Protein CagA xâm nhập tế bào ung thư dạ dày AGS qua con đường dịch thể của Helicobacter pylori doc

TCNCYH 23 (3) 2003
Protein CagA xâm nhập tế bào ung th dạ dày AGS
qua con đờng dịch thể của Helicobacter pylori

Juanita. L. M
1
, Nguyễn Thị Hồng Hạnh
2

1
Trờng Đại học tổng hợp Michigan (Mỹ)
2
Viện Công nghệ Sinh học

Các dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori chứa các protein độc chất đợc hình thành từ lớp
màng ngoài của vi khuẩn Helicobacter pylori. Sự xâm nhập của chúng vào tế bào ung th dạ dày
AGS C120 đã làm tăng tổng hợp của interleukin IL-8.

I. Đặt vấn đề
Vi khuẩn Helicobacter pylori sống trong
lớp niêm mạc dạ dày của ngời và của một số
động vật. Chúng là các vi khuẩn chậm, vì
không có xu hớng tấn công vật chủ. Các bệnh
nh viêm loét và ung th dạ dày, loét hành tá
tràng là kết quả tơng tác giữa vi khuẩn và
vật chủ kéo dài tới hàng chục năm [3].
Các nghiên cứu cho thấy, 90% vi khuẩn H.
pylori bơi trong lớp niêm mạc của dạ dày
mà không tơng tác trực tiếp với dạ dày. Năm
1999, Fiocca phát hiện: vi khuẩn Helicobacter
pylori có thể tiết ra thể dịch chứa protein toxin

vacA [5]. ít nhất hai protêin nữa là CagA và
HP1125 [7] cũng đợc tìm thấy trong các dịch
thể [Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cs các kết quả
cha công bố].
Helicobacter pylori đợc chia thành hai
loại: Loại I mang đảo bệnh lý cag dài ~ 40 kb
và loại II không mang cag. Các chủng vi
khuẩn thuộc loại I thờng làm tăng tổng hợp
interleukin IL-8 trong tế bào dạ dày [10].
Stefano tìm thấy protein cagA đợc mã hoá bởi
gien cagA nằm trong đảo bệnh lý cag đã thâm
nhập vào trong tế bào chủ qua một cầu tiếp
hợp. Bên trong tế bào, protein đợc phospho
hoá bởi các Kinase [4]
Không rõ, sự tổng hợp của interleukin IL-8
trong tế bào biểu mô dạ dày là do cagA của vi
khuẩn H. pylori thâm nhập vào tế bào qua cầu
nối hay còn do những lý do khác nh tơng tác
với cagA của dịch thể? Câu trả lời sẽ giúp hiểu
rõ mối tơng tác của vi khuẩn với vật chủ trong
quá trình bệnh lý.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét
tơng tác giữa dịch thể của vi khuẩn
Helicobacter pylori, chủng VNH85 với tế bào
ung th AGS C120. Chúng tôi đã xác nhận,
các protein cagA trong dịch thể đã xâm nhập
vào tế bào ung th dạ dày AGS và làm tăng quá
trình tổng hợp interleukin IL- 8 của tế bào.
II. Đối tợng và phơng pháp
nghiên cứu

1. Đối tợng
- Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VNH-
85
- Tế bào AGS (có nguồn gốc từ ung th dạ
dày ngời nhận từ ACTT (American Type
culture)
2. Phơng pháp
2.1. Nuôi vi khuẩn H. pylori và tách chiết
các thể dịch của vi khuẩn.
Vi khuẩn Helicobacter pylori, dòng VNH-
85 [1] đợc nuôi trong môi trờng Brucella
lỏng có bổ sung 5% huyết thanh bò và các

49
TCNCYH 23 (3) 2003
kháng sinh tơng ứng. Sau 3-4 ngày, các thể
dịch đợc thu nhận bằng ly tâm dịch nổi ở
100.000g trong hai giờ ở 4o C
2.2. Nuôi cấy tế bào.
Tế bào AGS [2] nhận từ ACTT (American
Type culture) đợc nuôi trên đĩa Petri 35 mm
(Corning Glas Works, Corning, NY) trong môi
trờng Dulbecco / Eagle (Gibco-BLR) có bổ
sung 10% huyết thanh bò, penicillin (100
àg/ml) và streptomycin (100 àg/ml) trong điều
kiện 5% CO2 ở 37
o
C. AGS C120 là dòng các tế
bào ung th AGS đợc biến nạp 240 Gastrin
contruct (240 GasLuc) chứa phần điều khiển

