hoàn thiện và phát triển các bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán các bệnh do hbv (hepatitis), hcv (hepatitis c virus) và hpv (human papillomavirus)

1
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH







BÁO CÁO TỔNG KẾT (đã chỉnh sửa)

DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM

HOÀN THIỆN VÀ PHÁT TRIỂN CÁC BỘ KIT SINH
HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DO HBV
(HEPATITIS B VIRUS), HCV (HEPATITIS C VIRUS),
HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS)








Chủ nhiệm dự án :
PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

Cơ quan chủ trì : Công ty TNHH CNSH KHOA THƯƠNG

Năm 2008


2


MỤC LỤC

Trang
TỔNG QUAN 1

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 8

NỘI DUNG – KẾT QUẢ 11
1. Hòan thiện các quy trình 11
1.1. Kit HBV đònh tính 11
1.2. Kit HCV đònh tính 14
1.3. Kit HPV đònh tính 17
1.4. Kit HBV đònh lượng 19
1.5. Kit HCV đònh lượng 29
1.6. Kit HPV phân nhóm 39
2. Triển khai sản xuất thử nghiệm 44

KẾT LUẬN 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Kit HBV đònh tính 48
Phụ lục 2. Kit HCV đònh tính 51
Phụ lục 3. Kit HPV đònh tính 54
Phụ lục 4. Kit HBV đònh lượng 57
Phụ lục 5. Kit HCV đònh lượng 62
Phụ lục 6. Kit HPV phân group 67
Phụ lục 7. Mô tả sản phẩm – Thành phần các kit và
Hướng dẫn sử dụng 82
Phụ lục 8. Quy trình sản xuất và kiểm tra chất lượng 120
Phụ lục 9. Phân tích hiệu quả kinh tế 129







3
TỔNG QUAN


Theo Tổ chức Y Tế Thế giới (WHO), bệnh truyền nhiễm nói chung và bệnh
nhiễm khuẩn nói riêng đang có khuynh hướng gia tăng và là mối đe dọa chung
trên phạm vi toàn cầu. Một số bệnh như viêm màng não, dòch tả, sốt vàng, … sau
nhiều năm suy giảm đã gia tăng trở lại tại nhiều quốc gia. Nhiều loại bệnh mới

nảy sinh với tốc độ nhanh chưa từng có. Bệnh Suy đường hô hấp cấp (SARS)
bùng nổ tại nhiều quốc gia châu Á vừa qua là một ví du.ï Trước tình hình đó, nhu
cầu về những biện pháp hiệu quả để phòng ngừa, chẩn đoán và điều trò bệnh
nhiễm trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết.


1. MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CÁC BỆNH NHIỄM : VIÊM GAN SIÊU VI B VÀ C,
NHIỄM HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS
1.1. Viêm gan siêu vi B và C
Viêm gan siêu vi là các bệnh nhiễm trùng do nhiều loại siêu vi có ái tính
với tế bào gan gây ra, dẫn đến viêm và hoại tử tế bào gan. Các bệnh này tuy có
triệu chứng tương tự nhau nhưng lại rất khác nhau về nguyên nhân, dòch tễ, lòch
sử tự nhiên và tiên lượng. Trong số các siêu vi gây viêm gan tìm thấy được cho
đến nay bao gồm siêu vi viêm gan A, B, C, D và E, siêu vi B (HBV) và C (HCV)
có ý nghóa quan trọng do sự phân bố đòa dư rộng, tỷ lệ nhiễm cao ở một số vùng
trên thế giới và có nguy cơ cao dẫn đến tình trạng nhiễm mạn tính và ung thư.
Các chẩn đoán viêm gan siêu vi hiện nay chủ yếu dựa vào biểu hiện lâm
sàng, sinh thiết gan, xét nghiệm sinh hoá và phản ứng huyết thanh. Các biện
pháp này trong nhiều trường hợp không cho phép xác đònh chính xác tác nhân
gây bệnh và nhất là không cho biết về trạng thái tồn tại của các tác nhân này ở
bệnh nhân.
Viêm gan siêu vi B
Bệnh viêm gan siêu vi do HBV có thời gian ủ bệnh biến động trong khoảng
60-110 ngày. Tỉ lệ nhiễm HBV mãn tính ở Bắc Mỹ thấp hơn 2% số người bò
nhiễm. Tỉ lệ này cao hơn nhiều ở châu Á, Phi, các đảo Thái Bình Dương và ở
người Eskimo. Đây là một vấn nạn y tế lớn - người ta ước chừng có khoảng 300
triệu người mang mầm bệnh mãn tính trên thế giới, và khoảng 3,5 tỷ người sống
trong những vùng bệnh lưu hành ở mức độ trung bình hoặc cao. Trên 122 triệu
em bé ra đời mỗi năm ở những vùng này và có nguy cơ rất cao trở thành những
người mang mầm bệnh ; khoảng 25%-30% những người mang mầm bệnh bò

nhiễm trong thời niên thiếu sẽ chết do các bệnh gan mãn tính hay ung thư gan.
Khoảng 1 tỷ đến 1 tỷ rưỡi người nhiễm HBV chết mỗi năm. HBV gây ra đến 80%
các trường hợp ung thư gan, là tác nhân gây ung thư chỉ đứng thứ hai sau thuốc
lá (WHO, 2000).

4
HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có vật liệu di truyền là một mạch đôi DNA
không hoàn toàn có kích thước khoảng 3,2 kb được bao bởi nucleocapsid có chứa
kháng nguyên lõi HBcAg, bên ngoài là kháng nguyên bề mặt HBsAg. Virus hoàn
chỉnh là một tiểu thể hình cầu có đường kính 42-47 nm, được gọi là hạt tử Dane.
Do triệu chứng lâm sàng của tình trạng nhiễm HBV không phân biệt được
với các dạng viêm gan siêu vi khác nên việc phát hiện bệnh chủ yếu dựa trên các
chẩn đoán huyết thanh học. Tình trạng nhiễm HBV cấp tính được đặc trưng bởi
sự hiện diện của HBsAg và IgM anti-HBc trong huyết thanh. Các phương pháp
huyết thanh học cho phép phát hiện các thành phần vừa nêu bao gồm phương
pháp khuếch tán miễn dòch, thử nghiệm kết dính hồng cầu và những thử nghiệm
có độ nhạy cao hơn như miễn dòch enzyme (EIA) và miễn dòch phóng xạ (RIA) có
thể phát hiện đến 0,1 ng/ml HBsAg. Gần đây người ta phát triển các chẩn đoán
phân tử có độ nhạy cao hơn như lai phân tử (slot hoặc dot blot) có thể phát hiện
DNA HBV đến hàm lượng 5pg/ml (tương ứng 1,5 x 10
6
bản sao/ml). Một thử
nghiệm lai trong pha lỏng đã thương mại hoá (Abbott) phát hiện được 1,5 pg/ml
DNA HBV còn thử nghiệm bDNA (Chiron) phát hiện 2,5 pg/ml DNA HBV. PCR
có độ nhạy còn cao hơn nhiều, có thể phát hiện được 10
-3
pg/ml (tương ứng
khoảng 100-1000 bộ gene) [1]
Viêm gan siêu vi C
Siêu vi viêm gan C (HCV), được xếp vào họ Flaviviridae, có vật liệu di

