ứng dụng hệ nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan hồ điệp lai ( phalaenopsis hybrid)

Sở Khoa học & Công nghệ Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
TP. Hồ Chí Minh Trung tâm Công nghệ Sinh học








BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI


ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI
TRONG NHÂN GIỐNG CÂY LAN HỒ ĐIỆP LAI
(Phalaenopsis hybrid)




Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Cung Hoàng Phi Phượng





TT Công nghệ sinh học TP HCM
GIÁM ĐỐC
Sở Khoa học &Công nghệ TP HCM
GIÁM ĐỐC

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 11/2007


Sở Khoa học & Công nghệ Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
TP. Hồ Chí Minh Trung tâm Công nghệ Sinh học






BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI


ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI
TRONG NHÂN GIỐNG CÂY LAN HỒ ĐIỆP LAI
(Phalaenopsis hybrid)

Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Cung Hoàng Phi Phượng



Danh sách cán bộ tham gia thực hiện :

1. PGS.TS Bùi Văn Lệ ĐH Khoa học tự nhiênTP HCM
2. TS. Nguyễn Quốc Bình Trung tâm Công nghệ Sinh học
3. ThS. Hà thị Loan Trung tâm Công nghệ Sinh học
4. CN. Nguyễn Quốc Thiện Trung tâm Công nghệ Sinh học
5. CN. Nguyễn Văn Hiếu Trung tâm Công nghệ Sinh học
6. CN. Lê Thành Tâm ĐH Khoa học tự nhiên TP HCM
7. SV Lê Thùy Mỹ Tiên ĐH Mở TP HCM








TP. Hồ Chí Minh, 11/2007
i
MỤC LỤC

Mục lục i
Danh sách các bảng v
Danh sách các hình vii
Danh sách các chữ viết tắt viii
Lời mở đầu ix
Phần I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các Kỹ thuật vi nhân giống sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào, cơ quan 1
1.1.1
Kỹ thuật vi nhân giống trên môi trường bán rắn 1
1.1.2 Kỹ thuật nuôi cấy lỏng 2
1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời 4
1.1.3.1 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống
4
1.1.3.2
Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 5
1.1.3.3 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống
10
1.1.3.4 Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
(Temporary Immersion system) 16
1.2 Giới thiệu về Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis)
1.2.1 Phân loại 18
1.2.2 Mô tả hình thái 19
1.2.2.1 Cơ quan sinh dưỡng 19
1.2.2.2 Cơ quan sinh sản 19
1.2.3 Điều kiện sinh trưởng 20
1.2.3.1 Nhiệt độ và ẩm độ 20
1.2.3.2 Ánh sáng 20
1.2.3.3 Tưới nước 20
1.2.3.4 Bón phân 21

1.2.3.5 Sự thông gió 21
1.2.4 Các phương pháp nhân giống Lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) từ phát hoa 21
1.2.5 Thị trường tiêu thụ 24
PHẦN II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1 NỘI DUNG
1:Thu thập mẫu thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi
nhân giống 27
2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường tạo chồi in vitro từ các mắt ngủ của phát
hoa. 27
2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và
nhân PLB 28
2.1.3 Thí nghiệm 1.3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs. 30
ii
2.1.4 Thí nghiệm 1.4: Tìm môi trường thích hợp cho sự ra rễ 30
2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc hay
không lắc (lỏng tĩnh) 31
2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong
hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc 31
2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong
hệ thống nuôi cấy lỏng không có lắc 31
2.3 Nội dung 3: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài
Loan 31
2.4 Nội dung 4 : Nghiên cứu sự nhân nhanh PLBs trong hệ thống Plantima của
Đài Loan 32
2.4.1 Thí nghiệm 4.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự nhân
nhanh PLBs trong hệ thống Plantima 32
2.4.2 Thí nghiệm 4.2: Khảo sát tần suất ngập chìm của mẫu cấy cấy lên sự nhân
nhanh PLBs trong hệ thống Plantima 32
2.5 Nội dung 5: Nghiên cứu tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima của Đài
Loan 33