của gen IL-8 và đã đợc chọn lọc trên môi
trờng G418 (Gibco-BLR).
2.3. Xử lý tế bào AGS C120 với các dịch
thể của vi khuẩn.
Các tế bào AGS đạt 80% confluence đợc ủ
với dịch thể ở nồng độ 3,5 àg / ml. Sau các
khoảng thời gian 12 giờ, 24 và 48 giờ, tế bào
đợc rửa bằng 1 x PBS lạnh và đợc xử lý với
Trypsin-EDTA trong vòng 10 phút ở 37
o
C.
Cũng ở các thời điểm 3, 6 và 21 giờ, 50 àl môi
trờng nuôi cấy tế bào đợc lấy để xác định
hàm lợng IL-8.
2.4. Định lợng protein: Protein đợc xác
định bằng Braford.
2.5. Tủa miễn dịch và phân tích Western.
Tế bào AGS thu thập ở 12, 18 và 24 giờ sau
khi ủ với các dịch thể đợc làm tan trong dung
dịch RIPA [0.15 mM NaCl / 0.05 mM Tris-HCl
pH 7. 2 / 1% Triton X-100 / 1% sodium
deoxycholate/ 0.1% SDS., 200mM vanadate, 5
mg/ml hỗn hợp protease ]. 200 àl của dịch tan
đợc trộn với 50 àl kháng thể đa dòng kháng
cagA và ử tiếp ở 4
o
C qua đêm. Cho thêm 50 àl
hạt Sepharose gắn protein A để tủa phức miễn
dịch. Hoà tủa protein trong 1x dung dịch
Laemmili (200 mM Tris-HCl pH 8., 8% SDS.,

1%Bromophenol Blue và 400 mM DTT).
Protein đợc phân giải bằng SDS - PAGE trên
gel Polyacrylamid Gradient nồng độ từ 4 đến
20%, sau đó đợc chuyển vào màng Hybond C
và lai với kháng thể đa dòng kháng protein
cagA.
2.6. Định lợng interleukin IL-8.
Interleukin IL-8 có trong dịch nổi nuôi cấy
tế bào đợc định lợng bằng phơng pháp
Elisa. Chế phẩm sinh học Quantikine của
R&D system, Inc. đợc sử dụng. Sản phẩm
màu của phản ứng Elisa đợc đo ở bớc sóng
550 nm
III. Kết quả
1. Xây dựng đờng chuẩn định lợng IL-
8.
Đờng chuẩn để xác định IL-8 đợc trình
bầy ở hình 1. Lợng IL-8 nhỏ nhất có thể xác
định bởi phơng pháp là 6,2 pcg.
2. Sự xâm nhập của các thể dịch của vi
khuẩn Helicobacter pylori vào tế bào AGS.
Các phân tích Western cho thấy, từ sau 12
giờ đợc ủ với các dịch thể của vi khuẩn
Helicobacter pylori, một số băng protein có
phân tử lợng 40 kDa, 35 kDa và 16 kDa đã
đợc phát hiện thêm trên Western đồ, chứng tỏ
các dịch thể đã thâm nhập vào trong tế bào ung
th AGS.
Các protêin có trọng lợng nhỏ hơn CagA
chứng tỏ, protein đã bị cắt bởi một vài protease

ở bên trong tế bào (hình 2). Hai protein của tế
bào ung AGS có phân tử lợng >85 kDa cho
phản ứng chéo với kháng thể đa dòng kháng
cagA cũng đợc phát hiện trên Western đồ.
3. Sự tăng tiết của IL-8 dới ảnh hởng
của các dịch thể
Các phân tích cho thấy, trong thí nghiệm
đối chứng, các tế bào ung th dạ dày AGS
C120 tổng hợp IL-8 invitro. Dới ảnh hởng
của các thể dịch của H. pylori, chúng đã gia
tăng tổng hợp IL-8 lên khoảng 1,5 lần. Lợng
interleukin IL-8 đợc tiết vào môi trờng tỷ lệ

50
TCNCYH 23 (3) 2003
thuận với thời gian ủ của dịch thể với vi khuẩn (hình 3).

OD (550nm)

1.5



1.0


0.5

6.2 12.5 25 50 (pcg)

Hình 1- Đờng chuẩn xác định hàm lợng của IL-8

IV. Bàn luận
Các kết quả phân tích của chúng tôi cho
thấy, dịch thể của vi khuẩn H. pylori, khi thâm
nhập vào trong tế bào ung th AGS đã làm tăng
mức độ tổng hợp của interleukin IL-8 trong tế
bào. Các nhà khoa học Nhật xác nhận: mức độ
tổng hợp interleukin IL-8 của các tế bào ung
th dạ dày có quan hệ trực tiếp với quá trình
tạo các mạch máu mới để nuôi mô ung th
cũng nh sự phát triển và di căn của các mô
ung th [6,9]. Sự tăng biểu hiện của MMP-9-
một protêinase gắn liền với khả năng
tấn công của các tế bào ung th dạ dày cũng
nằm trong sự ảnh hởng của interleukin IL- 8
[8].
Nh vậy, chúng tôi đã phát hiện protein
cagA có thể đi vào tế bào biểu mô dạ dày qua
con đờng dịch thể. Những nghiên cứu tiếp
sau sẽ đợc tập trung vào bản chất của các mối
tơng tác sẽ làm sáng tỏ ý nghĩa sinh học của
hiện tợng vừa đợc miêu tả.

