Định danh các type gen của Helicobacter pylori và ý nghĩa bệnh học trong ung thư dạ dày ( Bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM chủ nhiệm đê tài PGS.TS. Trần Thiện Trung )

MỞ ĐẦU
Ung thư dạ dày là một trong các bệnh ung thư được quan tâm nhiều vì là ung thư
thường gặp, gây tử vong cao; vì chẩn đốn trễ dù đã có khá nhiều các phương tiện chẩn
đốn hình ảnh hiện đại trong đó có nội soi tiêu hóa phát triển khá tốt, và ngoài nội soi
đến nay vẫn chưa có các xét nghiệm sinh học, các chẩn đốn về gen giúp phát hiện và
chẩn đoán sớm ung thư dạ dày được ứng dụng trong thực hành. Hơn nữa ở nước ta hiện
chưa có các biện pháp theo dõi, định hướng tầm soát ở cấp độ quốc gia các bệnh nhân
có nguy cơ cao của ung thư dạ dày.
Xu thế của các nhà nghiên cứu trên thế giới hiện nay về ung thư dạ dày có ba hướng
nghiên cứu chính:
(1) Thứ nhất là tập trung vào tiến trình các thương tổn tiền ung thư dạ dày như viêm
teo, chuyển sản ruột và nghịch sản nhằm phát hiện, chẩn đoán và điều trị sớm ung thư
dạ dày. Các nghiên cứu đi theo hướng này dựa trên các thương tổn qua nội soi dạ dày và
chẩn đốn mơ bệnh học theo các phân loại về viêm dạ dày chuẩn mực hiện nay đã được
thế giới công nhận như hệ thống Sydney (1990), Sydney cải tiến (1994), Whitehead…
và mới đây là đánh giá giai đoạn viêm dạ dày OLGA (operative link on gastritis
assessment) có khả năng giúp tiên lượng nguy cơ mắc phải ung thư dạ dày;
(2) Thứ hai là tập trung nghiên cứu về các týp gene của tác nhân sinh bệnh như vi
khuẩn H. pylori, vi khuẩn này được Tổ chức phòng chống ung thư thế giới và Tổ chức y
tế thế giới (WHO) năm 1994 xếp là tác nhân nhóm 1 nguy cơ gây bệnh ung thư dạ dày.
Nhiều công bố cho thấy một số týp gene của hai gene có liên quan chặt chẽ đến khả
năng gây bệnh của vi khuẩn H. pylori là các týp của gene cagA và vacA, trên cơ sở đó
đặt ra nhiệm vụ tầm sốt những bệnh nhân có nguy cơ cao khi bị nhiễm H. pylori với
các týp gene này;
(3) Thứ ba là trong những năm gần đây, một hướng khác tập trung nghiên cứu về
gene nhằm tìm ra các marker để chẩn đốn sớm bệnh ung thư, vì sự thay đổi về gene
bao giờ cũng là sự thay đổi sớm nhất trước khi xuất hiện hình thái thay đổi tế bào. Việc
1


nghiên cứu tìm hiểu về cơ chế gây ung thư để từ đó tìm ra phương pháp chẩn đốn sớm

và điều trị hiệu quả đang là hướng đi đầy thách thức và đang được các nhà Y-Sinh học
hiện đại đặc biệt quan tâm.
Như vậy trong ba hướng nghiên cứu chính liên quan đến ung thư dạ dày hiện nay
trên thế giới, chúng tôi tập trung nghiên cứu về các týp gene của tác nhân sinh bệnh là vi
khuẩn H. pylori.
Vi khuẩn H. pylori được tìm ra vào tháng 4 năm 1982, kể từ đó đã có rất nhiều cơng
trình nghiên cứu về vi khuẩn này trên nhiều phương diện. Nhiễm H. pylori được biết là
nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người, gặp ở khắp mọi nơi trên thế giới. Tất cả bệnh
nhân nhiễm H. pylori đều có viêm dạ dày mô học, tương ứng với viêm dạ dày mạn kinh
điển với đặc điểm là sự thấm nhập của các tế bào đa nhân trung tính và các loại tế bào
viêm khác; tuy vậy, số đơng suốt đời khơng có triệu chứng và thực sự chỉ có một số nhỏ
là tiến triển thành loét dạ dày, loét tá tràng, ung thư dạ dày, hay u mô limphô ở niêm
mạc dạ dày [6].
Năm 1983, Marshall là một trong hai người tìm ra H. pylori lần đầu tiên đưa ra giả
thuyết về sự kết hợp giữa ung thư dạ dày và nhiễm H. pylori [22]. Mặc dù phải hơn 23
năm sau khi tìm ra vi khuẩn H. pylori, ngày 3 tháng 10 năm 2005, hai nhà khoa học-bác
sĩ người Úc là Robin Warren và Barry Marshall mới được nhận giải thưởng Nobel về Y
học và Sinh lý học. Cho đến nay, việc tìm kiếm những chiến lược can thiệp có hiệu quả
để phòng ngừa ung thư dạ dày cũng như điều trị nhiễm H. pylori vẫn đang là những vấn
đề còn hết sức thời sự tại nhiều nước trên thế giới [6].
Các yếu tố nguyên nhân và bệnh sinh ung thư dạ dày cịn chưa được làm sáng tỏ
hồn tồn như chế độ ăn nhiều muối, thức ăn có chứa chất nitrosamin, nhóm máu và sự
đột biến gene... Đặc biệt trong hơn hai thập kỷ gần đây, thế giới tập trung nghiên cứu về
vai trò của vi khuẩn H. pylori trong bệnh sinh ung thư dạ dày với khả năng gây bệnh của
các chủng H. pylori khác nhau.
Vì vậy việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh các týp gene của vi
khuẩn H. pylori trong ung thư dạ dày nhằm hiểu biết về bệnh sinh và các yếu tố nguy cơ
có tầm quan trọng và hết sức cấp thiết để có thể tìm ra các biện pháp phịng ngừa, giúp
2

chẩn đoán sớm và làm giảm tỷ lệ tử vong của căn bệnh này. Đó là lý do của cơng trình
mà chúng tơi tiến hành nghiên cứu « Định danh các týp gene của H. pylori và ý nghĩa
sinh bệnh học trong ung thư dạ dày » với ba mục tiêu:
1. Định danh các týp gene cagA và vacA của vi khuẩn H. pylori trong bệnh ung
thư dạ dày (trên bệnh nhân được phẫu thuật cắt bán phần dưới dạ dày do ung
thư hang vị).
2. Đánh giá mối liên quan giữa các týp gene cagA và vacA của vi khuẩn H. pylori
với các thương tổn mô bệnh học niêm mạc dạ dày về các mức độ : viêm teo,
chuyển sản ruột, nghịch sản và mức độ ác tính (độ biệt hóa) của ung thư dạ dày.
3. Đánh giá và so sánh tỷ lệ giữa các týp gene của vi khuẩn H. pylori trên hai
nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày và nhóm chứng viêm dạ dày có H. pyloridương tính.
Từ đó có thể ứng dụng để tiếp tục nghiên cứu, để theo dõi và tầm soát những bệnh
nhân viêm dạ dày H. pylori-dương tính với các týp gene mắc phải có nguy cơ cao nhằm
góp phần chẩn đốn sớm bệnh ung thư dạ dày.

