nghiên cứu phương pháp phân tích các chất kích thích tăng trưởng họ beta-agonist trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo bằng phương pháp phân tích sắc ký ghép khối phổ (gc-ms)

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ




BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)




NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH CÁC CHẤT KÍCH
THÍCH TĂNG TRƯỞNG HỌ BETA-
AGONIST(CLENBUTEROL,
SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO,
GAN HEO, THỨC ĂN NUÔI HEO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ



CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI




CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ QUẢN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 2/ 2009


SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH
TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH VÀ THÍ NGHIỆM


BÁO CÁO NGHIỆM THU


NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH CÁC CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG
TRƯỞNG HỌ BETA-AGONIST
(CLENBUTEROL, SALBUTAMOL)
TRONG THỊT HEO, GAN HEO, THỨC
ĂN NUÔI HEO BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI
PHỔ GC/MS
n

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: THS. CHU VÂN HẢI



THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 01/2009

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH
TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH VÀ THÍ NGHIỆM


BÁO CÁO NGHIỆM THU


NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH CÁC CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG
TRƯỞNG HỌ BETA-AGONIST
(CLENBUTEROL, SALBUTAMOL)
TRONG THỊT HEO, GAN HEO, THỨC
ĂN NUÔI HEO BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI
PHỔ GC/MS
n

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: THS. CHU VÂN HẢI



THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 01/2009

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Clenbuterol (CLEN), Salbutamol (SAL) là các hợp chất thuộc nhóm beta-agonist

đ
ược sử dụng bất hợp pháp trong thức ăn gia súc để kích thích tăng trưởng, giảm hàm
l
ượng béo và tăng hàm lượng thịt. Tại Việt Nam, CLEN và SAL được phân tích chủ
y
ếu bởi phương pháp sàng lọc Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Phương
pháp GC/MS hay LC/MS ch
ưa có phương pháp chuẩn nhất là khâu chuẩn bị mẫu. Tại
Trung tâm d
ịch vụ phân tích và thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh (TTDVPTTN) đã
nghiên c
ứu phương pháp phân tích CLEN, SAL bằng GC/MS và được sử dụng để phân
tích CLEN, SAL trong th
ức ăn gia súc, thịt heo và gan heo, thực phẩm chế biến sẵn tại
thành ph
ố Hồ Chí Minh và các tỉnh lận cận.

M
ẫu được ly trích bởi dung dịch đệm CH
3
COONH
4
, enzym β_Glucuronidase và
sau đó đ
ược làm sạch bởi cột SCX (Alltech SPE 500mg/6ml), rửa giải bằng 6ml
MeOH:NH
3
(95:5). Sau đó được dẫn xuất với MSTFA + NH
4
I + DTE (1000:4:2) ở

60
0
C trong 15 phút. CLEN, SAL được phân tích bởi GC/MS (ESI (+) SIM) với các
m/z 227, 300, 335, 336 và 337 cho CLEN, và 207, 294, 350, 369 và 370 cho SAL.
Hi
ệu suất thu hồi của phương pháp hơn 65%-88%. Giới hạn phát hiện của phương
pháp cho CLEN là 0,16 ppb cho th
ức ăn gia súc, 0,05ppb cho thịt heo, 0,05ppb cho gan
heo; cho SAL là 0,11ppb cho th
ức ăn gia súc, 0,07ppb cho thịt heo, 0,07ppb cho gan
heo. Ph
ương pháp Elisa đã được sử dụng để phân tích các mẫu thức ăn cho heo, thịt
heo, gan heo và đ
ược xác nhận lại bằng GC/MS cho các kết quả âm tính và dương tính,
có so sánh k
ết quả với LC/MS đối với các mẫu dương tính.



SUMMARY OF RESEARCH CONTENT


Clenbuterol (CLEN), Salbutamol (SAL) may be illegally used as feed additive
for growth promotion with concomitant reduction of fat tissues in meat-producing
livestock. In Viet Nam, CLEN, SAL are being mainly detected by the screening ELISA
method. Use of GC/MS (Gas chromatographic-mass spectrometric method) or LC/MS
(Liquid chromatographic-mass spectrometric method) is somewhat limited due to lack
of appropriate sample preparation. Center of analytical services and experimentation
(CASE) has devised a quite efficient GC/MS method for CLEN, SAL analysis which
are being used to control feedstuff, pork meat, liver, processed food in Ho Chi Minh

City and other provinces.


Sample preparation involves extraction of CLEN, SAL by a CH
3
COONH
4,
enzyme β_Glucuronidase followed by a clean up step with SCX (Alltech SPE
500mg/6ml) column and elution with
6ml MeOH:NH
3
(95:5). The residue is
derivatized with
MSTFA + NH
4
I + DTE (1000:4:2) at 60
0
C for 15 minutes. The
selected ions monitoring mode is performed at m/z 227, 300, 335, 336 and 337 for
CLEN, and 207, 294, 350, 369 and 370 for SAL.
Recoveries of CLEN, SAL 65% -
88%. The limits of detection were about 0.16ppb_feedstuff, 0.05ppb_pork meat,
0.05ppb_ liver for CLEN; 0.11ppb_feedstuff, 0.07 ppb_ pork meat, 0.07ppb_ liver
for SAL. The technique include Elisa that is used as screening methods and GC/MS
as confirmatory methods and is compared with LC/MS for positive samples.