2.5.1 Thí nghiệm 5.1: Khảo sát mật độ PLB, thể tích môi trường nuôi cấy lên tái
sinh chồi từ PLBs trong hệ thống Plantima 33
2.5.2 Thí nghiệm 5.2: Khảo sát thời gian ngập và tần suất ngập của mẫu cấy lên tái
sinh chồi từ PLBs trong hệ thống Plantima 33
2.6 Nội dung 6: Nghiên cứu sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima
của Đài Loan 34
2.6.1 Thí nghiệm 6.1: Khảo sát ảnh hưởng thể tích môi trường, IBA, mật độ nuôi
cấy lên sự ra phát triển của cây con trong hệ thống Plantima. 34
2.6.2 Thí nghiệm 6.2: Khảo sát thời gian ngập và tần suất ngập của mẫu cấy lên sự
phát triển của cây con trong hệ thống Plantima 34
2.7 Chuyển cây con ra vườn ươm:
34
2.8 Điều kiện thí nghiệm 34
2.9 Xử lý số liệu: 35


iii
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 NỘI DUNG 1: Thu thập mẫu thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để
vi nhân giống 36

3.1.1 Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường tạo chồi in vitro từ các mắt ngủ của phát
hoa. 36

* Xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp cho việc tạo nguồn mẫu in vitro.
36
* Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự hình thành chồi ở phát hoa 38
3.1.2 Thí nghiệm 1.2: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và
nhân PLB.
* Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hóa PLBs từ mẫu lá của các chồi

thu được trong thí nghiệm 1 41
* Xác định nồng độ hormon tối ưu để nhân nhanh PLBs. 44
* Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLBs 47
3.1.3
Thí nghiệm 1.3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB 51
3.1.4 Thí nghiệm 1.4: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ NAA khác nhau lên sự
hình thành rễ của chồi tái sinh từ PLBs 53
3.2 NỘI DUNG 2:
Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng
có lắc hay không lắc 56
3.2.1 Thí nghiệm 2.1
: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ
thống nuôi cấy lỏng có lắc 56
* Với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang hoặc PLB để nguyên 56
* Với mẫu cấy là PLB dạng cụm 57
3.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong
hệ thống nuôi cấy lỏng tĩnh 59
* Với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang hoặc PLB để nguyên 59
* V
ới mẫu cấy là PLB dạng cụm 60
3.3 Nội dung 3: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài
Loan 63
iv
3.4 Nội dung 4 : Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của
Đài Loan 67
3.4.1 Thí nghiệm 4.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự
nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima 67
3.4.2 Thí nghiệm 4.2 : Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập lên sự nhân
PLBs trong hệ thống Plantima 73
3.5 Nội dung 5: Nghiên cứu tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima của Đài

Loan
77
3.5.1 Thí nghiệm 5.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên tái
sinh chồi từ PLBs. 77
3.5.2 Thí nghiệm 5.2: Khảo sát tần suất ngập chìm lên tái sinh chồi từ PLB
trong hệ thống Plantima
mật độ 50 PLBs và thể tích 200ml 82
3.6
Nội dung 6 : Nghiên cứu sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima
của Đài Loan 83
3.6.1 Thí nghiệm 6.1: Khảo sát ảnh hưởng thể tích môi trường, IBA, mật độ
nuôi cấy lên sự phát triển của chồi Hồ điệp trong hệ thống Plantima
83
3.6.2 Thí nghiệm 6.2: Khảo sát tần suất ngập chìm lên sự phát triển của cây
con trong hệ thống Plantima 91

3.7 Sự sinh trưởng và phát triển của cây Hồ Điệp ngoài vườn ươm. 94
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận 99
4.2 Đề nghị 100
PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 101
PHỤ LỤC
v
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1
Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự
hình thành PLBs từ lá 28
Bảng 2.2 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự nhân