3


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ung thƣ dạ dày
Trong các nguyên nhân gây tử vong, hiện nay ung thư đã vượt qua bệnh tim mạch
để trở thành căn nguyên hàng đầu với tỷ lệ mắc bệnh ngày càng cao mà độ tuổi ngày
càng giảm. Theo báo cáo năm 2007 của Viện nghiên cứu ung thư Mỹ, trên thế giới có
thêm khoảng 12 triệu trường hợp ung thư mới và có khoảng 7,6 triệu bệnh nhân tử vong.
Tại vùng Đơng Á và Đơng Nam Á, trong đó có Việt Nam có thêm khoảng 3,6 triệu
trường hợp ung thư mới với khoảng 2,5 triệu bệnh nhân tử vong mà ung thư dạ dày là
nguyên nhân đứng hàng thứ hai [24, 26].
Các nước có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao thuộc vùng Đông Á (Nhật bản, Trung
Quốc, Hàn Quốc), các nước thuộc Liên Xô cũ, Nam Mỹ, vùng Caribê và Nam Âu. Các

nước có tỷ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày thấp thuộc vùng Nam Á (Ấn Độ, Pakistan, Thái
lan), Bắc Mỹ, Úc và châu Phi... [21, 35].
1.1.1. Về điều trị
Năm 1996, Forman [22] cho rằng H. pylori là yếu tố nguy cơ cao của ung thư dạ
dày nên việc điều trị tiệt trừ H. pylori là điều cần và nên làm, điều trị tiệt trừ H. pylori
thành công có thể được coi là biện pháp dự phịng ung thư dạ dày. Một điều tra tầm soát
ung thư dạ dày ở 100.000 đàn ông tuổi từ 50 đến 59 ở các nước phương Tây, cho thấy
có khoảng 35.000 người có H. pylori -dương tính và 1.600 người sẽ tiến triển thành ung
thư dạ dày trong vòng 30 năm. Như vậy, người ta có thể ước tính là có khoảng 500 đến
1200 người trong số 1 600 trường hợp ung thư nói trên có thể có nguyên nhân liên quan
đến nhiễm H. pylori . Về lý thuyết, cần phải điều trị dự phòng cho 35.000 người bị
nhiễm H. pylori này và giá thành chi phí cho chiến lược điều trị này ở Anh là 5.00010.000 bảng để cứu được một người, tương đương với các chương trình tầm sốt ung
thư cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học hoặc tầm soát ung thư vú bằng chụp nhũ ảnh.
Chiến lược này đã thu hút được sự chú ý cao cũng như trả lời được nhiều câu hỏi đặt ra
trong thực hành. Tuy nhiên, nếu ở nhóm tuổi từ 50 đến 59 này mới được can thiệp thì
4


có thể coi là chậm trễ. Hiện nay, người ta cịn chưa rõ giai đoạn nào trong q trình tiến
triển đến ung thư là cịn có thể đảo ngược được. Ở những bệnh nhân nhiễm H. pylori ,
người ta thấy rằng các thương tổn của viêm niêm mạc dạ dày là có thể phục hồi và trở
lại bình thường sau điều trị tiệt trừ H. pylori thành công; nhưng đối với các thương tổn
khác như viêm teo niêm mạc hoặc chuyển sản ruột hoặc nghịch sản thì cịn cần phải
nghiên cứu thêm. Nếu các thương tổn này có thể hồi phục sau tiệt trừ H. pylori thành
cơng thì vẫn có thể hi vọng dự phòng được ung thư dạ dày trong dân số ở độ tuổi 55.
Việc điều trị cho những người nhiễm H. pylori trẻ hơn là cần thiết, tuy nhiên cần phải
theo dõi lâu dài. Tác dụng phụ của thuốc và tái nhiễm H. pylori sau điều trị tiệt trừ
cũng là những vấn đề cần được quan tâm. Liên quan đến cơ chế, nhiễm H. pylori ở
người có acid HCl bình thường và hậu quả của nhiễm H. pylori là thối hố mạn tính
biểu mơ dạ dày sẽ đưa đến viêm teo niêm mạc. H. pylori có thể được coi là yếu tố nguy

cơ chính về mơi trường ở giai đoạn đầu của ung thư dạ dày. Forman kết luận là ngày
nay, ngồi những nghi vấn có căn cứ, có sự liên quan giữa nhiễm H. pylori và nguyên
nhân của ung thư dạ dày. Nhiễm H. pylori chiếm khoảng 1/3 trong số một triệu trường
hợp ung thư dạ dày mới mỗi năm. Do đó vấn đề điều trị tiệt trừ H. pylori nhằm dự
phòng ung thư dạ dày được đặt ra, và cũng cần xác định xem chương trình tầm sốt
nhiễm H. pylori ở người lớn nên được thực hiện vào thời điểm nào để không bị chậm trễ
và đạt được hiệu quả cao. Vì vậy cần có những cơng tình nghiên cứu ngẫu nhiên có
nhóm chứng, và theo dõi đánh giá ít nhất trong 10 năm.
Mới đây, năm 2007, tại Hội thảo chuyên đề quốc tế về chủ đề “Phòng ngừa ung thư
dạ dày bằng tiệt trừ H. pylori” trong khuôn khổ Hội nghị lần thứ 92 của Hội Tiêu hóa
Nhật Bản. Sugano [39] cho rằng cần phải tiến hành cấp thiết việc điều trị tiệt trừ H.
pylori và coi đó là biện pháp đầu tiên để phòng ngừa bệnh ung thư dạ dày ở Nhật Bản.
Hàng năm ở Nhật, có gần 50.000 người chết vì ung thư dạ dày và hơn 100.000 trường
hợp ung thư dạ dày mới. Điều trị tiệt trừ vi khuẩn H. pylori mang lại một lợi ích khiêm
tốn là giảm được khoảng 20% đến 30% hay là ngăn chặn được hơn 20.000 trường hợp
ung thư dạ dày mỗi năm, đó là lý do mà chiến lược này được nhanh chóng chấp nhận ở
Nhật. Thêm vào đó, Nhật là nước có tỷ lệ ung thư dạ dày và tử vong cao nên chương
5


trình này cịn mang ý nghĩa chiến lược về mặt kinh tế-y tế góp phần giảm chi phí điều trị
cho người bệnh
1.1.2. Tiên lƣợng
Tỷ lệ sống thêm của ung thư dạ dày được chẩn đoán, điều trị ở giai đoạn sớm có thể
hơn 90% và ở các bệnh nhân được cắt dạ dày nhằm điều trị tận gốc vào khoảng 30%.
Nhìn chung, tiên lượng của ung thư dạ dày rất xấu và tỷ lệ sống thêm 5 năm sau mổ cuả
bệnh nhân ung thư dạ dày là khoảng 10% trường hợp tại các nước phương Tây và 40%
ở Nhật Bản và Hàn Quốc [7]. Nguyên nhân là phần lớn bệnh nhân ung thư dạ dày do
chẩn đốn muộn nên ít cịn có khả năng điều trị triệt để, cịn các trường hợp ung thư dạ
dày ở giai đoạn sớm thì rất khó phát hiện vì bệnh chỉ có ít hoặc khơng có triệu chứng

[18].
Vì vậy việc tầm sốt để theo dõi những bệnh nhân có các yếu tố nguy cơ, cũng như
chẩn đoán sớm bệnh ung thư dạ dày là hết sức quan trọng và cấp thiết
1.2.3. Các yếu tố nguy cơ trong bệnh ung thƣ dạ dày
Nhiễm H. pylori là điều kiện cần cho sự phát sinh ung thư dạ dày và ngồi ra cịn có
thêm các yếu tố kết hợp khác trong sự phát triển ung thư dạ dày theo (sơ đồ 1).
Các yếu tố môi trường (muối, các chất sinh ung thư…)
Thời gian nhiễm H. pylori (trên 20-80 tuổi)
Tình trạng chế tiết acid dạ dày (tùy theo các loại viêm dạ dày)
Yếu tố di truyền của ký chủ (chủng tộc, giới…)
Độc lực của các chủng H. pylori
Các yếu tố nguy cơ cao của các chủng H. pylori (cagA?)