MỤC LỤC

Trang
Tóm t
ắt đề tài tiếng Việt
Tóm t
ắt đề tài tiếng Anh
M
ục lục
Danh sách hình
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
Tên đ
ề tài 1
Ch
ủ nhiệm đề tài
C
ơ quan chủ trì
Th
ời gian thực hiện
Kinh phí đ
ược duyệt
Kinh phí đã c
ấp
1. M
ở đầu 1
1.1.Tình hình c
ấm sử dụng các chất kích thích tăng trưởng trên 3
th
ế giới và ở Việt Nam
1.2. Tình hình nghiên c
ứu phân tích CLEN, SAL trong và ngoài 5
n

ước
1.3. M
ục tiêu cuả đề tài 7
1.4. Đ
ối tượng nghiên cứu 8
1.5. N
ội dung thực hiện đề tài 8
1.6. Ph
ương pháp nghiên cứu 9
1.7. Nơi thu thập mẫu 10
1.8. Thời gian thu thập mẫu 10
1.9. N
ơi phân tích 10
1.10. S
ản phẩm cuả đề tài 10
1.11. Ý nghiã th
ực tiễn 10
CH
ƯƠNG II: TỔNG QUAN 12
2.1. T
ổng quan về CLEN và SAL 12
2.2. T
ổng quan các phương pháp phân tích CLEN, SAL trong thức ăn 16
nuôi heo, th
ịt heo, gan heo bằng GC/MS đã đăng báo
2.3. S
ơ lược về kỹ thuật sắc ký khí 18
2.4. Ph
ương pháp sắc ký khí ghép khối phổ 27
CH

ƯƠNG III: NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHLEN, SAL
TRONG TH
ỊT HEO, GAN HEO, THỨC ĂN NUÔI HEO BẰNG KỸ THUẬT
GC/MS 39
3.1. Thi
ết bị- Hoá chất 39
3.2. Pha dung d
ịch 41
3.3. Kh
ảo sát tối ưu phản ứng dẫn xuất sylyl hoá CLEN, SAL và nội 41
chu
ẩn 17- Methyltestosteron trên chuẩn bằng GC/MS
CH
ƯƠNG IV: KHẢO SÁT PHÂN TÍCH TRÊN MẪU THẬT 58
4.1. X
ử lý mẫu 58
4.2. Xác đ
ịnh LOD máy 65
4.3. Đ
ường chuẩn 66
4.4. Xác đ
ịnh MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu 68
th
ức ăn gia súc
4.5. Xác định MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu 71
th
ịt heo
4.6. Xác đ
ịnh MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu 73
gan heo

4.7. Tính toán đ
ộ không đảm bảo cuả mẫu 76
CHƯƠNG V: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 78
5.1. Tiêu chí l
ựa chọn điạ điểm thu thập mẫu 79
5.2. Thu th
ập mẫu thức ăn, mẫu thịt heo, gan heo, thực phẩm chế biến sẵn 79
5.3. K
ết quả và thảo luận_ Kết quả phân tích CLEN, SAL bằng Elisa 83
5.4. K
ết quả phân tích CLEN, SAL bằng GC/MS 86
5.5. Ki
ểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm 89
5.6. K
ết quả phân tích CLEN, SAL trên nền thực phẩm chế biến sẵn 92
CH
ƯƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 94
S
ẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI: Qui trình phân tích Clenbuterol, Salbutamol trong
th
ịt heo, gan heo, thức ăn cho heo.
PH
Ụ LỤC
TÀI LI
ỆU THAM KHẢO

DANH SÁCH CÁC HÌNH
S
Ố TÊN HÌNH ẢNH TRANG
2.1

Sơ đồ máy sắc ký khí

18
2.2 Mặt cắt của cột sắc ký mao quản phóng to
19
2.3 Mức độ phân cực của các loại cột sắc ký khí của Alltech
20
2.4 Cấu trúc cột sắc ký
21
2.5 Thời gian lưu của cấu tử phân tích
22
2.6 Sơ đồ loại sắc ký khí ghép khối phổ
27
2.7 Sự phân mảnh với sự thay đổi của năng lượng bắn phá
30
2.8 Sơ đồ quá trình hoạt động trong máy sắc ký khí ghép khối phổ
30
2.9
Sơ đồ GC/MS loại bẫy ion
34
2.10 Sơ đồ Ion trap electrode
34

