chiết tách các alcaloid crinamidin 6- hydroxy crinamidin của lá trinh nữ hoàng cung đạt yêu cầu độ tinh khiết trên 98%

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN
TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH


CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM
SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ







B
B
Á
Á
O
O


C
C
Á
Á
O
O


N
N

G
G
H
H
I
I
Ệ
Ệ
M
M


T
T
H
H
U
U




(Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 16/9/2010)





“CHIẾT TÁCH CÁC ALCALOIDCRINAMIDIN
VÀ 6-HYDROXYCRINAMIDIN CỦA LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG

ĐẠT YÊU CẦU ĐỘ TINH KHIẾT TRÊN 98%”












Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN HỮU LẠC THỦY
Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ






TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2010



a

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN
TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM
SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

Tên đề tài:

“Chiết tách các alcaloid Crinamdin và 6-hydroxycrinamidin
của lá Trinh Nữ Hoàng Cung đạt yêu cầu độ tinh khiết trên 98%”
(Isolation Crinamidin and 6-hydroxycrinamidin from Crinum latifolium L.
with required of 98 % pure)
Chủ nhiệm đề tài: Ths Nguyễn Hữu Lạc Thủy
Cơ quan chủ trì:
“Trung tâm phát triển khoa học và công nghệ trẻ - Thành đoàn TpHCM”
Thời gian thực hiện đề tài:
Kinh phí được duyệt: 80.000.000 (tám mươi triệu đồng).
Kinh phí đã cấp: 80.000.000 theo TB số: TB-SKHCN ngày
Mục tiêu của đề tài:
Chiết tách được
100 mg Crinamidin
50 mg 6–hydroxycrinamidin
với yêu cầu độ tinh khiết trên 98 %.
Nội dung:
Công việc dự ki
ế
n Công việc đã thực hiện
1 Thu thập dược liệu, chi
ế
t 50 g cao alcaloid toàn ph
ầ

n. Đã t
h
ực hiện
2 Thăm
d
ò c
á
c đ
i
ề
u kiện tách phân đoạn. Đã t
h
ực hiện
3 Qui trình tách Crinamidin và 6-hydroxycrinamidin Đã t
h
ực hiện
4 Xác định c
ấ
u trúc, định danh sản ph
ẩm
Đã t
h
ực hiện
5 Qui trình định lượng sản ph
ẩ
m có TNHC Đã t
h
ực hiện

b

Đề tài:

“Chiết tách các alcaloid Crinamdin và 6-hydroxycrinamidin
của lá Trinh Nữ Hoàng Cung đạt yêu cầu độ tinh khiết trên 98%”
(Isolation Crinamidin and 6-hydroxycrinamidin from Crinum latifolium L.
with required of 98 % pure)
TÓM TẮT
Đặt vấn đề
Hiện nay, các chế phẩm từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) với tác dụng điều trị
u phì đại lành tính tuyến tiền liệt và hỗ trợ điều trị ung thư như Tadimax, Crila, Panacrin đã
có mặt trên thị trường. Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm các chế phẩm này hiện đang gặp khó
khă
n vì thiếu chất chuẩn để có thể tiến hành kiểm nghiệm thường xuyên. Công trình này
nhằm phân lập nhanh một vài alcaloid từ lá TNHC làm chuẩn đối chiếu nhằm phục vụ công
tác kiểm nghiệm các chế phẩm chứa TNHC.
Phương pháp nghiên cứu
Từ alcaloid toàn phần của lá TNHC, dùng kỹ thuật VLC với các hệ dung môi tăng dần độ
phân cực, silicagel được tẩm đệm kiềm để phân lập nhanh các alcaloid tinh khiết. Alcaloid
sản phẩm đượ
c so sánh với alcaloid chuẩn trên sắc ký lớp mỏng, kiểm tra độ tinh khiết bằng
SKLHNC và xác định cấu trúc hóa học bằng các phân tích phổ học.
Kết quả và bàn luận
Từ 50 g cao alcaloid toàn phần, đã phân lập được 100 mg alcaloid G
1
và 50 mg G
2
(tinh khiết

trên 98 %, SKLHNC). Các dữ liệu phổ học đã khẳng định G
1
chính là Crinamidinvà G
2

chính là 6-hydroxycrinamidin. Điểm mới của nghiên cứu này là việc sử dụng silica gel đã
được xử lý bằng kiềm. Ưu điểm của phương pháp là giảm được thời gian rửa giải và tăng độ
tinh khiết của các hợp chất.

SUMMARY
Objectives
Extracts from Crinum latifolium have been proved to possess some properties in treatment of
the benign prostatic hyperplasia. Some of herbal drugs such as Tadimax, Crila, Panacrin
which all contain extracts from Crinum latifolium as bioactive components have appeared on
market for this therapeutic purpose. However, reference standards from Crinum latifolium
for medicine quality control purpose is in trouble due to the supply still not enough. This
paper reports a simple process to flash isolate a large amount of pure crinamidine an6-
hydroxycrinamidine for using as a working reference in order to control the herbal drugs
containing this extract as a bioactive component.
Experimentals
From total alkaloid residue of the leaves of , with a technique of VLC using basic modified
silica, nine fractions of alkaloid were separated. One of them (fraction G) was easily
crystalized to afford a pure alkaloid G
1
and G
2
.
Results and Conclusions
From 10 kg of the leaves of Crinum latifolium collected in Dong Nai province, 50 g of total
alkaloid residue was separated. With a VLC technique using basic modified silica gel as a

static phase, a large mount of alkaloid G
1
(100 mg) and G
2
(50 mg) were isolated
successfully from the total alkaloid residue. The structure of G
1
and G
2
were determined as
crinamidine and 6-hydroxycrinamidine [7], [12]., known alkaloids isolated from Crinum
latifolium L. species previously. The decrease in time of the process is an advantage of this
study.
c