truyền là một RNA mạch đơn (+), kích thước khoảng 9,5 kb. Virus này không thể
nuôi cấy được và được xem là nguyên nhân của phần lớn các trường hợp viêm gan
"không A không B". Mặc dù HCV không gắn chèn vào bộ gene ký chủ nhưng lại
có khả năng tồn tại đặc biệt dai dẳng ở người bò nhiễm. Sự nhiễm HCV dẫn đến
tình trạng bệnh mãn tính trong 50-70% trường hợp. Nhiễm cấp tính HCV thường
ít có hoặc có triệu chứng nhẹ, khó nhận biết. Chỉ khoảng 10% người nhiễm thải
loại hoàn toàn virus, số còn lại chuyển sang tình trạng mãn tính. Trong số sau
này, ít nhất 60% phát triển viêm gan mạn. Khoảng 20% bệnh nhân viêm gan
mạn sẽ bò xơ gan và một số chết do mất chức năng gan hoặc do ung thư gan.
Riêng ở thành phố Hồ Chí Minh, ung thư gan nguyên phát chiếm vò trí thứ ba
trong các dạng ung thư và vò trí thứ nhất ở bệnh nhân nam. Một công trình
nghiên cứu dòch tễ học sự nhiễm HCV cho thấy tỉ lệ lưu hành HCV ở người bình
thường là 1,8%, và cao hơn nhiều ở các nhóm người có nguy cơ, từ 50% ở người
nhận truyền máu cho đến 96,2% ở người nghiện [2]. Việc phát hiện HCV trong
máu người bò nhiễm vừa có ý nghóa cho chẩn đoán và theo dõi điều trò, vừa có
tầm quan trọng đặc biệt trong việc sàng lọc để đảm bảo an toàn truyền máu và
các sản phẩm từ máu.
Biện pháp chẩn đoán HCV đầu tiên là ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) sử dụng kháng nguyên c100 tạo dòng từ bộ gene HCV
(Chiron/Ortho Diagnostic Systems). Một loạt các chẩn đoán sử dụng thêm nhiều
kháng nguyên tái tổ hợp khác của HCV ra đời sau đó, với độ nhạy và độ đặc hiệu
ngày càng cao như ELISA thế hệ thứ hai, RIBA (Recombinant Immunoblot

5
Assay) thế hệ thứ nhất, thứ hai, thứ ba. Tuy nhiên các phương pháp xét nghiệm
miễn dòch này có một số nhược điểm như không phát hiện được sự nhiễm ở giai
đoạn sớm hoặc không cho kết quả ở người mà hệ thống miễn dòch không hoạt
động (immunosuppressed). Các bộ kit dựa trên kỹ thuật PCR được phát triển cho
phép phát hiện trực tiếp HCV ngay trong thời kỳ viremia với độ nhạy cao, đến
khoảng 2.000 bản sao/ml huyết thanh. Thế mạnh của kỹ thuật này được kể là :

chẩn đoán sớm và chính xác ở người có nguy cơ cao, phát hiện HCV ở người
mang không triệu chứng, ở người có hàm lượng ALT cao, ở người có hệ thống
miễn dòch không hoạt động, khẳng đònh kết quả ELISA dương tính và theo dõi
điều trò. Amplicor HCV (Roche Diagnostic Systems) là một bộ kit dựa trên kỹ
thuật PCR đã được thương mại hóa. Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên
cứu sử dụng các biện pháp vừa kể. Kỹ thuật bDNA đònh lượng HBV cũng đã được
áp dụng tại Trung Tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo Tp HCM.

1.2. Human papillomavirus (HPV)
Ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh thuộc hàng đầu và là nguyên
nhân lớn thứ hai gây nên cái chết cho phụ nữ trên toàn thế giới. Hàng năm có
440.000 ca bệnh mới chiếm tỉ lệ 5,8% trong các bệnh ung thư [3]. Ở Việt Nam,
ung thư cổ tử cung cũng là bệnh hàng đầu ở phụ nữ miền Nam và thứ tư ở phụ nữ
miền Bắc. Theo thống kê về ghi nhận ung thư quần thể ở thành phố Hồ Chí
Minh (1998) thì thành phố có thêm 28,6 người trên 100.000 phụ nữ mắc bệnh
này mỗi năm. Khoảng từ 90-99,7% trường hợp bệnh ung thư cổ tử cung được phát
hiện có dấu hiệu của sự nhiễm một hay nhiều loại HPV (human papillomavirus)
gây ung thư.
Human Papillomavirus (HPV) là một trong những virus lây truyền qua
đường tình dục phổ biến, gây ra nhiều loại bệnh khác nhau ở người như mụn cóc,
u nang biểu mô… và liên quan đến nhiều loại ung thư trong đó đáng chú ý nhất là
ung thư cổ tử cung ở phụ nữ. Đây là virus nhỏ có đường kính khoảng 55nm với bộ
gene DNA vòng mạch kép gồm từ 7.200-8.000 cặp base với khoảng 10 khung đọc
mở. Hiện nay hơn 77 kiểu gene (genotype) khác nhau của virus này đã được xác
đònh ở người đã được giải trình tự. Người ta chia HPV sinh dục - nhóm các HPV
xâm nhiễm chủ yếu bề mặt niêm mạc, thường thấy ở đường sinh dục - thành hai
loại dựa trên khả năng gây ung thư. Đó là nhóm "nguy cơ thấp" (low risk), ít có
khả năng gây ung thư và nhóm "nguy cơ cao" (high risk), có khả năng gây ung
thư cao. Gene HPVE6 và HPVE7 của virus có khả năng gắn xen vào bộ gene,
phiên mã tạo ra oncoprotein E6 và E7. Các protein E6 và E7 của các HPV "nguy

cơ cao" có khả năng gắn kết cao với các protein p53 (có chức năng tiêu diệt tế bào
tổn thương trong giai đoạn G1 của quá trình phân bào) và pRB (có chức năng
điều hoà quá trình phân bào). Phức hợp E6/p53 làm mất hoạt tính của p53 khiến
cho tế bào không bò tiêu diệt khi bò tổn thương và dẫn đến tình trạng không ổn
đònh di truyền của tế bào. Sự gắn kết của E7 và pRB giải phóng tác nhân phiên

6
mã là E2F làm tăng sự phiên mã, hoạt hoá quá trình phân bào. Gene E6 và E7
được tìm thấy trong các tế bào ung thư HPV dương tính [3].
Phương pháp chẩn đoán tế bào học do Papanicolaou phát minh năm 1949,
thường được gọi là PAP test (Pap smear), đã làm giảm đáng kể số tử vong do ung
thư cổ tử cung và đã trở nên biện pháp phát hiện sớm ung thư cổ tử cung rất
thông dụng. Tuy nhiên, biện pháp này không chính xác, dễ cho kết quả âm tính
và dương tính giả, và cần được kết hợp với một số kiểm tra khác. Một số kỹ
thuật phân tử như PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) được phát triển gần
đây để phát hiện sự hiện diện của DNA HPV trong tế bào cổ tử cung. Các kỹ
thuật phân tử này còn cho phép xác đònh được các type và phân biệt các thương
tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV. Phương pháp lai trong pha lỏng đã
được phát triển thành các bộ kit (Hybrid Capture Tube (HCT), Hybrid Capture II)
(Digene Corporation) và được phép sử dụng trong chẩn đoán giúp xác đònh nhóm
HPV "nguy cơ cao" và "nguy cơ thấp". Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ
đặc hiệu cao, được phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ MY09-
MY11 [4] và hệ GP5+-GP6+ [5]. Các hệ primer này được thiết kế dựa trên trình
tự gene L1, cho phép phát hiện sự hiện diện của nhiều type HPV trong bệnh
phẩm.


1. MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỄM
Cho đến nay, các phương pháp chẩn đoán bệnh nhiễm chủ yếu dựa trên
biểu hiện lâm sàng, kết quả soi, cấy vi trùng và các xét nghiệm sinh hoá, miễn

dòch cổ điển. Tuy vẫn được sử dụng phổ biến, các biện pháp nêu trên đều có
những nhược điểm riêng. Chẩn đoán dựa trên biểu hiện lâm sàng chỉ tiến hành
được khi đã xuất hiện triệu chứng, không đặc hiệu cho bệnh, khó cho phép phân
biệt một số bệnh nhiễm trùng ở giai đoạn sớm. Kỹ thuật nuôi cấy và đònh danh
có độ nhạy thấp, đòi hỏi một lượng vi sinh vật cao trong bệnh phẩm ; khó tiến
hành ở một số vi sinh vật nuôi cấy không được hay phát triển rất chậm và khó
khăn do đặc tính tự nhiên ; và đặc biệt không có hiệu quả khi bệnh nhân đã sử
dụng kháng sinh trước đó. Các phương pháp sinh hóa và miễn dòch là những
phương pháp phát hiện gián tiếp thông qua đáp ứng của bệnh nhân nên thường
khó cho kết quả chính xác ở giai đoạn sớm của bệnh. Các phương pháp này
không có độ đặc hiệu cao (trừ phi sử dụng kháng thể đơn dòng trong xét nghiệm
miễn dòch, vốn đắt tiền và khó sản xuất). Tóm lại, các biện pháp vừa kể, dù sử
dụng riêng lẻ hay kết hợp, thường ít cho kết quả như ý do độ đặc hiệu và độ nhạy
không cao, hoặc do thời gian chờ đợi kết quả rất dài ; do đó có ý nghóa hạn chế
cho phục vụ điều trò.

Các phương pháp sinh học phân tử ngày càng được phát triển để sử dụng
như những công cụ chẩn đoán, điều trò, nghiên cứu dòch tễ học và kiểm tra dòch
bệnh trong lónh vực bệnh nhiễm. Các ưu điểm chính của chẩn đoán phân tử là :

7
(1) độ đặc hiệu gần như tuyệt đối vì phát hiện trực tiếp vật liệu di truyền của vi
sinh vật gây bệnh, (2) độ nhạy rất cao, nhất là đối với kỹ thuật PCR, cho phép
phát hiện một lượng vi sinh vật rất nhỏ, (3) thời gian cho kết quả nhanh, (4) có
thể được tự động hóa và "kit" hoá. Tuy nhiên, chẩn đoán phân tử cũng bao hàm
một số nhược điểm : giá xét nghiệm cao, thiết bò đắt tiền, quy trình chẩn đoán
không phải lúc nào cũng được chuẩn hóa, kỹ thuật viên phải được đào tạo kỹ.
Mặc dù vậy, trên thế giới ngày càng phát triển xu hướng sử dụng một cách chọn
lọc và có kiểm soát các kỹ thuật sinh học phân tử để bổ sung, hỗ trợ cho các chẩn
đoán cổ điển. Các bộ kit thương mại hóa dùng để phát hiện các tác nhân gây

bệnh được ưa chuộng vì chúng dễ sử dụng, tránh được ngọai nhiễm do khâu chuẩn
bò, sử dụng các hóa chất, sinh phẩm và điều kiện kiểm tra đã được chuẩn hóa.
Tuy vậy, nhiều tác giả khuyến cáo nên phát triển những phương pháp "tự chế" để
đáp ứng với các nhu cầu thực tế nảy sinh và để phù hợp với túi tiền của người
bệnh ở các nước đang phát triển.

Các chẩn đoán phân tử chủ yếu dựa trên kỹ thuật lai phân tử và PCR
(Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp dây chuyền).
Các test kits sử dụng mẫu dò (lai phân tử) để phát hiện tác nhân gây bệnh
được thương mại hóa sớm và hiện vẫn đang được sử dụng rộng rãi, điển hình như
hệ thống PACE2 (Gen-Probe) nhằm phát hiện đồng thời Neisseria gonorrhoeae
và Chlamydia trachomatis hay hệ thống Hybrid capture (Digene, Murex) để phát
hiện HPV (Human Papillomavirus), HSV (Herpes Simplex Virus), CMV
(Cytomegalovirus). Các phương pháp vừa kể rất nhanh và đơn giản nhưng có độ
nhạy kém, chỉ thật sự có hiệu quả khi số lượng bản sao bộ gene của tác nhân gây
bệnh trong bệnh phẩm đạt 10
4
bản sao/ml. Các phương pháp sử dụng mẫu dò có
kết hợp khuếch đại tín hiệu như bDNA (branched DNA probe) (Chiron) hay QB
replicase (Gene-Trak) được phát triển để cải tiến độ nhạy của phản ứng đến
khoảng 500 bản sao bộ gene/ml.
Tuy nhiên, các kỹ thuật nhân bản trình tự đích, thông dụng nhất là kỹ
thuật PCR, ngày càng chiếm ưu thế do độ nhạy không gì sánh được. Bên cạnh
ngày càng nhiều bộ kit PCR được các hãng lớn thương mại hóa là vô số các bộ kit
và phương pháp được phát triển ngay tại các phòng thí nghiệm lâm sàng để phục
vụ nhu cầu tại chỗ. Trong các bộ kit này, kỹ thuật PCR kết hợp với điện di, lai
phân tử, sử dụng enzyme cắt giới hạn, … cho phép phát hiện các tác nhân gây
bệnh với hàm lượng rất thấp, thời gian xét nghiệm nhanh và hoàn toàn đặc hiệu.
Một vài bộ kit PCR điển hình đã được FDA (Food and Drug Administration)
công nhận để đưa vào sử dụng như : các bộ kit phát hiện Chamydia trachomatis,

Mycobacterium tuberculosis, đònh lượng HIV (Roche Diagnostic System).