3.1
Kết quả hiệu chỉnh máy (tuning) 43
3.2 Sắc ký đồ DFBZ 10 ng/ml ở chế độ full MS ( EI ) 44
3.3 Khối phổ của dẫn xuất di-TMS-CLEN và di-TMS-IS 47
3.4 Phản ứng tạo dẫn xuất silyl hố CLEN và IS 48
3.5 Cơ chế phân mảnh di-TMS-CLEN trong full MS 49
3.6 Cơ chế phân mảnh di-TMS-(17-methyltestosterone) trong full
MS.
50
CHƯƠNG 1:

MỞ ĐẦU
Tên đ
ề tài:
Nghiên cứu phương pháp phân tích các chất kích thích tăng trưởng họ beta-
agonist (Clenbuterol, Salbutamol) trong th
ịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo bằng
ph
ương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS.
Ch
ủ nhiệm đề tài: Ths.Chu Vân Hải
C
ơ quan chủ trì: Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm TPHCM.
Th
ời gian thực hiện : 12/2005-12/2008
Kinh phí đ
ược duyệt : 210.000.000 VNĐ
1. Mở đầu :

Clenbuterol (CLEN) và Salbutamol (SAL) là các chất đã bị Bộ Nông nghiệp và

phát tri
ển nông thôn (PTNT) cấm sử dụng từ năm 2002. Mặc dù bị cấm nhưng các chất
này v
ẫn được lén lút sử dụng trong thức ăn chăn nuôi. Sự tồn dư của các chất này gây
nh
ững rối lọan chức năng tim và phổi như tim đập nhanh, run cơ, đau đầu, buồn
nôn…mà các ch
ất này lại chỉ bị phân giải ở nhiệt độ cao. Hiện nay chưa có tài liệu
khoa h
ọc nào nói các chất Clenbuterol và Salbutamol cũng như dư lượng của chúng
trong s
ản phẩm chăn nuôi gây ung thư cho người. Tuy ảnh hưởng của dư lượng các
ch
ất này được coi là độc trung bình nhưng các nhà khoa học khẳng định rằng tất cả các
ảnh hưởng xấu của chất này trên người là không thể chấp nhận được.
Th
ời gian qua, một số cơ quan báo chí và Đài truyền hình Việt Nam đăng tải về
vi
ệc sử dụng hócmôn kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi và việc quản lý
nhà n
ước về lĩnh vực này. Bộ Nông nghiệp và PTNT đã có thông báo ý kiến chỉ đạo
ngày 09/06/2006 s
ố 2646/TB-BNN-VP về việc kiểm tra chất lượng Clenbuterol ở thức
ăn chăn nuôi trong ph
ạm vi tòan quốc. Đồng thời, ngày 25/08/2006 Bộ trưởng bộ Nông
nghi
ệp và PTNT đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường công tác quản lý, nâng cao
ch
ất lượng nông lâm sản, vật tư nông nghiệp và đảm bảo vệ sinh, an tòan nông sản,
th

ực phẩm. Theo đó, Bộ trưởng đã chỉ đạo các đơn vị trực thuộc thường xuyên kiểm tra
v
ề chất lượng sản phẩn chăn nuôi, con giống và thức ăn chăn nuôi. Bộ trưởng bộ Nông
nghiệp và PTNT đã ra quyết định ngày 09 tháng 01 năm 2007 số 65/QĐ-BNN-CN về
việc qui định các bước xác định hàm lượng chất Clenbuterol và Salbutamol trong thức
ăn chăn ni. Quy
ết định đã đề rõ: trước hết định lượng Clenbuterol, Salbutamol theo
ph
ương pháp sử dụng KIT ELISA. Nếu mẫu thức ăn cho kết quả âm tính thì khẳng
đ
ịnh là mẫu thức ăn đó khơng chứa các họat chất trên. Trong trường hợp mẫu thức ăn
cho k
ết quả dương tính với Clenbuterol, Salbutamol thì tiếp tục phân tích các chất này
theo m
ột trong các phương pháp: Sắc ký khí khối phổ GC/MS, Sắc ký khí khối phổ/
kh
ối phổ GC/MS/MS, Sắc ký lỏng khối phổ LC/MS, Sắc ký lỏng khối phổ/ khối phổ
LC/MS/MS. K
ết quả phân tích bằng một trong các phương pháp trên sẽ khẳng định
hàm l
ượng Clenbuterol, Salbutamol có trong mẫu thức ăn chăn ni.
Trong khi đó các doanh nghiệp xuất khẩu, các cơ quan chức năng quản lý
ngành nông nghiệp rất cần sự giúp đỡ từ phía các phòng thí nghiệm trong nước để
xác đònh các độc chất này nhằm bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và bảo vệ sức
khoẻ cộng đồng trước mắt cũng như lâu dài. Hiệ
n tại một số nơi ở Viêt Nam cũng đã
triển khai các đề tài nghiên cứu phân tích Clenbuterol, Salbutamol trong thức ăn gia
súc và th
ịt heo bằng phương pháp Elisa. Tại trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm
cũng đã triển khai đề tài: Nghiên cứu phương pháp phân tích các chất kích thích tăng