Lời cảm ơn:
Nhóm nghiên cứu chúng tôi chân thành cảm ơn:
Sở khoa học và công nghệ Tp Hồ Chí Minh
Thành đoàn Tp Hồ Chí Minh
Trung tâm phát triển Khoa học và công nghệ trẻ, Thành đoàn Tp HCM
Khoa Dược, đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh
Bô môn Phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, đại học Y dược Tp HCM
Đã tạo điều kiện về mọi mặt như: hổ trợ kinh phí, trang thiết bị để chúng tôi thực
hiện và hoàn thành đề tài. Đề
tài đã bổ sung nguồn chất chuẩn có nguồn gốc tự
nhiên, góp phần trong công tác tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu Trinh Nữ Hoàng

Cung để làm thuốc. Đồng thời qua quá trình thực hiện đề tài đã giúp tích lũy, nâng
cao các kiến thức để nghiên cứu khoa học cho nhóm nghiên cứu chúng tôi và các
bạn sinh viên Khoa Dược, đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh.


ii



MỤC LỤC

Trang
1. TỔNG QUAN ……………………………………………………………. 1
1.1 CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG….…………………………………………. 1
1.2 CHẤT CHUẨN ……………………………………………… 5
1.3 VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU …………… 6

2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU … 7
2.1 NỘI DUNG 1: CHIẾT ALCALOID TOÀN PHẦN ….…………… …………7
2.1.1. Yêu cầu cần thực hiện ………………………………………………… … 8
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu………………….………………………… …… 8
2.2 NỘI DUNG 2: THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN TÁCH PHÂN ĐOẠN…… … ….…9
2.2.1. Yêu cầu thực hiện ………… ………………………………………… .… 9
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………….… … 9
2.3. NỘI DUNG 3: TÁCH PHÂN ĐOẠN, PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 10
2.3.1. Yêu cầu cần thực hiện 10
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 10
2.4 NỘI DUNG 4: TINH CHẾ SẢN PHẨM 11
2.4.1 Yêu cầu 11
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.5 NỘI DUNG 5: ĐỊNH DANH SẢN PHẨ
M 12
2.5.1 Yêu cầu thực hiện 13
2.5.2. Phương pháp nghiên cứu 13
2.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CRINAMIDIN TRONG VIÊN OPCRILATI 14
2.6.1 Quy trình định lượng………………………………………… …………….14
2.6.2 Thẩm định qui trình ………………………………………… ……… ……17
iii

3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 20
2.1 NỘI DUNG 1: CHIẾT ALCALOID TOÀN PHẦN ….………… ………… 20
2.2 NỘI DUNG 2: THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN TÁCH PHÂN ĐOẠN…… ……. 21
2.3. NỘI DUNG 3: TÁCH PHÂN ĐOẠN, PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 24
2.4 NỘI DUNG 4: TINH CHẾ SẢN PHẨM 25
2.5 NỘI DUNG 5: ĐỊNH DANH SẢN PHẨM 25
2.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CRINAMIDIN TRONG VIÊN OPCRILATI 27

4. KẾT LUẬN 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… ……… 29

iv


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VIẾT TẮT THUẬT NGỮ
IR Infrared spectra
NMR Nuclear Magnetic Resonance
SKLM Sắc ký lớp mỏng
SKLHNC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
TNHC Trinh Nữ Hoàng Cung
UV Ultraviolet spectra

DANH SÁCH BẢNG
SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG
2.1 Kết quả rửa giải qua cột silica gel tẩm đệm pH kiềm (cột 1) 8
2.2 Kết quả rửa giải qua cột silica gel tẩm đệm pH acid (cột 2) 9
2.3 Kết quả rửa giải qua cột silica gel không tẩm (cột 3) 9

2.4 So sánh G1, G2 với Crinamidin và 6-hydroxycrinamidin 12
2.5
So sánh G1, G2 với Crinamidin và 6-hydroxycrinamidin phổ IR
12
2.6 So sánh G1 với Crinamidin trên phổ NMR 13
2.7 So sánh G2 với 6-hydroxycrinamidin trên phổ NMR 13
2.8 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của Crinamidin

16
2.9 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử 16
2.10 Kết quả khảo sát tính tuyến tính 18
2.11 Kết quả khảo sát độ đúng 18
2.12 Kết quả khảo sát độ lặp lại 19
3.1 Hiệu suất chiết alcaloid từ bột lá TNHC 20
3.2 Một số hệ dung môi khai triển SKLM 21
3.3 Các bước thay đổi độ phân cực của dung môi qua sắc ký cột 22
3.4 Kết quả tách các phân đoạn alcaloid bằng SKC chân không 24
3.5 Khối lượng kết tinh thu được của phân đoạn G 25

v



DANH SÁCH HÌNH

SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG
2.1 Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu chuẩn đối chiếu Crinamidin 17
2.2 Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu thử 17
2.3 Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu thử thêm chất chuẩn 17
2.4 Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích 18

3.1 Sắc ký đồ cao alcaloid toàn phần chiết bằng CH
2
Cl
2
21
3.2 Sắc ký đồ các phân đoạn tách được qua cột (UV 365 nm) 23
3.3 Sắc ký đồ các phân đoạn tách được qua cột (UV 254 nm) 23
3.4 Sắc ký đồ các phân đoạn tách được qua cột (hơ iod) 23
3.5 Sắc ký đồ các phân đoạn tách được qua cột (TT Dragendorff) 23
3.6 Các phân đoạn G xuất hiện kết tinh 25
3.7 Sắc ký đồ của kết tinh trong các ống nghiệm phân đoạn G 26