1 2 3 4



kDa

184
121
85
68
52
40

28
22
16,8
Hình 2- Protein cagA của dịch thể
(chỉ bằng mũi tên) xâm nhập vào
trong tế bào ung th AGS
1- tế bào AGS không ủ với dịch thể.
2-4: AGS đợc ủ với các dịch thể
sau 12, 24 và 48 giờ.
Phân tử lợng của các protein
chuẩn đợc chỉ ở phía trái của hình.




1

2


3



51
TCNCYH 23 (3) 2003

IL-8 (pcg/ml)
a

b



c


3 6

OD (550nm)

3


2

1
1440
960
480

240
21 giờ

Hình 3- Sự thâm nhập của các thể dịch của vi khuẩn H. pylori, chủng VNH 85 vào trong tế bào
AGS C120 làm tăng quá trình tiết IL-8 vào môi trờng
a) Tế bào AGS 120 đợc ủ với IL-1
b) Tế bào AGS đợc ủ với các dịch thể của vi khuẩn
c) Tế bào AGS không bị xử lý.
V. Kết luận
Qua nghiên cứu này, chúng tôi xin rút ra
một số kết luận nh sau:
1. Protein cagA có thể thâm nhập vào tế
bào biểu mô dạ dày bằng con đờng dịch thể
của vi khuẩn Helicobacter pylori
2. Bên trong tế bào biểu mô dạ dày,
protein cagA đã làm tăng quá trình tổng hợp
của IL-8 lên gắp gần 2 lần.
Tài liệu tham khảo
1. Lê Băng Sơn và Nguyễn Thị Hồng Hạnh:
Study on Helicobacter pylori, strain 85 isolated
from a Vietnamese patient. International
workshop on Biology. Hanoi- Viet Nam. 1.
2001: 414 - 417.
2. Baranco, S.C., Townsend,C.M.,
Casartelli, Jr.C., Macik, B.G., Burger, N.L.,

Boerwinkle, W.R and Gourley, W.K:
Establishment and characterization of an
invitro model system for human
adernocarcinoma of the stomach. Cancer Res.
1983, 43: 11703 - 1709.
3. Blaser, M.J and Parsonet, J: Parasitism by
the slow bacterium Helicobacter pylori leads to
altered gastric homeostatis and neoplasia. J.
Clin. Investig. 1994 94: 4- 8.
4. Censini, S., Stein, M and Covacci, A.:
Cellular responses induced after contact with
Helicobacter pylori. Current opinion in
Microbiology. 2000, 4: 41- 46.
5. Fiocca, R., Necchi, V., Sommi, P., Ricci,
V., Telford, J., Cover, T.L., Solicia, E.:
Release of Helicobacter pylori vacuolating
cytotoxin by both a specific secrection pathway
and budding of outer membrane vesicles.
Uptake of released toxin and vesicles by gastric
epithelium. J. Pathol. 1999, 188: 220-226.
6. Kido, S., Kitadai, Y., Hattori, N et al:
Interleukin IL-8 and vascular endothelial
growth factor- prognostic factors in human
gastric carcinomas?. 2001, Eur J. of Cancer
37 : 1482- 1487.
7. Kim, J.S., Chang, J.H., Seo, W.Y., Yu,
G.J., Chung, S.I. and Yum, J.S.: Cloning and
characterization of a 22-kDa Outer-Membrane

52

TCNCYH 23 (3) 2003
Protein (Omp22) from Helicobacter pylori.
Mol. Cells. 2001, 10 (6): 633 - 641.
8. Kitadai, Y., Haruma, K., Mukaida, N et
al: Regulation of disease – prograsion genes in
human gastric carcinoma cells by interleukin
IL-8. 2000, Clin Cancer Res. 6 : 2735- 2740.
9. Kitadai, Y., Haruma, K., Sumii, K.,
Yamamoto, S., Ue, T., Yozaki, H., Yasui, W.,
Ohmoto, Y., Kajiyama, G., Filder, I. J and
Tahara, E [1998]. Expression of interleukin
IL- 8 correlates with vascularity in human
gastric carcinomas. Am. J. Pathol. 2001, 152 :
93-100.
10. Stein, M., Rappuoli, R and Covacci, A:
Tyrosine phosphorylation of the Helicobacter
pylori CagA antigen after cag-driven host cell
translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :
1263 - 1268.
C«ng tr×nh nghiªn cøu nµy ®−îc tiÕn hµnh
t¹i tr−êng §¹i häc Tæng hîp Michigan (Mü).

Summary
The protein cagA enters the AGS cells via the
interaction of the vesicles of Helicobacter pylori
The vesicles formed from the outer membrane of the bacterium Helicobacter pylori contain many
protein toxins such as cagA.,vacA, HP1125. The entry of the toxin-bearing particles into the gastric
cancerous cells AGS led to the increased synthesis of interleukin IL-8.

53