tr
ưởng họ beta-agonist (Clenbuterol, Salbutamol) trong thịt heo, gan heo, thức ăn ni
heo b
ằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS với cực tiểu phát
hiện của phương pháp cho CLEN là 0,16 ppb cho thức ăn gia súc, 0,05ppb cho thịt heo,
0,05ppb cho gan heo; cho SAL là 0,11ppb cho th
ức ă n gia súc, 0,07ppb cho thịt heo,
0,07ppb cho gan heo. Hi
ệu suất thu hồi của phương pháp hơn 65%-88%, góp phần
p
hục vụ phân tích cho an toàn thực phẩm trong nước và phục vụ cho xuất khẩu.
1.1.
Tình hình cấm sử dụng các chất kích thích tăng trưởng trên thế giới và ở
Việt Nam

Tại Nhật bản: Cấm sử dụng các chất sau trong chăn nuôi, trong sản phẩm động
vật, sản phẩm nhập khẩu
1. Clenbuterol
2. Salbutamol
3. Chloramphenicol
4. Sulfamerazine
5. Sulfadimethoxine
6. Sulfamonomethoxine
7. Oxolinic acid
8. Pyrimethamine
9. Nicarbazin
10. Furazolidone
11. Avoparcin
Tại Malaysia: yêu cầu tất cả các sản phẩm thòt, thuỷ sản nhập khẩu phải có giấy
chứng nhận không có Nitrofuran, Chloramphenicol, ß-agonist, nếu không sẽ không

được nhập khẩu.
Tại Hương Cảng: Cấm các chất sau:
1. Chloramphenicol
2. Clenbuterol
3. Diethylstilbestrol
4. Salbutamol
5. Avoparcin
6. Dienoestrol
7. Hexoestrol
Tại Trung Quốc: cấm nhóm kích thích t
ăng trưởng, loại thuốc gây hưng phấn:
1. Clenbuterol
2. Salbutamol
3. Salbutamol sulfate
4. Ractopamine
5. Dopamine hydrochloride
6. Cimaterol
7. Terbutaline sulfate
Tại Việt Nam: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết đònh 29/2002-
QĐ-BNN, quyết đònh 54/2002/QĐ-BNN và quyết đònh 40/2002/QĐ-BNN cấm sử
dụng các chất sau :


Stt

Tên chất Stt Tên chất
1 Carbuterol 10 Methyl testosterone

2 Cimaterol 11 Metronidazole
3

Clenbuterol
12 19 Nortestosterone

4 Chloramphenicol 13 Ractopamine
5 Diethylstiberol(DES)

14
Salbutamol
6 Dimetridazole 15 Terbutaline
7 Fenoterol 16 Stilbenes
8 Nitrofuran 17 Trebolone
9 Isoxupin 18 Zeranol
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CLENBUTEROL,
SALBUTAMOL TRONG VÀ NGỊAI N
ƯỚC:
1.2.1.
Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Từ năm 1996 các nước châu Âu đã cấm đưa Clenbuterol và Salbutamol vào thức ăn
chăn ni. Sau đây là m
ột số các phương pháp phân tích đã được áp dụng ở nước
ngòai:
-Phương pháp xác đònh hàm lượng CLEN và SAL trong gan heo, nước tiểu heo
bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ: [32]
Xử lý mẫu: Mẫu được trích bởi Acetonitril sau đó được clean up bởi SPE C18
Dẫn suất: BSTFA + 1% TMCS
LOD: 0,5 ng/ml ( nước tiểu); 0,5 ng/g (gan)
% Recovery: >80%
-Phương pháp xác đònh hàm lượng CLEN và SAL trong thòt heo, gan heo, thức ăn
gia súc,tôm bằng phương pháp ELISA [33]
Xử lý mẫu: Mẫu được clean up bằng SPE C18

CLEN: LOQ: 5 ng/g (thức ăn), LOQ: 40 ppt (tôm, thòt,gan), SAL:LOQ: 0,05 ppb
% Recovery: >80%
-Phương pháp phân tích SAL và CLEN bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao [34]
Xử lý mẫu: Mẫu được Clean up và làm giàu mẫu bằng cột Oasis HLB 1cc/30mg
Extraction Cartridge
Đầu dò: Fluorescence
- Phương pháp phân tích SAL và CLEN bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ
[34]
Xử lý mẫu: Mẫu được clean up bằng cột MCX extraction plate, 10mg/96-well
Ion source: Electrospray positive
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
- Hiện nay Viện Nông nghiệp Miền Nam đang có dự án điều tra về CLEN trong
thực phẩm và thức ăn gia súc bằng Elisa.
- Tại Chi Cục Thú Y TP.Hồ Chí Minh cũng đang có dự án điều tra về CLEN trong
thực phẩm và thức ăn gia súc bằng Elisa.
- Ở Hà Nội, Bộ Thực phẩm cũng đang có dự án về điều tra tình hình nhiễm CLEN
và kháng sinh trong thực phẩm bằng Elisa.
- Tại Trung tâm đào tạo và phát triển Sắc ký đang triển khai phân tích Clenbuterol và
Salbutamol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ.
- Tạ
i trung tâm nhiệt đới Việt Nga, triển khai phân tích Clenbuterol trong thức ăn gia
súc bằng kỹ thuật sóng vng qt nhanh trên cực giọt chậm.
Hiện nay phân tích hàm lượng các chất siêu vết ở dạng ppb, ppt chỉ có thể áp
dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS) và sắc ký khí ghép khối phổ
(GC/MS). Chính vì vậy chúng tôi đã chọn kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ
(GC/MS) vì
đây là thiết bị phân tích sẵn có tại Trung tâm dịch vụ phân tích và thí
nghi
ệm.
1.2.3. Gi