 Ung thƣ dạ dày

Viêm dạ dày do nhiễm H. pylori

Sơ đồ 1.1: Các yếu tố có thể kết hợp trong ung thư dạ dày

6


Mối liên quan giữa nhiễm Helicobacter pylori (H. pylori) và ung thư dạ dày đã được
xác nhận bằng các thống kê dịch tễ học, các thực nghiệm trên động vật và các nghiên
cứu trên in vivo. Các phân tích gộp, các nghiên cứu bệnh-chứng đã xác nhận độ chênh
thuận giữa nhiễm vi khuẩn H. pylori và ung thư dạ dày. Các mơ hình thực nghiệm trên
con Gerbil Mơng cổ cho thấy nhiễm H. pylori làm tăng tỷ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày
và điều trị tiệt trừ H. pylori là cần thiết để có thể ngăn ngừa sự tiến triển thành ung thư
dạ dày [3, 6].
1.2. Vai trò của nhiễm Helicobacter pylori trong ung thƣ dạ dày

Helicobacter pylori (H. pylori), trực khuẩn có xoắn Gram âm có trong dạ dày
người (hình 1.1), có liên quan đến các bệnh về dạ dày-tá tràng và ung thư dạ dày.
Khoảng 90-95% các trường hợp loét tá tràng và 70-75% các trường hợp loét dạ dày
được cho là do nhiễm H. pyori [3, 6]. Từ năm 1994, H. pylori đã được Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) xếp vào nhóm I các tác nhân gây ung thư dạ dày, với hai dạng phổ biến là u
lympho (lymphoma) và ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma) [25].

Hình 1.1. Vi ảnh H. pylori chụp bằng kính hiển vi điện tử quét
Các chủng H. pylori khác nhau có thể có độc tính khác nhau trong q trình gây
bệnh trên người. Nhiều gene của H. pylori được chọn để phát hiện sự hiện diện cũng

7


như để đánh giá độc tính của vi khuẩn này trong bệnh phẩm như các gene urease, rRNA
16S, gene bám (adhesion gene).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung nghiên cứu hai gene cagA và vacA vì
sản phẩm của chúng được coi là hai yếu tố độc lực chủ yếu có khả năng gây bệnh, và
đặc trưng của vi khuẩn H. pylori.. Sự kết hợp các týp gene khác nhau giữa hai gene này
có thể liên quan đến biểu hiện lâm sàng khác nhau ở người bệnh. Các chủng có biểu
hiện cagA và vacA thể hiện vai trò gây bệnh rõ rệt, và được xem như là những chủng có
độc lực cao, được xếp vào týp I, để phân biệt với các týp khác.
1.3. Cơ chế bệnh sinh của nhiễm H. pylori trong ung thƣ dạ dày
Các yếu tố nguyên nhân và bệnh sinh ung thư dạ dày còn chưa được làm sáng tỏ
hồn tồn. Để giải thích được điều này, các tác giả trên thế giới hiện nay đang tập trung
nghiên cứu các yếu tố gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn H. pylori, trong đó protein VacA,
protein CagA là những tác nhân chính có khả năng gây bệnh. Phần lớn các nghiên cứu
đều cho thấy nhiễm H. pylori mang týp gene (genotype) có độc lực cao (sản xuất ra
protein CagA, VacA) kết hợp cùng với yếu tố ký chủ, có các thay đổi về di truyền như
thay đổi về gene thì có nguy cơ gây ra ung thư dạ dày rất lớn [9, 20].

1.3.1. Gene cagA
H. pylori có thể chia ra hai nhóm: sinh độc tố và khơng sinh độc tố là do kiểu
gene biểu hiện khác nhau, nói cách khác do có hoặc khơng có gene cagA: chủng có
mang gene cagA hay cagA-dương tính và khơng mang gene cagA hay cagA-âm tính. Sự
hiện diện của gene cagA ở một chủng thường có liên quan đến những hậu quả lâm sàng
nghiêm trọng cho người bị nhiễm [17].
Protein CagA, có kích thước 128-140 kDa, là gene độc tố trên tế bào ở vùng tiểu
đảo sinh bệnh (cagPAI: cytotoxin associated gene of pathogenicity island) có trong các
chuỗi DNA của hệ gene H. pylori. Protein CagA được chuyển dời vào trong các tế bào
đích thơng qua hệ thống cơ cấu bài tiết týp IV. Khi vào trong tế bào, protein CagA bị
tyrosine phosphoryl hóa, dẫn đến sự tăng sinh bất thường của các tế bào biểu mô dạ

8


dày., làm hư hại vùng niêm mạc dạ dày bị xâm nhiễm, gây viêm teo dạ dày, và là tiền đề
quan trọng cho sự phát triển của ung thư dạ dày [3, 6, 34].
1.3.2. Gene vacA
Hầu hết các chủng H. pylori đều có 1 bản sao của gene vacA, nhưng trong số đó
chỉ 50-60% gây độc. Gene vacA có chiều dài vào khoảng 3864 - 3933 bp, là một
monocistron, mã hóa cho protein VacA có trọng lượng phân tử vào khoảng 140 kDa, có
khả năng cảm ứng hình thành khơng bào. Trong nghiên cứu phân tử của Altherton, cấu
trúc gene gene vacA được phân lập có hai cặp alen ở vùng giữa (middle) gọi là m1 và
m2 và ba cặp alen khác cùng họ có trình tự ký hiệu (signal) là s1a, s1b và s2. Độc lực
cao hay thấp của gene vacA phụ thuộc vào các týp gene của hai vùng này. Chủng H.
pylori với týp gene vacA s1/m1 cảm ứng tạo không bào mạnh hơn, làm gia tăng phản
ứng viêm và có khả năng gây bệnh cao hơn các týp gene khác. Protein VacA ngăn chặn
sự tăng sinh các tế bào T và ảnh hưởng đến phản ứng miễn dịch của ký chủ dẫn đến tình
trạng nhiễm dai dẳng [9, 10].
Để hiểu rõ hơn về tính đa dạng và vai trò của các týp gene vacA của H. pylori liên

quan đến các bệnh dạ dày, Rhead và cs [36] đã nêu lên ngồi 2 vùng giữa của gene vacA
có các týp gene là m1 hoặc m2 và vùng tín hiệu có các týp gene là s1 hoặc s2 cịn có
vùng trung gian (intermediate) ký hiệu là i. Ở vùng trung gian có 2 cặp alen khác nhau
gồm i 1 (vacuolating) và i 2 (nonvacuolating). Tất cả các cặp gene vacA s1/m1 thuộc týp
i 1, tất cả các gene vacA s2/m2 thuộc týp i 2, và vacA s1/m2 có thể thuộc týp i 1 hoặc i
2.
Trong nghiên cứu của Basso và cs [12], trên 203 bệnh nhân nhiễm H. pylori gồm 53
ung thư dạ dày, 52 loét dạ dày, và 98 viêm dạ dày. Kết quả chủng H. pylori có cagA (+)
có liên quan đến ung thư dạ dày (p<0.001), và loét dạ dày (p<0,05). Gene vacA s1 và
vacA týp i 1 có liên quan đến ung thư dạ dày và vacA týp i 1 với loét dạ dày, tỷ số chênh
2,58 (khoảng tin cậy 95%: 1,19-5,61). Các tác giả kết luận ở các Phương Tây, nguy cơ
bệnh ung thư dạ dày có liên quan đến chủng H. pylori với gene cagA EPIYA-C, tỷ số
chênh 7,37 (khoảng tin cậy 95%: 1,98-27,48) ; đối với nguy cơ loét dạ dày liên quan đến
vùng trung gian của gene vacA týp i 1.
9