1

I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
Tên khác: Tỏi lơi lá rộng.
Tên khoa học: Crinum latifolium L.
Họ: Loa kèn đỏ (Amaryllidaceae)
1.1.1. Mô tả:
Cây cỏ lớn. Thân hành to, hình cầu hoặc hình trứng thuôn, đường kính 8- 10cm, phủ
bởi những vảy hình bản to, dày, màu trắng. Lá mọc thành tán trên một cán dẹt, dài 30-
40cm; lá bắc rộng, hình thìa dài 7 cm, màu lục, đầu nhọn; hoa màu trắng pha hồng, dài
10- 15 cm; bao hoa gồm 6 phiến bằng nhau, khi nở đầu phiến quăn lại; nhị 6; bầu hạ.
Quả g
ần hình cầu (ít gặp).
1.1.2. Phân bố, sinh thái
Chi Crium L. có khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới; trong đó, một số
loài được trồng làm cảnh và làm thuốc tương đối phổ biến.
Cây trinh nữ hoàng cung có nguồn gốc từ Ấn Độ, hiện được trồng rộng rãi ở nhiều

nước trong khu vực Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào,
Việt Nam, Ấn Độ …. Ở Việt Nam, cây được trồng chủ y
ếu ở các tỉnh từ Quảng Nam-
Đà Nẵng trở vào, sau được trồng ở các tỉnh phía bắc.
Trinh nữ hoàng cung là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng râm 1 phần, sinh
trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới. Cây có
khả năng đẻ nhánh khoẻ, hàng năm có thêm 3- 5 hành con từ thân hành mẹ. Cây trồng
được 3 năm sẽ tạo thành một khóm lớn, có đến 20 nhánh ở các tuổi khác nhau.
1.1.3. Cách trồng
Trinh nữ hoang cung đang được trồng ở nhiều nơi, từ miền Bắc đến miền Nam.
Cây được nhân giống bằng thân hành vào mùa xuân (tháng 2- 3) ở miền Bắc và vào
đầu mùa mưa ở miền Nam. Chọn thân hành bánh tẻ, chưa ra hoa, không sâu bệnh để
làm giống. Năm đầu, cây hầu như không đẻ nhánh. Từ năm thứ 2 trở đi, cây mới bắt
đầu đẻ nhánh. Vì vậy, tốc độ nhân giống rất ch
ậm, nhất là khi cần nhân một dòng đã
chọn lọc. Hiện nay, đã có phương pháp nhân dòng vô tính khá nhanh bằng kỹ thuật
nuôi cấy in vitro.
2

Trinh nữ hoàng cung hơi ưa bóng, ưa ẩm (luôn luôn là 60- 70%). Chọn loại đất thịt
nhẹ hoặc trung bình, có khả năng giữ ẩm. Đất cần cày bừa kỹ, để ải, bón lót cho mỗi
hecta 25- 30 tấn phân chuồng, 500kg supe lân, 300 kg sulfat kali. Trộn đều phân với
đất, lên luống cao 25- 30 cm, mặt luống rộng 0,8m rồi trồng 2 hàng, mỗi hốc trồng 1
thân hành với khoảng cách 40 x 40 cm. Khi trồng, cần cắt bỏ hết rễ, cắt bớt lá, vùi sâu
vừa h
ết phần thân hành. Thường xuyên làm cỏ, xới xáo, vun kín thân hành, tưới đủ
ẩm. Cây có thể chịu được úng ngập trong vài ngày.
Trinh nữ hoàng cung bị một loại sâu đặc hiệu gây hại rất nghiêm trọng, đó là Brithys
crini Fabricius thuộc họ Noctuidae, bộ Lepidotera. Sâu xuất hiện vào đầu tháng hai,
gây hại tất cả các bộ phận.

1.1.4. Bộ phận dùng: Lá, thân hành.
1.1.5. Thành phần hoá học:
Trinh nữ hoàng cung được nghiên cứu về hoá học vào khoảng từ năm 1980.
Các alcaloid có trong trinh n
ữ hoàng cung thuộc 2 nhóm:
-Không dị vòng: latisolin, latisodin, beladin.
-Dị vòng: ambelin, crinafolin, crinafolidin, 11- O- acetylambelin, 11- O- acetyl 1,2 β-
epoxyambelin, lycorin, epilycorin, epipancrassidin, 9-O–demethylhomolycorin,
lycorin–1–O–glucosid, pseudolycorin–1–O–β–D–glucosid, latindin, pratorin,
pratorinin, pratorinin, pratorimin, pratosin, latifin (Shibanath Glosal và cộng sự, 1983,
1985, 1986, 1988, 1989, Jeffs Peter W. 1985, Kobayashi Shigeru, 1984).
Thân rễ chứa 2 glucan: glucan A và glucan B, Glucan A gồm 12 đơn vị glucose, còn
glucan B có khoảng 110 gốc của glucose (Tomada Mashashi và cộng sự, 1985).
Ở Việt Nam, theo Nguyễn Hoàng và cộng sự, 1997, trinh nữ hoàng cung có 11
alcaloid, 11 acid amin, acid hữu cơ. Các acid amin là phenylalanin, 1– leucin, dl –
valin và arginin monohydroclorid.
Trần Văn Sung và cộng sự, 1997, đã phân lập được từ thân hành trinh nữ hoàng cung 5
alcaloid trong đó, 2 chất là lycorin và pratorin được nhận dạng bằng phổ khối lượng và
ph
ổ cộng hưởng từ hạt nhân proton carbon 13.
Võ Thị Bạch Huệ và cộng sự, 1998, đã phân lập được từ 2 lá alcaloid là Crinamidin,
6–hydroxycrinamidin được nhận dạng bằng các phân tích hoá học và quang phổ.

3

1.1.6. Tác dụng dược lý
Cao methanol của rễ, thân, và cao chiết alcaloid toàn phần của trinh nữ hoàng cung
đều có tác dụng ức chế sự phân bào, kìm hãm sự tăng trưởng của rễ hành ta; hoạt tính
của cao trinh nữ hoàng cung bằng hoặc hơn 50% so với hoạt tính của colchicin ở cùng
nồng độ. Panacrin là chế phẩm thuốc bào chế từ hỗn hợp 3 dược liệu: lá trinh nữ hoàng