ới hạn dư lượng tối đa cho phép:
Ngày 24/2/2005, Bộ trưởng Bộ thủy sản đã ban hành quyết đònh số
07/2005/QĐ-BTS về việc ban hành Danh mục hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế
sử dụng trong sản xuất kinh doanh thuỷ sản. Để triển khai quyết đònh này, các sản
phẩm thức ăn cho nuôi trồng thuỷ sản, thuốc thú y thuỷ sản trước khi đăng ký cấp
phép lưu hành, nguyên liệu thuỷ sản nuôi trước khi đưa vào chế biến phải được
kiểm nghiệm dư lượng các chất Clenbuterol, Salbutamol
và trong danh mục này có
18 ch
ất trong đó CLEN đứng ở hàng thứ 3, SAL đứng ở hàng thứ 14 bị cấm sử dụng.
Theo Codex thì MRL (Maximum residue limit) trong thị
t là 0,2ppb, MRL trong gan
là 0,6ppb.
1.3. Mục tiêu của đề tài :
Cho đến nay thì chưa có một phòng thí nghiệm nào ở Việt Nam có phương
pháp để xác đònh được hàm lượng CLEN và SAL trong thòt heo, gan heo, thức ăn
nuôi heo, trong khi đó các doanh nghiệp xuất khẩu, các cơ quan chức năng quản lý
ngành nông nghiệp rất cần sự giúp đỡ từ phía các phòng thí nghiệm trong nước để
xác đònh các độc chất này nhằm bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và bảo vệ sức
khoẻ cộâng đồng trước mắt cũng như lâu dài. Chính vì vậy mục tiêu của đề tài là cần
tìm ra các phương pháp phân tích khá nhạy để phát hiện và đònh lượng chính xác
độc chất CLEN và SAL trong thòt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo trên cơ sở nghiên
cứu xây dựng phương pháp dựa trên các bài báo đã công bố đồng thời đánh giá tình
hình nhiễm CLEN và SAL trong thòt heo, thức ăn nuôi heo, gan heo
và thực phẩm
ch
ế biến sẵn trên đòa bàn TP.Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận.
Do Trung tâm Dòch vụ Phân tích Thí nghiệm (TTPTDVTN) đang có máy sắc
ký ghép khối phổ sử dụng bẫy ion có thể cho phép thực hiện kỹ thuật ion hóa dươ
ng

PICI (Positive Ion Chemical Ionization), kỹ
thuật ion hoá bằng va chạm điện tử (
Electron impact- EI), cũng như kỹ thuật MS/MS, chúng tôi sẽ tận dụng ưu điểm này
của thiết bò để nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích CLEN, SAL với độ
nhạy lớn thích hợp với điều kiện Việt Nam và đủ sức đáp ứng yêu cầu về chất
lượng phân tích của nhiều nước tiên tiến trên thế giới, đồng thời qua đó góp phần
đảm bảo an t
òan thực phẩm trong nước, cũng như xuất khẩu.
Đề tài này được thực hiện nhằm vào 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng phương pháp phân tích Clenbuterol và Salbutamol trong thòt heo, gan
heo, thức ăn nuôi heo bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)
2. Báo cáo hiện trạng tồn dư Clenbuterol và Salbutamol trong thịt heo, gan heo, thức
ăn nuôi
heo. Đặc biệt trong các sản phẩm chế biến sẵn từ thịt heo, gan heo.
1.4. Đối tượng nghiên cứu:
- Th
ức ăn ni heo
- Th
ịt heo
- Gan heo
- Sản phẩm chế biến từ thịt heo, gan heo
1.5. Nội dung thực hiện đề tài:
Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài cần thực hiện nội dung nghiên cứu sau:
1/ Để xây dựng phương pháp phân tích Clenbuterol và Salbutamol trong thòt heo,
gan heo, thức ăn nuôi heo bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) cầ
n:
- Nghiên cứu chạy chuẩn CLEN và SAL trên máy ở 03 nồng độ từ thấp , trung
bình đến cao (hàm lượng các chất chuẩn này ở µg/kg – ppb) và tìm LOD của thiết
bò.
- Nghiên cứu phương pháp tách chiết để loại mỡ, loại tạp trên các nền mẫu thòt ,