Ý nghóa kinh tế xã hội của việc sử dụng các phương pháp chẩn đoán phân
tử cũng được thảo luận nhiều. Bên cạnh việc cải thiện khả năng chẩn đoán, điều
trò và phòng ngừa cho người bệnh, lợi ích kinh tế của điều này thể hiện ở việc

8
giảm thiểu các xét nghiệm ít đặc hiệu và ít nhạy hơn, giảm thiểu các quy trình
chẩn đoán và điều trò không cần thiết cũng như giúp loại bỏ tình trạng nhiễm
trùng bệnh viện. Bên cạnh đó, các chương trình y tế nhằm sàng lọc và kiểm soát
tác nhân gây bệnh như HPV, Chlamydia, các tác nhân gây bệnh hiện diện trong
máu, … ở mức độ phân tử đối với cá nhân hoặc tập thể những người có nguy cơ
cao cũng cũng có ý nghóa kinh tế xã hội quan trọng. Chi phí bỏ ra để đổi lấy lợi
ích của chẩn đoán và điều trò sớm ở cá nhân, kiểm soát sự lây lan trong quần thể
và các vấn đề khác của y tế cộng đồng là có thể chấp nhận được.
Ở nước ngoài, chủ yếu dựa trên các kỹ thuật lai phân tử và PCR, nhiều bộ
thử nghiệm (kit) chẩn đoán phân tử đã được thương mại hóa và sử dụng cho chẩn
đoán thường quy. Các bộ kit này hầu như được cung cấp cho kỹ thuật viên xét
nghiệm dưới dạng “sẵn sàng cho sử dụng” giúp giảm thiểu các khâu chuẩn bò có
thể dẫn đến ngoại nhiễm; ngoài ra, các hóa chất, sinh phẩm và quy trình đã được
kiểm tra và chuẩn hóa đảm bảo tính ổn đònh và độ tin cậy của xét nghiệm.
Ở nước ta và ở Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng, đã có một số nghiên cứu
phát triển và thương mại hóa các bộ kit dùng trong chẩn đoán phân tử một số
bệnh truyền nhiễm do các siêu vi gây viêm gan (HBV, HCV), Mycobacterium
tuberculosis, … , như Công ty Nam Khoa. Số lượng và chất lượng các bộ kit phát
triển trong nước cho đến nay chưa đáp ứng hết nhu cầu thực tế. Hiện nay một số
bệnh viện và trung tâm y tế lớn cũng đã bắt đầu thử nghiệm các bộ kit này cũng
như một số bộ kit nhập như Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Hoà Hảo, các phòng
xét nghiệm của Bệnh viện Đại học Y Dược, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh
viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Hoàn Mỹ, … Vấn đề đặt ra hiện nay đối với các bộ kit

nhập là chi phí cho một xét nghiệm rất lớn, ví dụ như một xét nghiệm phát hiện
HCV sử dụng hệ thống Amplicor (Roche) có giá là 1,5 triệu đồng cho một mẫu
thử. Còn đối với các kit phát triển trong nước vấn đề lớn là mức độ chuẩn hóa
thấp, dẫn đến sự không thống nhất lớn giữa các cơ sở xét nghiệm, kết quả không
có độ tin cậy cao. Vấn đề về nhân viên kỹ thuật được đào tạo bài bản cũng phải
được giải quyết để đảm bảo độ chính xác của phản ứng.

Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – bộ môn Di Truyền – trường ĐH
Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG Tp HCM đã tiến hành nghiên cứu và nghiệm thu
các đề tài có liên quan đến dự án bao gồm :
1. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán một số
bệnh nhiệt đới (Sốt xuất huyết Dengue, Viêm gan siêu vi B và C, Viêm não Nhật
bản, nhiễm HPV (Human Papillomavirus) – đề tài NCKH trọng điểm ĐHQG Tp
HCM, nghiệm thu 2004.
2. Xây dựng quy trình phát hiện HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên
cứu và chẩn đoán – đề tài Vườn ươm sáng tạo KHKT trẻ – Sở KH & CN Tp
HCM, nghiệm thu 2004.
3. Xây dựng quy trình đònh lượng virus viêm gan B trong máu bệnh nhân bằng
kỹ thuật real-time PCR – đề tài NCKH trọng điểm ĐHQG, nghiệm thu 2005

9
4. Xây dựng quy trình đònh lượng virus viêm gan C bằng kỹ thuật real-time RT-
PCR phục vụ cho việc nghiên cứu và điều trò bệnh viêm gan siêu vi C – đề tài Sở
KH & CN Tp HCM, nghiệm thu 2005.
Từ các kết quả nghiệm thu trên, chúng tôi tiếp tục hoàn thiện các kit HBV
và HCV đònh tính, HBV và HCV đònh lượng và đưa thử nghiệm tại các cơ sở y tế
có quan hệ hợp tác và nhu cầu sử dụng thông qua việc chuyển giao công nghệ cho
Công ty TNHH CNSH Khoa Thương.

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Tiến hành triển khai các quy trình và các bộ kit dùng cho chẩn
đoán phân tử đối với các tác nhân virus bao gồm HCV, HBV, HPV từ các
kết quả nghiên cứu cơ bản đạt được và từ các thành tựu đã công bố trên
thế giới




















10

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH


1. HOÀN THIỆN CÁC QUY TRÌNH
D Bệnh phẩm
Các mẫu huyết thanh nghi nhiễm HCV, HBV do Bệnh viện ĐH Y Dược,
DIAG Center và Trung tâm Chẩn Đoán Y Khoa Hòa Hảo (Medic) cung cấp trong
thời gian từ tháng 9/2005 đến tháng 4/2006. Các mẫu dòch phết cổ tử cung do
Bệnh viện Hùng Vương Tp HCM cung cấp trong thời gian từ tháng 9/2005 đến
tháng 4/2006.
D Các đơn vò tham gia :
- Phòng Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y Dược Tp HCM (BV ĐH Y Dược)
- Phòng PCR – DIAG Center (DIAG Center)
- Phòng PCR – BV Hùng Vương Tp HCM (BV Hùng Vương)
- Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử – trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên
(ĐH KHTN).

1.1. Độ đúng (Accuracy)
Đơn vò chòu trách nhiệm là ĐH KHTN.
Thiết bò sử dụng :
- PCR đònh tính : Techne TC-312
- PCR đònh lượng : iCycler 584BR
Độ đúng được đònh nghóa là độ trùng hợp giữa giá trò trung bình
của thử nghiệm với giá trò được công nhận là chuẩn. [6]
Độ đúng của các quy trình được xác đònh với hai cách tiếp cận :
W So sánh kết quả thu được từ các quy trình thử nghiệm với kết quả đã
biết trên 10 bệnh phẩm. Cụ thể, kết quả của quy trình phát hiện và đònh lượng
HBV cũng như quy trình phát hiện và đònh lượng HCV được so sánh với kết quả
bDNA và với hàm lượng DNA HBV và HCV đã biết ; kết quả quy trình phát hiện
và phân nhóm HPV thì được so sánh với kết quả giải trình tự.