. Liên quan giữa cagA với cấu trúc gene của vacA như sau: những chủng có cagAdương tính đều có trình tự alen là s1 và những chủng có cagA-âm tính có trình tự alen s2
[16]. Nói cách khác, chủng sinh độc tố là những chủng có cagA-dương tính thì có vacA
s1và có khả năng gây bệnh cao hơn so với những chủng H. pylori có cấu trúc di truyền
khác [13, 16]. H. pylori có thể được phân định ra làm 4 týp: týp I khi có cagA-dương
tính vacA-dương tính; týp II khi khơng có hai gene này; týp III khi cagA-dương tính
vacA-âm tính; và týp IV khi cagA-âm tính vacA-dương tính. Týp I ở H. pylori có thể độc
hại hơn và phân lập được thường xuyên hơn từ các bệnh nhân ung thư dạ dày ở các
nước phương Tây [35]. Tại các nước châu Á kể cả Nhật Bản có độ lưu hành ung thư dạ
dày rất cao, hầu hết các chủng H. pylori cũng thuộc týp I [6].
Bach và cs [11] nghiên cứu các chủng týp I của H. pylori phân lập từ các bệnh nhân
người Áo và người Bồ Đào Nha. Ở 41 chủng từ Áo, 8 trong số 14 (57,2%) phân lập từ
các bệnh nhân viêm dạ dày, 14 trong số 19 (73,7%) từ các bệnh nhân loét dạ dày, và 8
trong số 8 (100%) từ các bệnh nhân ung thư dạ dày thuộc các chủng týp I. Ở 39 chủng

từ Bồ Đào Nha, các số liệu tương ứng của các chủng týp I lần lượt là 8/14 (57,2%),
10/12 (83,3%), và 5/13 (38,5%). Như vậy, ở hai dân số nghiên cứu, tỷ lệ H. pylori týp I
thì giống nhau ở các nhóm viêm dạ dày và loét dạ dày. Tuy vậy, sự lưu hành của týp I ở
các bệnh nhân ung thư dạ dày người Áo thì cao hơn có ý nghĩa (p=0,007). Sau cùng,
thử nghiệm PCR-đặc hiệu cho cagE là đáng tin cậy trong việc phát hiện cagPAI ở các
chủng H. pylori. Tuy vậy, tại các nước châu Á kể cả Nhật Bản có độ lưu hành ung thư
dạ dày rất cao, hầu hết các chủng H. pylori cũng thuộc týp I.
1.3.4. Gene urease
Nhiều nghiên cứu cho thấy vai trò của urease, do gene urease mã hóa, trong sự
tồn tại và khả năng gây bệnh của H. pylori. Urease xúc tác phản ứng thủy giải urea tạo
CO2 và NH3 làm trung hòa pH acid của dịch dạ dày. Sự hình thành một lượng lớn NH 3
còn dẫn đến sự xuất hiện một lượng lớn các dẫn xuất của NH3 như monochloramine có
tính gây độc cao cho tế bào chủ. Ngồi ra, urease cịn có thể làm tăng tính linh động của
vi khuẩn và ức chế quá trình thực bào của cơ thể chủ. Một số vi sinh vật khác cũng có
thể sản sinh urease như Proteus spp., Morganella spp., Providencia, …
10


1.3.5. Mối liên quan giữa các gene và cơ chế bệnh sinh
Nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rõ là các yếu tố độc hại của H. pylori bao
gồm sản phẩm của cagPAI, urease, VacA và lipo-polysaccharide tác động qua lại với tế
bào biểu mô dạ dày, điều này chứng tỏ là có liên quan đến q trình sinh ung thư của dạ
dày. Như đã nói ở trên, cagPAI là cụm gene độc hại chủ yếu và protein CagA được
chuyển dời vào trong các tế bào đích thơng qua hệ thống cơ cấu bài tiết týp IV, được
tyrosine phosphoryl-hóa và tác động như một yếu tố tăng trưởng. Một trong những chức
năng quan trọng của CagA là kích hoạt các đáp ứng tế bào kể cả một số lớn các biểu
hiện gene. Nhiễm H. pylori làm kích hoạt các yếu tố phiên mã di truyền, chẳng hạn NFkB (nuclear factor kappa B) kích thích tiết IL-8, IL-10, IL-12 và các phân tử tín hiệu bào
để tạo ra các yếu tố phiên mã AP-1, đưa đến sự biểu hiện của nhiều gene, chẳng hạn các
gene sinh u, và các gene của COX-2 (cyclooxygenase-2), các chất kích thích hóa học và
các yếu tố kháng-chết tế bào theo chương trình (antiapoptotic). Họ các protein kích hoạt

1 (activating protein 1/AP-1) của các yếu tố phiên mã giữ một vai trò trung tâm trong sự
sinh sản tế bào và sự biến đổi thành ung thư. Các phức hợp AP-1 gồm có các họ tiền
ung thư Fos, Jun và ATF, được kích hoạt do các kích thích ngoại tế bào bao gồm các
yếu tố tăng trưởng, các cytokine, và các tín hiệu của stress tế bào. Dẫn đến tăng phiên
mã c-fos và tăng phosphoryl-hóa c-Jun, các protein này được coi là những sản phẩm tiền
ung thư (Hình 1.2) [6].

Hình1. 2. Sinh sản tế bào phụ thuộc cag PAI và sản xuất IL-8 tại các tế bào dạ dày
bị nhiễm H. pylori
11


Dùng kỹ thuật cDNA microarray để phát hiện các dòng tế bào ung thư dạ dày bị
nhiễm H. pylori, hơn 300 gene được tìm thấy có mức độ biểu hiện mRNA thay đổi tại
những thời điểm khác nhau, trong số đó 1/4 liên quan đến bộ khung tế bào, 1/3 kết hợp
với chu kỳ tế bào, sự chết và phân chia của tế bào, biểu lộ IL-8 cũng được điều hịa
mạnh lên. Nhiễm H. pylori với cagPAI-dương tính có thể gây ra chết tế bào theo
chương trình chủ yếu là thông qua các ti thể và các tác dụng kháng-chết tế bào theo
chương trình bằng kích hoạt NF-kB trong các tế bào ung thư dạ dày. Biểu lộ COX-2
được điều hòa mạnh lên trong nhiễm H. pylori ở các tế bào biểu mơ dạ dày mà có thể
tham gia vào sự sinh ung thư dạ dày. Các sản phẩm khác của gene cũng có thể chuyển
dời vào trong các tế bào đích và đẩy nhanh sự sinh sản cũng như sự chết theo chương
trình của tế bào.
Tóm lại khi H. pylori tiếp xúc với tế bào dạ dày ở người, sẽ dẫn đến: kích thích tiết
IL-8, IL-10, IL-12 do hoạt hóa yếu tố NF-kB; tiết và chuyển dời protein CagA vào trong
tế bào, rồi protein này bị tyrosine phosphoryl hóa; kích thích tạo ra các yếu tố phiên mã;
sau cùng tạo ra các sản phẩm tiền ung thư c-Fos, c-Jun [3]. Một số nghiên cứu gần đây
đã cho thấy một số khía cạnh mới về vai trị của nhiễm H. pylori trong ung thư dạ dày,
chẳng hạn như tính đa dạng của các gene H. pylori, tính đa dạng di truyền của IL-1, vấn
đề chết tế bào theo chương trình, các biến đổi thuộc di truyền và thuộc qui trình biểu

sinh của một quá trình nhiều bước trong sự sinh ung của dạ dày…
1.3.6. Tính đa dạng gene ở H. pylori
Nghiên cứu của Yakoob và cs [43] khảo sát tính đa dạng gene của H. pylori, tiến
hành trên các bệnh nhân người Trung Quốc ở bệnh viện Xiangya (Hunan) từ tháng 11/
1998 đến tháng 1/1999. Tính đa dạng DNA của các vi khuẩn được xác định bằng
phương pháp “dấu ấn di truyền” theo hai phương pháp PCR-RAPD (polymerase chain
reaction - random amplified polymorphic DNA) và PCR-RFLP (polymerase chain
reaction - restriction fragment length polymorphism). Từ các mẫu bệnh phẩm phân lập
được bốn mươi chủng, cho thấy tính đa dạng về gene của H. pylori là hết sức lớn. Một
vị trí đơn lẻ trong dạ dày thường có một chủng riêng cư trú và chủng này ngăn chặn sự
tăng trưởng của các chủng khác. Tính nhạy cảm với kháng sinh của các chủng H. pylori
12