PLBs 29
Bảng 2.3 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường sử
dụng lên sự nhân PLBs.
29
Bảng 3.1
Trung bình số mẫu sạch 36
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi dinh dưỡng 38
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLBs từ lá .41
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh PLBs từ
một PLB ban đầu
44
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLBs 47
Bảng 3.6a
Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLBs của giống số 1(Dtps. Taida
Salu) 51

Bảng 3.6 b Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLBs của giống số 2 (Dtps. Taida
FireBird)
51
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của hai giống lan Hồ Điệp 54
Bảng 3.8
Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng lắc của giống số 1với mẫu
cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang và PLB để nguyên
56
Bảng 3.9 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng lắc của giống số 1với mẫu
cấy là PLBs dạng cụm
58
Bảng 3.10 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh của giống số 1 với
mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang và PLB để nguyên
59

Bảng 3.11 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh của giống số 1 với
mẫu cấy là PLB dạng cụm
60
Bảng 3.12 Tóm tắt các kết quả nuôi cấy tối ưu của các dạng PLBs trên môi trường
lỏng 61
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự nhân PLBs trong hệ thống Plantima
Bảng 3.14 Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên việc nhân PLBs 70
Bảng 3.15 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLBs 73
vi
Bảng 3.16 So sánh hệ số nhân PLBs của các hệ thống nuôi cấy khác nhau 74
Bảng 3.17
Ảnh hưởng mật độ nuôi cấy lên sự tái sinh chồi từ PLBs 77
Bảng 3.18 Ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tái sinh chồi từ PLB 80
Bảng 3.19
Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên quá trình tái sinh chồi từ PLBs 82
Bảng 3.20 Ảnh hưởng mật độ chồi lên sự phát triển của cây con trong bình Plantima 84
Bảng 3.21
Ảnh hưởng IBA lên sự phát triển của chồi Hồ điệp 87
Bảng 3.22 Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên sự phát triển cây con Hồ Điệp 89
Bảng 3.23
Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự phát triển cây con Hồ Điệp 91

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1 : Hệ thống APCS của Tisserat và Vandercook, 1985 5
Hình 2 :- A : Hệ thống của Aitken – Christie và Davies (1988),- B: Hệ thống của Simonton
và cộng sự (1991) 6
Hình 3:
Hệ thống RITA® 8
Hình 4: Hệ thống BIT
®
9
Hình 5A: Các thành phần của Bình Plantima, Đài Loan 9
Hình 5B: Hệ thống Plantima a. Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập; b. Cây
sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima 10
Hình 6: Các giống lan Hồ Điệp sử dụng trong thí nghiệm 37
Hình 7: Chồi hình thành từ mắt ngủ của phát hoa Hồ Điệp 40

Hình 8: PLBs hình thành từ mẫu lá nuôi cấy trên các môi trường khác nhau 43
Hình 9: PLBs và chồi của giống số 1 (Dtps. Taida Salu) trên các môi trường MS có nồng
độ
chất điều hòa sinh trưởng khác nhau 45
Hình 10: PLBs và chồi của giống số 2 (Dtps. Taida Firebird) trên các môi trường MS có nồng
độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau. 46
Hình 11: Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự nhân PLBs của giống số 1 và
số 2 50
Hình 12: Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB 53
Hình 13: Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ 55
Hình 14:Ảnh hưởng của nuôi c
ấy lỏng lên sự nhân PLBs của 3 loại mẫu cấy 62
Hình 15
: Sơ đồ lắp ráp hệ thống ngập chìm tạm thời của Đài Loan 63
Hình 16: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp trong bình Plantima 66
Hình 17:Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự nhân PLBs 69
Hình 18:Ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự nhân PLBs 72
Hình 19:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLBs 76
Hình 20:Ảnh hưởng của mật độ m
ẫu cấy lên sự tái sinh chồi từ PLBs 79
Hình 21:Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự tái sinh chồi và nhân chồi từ
PLBs 81
Hình 22:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự tái sinh chồi từ PLBs 83
Hình 23:Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự phát triển của cây con 86
Hình 24: Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo chồi nách của ở Lan Hồ Điệ
p lai 88
Hình 25:Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của cây con Hồ Điệp
trong bình Plantima 90
Hình 26:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự phát triển của cây con Hồ Điệp 93
Hình 27: Cây con Hồ Điệp giai đoạn vườn ươm 95