Thao tác viên nhận 10 bệnh phẩm từ trưởng nhóm không kèm thông tin gì
về bệnh phẩm. Đối với mỗi bệnh phẩm, thao tác viên tiến hành tách chiết
DNA/RNA và đặt 03 phản ứng PCR/RT-PCR độc lập, sử dụng cùng bộ dụng cụ,
cùng lô hóa chất và cùng máy PCR.
W Sử dụng các huyết thanh có hàm lượng HBV (5.10
5
IU/ml) và HCV (5.10
4
IU/ml) đã biết do WHO cung cấp để kiểm tra độ chính xác của hai quy trình đònh
lượng HBV và HCV. Các huyết thanh WHO được sử dụng để kiểm tra độ chính
xác của đường cong chuẩn do chúng tôi xây dựng.
Các huyết thanh WHO được pha loãng bậc 10 thành ba nồng độ dùng để
xây dựng đường cong chuẩn WHO. Đường chuẩn WHO và đường chuẩn từ
amplicon do chúng tôi xây dựng được sử dụng để đònh lượng DNA HBV và RNA
HCV của 5 bệnh phẩm. Các kết quả từ hai phản ứng đònh lượng được so sánh để
rút ra kết luận.

11
1.2. Độ lặp lại :
Các đơn vò tham gia nghiên cứu bao gồm :
Quy trình Đơn vò tham gia
Phát hiện HBV
Đònh lượng HBV
Phát hiện HCV
Đònh lượng HCV

1) BV ĐH Y Dược
2) DIAG Center
Phát hiện HPV
Đònh nhóm HPV

1) BV ĐH Y Dược
2) BV Hùng Vương
Thiết bò sử dụng :
- BV ĐH Y Dược : iCycler 584BR
- DIAG Center : iCycler 582BR iQ5
- BV Hùng Vương : Master Cycler 22331(Eppendorf)
Độ lặp lại của quy trình được đònh nghóa là mức độ giống nhau
giữa các lần lặp lại khi tiến hành quy trình trong cùng điều kiện và
trong những điều kiện khác nhau. [6]
Độ lặp lại của các quy trình được khảo sát trên 10 bệnh phẩm đã được
kiểm tra dương tính như nêu ở mục 1.1. Các bệnh phẩm này được phân làm ba
phần, một phần lưu tại ĐH KHTN, hai phần còn lại được chuyển ngay đến các
đơn vò tham gia nghiên cứu.
Đối với mỗi mẫu, hai kỹ thuật viên tại ĐH KHTN sẽ tiến hành lặp lại 03
lần. Tại mỗi cơ sở y tế tham gia nghiên cứu, một kỹ thuật viên tiến hành tách
chiết DNA/RNA và đặt phản ứng PCR/RT-PCR theo quy trình do ĐH KHTN cung
cấp.

1.3. Xác đònh ngưỡng phát hiện đối với hai quy trình đònh lượng
HBV và HCV :
Đơn vò chòu trách nhiệm : ĐH KHTN
Thiết bò sử dụng : iCycler 584BR
Các amplicon HBV và HCV dùng để xây dựng đường chuẩn đònh lượng với
nồng độ 10
14
bản sao/ml được pha loãng bậc 10 đi từ 10
0
đến 10
9
. Mỗi quy trình

đònh lượng được tiến hành ba lần trên từng nồng độ pha loãng.

1.4. So sánh kết quả của quy trình với kết quả khi sử dụng những
phương pháp khác trên 20 bệnh phẩm mỗi loại
Kit Phương pháp so sánh
Phát hiện HBV
Đònh lượng HBV
Versant™ HBV DNA 3.0 assay (bDNA)
(Bayer)

Phát hiện HCV
Đònh lượng HCV
Versant™ HCV RNA 3.0 assay (bDNA)
(Bayer)

Phát hiện HPV
Phân nhóm HPV
kit Takara

12
Các kết quả từ phương pháp bDNA do Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Hòa
Hảo cung cấp.

1.5. Tính ổn đònh theo thời gian của sản phẩm :
Tính ổn đònh của các kit thử nghiệm được kiểm tra liên tục sau 14, 30, 60,
90, 120, 150, 180 ngày. Ở mỗi đợt kiểm tra, lô sản phẩm đã qua các thời gian bảo
quản ở -20°C và lô sản phẩm mới pha sẽ được sử dụng song song trên 01 mẫu âm
tính và 01 mẫu dương tính với tác nhân cần kiểm tra.

1.6. Độ đặc hiệu và độ nhạy lâm sàng

Xác đònh tỉ lệ người mắc bệnh và không mắc bệnh thực tế dựa trên tổ hợp
nhiều phương pháp và so sánh với kết quả thu được với các kit thử nghiệm. Kết
quả phát hiện HBV, HCV được so sánh với tổ hợp kết quả sinh hóa và miễn dòch;
kết quả phát hiện HPV được so sánh với kết quả Pap test.


2. TRIỂN KHAI SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM
2.1. Chuyển giao kỹ thuật
Trước khi các kit được đưa thử nghiệm tại các cơ sở y tế tham gia nghiên
cứu, chúng tôi tổ chức huấn luyện kỹ thuật thao tác cho các kỹ thuật viên về tất
cả các công đoạn của quy trình trong thời gian 1-2 tuần

2.2. Tổ chức sản xuất và cung cấp kit cho các cơ sở y tế tham gia
nghiên cứu
2.2.1. Đặt hàng
2.2.2. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu
2.2.3. Pha chế các hỗn hợp tách chiết DNA/RNA, PCR, RT/PCR đònh tính,
PCR/RT-PCR đònh lượng
2.2.4. Kiểm tra chất lượng các kit
2.2.5. Giao hàng

2.3. Giải quyết các vấn đề “hậu mãi”

13
NỘI DUNG - KẾT QUẢ


1. HOÀN THIỆN CÁC QUY TRÌNH

1.1. Quy trình phát hiện HBV
1.1.1. Độ đúng
Kết quả phát hiện HBV với kit HBV đònh tính trên 10 bệnh phẩm lặp lại
ba lần của hai người thao tác được trình bày trong bảng 1. Kết quả đầy đủ được
trình bày trong phụ lục 1. Kết quả được tính là dương hay âm tính khi cả 03 lần
lặp lại cho cùng kết quả. Các kết quả dương/âm tính được đánh giá dựa trên sự
phù hợp với kết quả bDNA HBV.

Bảng 1 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm của 02 người thao tác
Bệnh phẩm Kết quả 03 lần lặp
lại của người I
Kết quả 03 lần lặp
lại của người II
Kết quả đònh lượng bằng
bDNA (bản sao/ml)
1 + +
1.423.039
2 + +
130.419
3 + +

6.628.213
4 + +
2.721.019
5 + +
275.022
6 + +
526.399
7 + +
364.103
8 + +
689.795
9 + +
1.157.341
10 + +
2.554.745
11 - -
<2.000
Trong số các bệnh phẩm thử nghiệm có 01 bệnh phẩm âm tính với HBV và
10 bệnh phẩm có chứa các hàm lượng virus khác nhau đi từ 130.419 bản sao/ml
đến 6.628.213
bản sao/ml. Kết quả trên cho thấy quy trình phát hiện HBV phù
hợp 100% với kết quả đònh lượng bằng phương pháp bDNA.

1.1.2. Độ lặp lại
Kết quả phát hiện HBV với kit HBV đònh tính từ 02 cơ sở y tế là BV ĐH Y
Dược và DIAG Center được trình bày trong bảng 2.