có thể khơng giống nhau tại các vị trí khác nhau của dạ dày. Tính đề kháng với kháng
sinh có thể chuyển cho nhau giữa các chủng. Nghiên cứu cho thấy là so với các nước
châu Âu, ở người Trung Quốc hay gặp hơn tình trạng nhiễm đồng thời nhiều chủng vi
khuẩn H. pylori.
1.3.7. Vấn đề chết tế bào theo chƣơng trình
Sugiyama và cs [40] năm 2004, có đề cập đến vấn đề chết theo chương trình của tế
bào với sự sinh ung của dạ dày. Theo đó, sự tồn vẹn của niêm mạc dạ dày được duy trì
do sự cân bằng giữa tỷ lệ tổn thất tế bào và tỷ lệ tái sinh hay sinh sản của tế bào H.
pylori có nhiều các yếu tố độc hại có thể gây tổn thất cho các tế bào biểu mô dạ dày.
Độc tố tạo không bào của H. pylori gây độc trực tiếp cho tế bào, và monochloramine (là
sản phẩm phản ứng của các gốc oxy-hóa sinh ra từ các tế bào đa nhân trung tính thâm
nhập trong niêm mạc dạ dày với ammonium của H. pylori) cũng như lipase và protease
bắt nguồn từ chính H. pylori đều có tác dụng gián tiếp làm thương tổn tế bào qua cơ chế
miễn dịch. Nghiên cứu hóa mơ miễn dịch trên niêm mạc dạ dày tự nhiên cho thấy sự
tăng biểu lộ của các thụ thể CD95 (Apo-1/Fas) trong các tế bào biểu mô và trong các
limphô bào của lớp cận niêm gây độc hại cho tế bào qua trung gian tế bào T. Ngồi ra,

H. pylori có khả năng trực tiếp gây ra sự chết theo chương trình của tế bào thơng qua sự
kích hoạt của họ caspase, nhất là caspase-9 và caspase-3. H. pylori cịn có thể làm điều
hịa mạnh lên sự biểu hiện Smad5, gây ra sự chết theo chương trình của các tế bào biểu
mơ dạ dày (Hình 1.3), [31].

Hình 1. 3: Động học tế bào biểu mơ dạ dày nhiễm H. pylori trong ung thư dạ dày
13


Các tác giả cũng đã xác định là chỉ có các chủng H. pylori cagPAI-dương tính mới
có khả năng đem lại Smad5 mRNA cũng như gây ra sự chết theo chương trình của các
tế bào dạ dày ở người. CagA là protein của H. pylori duy nhất được biết là chuyển vị từ
vi khuẩn vào trong tế bào qua hệ thống bài tiết týp IV và có thể nghĩ rằng sự chuyển vị
này là cần thiết cho sự điều hòa mạnh lên của Smad5 ở các tế bào biểu mô dạ dày.
Nghiên cứu động học tế bào của niêm mạc dạ dày bị nhiễm vi khuẩn H. pylori cho thấy
sự chết theo chương trình và sự sinh sản của các tế bào biểu mô dạ dày cả hai đều tăng
nhanh tương xứng với mức độ teo của niêm mạc dạ dày [42].
Tuy vậy, sự chết theo chương trình nói chung bị ức chế ở các tế bào ung thư trong
khi sự sinh sản của tế bào biểu mô dạ dày vẫn tiếp tục nhanh và tiến triển thành ung thư
dạ dày. Sau khi chuyển sang giai đoạn không thể đảo ngược trong một chuỗi các trình tự
viêm dạ dày-viêm teo-ung thư (điểm khơng thể trở lại) thì việc điều trị tiệt trừ vi khuẩn
H. pylori có thể khơng cịn có tác dụng nữa trong việc đề phòng sự tiến triển thành ung
thư.
Như vậy, một nghiên cứu về các cơ chế chết tế bào theo chương trình do nhiễm H.
pylori có thể là đầu mối quan trọng cho việc chọn ra những người nào cần được tiệt trừ
để đề phịng có hiệu quả sự tiến triển thành ung thư, bởi vì đứng về mặt tài chính, khơng
thể điều trị tiệt trừ cho tất cả mọi người bị nhiễm H. pylori không triệu chứng.
1.4. Các nghiên cứu về ung thƣ dạ dày liên quan nhiễm H. pylori trong nƣớc
Ở Việt Nam, ước tính mỗi năm có khoảng 15 000-20 000 người bị ung thư dạ dày.
Tại Hà Nội giai đoạn 1993-1995, theo Đoàn Hữu Nghị, tỷ lệ mắc ung thư dạ dày ở nam

là 25,7/100 000 dân so với 12,5/100 000 dân ở nữ [3]. Tại thành phố Hồ Chí Minh năm
1997, theo Nguyễn Chấn Hùng và cs [2] tỷ lệ mắc ung thư dạ dày là 18,8/100 000 dân ở
nam và là 7,3/100 000 dân ở nữ.
Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm H. pylori cao, và ung thư dạ dày
hiện đang là một vấn đề lớn trong các bệnh ung thư đường tiêu hoá. Cho đến nay, việc
nghiên cứu để hiểu rõ hơn về bệnh sinh của ung thư dạ dày và tìm kiếm những chiến
lược can thiệp có hiệu quả để phịng ngừa ung thư dạ dày là những vấn đề hết sức quan
trọng và cấp thiết tại nước ta.
14


Nguyễn Xuân Vinh [8], trên 118 bệnh nhân ung thư dạ dày, có tỷ lệ chẩn đốn
huyết thanh H. pylori-dương tính là 93,2%. Nghiên cứu cho thấy ở người nhiễm H.
pylori, nguy cơ ung thư dạ dày cao gấp 5 lần so với người không bị nhiễm với tỷ suất
chênh là 5,34 (khoảng tin cậy 95%, 2,34-12,1). Tác giả cho rằng có sự liên quan giữa
nhiễm H. pylori với ung thư dạ dày, và đưa ra kiến nghị là đối với những người nhiễm
H. pylori có các yếu tố nguy cơ cao như lớn tuổi, viêm loét dạ dày, hay trong tiền sử gia
đình có người bị ung thư dạ dày thì cần điều trị tiệt trừ vi khuẩn H. pylori càng sớm
càng tốt.
Tạ Long và cs [4] nghiên cứu mối liên quan giữa ung thư dạ dày và nhiễm H. pylori,
trong thời gian từ tháng 3/2003 đến tháng 4/2004, tại các bệnh viện Trung ương Quân
đội 108, bệnh viện Bưu điện và bệnh viện Việt Đức-Hà nội. Có 208 bệnh nhân, được
chia làm 2 nhóm: (1) 104 ung thư dạ dày; và (2) 104 viêm dạ dày mạn tính xác định
bằng mơ bệnh học. Chẩn đốn H. pylori thực hiện bằng nội soi dạ dày-tá tràng và làm
các thử nghiệm CLOtest, mơ bệnh học, PCR và chẩn đốn huyết thanh. Tỷ lệ H. pyloridương tính trên chẩn đốn huyết thanh ở nhóm ung thư dạ dày và nhóm viêm dạ dày
mạn lần lượt là 90,6% và 88,1% (p=0,76), trên CLOtest là 55,1% và 44,5% (p=0,43), và
trên mô bệnh học là 71,1% và 57,6% (p=0,04). Trong số 104 trường hợp ung thư dạ
dày, týp ruột theo phân loại Lauren là 81,7% và týp lan tỏa chỉ là 18,3%. Ba mươi tám
mẫu được gửi làm PCR tại Đại học Fukui (Nhật Bản), cho thấy týp cagA-dương tính Á
đơng có khả năng gây bệnh viêm dạ dày chiếm tỷ lệ 82,3%, cao hơn so với 47,6% trong