Hình 28: Tóm tắt quy trình nhân giống Hồ Điệp có sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời .98
viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MS: Murashige & Skoog
MS1/2: Murashige & Skoog giảm một nửa khoáng đa lượng
BA: 6-benzyladenin
NAA: -naphthalene acetic acid
IBA : Indole-3 –butyric acid
PLBs: Protocorm-like bodies
CW: nước dừa
CA: activated charcoal (than hoạt tính)
B1: Thiamine
B6: Pyridoxine
PVP: Polyvinylpyrrolidone
TIS: Temporary Immersion system (hệ thống ngập chìm tạm thời)
chất ĐHSTTV: chất điều hòa sinh trưởng thực vật
SPSS: Statistical Program Scientific System

ix
Lời mở đầu
Trong những năm gần đây, các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được
nhiều nước trên thế giới triển khai và ứng dụng trong nhân giống nhiều loại cây trồng.
Ảnh hưởng tích cực của hệ thống này đã được thể hiện trong việc tăng sinh chồi, nuôi
cấy đốt thân, nuôi cấy củ bi và tạo phôi vô tính. Hệ thống này có tác dụng làm tăng
chất lượng cây trồng thể
hiện ở việc làm tăng cường sức sống của chồi và khả năng tạo
phôi soma không bị biến dị ở tần số cao. Hiện tượng thủy tinh thể, thường gây ảnh
hưởng rất nghiêm trọng đến chất lượng mẫu cấy khi nuôi cấy lỏng, có thể được loại bỏ
khi sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời hoặc có thể được kiể
m soát bằng cách điều
khiển thời gian ngập chìm. Thực vật được nhân giống trong hệ thống ngập chìm có
khả năng thích nghi tốt hơn trong giai đoạn thuần hóa ngoài vườn ươm so với các thực
vật được nuôi cấy trong hệ thống bán rắn hay lỏng. Với những ưu điểm trên hệ thống
ngập chìm tạm thời đang được mở rộng ở quy mô lớn phục v
ụ trong sản xuất thương
mại.
Việc ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống hoa kiểng đặc
biệt là phong lan ở Việt Nam hầu như còn bỏ ngỏ. Xuất phát từ nhu cầu Lan Hồ Điệp
là một loại cây trồng không những có giá trị về mặt thẩm mỹ mà còn có giá trị thương
mại cao nhưng khó nhân giống, chúng tôi đã sử dụng lan Hồ Đi
ệp như một đối tượng
thực vật trong nghiên cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời để nhân
giống loại lan này. Mục đích là khảo sát khả năng ứng dụng hệ thống này trong nâng
cao số lượng cũng như chất lượng của cây giống Hồ Điệp khi so sánh với các hệ thống
nuôi cấy thông thường để góp phần mở ra khả nă
ng sản xuất với số lượng lớn cây

giống có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường tại Việt Nam.
Tác giả và nhóm thực hiện đề tài xin cảm ơn Sở KHCN TP. HCM đã tạo điều
kiện trong suốt 2 năm qua để có thể bước đầu hoàn thành đề tài này. Chúng tôi hy
vọng đề tài này sẽ là tài liệu tham khảo tốt cho những ai quan tâm đến kỹ thuật nuôi
cấy ngậ
p chìm tạm thời.