gan, thức ăn gia súc.
- Chạy mẫu và tìm LOQ của mẫu.
- Phân tích mẫu thêm chuẩn và tính hiệu suất thu hồi của phương pháp ở 03 nồng
độ khác nhau.
- Phân tích các dư lượng Clebuterol và Sabutamol trong thòt, gan heo và thức ăn
nu
ơi heo bằng phương pháp Elisa.
- Các kết quả có được từ phương pháp Elisa sẽ bắt đầu triển khai phân tích đònh
lượng trên thiết bò sắc ký khí ghép khối phổ ( GC/MS).
2/ Để báo cáo hiện trạng tồn dư Clenbuterol, Salbutamol trong thức ăn ni heo, thịt
heo, gan heo, th
ực phẩm chế biến sẵn từ thịt heo và gan heo trên địa bàn thành phố và
các t
ỉnh lân cận cần:
- Xác đ
ịnh hàm lượng Clenbuterol, Salbutamol trong thức ăn ni heo, thịt heo, gan
heo, th
ực phẩm chế biến sẵn từ thịt heo, gan heo trên địa bàn thành phố và các tỉnh lân
c
ận.
- So sánh k
ết quả giữa phương pháp Elisa và GC/MS.
- So sánh kết quả với 1 phòng thí nghiệm khác để kiểm chứng về phương pháp phân
tích.
1.6. Ph
ương pháp nghiên cứu:
- Phương pháp thu thập tài liệu: Tìm hiểu các công trình nghiên cứu của một
số tác giả trên thế giới về CLEN và SAL.
- Phương pháp thực nghiệm: Lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp với
điều kiện hiện có và phân tích thử nghiệm.

- Phương pháp phân tích số liệu: sử dụng các phương pháp thống kê để xử lý
cũng như đánh giá số liệu phân tích
-
Phương pháp so sánh và đánh giá
1.7. Nơi thu thập mẫu: Thu thập 22 mẫu thức ăn hỗn hợp cho heo thịt, 20 mẫu thịt
heo, 10 m
ẫu gan heo khu vực TP. Hồ Chí Minh và Đồng Nai. 20 mẫu thực phẩm chế
bi
ến sẵn trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh.
1.8. Thời gian thu thập mẫu: tháng 10/2007 – 11/2008
1.9. Nơi phân tích:
- N
ơi lấy mẫu và phân tích bằng phương pháp Elisa: Viện Khoa học Kỹ thuật nơng
nghi
ệp Miền nam theo hợp đồng số 113/2007/HĐK-TTPT giữa Viện Khoa học Kỹ
thu
ật nơng nghiệp Miền nam và Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm ngày 12
tháng 9 năm 2007.
- Nơi thực hiện xây dựng phương pháp phân tích và phân tích mẫu theo kỹ thuật
GC/MS: Trung tâm d
ịch vụ phân tích và thí nghiệm.
1.10. Sản phẩm của đề tài:
- Đề xuất phương pháp phân tích CLEN, SAL trong thòt heo, thức ăn nuôi heo, gan
heo bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ
- Báo cáo đánh giá hiện trạng tồn dư CLEN, SAL trong thòt heo, thức ăn nuôi heo,
gan heo, thự
c phẩm chế biến sẵn từ thịt và gan heo trên đòa bàn TP.Hồ Chí Minh và
các tỉnh lân cận.
1.11. Ý NGHĨA THỰC TIỄN
- Góp phần đánh giá hiện trạng tồn dư CLEN, SAL trong thòt heo, thức ăn nuôi heo,

gan heo, thự
c phẩm chế biến sẵn từ thịt và gan heo trên đòa bàn TP.Hồ Chí Minh và
các t
ỉnh lân cận.
- Từ các kết quả nghiên cứu xây dựng được phương pháp ly trích mẫu, phân tích
CLEN, SAL trong thòt heo, thức ăn nuôi heo, gan heo với kết quả tin cậy được trên
trang thiết bò hiện có của Trung tâm Dòch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm, phục vụ
phân tích cho an toàn thực phẩm trong nước và phục vụ cho xuất khẩu.


















CHƯƠNG II: TỔNG QUAN

2. 1. T
ỔNG QUAN VỀ CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL

2.1.1. Một số tính chất cơ bản của Clenbuterol và Salbutamol:
- Clenbuterol:

-Tờn húa hc: 4-amino-3,-dichloro--(((1,1-
imethylethyl)amino)methyl)benzenemethanol;
4-amino- ((tert-butylamino)methyl)-3,5-dichlorobenzyl alcohol;
- Tờn th
ng mi: Monores ( Valeas)
- Cụng th
c phõn t: C
12
H
18
Cl
2
N
2
O
- Tr
ng lng phõn t: 277,19
* D
n xut: Hydrochloride
- Tờn th
ng mi: Spiropent, Ventipulmin
- Cụng th
c phõn t: C
12
H
18
Cl