ung thư dạ dày. Trong ung thư dạ dày, tỷ lệ gặp viêm dạ dày mạn tính hoạt động ở các
mức độ vừa và nặng là 55,7%, cao hơn so với 40,1% gặp viêm dạ dày mạn (p=0,05).
Các tác giả kết luận là có mối liên quan giữa nhiễm H. pylori với ung thư dạ dày.
Ở Việt Nam, nghiên cứu của Trần Ngọc Ánh [1] năm 2006 cho thấy tỷ lệ H. pylori
týp I trong ung thư dạ dày là 78,6% cao hơn trong viêm dạ dày là 33,3%, tỷ lệ H. pylori
có cagA-dương tính và vacA-dương tính ở nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày lần lượt là
80,9% và 97,6%, cao hơn ở nhóm bệnh nhân viêm dạ dày là 47,6% và 52.3% (p<0,05),
nguy cơ ung thư dạ dày cao gấp 4,86 lần với cagA-dương tính và gấp 32,27 lần với
vacA-dương tính so với nhiễm H. pylori cagA-âm tính vacA-âm tính. Tuy nhiên hạn chế
15


trong nghiên cứu của tác giả là chưa có điều kiện phân tích các phân týp của vacA nhằm
đánh giá đầy đủ hơn về vai trò của týp H. pylori cagA-dương tính và vacA-dương tính
trong bệnh ung thư dạ dày.
Nghiên cứu của Tạ Long và cs [3] cho thấy tỷ lệ nhiễm H. pylori týp I trong loét dạ
dày là 73,3%, tương đương với trong ung thư dạ dày là 75%, và cao hơn trong viêm dạ
dày là 46,7%.
Tóm lại :
Các nghiên cứu dịch tễ học vào cuối thập niên những năm 1990 đã nêu lên mối liên
quan giữa nhiễm H. pylori và ung thư dạ dày ở người. Các nghiên cứu thực nghiệm trên
gerbil Mông Cổ cũng đã chỉ ra mối liên quan này và việc tiến hành điều trị tiệt trừ H.
pylori là cần thiết để có thể ngăn ngừa sự tiến triển thành ung thư dạ dày.
Điều trị tiệt trừ H. pylori có nhiều hứa hẹn trong phịng ngừa ung thư dạ dày. Cần có
những nghiên cứu tiếp tục và phải được theo dõi lâu dài để làm sáng tỏ nguồn gốc cũng
như các điều kiện để viêm dạ dày tiến triển thành các thương tổn tiền ung thư và ung thư
như đã được biết đến trong các nghiên cứu của những thập kỷ qua.
Các yếu tố sinh ung khác có thể kết hợp với nhiễm H. pylori trong bệnh ung thư dạ
dày, nhưng các yếu tố độc lực cao của các chủng H. pylori có khả năng gây bệnh đóng
vai trị quan trọng trong bệnh sinh của ung thư dạ dày cần được nghiên cứu và làm sáng

tỏ thêm.
1.5. Tính cấp thiết của đề tài
Như đã trình bày ở trên, bệnh ung thư dạ dày thường chẩn đốn muộn, chẩn đốn
sớm ung thư dạ dày cịn rất nhiều khó khăn trong điều kiện và hồn cảnh ở nước ta hiện
nay kể cả ở các nước phát triển. Việc chẩn đoán ung thư dạ dày ở giai đoạn muộn dẫn
đến ít cịn khả năng điều trị triệt để và tiên lượng sống thêm sau mổ ung thư dạ dày rất
xấu. Định danh các týp gene của vi khuẩn H. pylori và nghiên cứu ý nghĩa bệnh học của
các týp gene này trong ung thư dạ dày nhằm :
1. Góp phần nghiên cứu về bệnh sinh của ung thư dạ dày với các týp gene mắc phải
có nguy cơ cao.
2. Liên quan giữa các týp gene với các thương tổn mô bệnh học niêm mạc dạ dày.
16


3. Sự biểu hiện của các týp gene của vi khuẩn H. pylori trên nhóm chứng bệnh nhân
viêm dạ dày có H. pylori-dương tính
Từ đó có thể ứng dụng để tiếp tục nghiên cứu, theo dõi và tầm soát những bệnh nhân
viêm dạ dày H. pylori-dương tính với các týp gene mắc phải có nguy cơ cao nhằm chẩn
đốn sớm bệnh ung thư dạ dày.
Là một trong số các Trường Đại học Y khoa trong nước, Đại học Y Dược thành phố
Hồ Chí Minh có một đội ngũ khoa học nhiều kinh nghiệm trong lĩnh vực Y học lâm
sàng cùng với việc hợp tác với các Trường Đại học bạn trong nghiên cứu y học cơ sở và
ứng dụng những tiến bộ khoa học trong lĩnh vực Y-Sinh học phân tử.
Dựa trên định hướng và khả năng phát triển của Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí
Minh kết hợp với Trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh,. Dựa trên
tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu « Định danh các týp gene của Helicobacter pylori
và ý nghĩa bệnh học trong ung thư dạ dày ». Đây là một cơng trình có tính khoa học và
giá trị thực tiễn cao với việc ứng dụng sinh học phân tử để giải quyết một vấn đề cấp
thiết và cụ thể đặt ra trong xu hướng phát triển chung của nền Y học Việt Nam nhằm
phục vụ sự nghiệp chăm sóc sức khỏe của người dân.

Vì vậy việc Định danh các týp gene của vi khuẩn Helicobacter pylori trong ung thư
dạ dày và nghiên cứu ý nghĩa bệnh học của các týp gene này để từ đó có kế hoạch tầm
sốt và theo dõi những bệnh nhân có các yếu tố nguy cơ cao, cũng như chẩn đoán sớm
bệnh ung thư dạ dày là hết sức quan trọng và cấp thiết
1.6. Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn
Dựa trên việc ứng dụng sinh học phân tử để định danh các týp gene của vi khuẩn
Helicobacter pylori trong ung thư dạ dày. Việc định danh các týp gene, đặc biệt là gene
cagA-dương tính hoặc âm tính kết hợp với các týp gene vacA mà sự xuất hiện của các
týp này có liên quan đến biểu hiện lâm sàng khác nhau của bệnh viêm, loét hoặc ung thư
dạ dày. Đó là tiền đề hết sức quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới nhằm tìm hiểu
chủng có nguy cơ cao trong đặc điểm bệnh tật-ung thư dạ dày ở người bệnh Việt Nam.
Cơng trình nghiên cứu ngồi tính khoa học cịn có giá trị thực tiễn dựa trên các týp
gene có độc lực cao với mối liên quan đến ung thư dạ dày, trên cơ sở đó đặt ra kế hoạch
17


theo dõi và tầm sốt ở các nhóm bệnh nhân khác nhau để giúp chẩn đoán và phát hiện
sớm bệnh ung thư dạ dày. Đó cũng chính là việc áp dụng những tiến bộ của khoa học
trong lĩnh vực sinh học phân tử vào thực tiễn lâm sàng để phục vụ cơng tác chăm sóc
sức khỏe người bệnh. Vì vậy cơng trình ngồi ý nghĩa khoa học và thực tiễn cịn mang
tính xã hội và nhân văn....

18


CHƢƠNG II
ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP
VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2. 1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Trong khoảng thời gian từ tháng 12/2008 đến tháng 8/2010, tại Bệnh viện Đại học

Y Dược TP. Hồ Chí Minh kết hợp với Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí
Minh, chúng tơi tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình multiplex PCR ; và nghiên
cứu định danh các týp gene của vi khuẩn H. pylori ở 2 nhóm bệnh nhân viêm dạ dày và
ung thư dạ dày. Bệnh nhân được đưa vào nghiên cứu cư ngụ tại thành phố Hồ Chí Minh
và các tỉnh thành thuộc khu vực miền Nam Việt Nam.

2. 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu bệnh chứng
Thiết kế nghiên cứu bệnh chứng gồm 2 nhóm: nhóm bệnh ung thư dạ dày (ung thư
hang vị) được phẫu thuật cắt 2/3 dạ dày và nhóm chứng viêm dạ dày. Cả hai nhóm đều
có H. pylori-dương tính.
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh và loại trừ
2.2.2.1. Nhóm bệnh-Ung thƣ dạ dày
Tiêu chuẩn chọn bệnh
- Bệnh nhân ung thư dạ dày (ung thư hang vị-là vị trí chủ yếu chiếm trên 2/3 các
trường hợp ung thư ở dạ dày) được phẫu thuật cắt 2/3 dạ dày, nạo hạch R2.
- Chẩn đoán xác định bằng Giải phẫu bệnh: Carcinôm tuyến (ung thư biểu mô
tuyến-chiếm trên 95% các trường hợp ung thư dạ dày và là thương tổn có liên
quan đến nhiễm H. pylori được Tổ chức Y tế thế giới công nhận năm 1994).