Bảng 2 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm ở 02 cơ sở y tế
Bệnh
phẩm

Kết quả 03 lần lặp lại
tại BV ĐH Y Dược
Kết quả 03 lần lặp
lại tại DIAG Center
Kết quả bDNA
(bản sao/ml)
1 + +
275.022
2 + +
>100.000.000
3 + +
32.772
4 + +
>100.000.000

14
5 + +
9.103.353
6 + +
>100.000.000
7 + +
>100.000.000
8 + +
>100.000.000
9 + +
1.157.341
10 + +
2.554.745
Kết quả bảng 2 cho thấy độ lặp lại của quy trình phát hiện HBV là 100%
trên 10 mẫu thử nghiệm ở 02 cơ sở y tế. Các mẫu này là huyết thanh âm và

dương tính có chứa hàm lượng HBV từ 32.772 đến > 100.000.000 bản sao/ml.

1.1.3. So sánh kết quả sử dụng kit HBV đònh tính với kết quả sử
dụng kit Versant (Bayer) trên 20 bệnh phẩm

Bảng 3. Kết quả thu được với kit HBV đònh tính và kit Versant (Bayer)
Bệnh phẩm Kit Versant (bản sao/ml) Kit HBV đònh tính
1 123.192 ++
2 >100.000.000 ++++
3 151.346 +++
4 6.628.213 ++++
5 10.526.708 ++++
6 8.490.049 ++++
7 63.507.092 ++++
8 689.795 ++++
9 582.386 +++
10 >100.000.000 ++++
11 304.528 +++
12
<2.000
-
13
3.261
+
14 100.000.000 ++++
15 9.103.353 ++++
16 89.412.936 ++++
17 >100.000.000 ++++
18 >100.000.000 ++++
19 1.423.039 +++

20 >100.000.000 ++++
21 <2.000 -
Ghi chú : +

++++ : Cường độ tín hiệu dương tính ước lượng qua mắt thường so
với một mẫu có hàm lượng DNA HBV đã biết.

Kết quả (bảng 3) cho thấy :
- 19 mẫu dương tính với kit HBV đònh tính có hàm lượng HBV từ 3.261 bản
sao/ml đến > 10
8
bản sao/ml ; điều này phù hợp với ngưỡng phát hiện của kit
HBV đònh tính là 10
3
bản sao/ml.

15
1 2 3 4
- 2 mẫu âm tính có hàm lượng HBV thấp dưới ngưỡng phát hiện của kit Versant
HBV DNA.

1.1.4. Tính ổn đònh của sản phẩm theo thời gian bảo quản
Tính ổn đònh này được đánh giá một cách tương đối dựa trên kết quả
dương/âm tính và việc so sánh cường độ tín hiệu quan sát bằng mắt thường giữa
các phản ứng sử dụng lô sản phẩm bảo quản và lô sản phẩm mới trên cùng một
bệnh phẩm. Bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm thu nhận ngay trước khi tiến
hành thí nghiệm ; lô mới được chuẩn bò ngay trước khi tiến hành thí nghiệm

Bảng 4. Kết quả khảo sát độ ổn đònh của kit HBV đònh tính theo thời gian
Lô bảo quản Lô mới Thời gian (ngày)

Mẫu (-) Mẫu (+) Mẫu (+)
14 - ++ ++
30 - +++ +++
60 - +++ ++
90 - +++ +++
120 - +++ ++
150 - + ++
180 - ++ ++
(A) (B) (C) (D)






(E) (F) (





Hình 1 : Kết quả PCR với lô sản phẩm đã qua bảo quản và với lô mới của
kit HBV đònh tính
1 : Thang 485 bp; 2, 3 : mẫu (-) và (+) thực hiện với lô sản phẩm đã qua bảo
quản – A-G : thời gian bảo quản 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 ngày ; 4 : mẫu (+)
thực hiện trên lô sản phẩm mới.

Kết quả cho thấy kit HBV đònh tính giữ nguyên hiệu quả trong thời gian
180 ngày trong điều kiện bảo quản phù hợp.

1 2 3 4 1 2 3 4
1 2
3
4 1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4

16
1.2. Kit HCV đònh tính
1.2.1. Độ đúng
Kết quả phát hiện HCV với kit HCV đònh tính trên 10 bệnh phẩm lặp lại
ba lần của hai người thao tác được trình bày trong bảng 5. Kết quả đầy đủ được
trình bày trong phụ lục 2. Tương tự như đối với kit HBV đònh tính, kết quả được
tính là dương hay âm tính khi cả 03 lần lặp lại cho cùng kết quả và được đánh
giá dựa trên sự phù hợp với kết quả bDNA HCV.

Bảng 5 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm của 02 người thao tác
Bệnh phẩm Kết quả 03 lần lặp
lại của người I
Kết quả 03 lần lặp
lại của người II
Kết quả bDNA
(bản sao/ml)
1 + +
1.293.496
2 + +
782.861
3 + +
580.151
4 + +

1.660.823
5 + +
3.068.264
6 + +
566.565
7 + +
3.917.415
8 + +
6.090.000
9 + +
4.030
10 + +
1.260.000
Các bệnh phẩm dương tính với HCV có chứa các hàm lượng virus đi từ
4.030 đến 6.090.000 bản sao/ml. Kết quả trên cho thấy quy trình phát hiện HCV
đạt độ chính xác 100% trên các mẫu có hàm lượng HCV nằm trong ngưỡng trên.

1.2.2. Độ lặp lại
Kết quả phát hiện HCV với kit HCV đònh tính từ 02 cơ sở y tế là BV ĐH Y
Dược và DIAG Center được trình bày trong bảng 6

Bảng 6 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm ở 02 cơ sở y tế
Bệnh
phẩm
Kết quả 03 lần lặp lại
tại BV ĐH Y Dược
Kết quả 03 lần lặp
lại tại DIAG Center
Kết quả đònh
lượng bằng bDNA

1 + +
380.494
2 + +
23.055
3 + +
4.107.441
4 + +
4.280.137
5 + +
38.366
6 + +
99.577
7 + +
1.060.000
8 + +
157.000
9 + +
1.130.000
10 + +
782.861

17
Kết quả bảng 6 cho thấy độ lặp lại của quy trình phát hiện HCV là 100%
trên 10 mẫu thử nghiệm ở 02 cơ sở y tế. Các mẫu này là huyết thanh âm và
dương tính có chứa hàm lượng HCV từ 23.055 đến 4.280.137 bản sao/ml được xác
đònh bằng kit Versant (Bayer)

1.2.3. So sánh kết quả sử dụng kit HCV đònh tính với kết quả sử
dụng kit Versant (Bayer) trên 20 bệnh phẩm

Bảng 7. Kết quả so sánh giữa kit HCV đònh tính với kit Versant HCV trên
20 bệnh phẩm nghi nhiễm HCV
Bệnh phẩm Kit Versant (bản sao/ml) Kit HCV đònh tính (bản sao/ml)
1 12.921.664 ++++
2 571.580 +++
3 505.799 +++
4 2.793.335 ++++
5 3.214.227 ++++
6 467.278 +++
7 13.257.142 ++++
8 2.357.943 ++++
9 4.756.803 +++
10 610.046 +++
11 147.029 ++
12 999.677 +++
13 682.133 +++
14 3.228.902 ++++
15 19.245.820 ++++
16 3.316.638 ++++
17 1.832.821 +++
18 4.115.851 +++
19 <3.200 -
20 <3.200 -
Ghi chú : +