cung, củ tam thất và lá đu đủ, được nghiên cứu về tác dụ
ng chống ung thư. Trên mô
hình gây u báng thực nghiệm bằng cách cấy truyền vào xoang bụng chuột nhắt trắng tế
bào u báng Sarcom TG – 180 với lượng 10
6
tế bào/1 chuột. Thuốc đã có tác dụng làm
giảm sinh khối của u hay giảm tổng số tế bào ung thư, đồng thời làm giảm chỉ số gián
phân của tế bào ung thư.
Trong mô hình gây ung thư đùi thực nghiệm bằng tiêm vào đùi chuột nhắt trắng tế bào
u báng Sarcom TG – 180, Panacrin có tác dụng hạn chế sự phát triển khối u và hạn chế
sự di căn của tế bào ung thư từ u đùi lên gan, phổi, lách. Thuố
c có tác dụng kéo dài
thời gian sống của chuột mang ung thư được điều trị gần gấp đôi so với chuột đối
chứng mang ung thư.
Trong công trình nghiên cứu khả năng tăng cường sự sinh sản in vitro của tế bào
lympho T khi sử dụng cao chiết bằng nước nóng từ trinh nữ hoàng cung (1 – 8 mg/ml),
đã dùng bạch cầu đơn nhân to lấy từ máu ngoại vi của người cho máu khoẻ mạnh, và
nuôi cấy trong môi trường chứ
a cao chiết với nước nóng từ trinh nữ hoàng cung theo
tỷ lệ 1:3. Cao chiết bằng nước nóng từ dược liệu có tác dụng kích thích sự sản của tế
bào limpho T, và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD
4
+ T trong thử
nghiệm in vitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi người. Trong
thử nghiệm in vitro, cho chuột nhắt trắng uống cao chiết nước nóng từ trinh nữ hoàng
cung, cũng thấy có tác dụng kích thích sự sản sinh của tế bào lympho T, và hoạt hoá
mạnh tế bào lympho trong máu ngoại vi của chuột thử nghiệm. Sự tăng sinh tế bào
lympho T có tầm quan trọng đặc biệt trong miễn dịch học ung thư.
Một s
ố alcaloid trong cây trinh nữ hoàng cung có hoạt tính sinh học. Lycorin ức chế sự

tổng hợp protein và DNA của tế bào chuột, và ức chế sự phát triển của u báng cấy ở
chuột. Trong thử nghiệm in vitro, lycorin ức chế sinh tổng hợp vitamin C trong cây cỏ,
làm ngừng sự phát triển virus gây bệnh bại liệt, ức chế sự tổng hợp các tiền chất cần
4

cho sự sinh trưởng của virus gây bệnh bại liệt, và enzym polipeptidase, và có tác dụng
kháng virus. Lycorin có đọc tính cấp tính thấp.
Lycorin – O – glycosid ở mức liều microgam gây kích thích các tế bào lympho lách
chuột nhắt trắng, có tác dụng điều hoà miễn dịch. Pseudolycorin có tác dụng làm
ngừng sự phát triển tế bào Hela, ngăn cản sự tổng hợp protein trong tế bào u báng và
làm chậm lại quá trình tổng hợp DNA. Hippadin ức chế một cách hồi phục được sự
thụ tinh của chuột c
ống đực; 1,2 – β – epoxyambellin gây hoạt hoá tế bào lympho lách
chuột nhắt. Hỗn hợp ambellin và 1, 2 – β – epoxyambellin gây hoạt hoá tế bào lympho
giống như chất concanavalin A.
Thuốc Panacrin cũng được dùng cho 3 nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày, ung thư gan
và u lympho ác tính, có kiểm chứng, thấy được dung nạp tốt và có ít tác dụng không
mong muốn. Sau 3 tháng dùng thuốc, mức độ đáp ứng của bệnh nhân dùng Panacrin
có thuận lợi hơn so với nhóm đối chứng, nhưng vì cỡ mẫu nghiên cứu còn nhỏ
nên
chưa tạo được sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
1.1.7. Tính vị, công năng
Trinh nữ hoang cung có vị đắng, chát, có tác dụng gây sung huyết da.
1.1.8. Công dụng:
Trinh nữ hoàng cung được dùng trong phạm vi dân gian để chữa ung thư vú, ung thư
tử cung, ung thư tuyến tiền liệt. Lá thái nhỏ, với liều dùng mỗi ngày 3- 5 lá, sao vàng
sắc uống. Cũng có người dùng điều trị ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư gan và
chữa đau d
ạ dày. Ở các tỉnh phía nam, trinh nữ hoàng cung được dùng phổ biến chữa
bệnh đường tiết niệu.

Dùng ngoài, lá và thân hành giã nát, hơ nóng dùng xoa bóp làm xung huyết da chữa tê
thấp, đau nhức.
Ở Ấn Độ, nhân dân dùng thân hành cây trinh nữ hoàng cung xào nóng, giã đắp trị thấp
khớp, và cũng dùng để đắp trị mụn nhọt và áp xe. Dịch ép lá là thuốc nhỏ tai chữa đau
tai. Ở Campuchia, nhân dân dùng cây trinh nữ hoàng cung để điều trị bệnh phụ khoa.




5

1. 2. CHẤT CHUẨN
Chất đối chiếu là chất cần thiết để đảm bảo các kết quả phân tích đạt độ chính xác,
chúng được làm chất chuẩn gốc để đánh giá các nguyên liệu, chế phẩm theo quy định
Dược điển. Việc thiết lập các chất chuẩn đối chiếu dựa vào các báo cáo kết quả thí
nghiệm đánh giá của các phòng thí nghiệm với các phương tiện phân tích hiện đại
chứ
ng tỏ chúng đáp ứng mục đích sử dụng. Chất đối chiếu đã được định nghĩa như
sau: “chất đối chiếu là những nguyên liệu đồng nhất đã được chuẩn mực, dùng cho các
phép thử hoá lý, vi sinh, trong đó tính chất của chúng được đối chiếu với sản phẩm thử
nghiệm và mức độ tinh khiết của chất đối chiếu phải đáp ứng mụ
c đích sử dụng”.
Các chất đối chiếu hiện có:
- Chất đối chiếu WHO (ICRS)
- Chất đối chiếu Châu Âu (EPRS)
- Chất đối chiếu Anh (BPCRS)
- Chất đối chiếu Mỹ (USP)
- Chất đối chiếu Asean (ARS)
- Chất đối chiếu quốc gia do cơ quan quản lý chất lượng quốc gia công nhận và ban
hành.