19


- Như vậy : Trong tiêu chuẩn chọn bệnh phải đáp ứng đủ 2 điều kiện : (1) ung
thư dạ dày biểu mơ tuyến ; và (2) H. pylori-dương tính.
Tiêu chuẩn loại trừ
Không đủ dữ liệu, bệnh phẩm không đạt về kích thước và yêu cầu bảo quản đặt
ra; Các trường hợp loại trừ khác như ung thư dạ dày có H. pylori-âm tính.
Tiêu chuẩn chẩn đốn nhiễm vi khuẩn H. pylori
- Hai mẫu mô (1 ở hang vị và 1 thân vị) làm CLO test chẩn đoán H. pylori

- Hai mẫu mô làm mô bệnh học (1 mô bệnh và 1 mơ lành- thân vị, cách thương
tổn u ít nhất 5 cm). Mô bệnh xác định ung thư biểu mơ tuyến; mơ lành chẩn
đốn nhiễm vi khuẩn H. pylori và xác định các thương tổn mô bệnh học niêm
mạc dạ dày: viêm teo, chuyển sản ruột, nghịch sản và mức độ biệt hóa (ác tính)
của ung thư dạ dày.
- Hai mẫu mô (1 mô bệnh và 1 mô lành- thân vị, cách thương tổn u ít nhất 5 cm)
được gửi làm Multiplex PCR để chẩn đoán H. pylori và định týp gene.
- Như vậy, H. pylori-dương tính được định nghĩa khi cả ba thử nghiệm hoặc 2
trong 3 thử nghiệm nói trên dương tính, trong đó điều kiện bắt buộc là thử
nghiệm PCR-dương tính.
2.2.2.2. Nhóm chứng -Viêm dạ dày
- Bệnh nhân được nội soi dạ dày, sinh thiết từ 3-6 mẫu mô ở vùng hang vị.
- Một mẫu (nếu khơng đủ kích thước lấy 2 mẫu mơ) làm CLOtest chẩn đốn
nhiễm vi khuẩn H. pylori.
- Một mẫu (nếu khơng đủ kích thước lấy 2 mẫu mơ) gửi làm mơ bệnh học chẩn
đoán nhiễm vi khuẩn H. pylori và xác định các thương tổn mô bệnh học niêm
mạc dạ dày: viêm teo, chuyển sản ruột, nghịch sản. Kết quả mô bệnh học được
đọc do một bác sĩ Bộ môn giải phẫu bệnh-Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí
Minh sau khi đã thống nhất các tiêu chuẩn chẩn đoán các thương tổn nêu trên.

20


-

Một mẫu (nếu khơng đủ kích thước lấy 2 mẫu mơ) của nhóm bệnh nhân viêm dạ
dày gửi phát hiện týp gene bằng Multiplex PCR và định týp gene.

-

Để đáp ứng tiêu chuẩn và qui cách lấy mẫu chính xác, chúng tôi tập huấn và chọn
2-3 bác sĩ nội soi lấy mẫu. Số lượng mẫu viêm dạ dày có H. pylori-dương tính
chỉ lấy cho đến khi đủ theo thiết kế nghiên cứu.

2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu được tính dựa vào Statcalc trong phần mềm EPI-IFNO
phiên bản 3.5.1. Công thức tính cỡ mẫu dùng trong nghiên cứu bệnh – chứng:
(1 + r)2 (Z1- α/2 + Z1-β)2
n=
r(ln OR)2 p(1 – p)
Trong đó:
– OR =
–p=

p1(1 – p2)
p2(1 – p1)
p2 + rp1
r+1

– z1- α/2: giá trị của phân phối chuẩn tương ứng với ngưỡng sai lầm loại I. Chọn α =
5% để độ tin cậy của nghiên cứu (1 – α) = 95%, thì z1- α/2 = 1,96.
– z1- β: giá trị của phân phối chuẩn tương ứng với ngưỡng sai lầm loại II. Chọn β =
1% để hiệu lực của nghiên cứu đạt (1 – β) = 99%
Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Trần Ngọc Ánh [1] năm 2006 cho thấy tỷ lệ H.
pylori có cagA-dương tính và hoặc vacA-dương tính ở nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày
lần lượt là 80,9% và 97,6%, cao hơn so với 47,6% và 52,3% ở nhóm bệnh nhân viêm dạ
dày (p < 0,05). Chúng tôi ước lượng:
-

p1: tỉ lệ tiếp xúc với yếu tố nguy cơ trong nhóm bệnh, chọn p1 = 81%.

-

P2: tỉ lệ tiếp xúc với yếu tố nguy cơ trong nhóm chứng, chọn p2 = 48%.

Suy ra tỷ số độ chênh OR = 4,62.
– r: tỉ số giữa nhóm bệnh và nhóm chứng, để nghiên cứu khả thi chọn r = 1:1.
Như vậy cỡ mẫu cần thu thập tính cho cả 2 nhóm là 156 trường hợp, trong đó
- 78 trường hợp thuộc nhóm bệnh-ung thư dạ dày, và
- 78 trường hợp nhóm chứng-viêm dạ dày.

21


2. 3. NỘI DUNG TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU
2.3.1. Xây dựng quy trình Multiplex PCR định danh các týp gen của H.pylori
2.3.1.1. Các chủng vi khuẩn chứng
- H. pylori gồm 2 chủng :
(1) J99 (ATCC 700824) có kiểu gene cagA+, vacA s1m1, urease+
(2) Tx30a (ATCC 51932) có kiểu gene cagA-, vacA s2m2, urease+
- E. coli (ATCC 25922 và ATCC 35218)
- Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603)
- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)
- Salmonella typhimurium (ATCC 13311)
- Clostridium perfringens : mẫu thực địa đã giải trình tự
2.3.1.2. Mồi
Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được tổng hợp tại công ty IDT (Integrated
DNA Technologies - Hoa kỳ-xem trong quy trình).
2.3.1.3. Xử lý mẫu sinh thiết
Mẫu sinh thiết dạ dày được xử lý để : (1) bảo quản trong thời gian vận chuyển
mẫu đến phịng thí nghiệm, (2) tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết DNA tiếp theo.

Mẫu sinh thiết, có kích thước khoảng 3-5 mm, được cho vào các eppendorf 1,5
ml chứa sẵn dung dịch PBS 1X. Sau đó bổ sung 1 trong 3 loại dung dịch xử lý mơ : (1)
10 µl proteinase K (10 µg/ml); (2) 200 µl TE, 40 µl SDS 10%, 10 µl proteinase K (10
µg/ml); và (3) 200 µl TE và 40 µl SDS 10%. Mơ sau đó được cắt thật nhỏ, vortex mạnh
trong 10-15 giây và ủ ở nhiệt độ 700C trong 1-2 giờ. Sau giai đoạn này, có thể tiến hành
tách chiết DNA ngay hoặc giữ ở âm 200C cho đến khi tách chiết.
2.3.1.4.T ách chiết DNA H. pylori
Hai phương pháp tách chiết DNA được khảo sát là tách chiết dựa trên dung môi
hữu cơ phenol-chloroform (gọi tắt là tách chiết tủa) và tách chiết dựa trên sự hấp phụ
DNA lên màng silica (gọi tắt là tách chiết cột).
Quy trình tách chiết tủa : 100 µl dung dịch xử lý mẫu sinh thiết được cho vào
eppendorf 1,5 ml ; thêm vào 900 µl Trizol (phenol pH8), vortex mạnh và ủ trong 10
phút ở nhiệt độ phòng; tiếp đến cho vào 200 µl chloroform và lắc đều; ly tâm 13.000
22