++++ : Cường độ tín hiệu dương tính ước lượng qua mắt thường so
với một mẫu có hàm lượng DNA HBV đã biết

Kết quả (bảng 7) cho thấy :
- 18 mẫu dương tính với kit HCV đònh tính có hàm lượng HCV từ 147.029 đến

19.245.820 bản sao/ml ; điều này phù hợp với ngưỡng phát hiện của kit HCV
đònh tính là 10
3
bản sao/ml
- 2 mẫu âm tính với kit HCV đònh tính có hàm lượng HCV thấp dưới ngưỡng
phát hiện của kit Versant HCV RNA
Nhìn chung, kết quả phát hiện HCV bằng kit HCV đònh tính phù hợp với
kết quả đònh lượng HCV bằng kỹ thuật bDNA


18
1.2.4. Tính ổn đònh của kit HCV đònh tính theo thời gian bảo quản
Tính ổn đònh của kit HCV đònh tính được đánh giá tương tự như đối với kit
HBV đònh tính : đọc kết quả dương/âm tính và so sánh cường độ tín hiệu quan
sát bằng mắt thường giữa các phản ứng sử dụng lô sản phẩm bảo quản và lô sản
phẩm mới trên cùng một bệnh phẩm. Bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm thu
nhận ngay trước khi tiến hành thí nghiệm ; lô mới được chuẩn bò ngay trước khi
tiến hành thí nghiệm.

Bảng 8. Kết quả khảo sát độ ổn đònh của kit HCV đònh tính theo thời gian
Lô qua bảo quản Lô mới Thời gian (ngày)
Mẫu (-) Mẫu (+)
14 - + +
30 - ++ ++
60 - + +
90 - + +
120 - +++ +++
150 - +++ +++
180 - +++ +++

(A) (B) (C) (D)






(E) (F) (G)





Hình 2 : Kết quả PCR với lô sản phẩm đã qua bảo quản và với lô mới của
kit HCV đònh tính
1 : Thang 192 bp; 2, 3 : mẫu (-) và (+) thực hiện với lô sản phẩm đã qua bảo
quản – A-G : thời gian bảo quản 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 ngày ; 4 : mẫu (+)
thực hiện trên lô sản phẩm mới.

Kết quả phát hiện HCV với lô kit đã qua các thời gian bảo quản và với lô
kit chuẩn bò ngay trước khi tiến hành phản ứng cho thấy kit HCV đònh tính giữ
nguyên hiệu quả sau 180 ngày bảo quản ở điều kiện phù hợp.


1 2 3 4
1 2 3 4
1 2 3 4
1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

19
1.3. Kit HPV đònh tính
1.3.1. Độ đúng
Kết quả phát hiện HPV với kit HPV đònh tính trên 10 bệnh phẩm đã được
xác đònh là dương tính với hai người thao tác được trình bày trong bảng 9.
Các số liệu chi tiết được trình bày trong phụ lục 3.

Bảng 9 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm của 02 người thao tác
Bệnh phẩm Kết quả 03 lần lặp
lại của người I
Kết quả 03 lần lặp
lại của người II
Kết quả giải trình tự
1 + +
HPV 18
2 + +
HPV 18
3 + +
HPV 58
4 + +
HPV 11
5 + +
HPV 18
6 + +
HPV 16
7 + +
HPV 58
8 + +
HPV 18
9 + +

HPV 18
10 + +
HPV 6
Kết quả (bảng 9) cho thấy có sự phù hợp 100 % giữa kết quả phát hiện
HPV bằng kit HPV đònh tính với kết quả giải trình tự.

1.3.2. Độ lặp lại
Kết quả phát hiện HPV với kit HPV đònh tính từ 02 cơ sở y tế là BV Hùng
Vương và BV ĐH Y Dược được trình bày trong bảng 10.

Bảng 10 : Kết quả 03 lần lặp lại trên 10 bệnh phẩm ở 02 cơ sở y tế
Bệnh
phẩm
Kết quả 03 lần lặp lại
tại BV ĐH Y Dược
Kết quả 03 lần lặp
lại tại DIAG Center
Kết quả giải trình tự
1 + +
HPV 18
2 + +
HPV 16
3 + +
HPV 6
4 + +
HPV 18
5 + +
HPV 42
6 + +
HPV 18

7 + +
HPV 58
8 + +
HPV 18
9 + +
HPV 11
10 + +
HPV 16
Kết quả phát hiện HPV từ 02 đơn vò bằng kit HPV đònh tính có sự phù hợp
100%.



20
1.3.3. Tính ổn đònh của kit HPV đònh tính theo thời gian bảo quản
Tính ổn đònh của kit HPV đònh tính được đánh giá tương tự như đối với kit
HBV đònh tính : đọc kết quả dương/âm tính và so sánh cường độ tín hiệu quan
sát bằng mắt thường giữa các phản ứng sử dụng lô sản phẩm bảo quản và lô sản
phẩm mới trên cùng một bệnh phẩm. Bệnh phẩm sử dụng là bệnh phẩm thu
nhận ngay trước khi tiến hành thí nghiệm ; lô kit mới được chuẩn bò ngay trước
khi tiến hành thí nghiệm.

Bảng 11. Kết quả khảo sát độ ổn đònh của kit HPV đònh tính theo thời gian
Lô bảo quản Lô mới Thời gian (ngày)
Mẫu (-) Mẫu (+) Mẫu (+)
14 - ++ ++
30 - +++ ++
60 - + +
90 - +++ +++
120 - +++ +++

150 - + ++
180 - ++ ++
(A) (B) (C) (D)







(E) (F) (G)






Hình 3 : Kết quả PCR với lô sản phẩm đã qua bảo quản và với lô mới của
kit HPV đònh tính
1 : Thang 450 bp; 2, 3 : mẫu (-) và (+) thực hiện với lô sản phẩm đã qua bảo
quản – A-G : thời gian bảo quản 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180 ngày ; 4 : mẫu (+)
thực hiện trên lô sản phẩm mới.

Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa lô đã qua các thời gian bảo
quản khác nhau với một lô chuẩn bò mới. Như vậy kit HPV đònh tính có thể bảo
quản ít nhất 180 ngày trong điều kiện phù hợp.

1 2 3 4 1 2 3 4
12 34
1 2 3 4

1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4

21
Người 1 và Amplicon
R
2
= 0.9994
0
5
10
0246810
Nguoi 1
Amplicon
Người 2 và Amplicon
R
2
= 0.9997
0
5
10
0246810
Nguoi 2
Amplicon
1.4. Kit HBV đònh lượng
1.4.1. Độ đúng
Độ đúng của quy trình đònh lượng HBV được kiểm tra qua hai nội dung :
(1) tính phù hợp của kết quả kit HBV đònh lượng với giá trò đã biết, ở đây là các
hàm lượng DNA amplicon (10
14

bản sao/ml) pha loãng thành các nồng độ khác
nhau, từ hai người thao tác độc lập ; (2) kiểm tra đường cong chuẩn dùng trong
đònh lượng của kit HBV đònh lượng bằng mẫu HBV “chuẩn” (WHO).