- Chất chuẩn làm việc (working standard): do cơ sở thành lập.
Theo FDA hướng dẫn soạn tài liệu để
đăng ký sản xuất chất chuẩn:
- Chuẩn đối chiếu (Reference standard) là một lô hoặc mẻ của hợp chất làm thuốc
được điều chế đặc biệt bằng cách tổng hợp độc lập hay bằng cách tinh chế bổ sung của
nguyên liệu sản xuất và được chứng minh bằng một loạt các thử nghiệm phân tích sâu
rộng để xác nhận nó là nguyên liệu xác thực có độ tinh khiết tối đa có th
ể đạt được.
Thường dùng cho việc giải cấu trúc và chất làm chuẩn cho các chất chuẩn làm việc.
- Chuẩn làm việc là một hợp chất làm thuốc có chất lượng và độ tinh khiết được xác
lập khi so sánh với các chất chuẩn đối chiếu, được dùng làm chất chuẩn cho các công
việc thường ngày của phòng thí nghiệm như trong việc phân tích các lô sản xuất các
chất thuốc mới hay thành phẩm thuốc.
Mục đích sử
dụng chất đối chiếu:
Các chất đối chiếu được sử dụng theo yêu cầu của chuyên luận dược điển hay yêu cầu
kiểm nghiệm.
6

- Định tính: phổ hồng ngoại, SKLM, SKLHNC
- Thử tạp chất liên quan: SKLM, quang phổ, SKLHNC, SK khí
- Định lượng: quang phổ, SKLHNC
Dù là chuẩn khu vực, chuẩn quốc gia hay chuẩn làm việc, đều phải tuân theo một
nguyên tắc chung về thiết lập, bảo quản, phân phối như sau:
Nguyên liệu được sử dụng thiết lập chuẩn phải có độ tinh khiết cao, lựa chọn từ các lô
nguyên liệu sản xuất thuốc có ch
ất lượng cao và từ các nguồn cung cấp tin cậy.
Việc đánh giá mức độ phù hợp của một nguyên liệu dự kiến thiết lập chuẩn phải được
tiến hành rất cẩn thận, phải cân nhắc tất cả số liệu thu được từ các phép thử và nên áp
dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau để đánh giá so sánh.

Đóng gói, bảo quản:
Vật dụng đóng gói chất đối chiếu phả
i có khả năng chống hút ẩm, ánh sáng và oxy.

1.3 VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
1.3.1 Nguyên vật liệu
- Lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung thu hái ở Bình Định từ tháng 2 đến tháng 8 năm 2008.
- Chất đối chiếu Crinamidin và 6 Hydroxycrinamidin do bộ môn Phân tích –Kiểm
nghiệm cung cấp.
1.3.2. Dung môi - Hóa chất
- Các hóa chất thuốc thử đạt độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng.
- Các dung môi như: cyclohexan, dichloromethan, chloroform, ethyl acetat, aceton,
methanol, ethanol, HCl, amoniac đạt tinh khiết loại PA do Trung Quốc sản xuất.
- Dung môi dùng cho SKLHNC: methanol (Merck); KH
2
PO
4
(Kanto- Nhật)
1.3.3. Dụng cụ
-Máy SKLHNC hiệu Water 2695 (Separations Module)
-Cân tích Sartorius có độ nhạy 0,1 mg
-Máy cô quay R-3000
-Đèn UV hai bước sóng 254 nm, 365 nm
-Máy ảnh kỹ thuật số hiệu Canon
Các thực nghiệm được thực hiện tại: Bộ môn Hoá Phân tích – Kiểm nghiệm, khoa
Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
7

2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NỘI DUNG 1: CHIẾT ALCALOID TOÀN PHẦN

2.1.1. Yêu cầu cần thực hiện: “Chiết được 50 - 60 g cao alcaloid toàn phần.”
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu:
- Thu nguyên liệu: chọn lá bánh tẻ ở các cây trên 2 năm tuổi, không dùng các lá đã
khô trên cây. Xử lí: rửa sạch, để ráo, thái nhỏ và xay để được bột lá.
- Bột lá: chiết xuất cao alcaloid toàn phần trên nguyên tắc là alcaloid dạng base tan
trong dung môi kém phân cực, alcaloid dạng muối tan trong dung môi phân cực.
2.1.2.1. Quy trình 1: chiết bằng chloroform
- Bột lá được làm ẩm và ngấm kiệt bằng hỗ
n hợp dung môi cồn và acid HCl. Điều
chỉnh nồng độ acid để thu được dịch ngấm kiệt có pH acid, sau đó trung hòa dịch chiết
đến pH trung tính. Lọc bỏ tủa, dịch lọc được cô cách thủy và kiềm hoá bằng đến pH
kiềm. Dịch này được chiết với CHCl
3
để thu alcaloid dạng base.














Sơ đồ 2.1. Quy trình thử nghiệm chiết alcaloid từ lá TNHC bằng CHCl
3

2.1.2.2. Quy trình 2: chiết bằng Dichloromethan
Thực hiện các bước giống quy trình 1 nhưng thay dung môi chiết CHCl
3
bằng CH
2
Cl
2
.

Dịch CHCl
3

Bột lá TNHC (50 g)
Dịch chiết cồn - acid Bã dược liệu
Chiết ngấm kiệt bằng cồn- HCl

- dd NH
4
OH đđ, pH
≈
7
- Lắng, lọc
- BM đến còn 1/ 3 thể tích
- Lọc
Dịch lọc
- dd NH
4
OH đđ
- CHCl
3

- Lắc kỹ và để tách lớp hoàn toàn

Dịch kiềm
- Cô giảm áp
- Tinh chế
- Thu hồi dung môi

Cao alcaloid toàn phần
(0,1620 g)
Tủa nhầy
8

2.2. NỘI DUNG 2: THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN TÁCH PHÂN ĐOẠN
2.2.1. Yêu cầu cần thực hiện:
Xác định hệ dung môi và điều kiện triển khai sắc ký cho hiệu quả tách tốt nhất.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu:
Thăm dò hệ dung môi sắc ký:
Thăm dò hệ dung môi: kiểm tra bằng SKLM với mẫu thử là cao alcaloid toàn phần với
một vài hệ dung môi và phát hiện bằng thuốc thử đặc hiệu của alcaloid là Dragendorff.

