡng của con người
cũng thay đổi. Ngày nay, con người mong muốn thực phẩm không chỉ đảm bảo đủ
calo, ngon, sạch, mà còn phải chứa các hoạt chất sinh học tự nhiên cần cho sức khỏe và
sắc đẹp. Bên cạnh đó, thực phẩm cũng được yêu cầu phải mang lại cho người sử dụng
khả năng miễn dịch cao, chống sự lão hóa, tăng tuổi thọ, giúp phòng ngừa được một số
bệnh, kể cả ung thư. Vì vậy, thực phẩm chức năng – loại thực phẩm bổ sung các hoạt
chất có tác dụng như là những vị thuốc quý, giúp con người bồi bổ sức khỏe, phòng
ngừa bệnh tật – ngày càng được quan tâm và sử dụng rộng rãi.
Nhung hươu là một vị thuốc quý, đã được dân gian sử dụng từ rất lâu đời. Các
hoạt chất thu nhận từ nhung hươu cho thấy một tiềm năng to lớn trong việc cải thiện và
bồi bổ sức khỏe. Vì vậy, nhung hươu được xem như là một nguyên liệu đầy hứa hẹn
dùng để chế biến thực phẩm chức năng. Tuy nhiên, những nghiên cứu in vitro về thành
phần và công dụng của nhung hươu vẫn chưa được thực hiện nhiều. Ở Việt Nam, đây
là một lĩnh vực hoàn toàn mới. Vì vậy, sự thành công của đề tài đặc biệt rất có ý nghĩa
trong lĩnh vực thực phẩm chức năng.
1.5. Ý nghĩa và tính mới về khoa học thực tiễn
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, nhung hươu chứa một loạt
những hoạt chất sinh học quý như: proteoglycan, parathyroid hormone – related
peptide (PTHrP), glycosaminoglycan, collagen, hormone tăng trưởng, nhân tố tăng
trưởng, chất chống oxi hóa… Đặc biệt, năm 2008, Hans J. Rolf và cộng sự tại trường
đại học Goettingen (Đức) đã thu nhận thành công các tế bào giống tế bào gốc từ nhung

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

12

hươu. Điều này mở ra một tiềm năng ứng dụng mới, đó là: có thể thu nhận, nuôi cấy và
tạo ra số lượng lớn các tế bào gốc nhung hươu trong phòng thí nghiệm để thu nhận các
hoạt chất sinh học quý thay cho phương thức nuôi hươu truyền thống như hiện nay.
Việc này sẽ giúp tiết kiệm được rất nhiều tiền của, thời gian và bảo vệ môi trường
sống.
Bên cạnh đó, các nghiên cứu mới đây còn chứng minh quá trình tái sinh hằng
năm của nhung hươu - một loài động vật hữu nhũ - có thể phụ thuộc vào sự hoạt động
tuần hoàn của các tế bào gốc trung mô nằm trong màng xương cuống. Kết quả này
cũng cho thấy sự tái sinh các mô và nhiều phần phụ khác trong động vật hữu nhũ là
một quá trình dựa trên tế bào gốc. Do đó, việc nghiên cứu tế bào nhung hươu sẽ mang
lại một ý nghĩa to lớn trong lĩnh vực y học phục hồi.

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

13

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu và tiến trình nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu mô nhung hươu sao (lộc nhung) thu nhận từ Trại chăn nuôi hươu sao
Trường Thịnh, Xã Phước Tân, Huyện Long Thành, Tỉnh Đồng Nai (hình 2.2). Sau đó,
mẫu mô được chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để xử lý sơ bộ.
2.1.2. Tiến trình nghiên cứu

Mô nhung hươu tươi
Đông lạnh
Giải đông
Thu nhận tế bào đơn
Xác định tính gốc
của tế bào nhung hươu
1. Thu nhận tế bào đơn
2. Nuôi sơ cấp
3. Cấy chuyền tăng sinh
Phân tích
dựa trên

kiểu hình

Phân tích
dựa trên
khả năng
tăng sinh
Phân tích
dựa trên
khả năng
biệt hóa
Nghiệm thu đề tài Vườn ươm

14

Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các nội dung nghiên cứu

Hình 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao
2.2. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.1. Danh mục các dụng cụ sử dụng trong đề tài
Tên dụng cụ Hãng sản xuất Mã hàng
Đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng Corning 3512
Đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng Corning 3596
Flask nuôi cấy tế bào T25 Corning 430168
Màng lọc tế bào 70 µm BD Biosciences 352350
Ống đông lạnh Nunc 377267
Ống li tâm 15 ml Corning 430791
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã thiết bị