Bảng 12 . Trung bình 3 lần lặp lại của 02 người thao tác trên 10 bệnh phẩm
Mẫu Người thao tác I (log
10

bản sao/ml)
Người thao tác II (log
10

bản sao/ml)
Hàm lượng DNA amplicon
HBV (log
10
bản sao/ml)
1
5.305494677 5.312882266 5.301029996
2
3.068680502 3.06793833 3
3
5.191451014 5.247482261 5.301029996
4
9.015639134 9.006323393 9
5
3.10060027 3.10720997 3
6
3.094587577 3.115721428 3
7

3.951984754 3.958404597 4
8
5.01171138 5.012556037 5
9
5.371560399 5.375968275 5.397940009
10
8.983175072 8.985276743 9









Hình 4 : Hệ số tương quan giữa trung bình 03 lần lặp lại của người thao
tác so với giá trò amplicon HBV đã biết

Chúng tôi tính toán độ đúng của kết quả theo công thức [7, 8] :

(Xj – X)
Z =
S
Xj : Giá trò trung bình của kết quả nhận được
X : Giá trò đã biết
S : Độ lệch chuẩn

Giá trò độ đúng ≤ 2% : kết quả được xem là tốt.

22
Standard Who và Amplicon
R
2
= 0.9786
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 2000 4000 6000 8000 10000
Standard Who
Amplicon
Bảng 13. Độ đúng của quy trình HBV đònh lượng với các người thao tác
Mẫu Người thao tác I Người thao tác II
1
0.059532246 0.069768587
2
0.008557697 0.01141413
3
0.98251922 0.446273319
4
0.08113102 0.085570443
5
0.148975807 0.086809122
6
0.108824732 0.220547775
7
0.258228628 0.124219557

8
0.003225416 0.003060473
9
0.0191146 0.017868253
10
0.013126458 0.012223778

Các giá trò độ đúng đối với cả hai người thao tác đều < 2%, cho thấy có sự
phù hợp cao giữa hàm lượng HBV xác đònh bằng kit HBV đònh lượng với hàm
lượng DNA amplicon HBV hiện diện trong mẫu đối với cả hai người thao tác.

Bên cạnh đó, kết quả so sánh việc sử dụng đường cong chuẩn từ amplicon
do chúng tôi xây dựng với đường cong chuẩn xây dựng từ mẫu chuẩn WHO để
đònh lượng DNA HBV có trong 5 bệnh phẩm được trình bày trong bảng 14 cho
thấy có sự phù hợp cao giữa kết quả đònh lượng sử dụng hai đường cong chuẩn với
hệ số tương quan là 0,9786.

Bảng 14. Kết quả đònh lượng của 05 bệnh phẩm sử dụng đường cong
chuẩn xây dựng với amplicon HBV và với DNA HBV WHO
Mẫu Đường cong chuẩn WHO
(IU/ml)
Đường cong chuẩn kit HBV đònh
lượng (IU/ml)
1
3840 3825
2
525 650
3
805 970
4

2.22 2.835
5
905 1090








Hình 5. Hệ số tương quan giữa kết quả đònh lượng HBV sử dụng
amplicon HBV và sử dụng mẫu chuẩn WHO


23
1.4.2. Khảo sát tính lặp lại của phản ứng real-time PCR
Độ tin cậy của thí nghiệm được thể hiện qua tính lặp lại của một thí
nghiệm. Tính lặp lại càng cao thì độ tin cậy càng cao. Tính lặp lại của phản ứng
real-time PCR được biểu hiện qua hai hệ số biến thiên (variability coefficient)
gồm biến thiên liên phản ứng và biến thiên nội phản ứng. Hệ số biến thiên càng
thấp thì tính lặp lại càng cao. Biến thiên liên phản ứng là độ biến thiên giữa các
lần lặp lại phản ứng vào các thời điểm khác nhau. Biến thiên nội phản ứng là độ
biến thiên giữa các phản ứng được thiết lập vào cùng một thời điểm. Chu kỳ
ngưỡng là yếu tố dùng để đánh giá các độ biến thiên này.

1.4.2.1. Hệ số biến thiên nội phản ứng (intra-assay variability coefficicent)
Chúng tôi khảo sát hệ số biến thiên nội phản ứng bằng cách tiến hành
phản ứng trên đường chuẩn với 5 nồng độ từ 10
3

đến 10
7
; phản ứng trên mỗi
nồng độ được lặp lại 5 lần. Kết quả minh họa được trình bày trong hình 6.

PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490












Standard Curve Graph for FAM-490


Hình 6 : Hệ số biến thiên nội phản ứng.
1, 2, 3, 4, 5 : Amplicon HBV với các nồng độ 10
3
, 10
4
, 10
5
,10
6

, 10
7
bản sao/phản ứng

Kết quả (hình 6) được thể hiện dưới dạng giá trò Ct trong bảng 15 sau đây.

1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
2
345

24
Bảng 15 : Giá trò Ct của các nồng độ của đường chuẩn
Nồng độ
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5
10
3
31,88 31,88 31,88 31,88 31,87
10
4
27,65 27,65 27,65 27,65 27,63

10
5
25,03 25,02 25,03 25,02 25,02
10
6
21,80 21,80 21,80 21,70 21,6
10
7
17,91 17,90 17,90 17,91 17,9

Dựa vào kết quả của bảng 15, chúng tôi tính toán ra hệ số biến thiên nội
phản ứng đối với từng nồng độ của đường chuẩn như sau (bảng 16):

Bảng 16 : Hệ số biến thiên nội phản ứng của các nồng độ đường chuẩn.
Nồng độ Trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến
thiên
10
3
31,878 0.007071 0,02
10
4
27,646 0.014142 0,05
10
5
25,024 0.007071 0,02
10
6
21,74 0.141421 0,05
10
7

17,904 0.007071 0,02

Theo bảng 16, hệ số biến thiên thấp nhất là 0.02 (ứng với các nồng độ 10
3
,
10
5
, 10
7
) và hệ số biến thiên cao nhất là 0.05 (ứng với các nồng độ 10
4
, 10
6
). So
sánh với các công trình đã công bố thì hệ số biến thiên trong đề tài là tương
đương (Sum & cs, 2004 ; Garson & cs, 2005 ; Zhao & cs, 2005).

1.4.2.2. Hệ số biến thiên liên phản ứng (inter-assay variability coefficicent)
Chúng tôi xác đònh hệ số biến thiên liên phản ứng trên đường chuẩn gồm
5 nồng độ từ 10
3
đến 10
7
. Các phản ứng này được lặp lại 5 lần vào 5 thời điểm
khác nhau.

Ngày 1

1
0
1
0
1
0
1
0
1
0

25
Ngày 2


Ngày 3


Ngày 4


Ngày 5


Hình 7 : Hệ số biến thiên liên phản ứng.


1

0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0

1
0
1
0
1
0
1
0
1
0

10 10 10 10 10