Thăm dò điều kiện tách phân đoạn alcaloid bằng kỹ thu
ật sắc ký cột chân không:
- Thử nghiệm thăm dò điều kiện tách các phân đoạn alcaloid bằng kỹ thuật sắc ký cột
chân không với các điều kiện sau:
-Thay đổi pH cột bằng cách tẩm silica gel với dung dịch đệm pH kiềm, đệm pH
acid và không tẩm đệm.
- Xác định lượng dung dịch đệm vừa đủ để tẩm silica gel.
- Thay đổi cách nạp mẫu vào cột sắc ký: nhồi cột khô, nhồi cộ
t ướt.

2.2.2.1. Cột silica gel được tẩm đệm pH kiềm
- Trộn đều silica gel với một lượng đệm kiềm thích hợp, nạp vào cột, hoạt hoá và ổn
định cột bằng cyclohexan.
- Mẫu: cao alcaloid toàn phần: cân khoảng 0,2 g cao cho vào cột đã được tẩm đệm pH
kiềm và rửa giải bằng các hệ dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần.

Bảng 2.1 . Kết quả rửa giải qua cột silica gel tẩ
m đệm pH kiềm (cột 1)
STT Dung môi
Phân
đoạn
Màu sắc
Quan sát
Phản ứng với
TT Dragendorff
1 Cyclohexan 1 Không màu -
2 Cyclohexan : CH
2
Cl
2
(10: 1) 2 Không màu +++
3 CH
2
Cl
2
3 Vàng nhạt +++
4 CHCl
3
4 Vàng nhạt +++
5 Ethyl acetat 5 Vàng nhạt +++

6 Aceton 6 Vàng +
7 MeOH 7 Vàng +
(-): vàng; (+): hơi cam; (++): vàng cam; (+++): đỏ cam


9

2.2.2.2. Cột silica gel được tẩm đệm pH acid
- Trộn đều silica gel với một lượng đệm acid thích hợp, nạp vào cột, hoạt hoá và ổn
định cột bằng cyclohexan.
- Mẫu: cao alcaloid toàn phần: cân khoảng 0,2 g cao cho vào cột đã được tẩm đệm acid
và rửa giải bằng các hệ dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần.
Bảng 2.2 . Kết quả rửa giải qua cột silica gel tẩm đệm pH acid (cột 2)
STT Dung môi
Phân
đoạ
n
Màu sắc
Quan sát
Phản ứng với TT
Dragendorff
1 Cyclohexan 1 Hơi đục -
2 Cyclohexan : CH
2
Cl
2
(10:1) 2 Không màu -
3 CH
2
Cl

2
3 Vàng nhạt -
4 CHCl
3
4 Vàng nhạt ++
5 Ethyl acetat 5 Vàng +++
6 Aceton 6 Vàng +++
7 MeOH 7 Vàng +++
(-): vàng; (+): hơi cam; (++): vàng cam; (+++): đỏ cam

2.2.2.3. Cột silica gel không tẩm
- Nạp silicagel vào cột, hoạt hoá và ổn định cột bằng cyclohexan.
-Mẫu: cao alcaloid toàn phần: cân khoảng 0,2 g cao cho vào cột đã được hoạt hoá và
rửa giải bằng các hệ dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần.
Bảng 2.3 . Kết quả rửa giải qua cột silica gel không tẩm (cột 3)
STT Dung môi
Phân
đoạn
Màu sắc
quan sát
Phản ứng với
TT Dragendorff
1 Cyclohexan 1 Không màu -
2 Cyclohexan : CH
2
Cl
2
(10:1) 2 Không màu -
3 CH
2

Cl
2
3 Vàng nhạt +
4 CHCl
3
4 Vàng nhạt ++
5 Ethyl acetat 5 Vàng nhạt +++
6 Aceton 6 Vàng +++
7 MeOH 7 Vàng +++
(-): vàng; (+): hơi cam; (++): vàng cam; (+++): đỏ cam

Các phân đoạn thu được từ cột (1), cột (2) và cột (3) được kiểm tra bằng sắc ký lớp
mỏng để so sánh khả năng tách các phân đoạn sau khi tẩm silica gel bằng các dung
dịch đệm có pH khác nhau.

10

2.3. NỘI DUNG 3: TÁCH PHÂN ĐOẠN, PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT
2.3.1. Yêu cầu cần thực hiện:
Phân lập 100 mg Crinamidin và 50 mg 6-hydroxycrinamidin độ tinh khiết trên 98 %.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.2.1 Tách phân đoạn alcaloid bằng kỹ thuật sắc ký cột chân không
Cột silica gel tẩm đệm pH kiềm được chọn để triển khai sắc ký cột chân không.
Điều kiện tiến hành
-Kích thước cột: 25 x 9 (cm) -Silica gel (Merck) cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm
-Mẫu phân tích: 50 (g) cao alcaloid toàn phần lá TNHC.
-Dung môi khai triển: cyclohexan, hỗn hợp cyclohexan và DCM, DCM, chloroform,
ethyl acetat, aceton đến methanol.
Các bước tiến hành
-Bước 1: nạ

p silica gel đã tẩm đệm pH kiềm, hoạt hoá và ổn định cột bằng cyclohexan.
-Bước 2: nạp mẫu vào cột bằng phương pháp nhồi cột ướt.
-Bước 3: rửa giải bằng các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: cyclohexan,
hỗn hợp cyclohexan và DCM, DCM, chloroform, ethyl acetat, aceton đến methanol.

11

2.4 NỘI DUNG 4: TINH CHẾ SẢN PHẨM
2.4.1 Yêu cầu: độ tinh khiết trên 98%.
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu:

Tinh chế

Sơ đồ 3.2 Tinh chế các kết tinh của phân đoạn G

- Kết tinh trong các ống nghiệm được lấy bằng cách lọc qua phễu thuỷ tinh xốp, rửa
bằng ethyl acetat lạnh, rồi methanol lạnh.
- Phần kết tinh trên phễu sẽ được hoà trong ethyl acetat rồi để kết tinh, lọc, rửa bằng
ethyl acetat lạ
nh, sau đó đem hút chân không.
- Dịch lọc qua phễu được cho vào bình cầu đáy tròn để tiếp tục kết tinh.