2
N
2
O.HCl
- Tớnh ch
t: Dng bt, vi tinh th khụng mu, nhit núng chy: 174-175,5
0
C. Tan
t
t trong nc , methanol, ethanol, tan nh trong Chloroform. Khụng tan trong
benzene. LD
50
trờn chut, chut lang ( mg/kg) : 176; 67,1, bng ng ming:
27,6;12,6. Nhi
t núng chy: 174-175,5
0
C.
- Salbutamol:
- Coõng thửực hoaự hoùc cuỷa Salbutamol

-
Tên hóa học: α-(((1, 1-Dimethylethyl) amino)methyl)-4-hydroxy-1,3-
benzenedimethanol;
α-((tert-butylamino) methyl)-4-hydroxy-m-xylene- α, α
’
-diol
- Cơng th
ức phân tử: C
13
H

21
NO
3

- Tr
ọng lượng phân tử: 239,31
- Tính ch
ất: Dạng bột tinh thể, nhiệt độ nóng chảy: 151
0
C. Tan tốt trong dung mơi hữu
c
ơ.
2.1.2. Tác hại của Clenbuterol và Salbutamol đối với động vật và người [4]
- Clenbuterol, Salbutamol là chất kích thích tăng trưởng, biểu hiện trên lâm sàng,
giãn phế quản, trò bệnh đường phổi, dùng số lượng lớn, nhòp mạch đập nhanh và hệ
thống thần kinh bò hưng phấn.
- Clenbuterol là chất dùng để điều trị bệnh đường hơ hấp cho trâu, bò, ngựa và dùng
cho trâu bò khi sinh đ
ẻ…Thuốc có thể thải dần theo đường tiểu và một ít qua phân của
gia súc. Th
ử nghiệm với liều cao trên chuột, thỏ, chó cho thấy độc tính chủ yếu làm
tăng nh
ịp tim và gây co giật; ở trâu bò nếu tiêm tĩnh mạch liều cao cũng làm tăng nhịp
tim, nh
ịp hơ hấp. Nếu sử dụng ở liều cao kéo dài có thể gây họai tử cơ tim. Sử dụng
clenbuterol v
ới liều uống 100mg/kg/ngày trên chuột cống có thể gây dị tật bào thai.
C
ũng theo nghiên cứu này trên một số gia súc cho biết 100% dư lượng của thuốc này
t

ồn dư ở trong cơ khơng biến đổi, mất đi qua q trình nấu nướng ở nhiệt độ đun sơi
100
0
C, ngay cả khi nướng, chiên…Tuy nhiên nếu qua chiên dầu ở nhiệt độ 260
0
C trong
kh
ỏang năm phút thì có thể mất đi.
- Ngoài ra CLEN, SAL còn điều tiết sinh trưởng động vật. Động vật vỗ béo thòt sử
dụng 5-10 lần liều trò bệnh. Nó thúc đẩy phát triển cơ bắp và tác dụng phân giải
lipit, tăng cao tỷ lệ thòt nạc so với thòt mỡ. Có tác dụng phân phối lượng năng lượng
nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn.
Vì vậy, CLEN, SAL thường bò lợi dụng làm chất bổ sung tăng tỷ lệ thòt nạc,
tăng khả năng tiêu hóa và chúng là những chất rất dễ tồn dư trong thòt, thường tạo
thành hiện tượng trúng độc cấp tính và trúng độc mãn tính khi sử dụng thực phẩm
còn tồn dư CLEN, SAL.
Ở nước ngoài [7]:
Tại Tây Ban Nha: 22/3-4/4 và 22/5-17/6/1991: 43 gia đình đã bò nhiễm CLEN, SAL
sau khi ăn gan heo. Các triệu chứng như chân tay run, nhòp tim đập nhanh, bồn
chồn, đau đầu, chóng mặt, buồn nôn, sốt, lạnh. Triệu chứng xảy ra trong vòng 30-
360 phút. Kết quả kiểm tra nước tiểu của các bệnh nhân cho thấy rằng hàm lượng
CLEN là 160-291 ppb.
Tại Pháp: 24/9/1990, 22 bệnh nhân từ 8 gia đình tại các khu vực khác nhau cũng bò
nhiễm CLEN sau khi ăn thòt heo với các triệu chứng như cơ bắp run, đau đầu, tim
đập nhanh.
Tại Trung Quốc: 5/1998: Tại Hương Cảng 17 người dân đã bò trúng độc CLEN, SAL
khi ăn thòt heo làm chân tay run rẩy, đau đầu, tim đập nhanh, miệng khô, mắt bò
trợn…
2001: toàn Trung Quốc có 1600 người bò trúng độc với tròêu chứng như trên.
Phân tích mẫu thòt phát hiện CLEN 1020µg/kg, 310µg/kg, 80µg/kg (Trung tâm

khống chế và dự phòng bệnh Triết Giang)
Tại Việt Nam
[4]:

Những năm gần đây đôi lúc cũng xảy ra trường hợp ngộ độc thức ăn tương
tự, không loại trừ khả năng trong thực phẩm còn tồn dư những chất cấm mà chưa
được kiểm soát. Một số người buôn lậu thức ăn gia súc và các chế phẩm sinh học
qua biên giới, không được giám sát kỹ thuật, chất lượng, đưa lậu vào thò trường Việt
Nam, ngoài ra một số thức ăn bổ sung của nước ngoài đưa vào thò trường Việt Nam
chỉ mới kiểm soát qua giấy tờ mà chưa phân tích kiểm nghiệm chất lượng, vì vậy ta
chưa kiểm soát và phát hiện được những chất cấm sử dụng trong thức ăn chăn nuôi.
Tồ
n dư các chất này trong thịt gia súc, gia cầm có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người
tiêu dùng như gây biến chứng ung thư, run cơ, đau tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp,
chóang váng.
Ở quận Cái Răng (Cần thơ), tại trại gà sau khi cho đàn gà 17 tháng tuổi ăn
(100 con) . Sau đó bốn ngày một hiện tượng lạ xảy ra; lượng trứng gà tăng lên đột
ngột đạt 98% trước đó tỉ lệ trứng đạt 65-70%. Chưa hết, ngay chiều hôm đó có một
con gà chết, hôm sau gà lại tiếp tục chết. Không chỉ thế đàn gà tơ khi cho ăn lô
thức ăn này cũng gặp những trường hợp tương tự. Sáu ngày sau khi cho ăn thì lượng
trứng tăng lên rất nhiều, có con đẻ mỗi ngày hai trứng. Khoảng 20 ngày sau thì đàn
gà chết hết. Khi cho đàn vòt xiêm khoảng 10 con và ba con vòt siêu thòt ăn. Chuyện
lạ tiếp tục đến: vòt đẻ trứng to dò thường, có hai lòng đỏ, thậm chí có những con mới
vừa ấp lại bỏ ổ và… tiếp tục đẻ.
TTDVPTTN phân tích lô mẫu thức ăn gia cầm này bằ
ng phương pháp Elisa, phân
tích 3 mẫu và cả 3 đều phát hiện thấy Clenbuterol với hàm lượng 137,03
ng/g,149,46ng/g, 142,97 ng/g.
Chất Clenbuterol được người chăn ni sử dụng cách khoảng 21 ngày trước khi
xu

ất chuồng bán. Đây là chất cực mạnh, có tác dụng nhanh, với 1 kg Clenbuterol có thể
tr
ộn với 1 tấn thức ăn gia súc. Nếu như trước đây ni một con heo 5 tháng mới được 1
t
ạ, nay với Clenbuterol chỉ cần chưa đầy 3 tháng là heo đã đủ tạ. Một trang trại ni vài
trăm con heo, có sử dụng Clenbuterol trong thức ăn, thì lợi nhuận tăng rất nhanh.
Nhưng hậu quả ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng là rất nghiêm trọng.
2.2. Tổng quan các phương pháp phân tích Clenbuterol, Salbutamol trong thức
ăn nuôi heo, th
ịt heo, gan heo bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ ñaõ
ñaêng baùo:
* Phươ
ng pháp phân tích hàm lượng vết Clenbuterol trong các mẫu nước tiểu và mẫu
gan: [13]
- X
ử lý mẫu gan: mẫu + acetonitril, ly tâm, đuổi khô dung môi, hòa tan cặn với đệm
phosphate. Clean up b
ằng cột SPE C
18
.
- D
ẫn xuất: BSTFA + 1% hay 10% TMCS hoặc MSTFA + 1% hay 10% TMCS
- S
ử dụng máy: Trace GC 2000 series ghép với đầu dò MS (EI) Finnigan Polaris
(Thermo Quest).
- Các ion xác nhận m/z: 243, 262, 264, 333
- Hi
ệu suất thu hồi: 83-94%
- Gi
ới hạn phát hiện: 0,5 ng/g

* Ph
ương pháp phân tích hàm lượng Clenbuterol trong thịt, gan, thận, phổi heo sử dụng
kỹ thuật thủy phân acid và clean up mẫu bằng cột SCX [12]
- X
ử lý mẫu: mẫu + acid perchloric, đánh siêu âm. Lọc. Chỉnh pH với sodium
hydroxide. Thêm vào m
ẫu sodium chloride, isopropanol, ethyl acetate. Đuổi khô dung
môi. Hòa tan c
ặn với đệm phosphate. Clean up mẫu bằng cột SCX.
- D
ẫn xuất: 1% TMCS + BSTFA hoặc HFBA hoặc BBA
- S
ử dụng máy: GC-SIMMS
- Các ion xác nh
ận m/z: cho BSTFA: 86, 243, 262, 277
cho HFBA: 363, 398, 439, 456
cho BBA: 243, 245, 327, 329
- Giới hạn phát hiện: 0,34 ppb cho thịt, 0,23 ppb cho gan.