vịng/10 phút ; 600 µl dịch nổi được chuyển vào một eppendorf 1,5 ml mới; thêm vào
900 µl ethanol tuyệt đối và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ âm 20oC ; ly tâm 13.000 vòng/10
phút để thu tủa DNA ; rửa tủa bằng 600 µl dung dịch ethanol 70o ; làm khơ 10 phút ở
nhiệt độ 60oC ; hịa tan tủa trong 50 µl TE và giữ ở 4oC hoặc âm 20oC tùy theo thời gian
bảo quản.
Quy trình tách chiết cột : 100 µl dung dịch xử lý mẫu sinh thiết được cho vào
eppendorf 1,5 ml; thêm vào 100 µl dung dịch ly giải tế bào (guanidinium hydrochloride
6M), vortex mạnh và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ 70oC ; thêm vào 50 µl isopropanol và
chuyển tồn bộ hỗn hợp vào cột tách chiết ; ly tâm 8.000 vòng/1 phút; rửa cột lần 1 bằng
dung dịch rửa (guanidinium hydrochloride 3M), rửa cột lần 2 bằng ethanol 70o ; dung
giải bằng 50 µl TE ở nhiệt độ 70oC trong 20 phút và giữ ở 4oC hoặc âm 20oC tùy theo
thời gian bảo quản.
2.3.1.5. Quy trình PCR
Kỹ thuật PCR sử dụng trong nghiên cứu bao gồm PCR monoplex (sử dụng một

cặp mồi đặc hiệu cho một trình tự mục tiêu), và PCR multiplex (sử dụng nhiều cặp mồi
nhân bản cho nhiều trình tự mục tiêu trong một phản ứng).
DNA bộ gene H. pylori sau khi tách chiết được dùng để tiến hành phản ứng PCR
monoplex và multiplex trong hệ thống PCR CFX96TM Real-Time (BioRad).
Quy trình PCR monoplex: Hỗn hợp phản ứng monoplex PCR bao gồm 1U Taq
DNA polymerase (Bio-Rad), 200 µM dNTP, 2 mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 200 nM
mỗi loại mồi xuôi và ngược (IDT) là một trong những cặp mồi đặc hiệu cho các gene
cagA, vacA s1/s2, vacA m1/m2, chứng nội hGST (glutathione-S-transferase) và 5 µl
DNA tách chiết trong tổng thể tích phản ứng là 25 µl.
Quy trình PCR multiplex : Hỗn hợp phản ứng multiplex PCR bao gồm 1U Taq
DNA polymerase (Bio-Rad), 200 µM dNTP, 2 mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 200 nM
mỗi loại mồi xuôi và ngược (IDT) gồm các cặp mồi đặc hiệu cho các gene cagA, vacA
s1/s2, vacA m1/m2, 50 nM mồi chứng nội hGST và 5 µl DNA tách chiết trong tổng thể
tích là 25 µl.
Chương trình nhiệt cho phản ứng monoplex và multiplex PCR : 3 phút 30 giây
0
ở 95 C, 40 chu kỳ lặp lại gồm 20 giây ở 940C, 40 giây ở 600C và 40 giây ở 720C, và
cuối cùng là 6 phút ở 720C. Chứng dương trong các phản ứng PCR là DNA tách chiết từ

23


các chủng H. pylori ATCC, với các sản phẩm nhân bản có týp gene cagA (+), vacA
s1m1 và cagA (+), vacA s2m2. Chứng âm trong các phản ứng PCR là nước cất hai lần
đã khử trùng.
2.3.1.6. Thiết kế mồi
Chúng tôi thiết kế các cặp mồi HP4-F/R, HP6-F/R, HP7-F/R, HP8-F/R, HP10F/R lần lượt dựa trên các vùng gene urease, cagA, vacA s1/s2, vacA m1/m2, smad4.
Việc thiết kế được thực hiện bằng các phần mềm chuyên dụng như ClustalX, Primer3,
Bioedit, Annhyb, Oligo Analyzer, BLAST và Primer-BLAST.
Trước tiên, các trình tự chứng NCBI của các gene mong muốn (Phụ lục 1) được

nạp xuống máy và sắp gióng cột để xác định các trình tự bảo tồn bằng ClustalX. Sau khi
xác định được vùng trình tự mong muốn, chọn trình tự đó để thiết kế mồi bằng công cụ
Primer-BLAST của NCBI và Primer3. Mồi được chọn theo các chỉ tiêu mong muốn với
phần mềm Oligo Analyzer. Đánh giá khả năng bắt cặp của mồi đã thiết kế với các trình
tự chứng NCBI bằng phần mềm Annhyb, Bioedit và BLAST.
2.3.1.7. Phương pháp điện di trên gel agarose
Sản phẩm nhân bản được quan sát qua điện di trên gel agarose 5% nhuộm
ethidium bromide (0,2 mg/mL) với thang phân tử 100 bp (Bio-Rad).
2.3.1.8. Giải trình tự
Mẫu DNA H. pylori chứng trong các phản ứng PCR là các sản phẩm nhân bản có
týp gen cagA (+) vacA s1m1 và cagA (+) vacA s1m2 được xác định giải trình tự. Các
sản phẩm này được gửi đi giải trình tự tại công ty Macrogene (Hàn Quốc).
2.3.2. Xác định các týp gene của H. pylori
Việc phát hiện và định týp H. pylori có thể được thực hiện bằng nhiều phương
pháp như giải trình tự, PCR và lai phân tử với mẫu dị đặc hiệu. Trong nghiên cứu này,
chúng tơi xây dựng quy trình (Sơ đồ 2.1) phát hiện và định týp gene cagA và vacA của
H. pylori từ mẫu sinh thiết dạ dày của bệnh nhân viêm và ung thư dạ dày có H. pyloridương tính bằng kỹ thuật multiplex PCR, cho phép phát hiện và định týp đồng thời các
gene vacA và cagA chỉ trong một phản ứng. Quy trình này nhằm tìm hiểu mối liên quan
giữa các týp gene cagA và vacA với các biểu hiện lâm sàng ở bệnh nhân ung thư và
viêm dạ dày. Bên cạnh đó, quy trình cịn là cơ sở để phát triển một phương pháp chẩn
đốn nhanh và chính xác tình trạng nhiễm H. pylori.
Kết quả áp dụng quy trình trên một số bệnh phẩm của bệnh nhân viêm và ung thư dạ
dày trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy ưu thế của týp gene cagA (+), vacA s1m1;
và cagA (+), vacA s1m2.
24


2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ
Dữ liệu thu thập được nhập, xử lý và phân tích bằng phần mềm SPSS 15.0. Các phép
kiểm T-test, Fisher’s exact, chi bình phương (χ2 ) được dùng trong nghiên cứu có ý

nghĩa thống kê khi p < 0,05. Xác định các yếu tố nguy cơ bằng tỷ số chênh (Odds Ratio)
với khoảng tin cậy 95%.
Sơ đồ 2.2. Quy trình định týp gen bao gồm các bƣớc
Mẫu sinh thiết dạ dày:
- Mẫu tươi
- Mẫu CLO test

Lưu mẫu (-20oC)

Xử lý mẫu sinh thiết:
- Nghiền
- SDS 10%
- 20 phút ở 70oC

Chuẩn bị hỗn hợp PCR multiplex:
- 1U Taq DNA polymerase
- 200 µM dNTPs
- 2 mM MgCl2
- 1X PCR Buffer
- 200 nM mồi (cagA, vacA s1/s2, m1/m2)
- 50 nM mồi hGST

Tách chiết DNA H. pylori:
- Phương pháp tủa
- Phương pháp cột

Chương trình multiplex PCR:
- 3 phút 30 giây ở 950C
- 40 chu kỳ lặp lại
o 20 giây ở 940C

o 40 giây ở 580C
o 40 giây ở 720C
- 6 phút ở 720C

Phân tích kết quả multiplex PCR

25