Kiểm tra độ tinh khiết của các kết tinh
Bằng phương páhp SKLM và SKLHNC.
Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng
- Hệ dung môi khai triển CHCl
3
: MeOH : NH
4
OH đđ (9 : 1 : 0,05)

- Bản mỏng silica gel F
254
(Merck)
- Mẫu thử: G1, G2, G3, G4, Crinamidin, 6-hydroxycrinamidin hoà trong methanol.
Phân đoạn G
Dịch màu vàng
- Ethyl acetat lạnh
- MeOH lạnh
- Lọc qua phễu thuỷ tinh xốp
Tinh thể G
Tủa
- Kết tinh lại
- Lọc qua phễu thuỷ tinh xốp
- Ethyl acetat lạnh

12

Kiếm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLHNC kết tinh G1 và G2:
Điều kiện:
- Cột Phenomenex RP C8 (25 x 4,6 mm, 5 m)
- Pha động: methanol – đệm phosphat pH (20 : 80)
- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút
- Detector PDA ở bước sóng UV 214 nm
Mẫu thử: cân chính xác khoảng 1 mg G1, G2 hoà tan và điền đến vạch bằng methanol
trong bình định mức 1 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử được bơm vào hệ thống
SKLHNC với các điều kiện như trên.

2.5 NỘI DUNG 5: ĐỊNH DANH SẢN PHẨM
2.5.1 Kết quả cần đạt: định danh được các hợp chất đã phân lập.
2.5.2. Phương pháp nghiên cứu: sau khi kiểm tra độ tinh khiết hai kết tinh G1 và G2,

chúng tôi so sánh giá trị trên: R
f
trên sắc ký lớp mỏng, thời gian lưu trên SKLHNC,
phổ UV-Vis, phổ IR, phổ NMR.
của G1 và G2 với Crinamidin và 6-hydroxycrinamidin do nhóm đã phân lập trong
công trình năm 2006
[7; 12]
, kết quả khẳng định G1 là Crinamidin và G2 là 6-
hydroxycrinamidin.
Kết quả:
Bảng 2.4: Kết quả so sánh G1, G2 với Crinamidin và 6-hydroxycrinamidin

SKLHNC SKLM
Rt
Phút
Uv
(nm)
Dragendorff Uv 254 Uv 365 Rf
Crinamidin
25,84 279 1 vết màu cam 1 vết 0,45
G1
25,75 279,3 1 vết màu cam 1 vết 0,45
6-hydroxycrinamidin
14,5 280 1 vết màu cam 1 vết 1 vết 0,34
G2
13,78 280,5 1 vết màu cam 1 vết 1 vết 0,34
Các giá trị so sánh với phổ IR
[7; 12]
:
Bảng 2.5: Kết quả so sánh G1, G2 với Crinamidin và 6Hydroxycrinamidin trên phổ IR

G1
Crinamidin [7,12]
G2
6
Hydroxycrinamidin
IR
ν cm
−1
(KBr)
804; 1276
1498 (epoxy)

1035; 932 (OCH
2
O)
1276 (-OCH
3
)
805; 1260
1498 (epoxy),

1043;940(OCH
2
O)
1278
(-OCH
3
)
804; 1244,

1481 (epoxy),
3508(-OH)
1083;939 (OCH
2
O)
1286(-OCH
3
)
805; 1244
1494 (epoxy)
3504 (-OH)
1039;938(OCH
2
O)
1280 (-OCH
3
)
13


Các giá trị so ánh với phổ NMR của G1
[7; 12]
Bảng 2.6: Kết quả so sánh G1 với Crinamidin trên phổ NMR
C
G1 Crinamidin
[7; 12]

δC δH, m, nH δC δH, m, nH
1 55.37 3.90 d; 1H 53,8 3.90 d; 1H
2 58.36 3.27 m; 1H 56,4 3.27 m; 1H

3 66.89 4.41 q; 1H 65,5 4.41 q; 1H
4 31.06 1.61 m; 2H 29,7 1.61 m; 2H
4a 63.24 3.38 m; 1H 61 3.38 m; 1H
6 58.60 3.83 d; 4.24 d 58.60 3.83 d; 4.24 d
6a 118.69 – 117,6 –
7 143.31 – 141,1 –
8 141.07 – 133,4 –
9 151.04 – 148,1 –
10 98.67 6.81 s; 1H 96,4 6.81 s; 1H
10a 135.85 – 138,7 –
10b 44.11 – 41,6 –
11 40.87 2.04 m; 2.44 m 39,2 2.04 m; 2.44 m
12 53.99 2.89 m; 3.13 m 52,5 2.89 m; 3.13 m
13 103.11 5.92 s; 2H 100,7 5.92 s; 2H
14 60.66 4.03 s; 3H 59,1 4.03 s; 3H

Các giá trị so ánh với phổ NMR của G2
[7; 12]

Bảng 2.7: Kết quả so sánh G2 với 6-hydroxycrinamidin trên phổ NMR
6-hydroxycrinamidin G2
C
δC (ppm)
δ
H (ppm)
δ
C (ppm) δH (ppm)
1 53,5 3,65 53,6 3,71
2 56,1 3,20 56,4 3,28
3 65,2 4,44 64,9 4,40

4 28,3 1,72 28,6 1,51-1,60
4a 54,1 3,93 54,6 3,68
6 86,3 5,33 85,2 5,19
10 96,7 6,61 96,7 6,65
11 35,3 1,75 35,5 1,76
12 46,0 2,70-3,18 46,3 2,71-3,12
O-CH2O 100,9 5,88-5,59 101,2 5,91
7- OMe 59,8 4,01 59,7 4,05

14

2.6 NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH
LƯỢNG CRINAMIDIN TRONG VIÊN OPCRILATI
2.6.1 Quy trình định lượng
Mẫu nghiên cứu: viên OPCrilati
Điều kiện sắc ký
- Hệ thống SKLHNC hiệu Waters 2695, đầu dò Waters 2996 Photodiode Array
Detector, hệ thống bơm mẫu tự động, phần mềm xử lý Empower.
- Cột sắc ký: Phenomenex C8 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).
- Pha động: MeOH – acid H
3
PO
4
0,5%

(18 : 82).
- Bước sóng phát hiện: UV – 214 nm.
- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.
- Thể tích bơm: 10 µl.
Chuẩn bị các dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu thử

- Mẫu đối chiếu: hòa tan Crinamidin trong Methanol nồng độ chính xác 0,1 mg/ ml.
- Mẫu thử:
Giai đoạn chiết alcaloid thô
- 10 viên OPCrilati cho vào một becher 250ml. Thêm 30ml HCl 1%, siêu âm trong 30
phút. Để lắng. Lọc dịch trong qua bông gòn cho vào becher 250ml (làm 3 lần).
- Tất cả dịch HCl 1% chiết được từ viên OPCrilati được lọc qua giấy một lầ
n nữa cho
trong suốt rồi kiềm hóa bằng NH
4
OH đậm đặc đến Ph = 9-10.
- Lọc qua giấy lọc để loại hết tủa (nếu thấy đục và có tủa).
- Dịch kiềm được cho vào bình lắng 500ml. Thêm CHCl
3
vào bình lắng, lắc và để yên
cho tách lớp.
- Tiếp tục thực hiện lần 2 và lần 3. Toàn bộ dịch CHCl
3
sẽ được gộp lại, cho qua lọc để
được dịch CHCl
3
trong suốt.
- Cô quay áp suất giảm, nhiệt độ khoảng 60-70
0
C đến cắn khô.
Giai đoạn tinh chế
Lập lại các giai đoạn trên 2 đến 3 lần. Cắn alcaloid được tiếp tục xử lí qua SPE và định
lượng Crinamidin bằng phương pháp SKLHNC.


15

Kết quả thực nghiệm thẩm định qui trình và định lượng Crinamidin trong viên
OPCrilati:
Với điều kiện sắc ký và phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu được cho
các đỉnh tách rõ ràng, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử. Sắc ký đồ
cho thấy mẫu thử có đỉnh có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của đỉnh Crinamidin
trong sắc ký đồ
của mẫu đối chiếu.
Tại thời gian lưu của đỉnh Crinamidin trên sắc ký đồ mẫu thử và mẫu đối chiếu, phổ
UV của mẫu thử và mẫu đối chiếu trùng khít lên nhau. Điều này chứng tỏ đỉnh thu
được của mẫu thử là tinh khiết và các thành phần khác trong mẫu thử không ảnh
hưởng đến quá trình phân tích Crinamidin ở điều kiện sắc ký đã lựa chọn.

Khảo sát tính tương thích hệ thống
- Để đánh giá tính tương thích của chất chuẩn đối chiếu Crinamidin, pha dung dịch
chất đối chiếu có nồng độ 1 mg/ml (cân chính xác khoảng 5 mg Crinamidin cho vào
bình định mức 5 ml, cho MeOH vào hòa tan và điền đến vạch, pha loãng). Tiêm mẫu
đối chiếu 6 lần vào hệ thống SKLHNC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn.
- Để đánh giá tính tương thích của mẫu thử, mẫu thử sau khi được xử lý như trên, bơm
6 lần vào h
ệ thống SKLHNC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn.







16

Bảng 2.8. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của Crinamidin



Bảng 2.9. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử

Số lần
bơm
Thời
gian lưu
Diện tích
đỉnh
Hệ số
dung
lượng
Hệ số
chọn
lọc
Độ
phân
giải
Hệ số
bất đối
Số đĩa
lý
thuyết
1 18,64 1008932 12,32 1,10 2,04 1,16 7029
2 18,27 1007214 12,05 1,10 2,12 1,15 7408
3 18,11 1018082 11,94 1,10 2,11 1,19 7627
4 18,02 1014588 11,87 1,10 2,10 1,21 7758

5 18,40 1008678 12,14 1,10 2,09 1,18 7229
6 18,03 1028070 12,84 1,10 2,28 1,14 7123
TB 18,25 1014261 12,19 1,10 2,12 1,17 7362
SD 0,24 7932 0,35 0,00 0,08 0,03 288
RSD(%) 1,34 0,78 2,91 0,15 3,78 2,32 3,91

Nhận xét: thời gian lưu và diện tích đỉnh của mẫu thử và mẫu chuẩn đều có́ RSD <
2%. Hệ số chọn lọc (1,05 ≤ α ≤ 2), hệ số bất đối (0,8 ≤ A
F
≤ 1,2) và độ phân giải (Rs ≥
1,5) nằm trong giới hạn cho phép, hệ số dung lượng ( 1 ≤ k’ ≤ 8) lớn hơn 8.

Số lần
bơm
Thời
gian
lưu
Diện tích
đỉnh
Hệ số
dung
lượng
Hệ số
chọn lọc
Hệ số
bất
đối
Độ
phân
giải

Số đĩa
lý
thuyết
1 18,89 1314067 12,49 2,08 0,91 9,88 4734
2 18,42 1316775 12,16 2,03 0,89 8,66 4644
3 18,85 1310406 12,46 2,08 0,92 9,91 5143
4 18,41 1315737 12,15 2,08 0,90 9,80 4873
5 18,89 1314067 12,49 2,08 0,91 9,88 4734
6 18,59 1312690 12,28 2,08 0,92 9,88 4837
TB 18,67 1313957 12,34 2,07 0,91 9,67 4827
SD 0,23 2251,63 0,17 0,02 0,01 0,50 175,10
RSD(%) 1,24 0,17 1,34 1,03 1,00 5,12 3,63
17


2.6.2 Thẩm định qui trình
Tính đặc hiệu
Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích đỉnh của đỉnh của Crinamidin trong
mẫu thử tăng so với lúc chưa cho chất chuẩn.








Hình 2.1. Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu chuẩn đối chiếu Crinamidin

Hình 2.2. Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu thử









Hình 2.3. Sắc ký đồ và phổ UV của mẫu thử thêm chất chuẩn



Nhận xét: quy trình đạt yêu cầu về tính đặc hiệu.
19.300
18.933
18.999