PHAÀN 1



TOÅNG
QUAN
TAØI
LIEÄU
Toång quan tài liệu

1
1.1 Các kỹ thuật vi nhân giống sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào, cơ quan
1.1.1 Kỹ thuật vi nhân giống trên môi trường bán rắn
Vi nhân giống đã trở nên là một phần quan trọng trong ngành nhân giống thực vật
(George và Sherrington, 1984). Kỹ thuật phổ biến nhất của vi nhân giống thực vật là
nghiên cứu các mô thực vật trên môi trường bán rắn và hiện đang được sử dụng trong hầu

hết các quay trình nhân giống mà đặc biệt là sự tái sinh cây từ các tế bào nuôi cấy trong
điều kiện nhân tạo. Nhờ những
ưu điểm so với các phương pháp nhân giống khác
(Debergh, 1987; Litz, 1987; Kyte, 1987; Macdonald, 1986) vi nhân giống thường được sử
dụng trong các mục đích sau: nhân giống số lượng lớn những cây giống đồng dạng về
kiểu gen, sản xuất giống cây sạch bệnh, sản xuất cây giống đầu dòng sử dụng cho mục
đích lai tạo giống mới, bảo quản nguồn gen.
a. Ưu điểm
Ưu điểm chính c
ủa vi nhân giống là từ một phần mô nhỏ của thực vật có thể sản
xuất ra hàng nghìn cây thực vật đó mà có thể thực vật đó sẽ được tiếp tục sử dụng như thế
hệ bố mẹ.
• Thu nhận được thế hệ cây con đồng nhất.
• Sản xuất cây sạch bệnh.
• Thực vật thường phát triển nhanh hơn, s
ức sống cao.
• Cây trưởng thành nhanh hơn so với cây nhân giống bằng hạt.
Các loài cây thân thảo có thể được nhân giống quanh năm bằng các phương pháp
nhân giống truyền thống tuy nhiên số lượng rất hạn chế, vi nhân giống sẽ làm tăng tỉ lệ
nhân giống loài cây này lên gấp nhiều lần đủ phục vụ cho mục đích thương mại.
Vi nhân giống được xem là công cụ tối ưu phục vụ cho công nghệ di truy
ền. Giảm
được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu trữ được lâu dài và chiếm ít không gian so với
phương pháp nhân giống vô tính truyền thống.
b. Nhược điểm
Một số giới hạn trong ứng dụng vi nhân giống đối với tất cả các loài thực vật:
Toång quan tài liệu

2
• Giới hạn về sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống, nghĩa là cây con tạo ra

thường đồng nhất về mặt kiểu hình.
• Tiến trình nhân giống phức tạp (bao gồm nhiều giai đoạn liên quan nhau và kéo dài
5 - 6 tháng trước khi có thể thích ứng và trồng ngoài vườn ươm).
• Giá thành sản phẩm nhân giống còn khá cao.
• Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điề
u hòa tăng trưởng bổ sung vào
môi trường.
• Nhân giống nhanh và nhân với số lượng lớn cho đến ngày nay vẫn chưa thực hiện
được trên tất cả các loài cây, cụ thể như đối với các loài ngũ cốc thì việc nhân
giống vẫn còn nhiều giới hạn.
• Sự tái sinh thành cây in vitro thường khó xảy ra, đặc biệt với các cây thân gỗ.
Ngoài những khó khăn trên, vấn đề hiện đang được quan tâm nhấ
t là giá thành sản
phẩm còn cao. Nguyên nhân chính là sự thất thoát do nhiễm vi khuẩn và nấm trong quá
trình nuôi cấy, tỉ lệ sống sót thấp của cây nuôi cấy trong giai đoạn vườn ươm, giá nhân
công chiếm 60 - 70 % tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu
cấy sang môi trường mới, giá thành trang thiết bị (chiếu sáng, bình nuôi cấy, ) và
nguyên liệu cơ bản (đường, agar, ) cao. Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần sẽ làm giảm
đ
áng kể hiệu quả về sức sinh trưởng và phát triển của thực vật có khi làm tăng tính bất
thường về di truyền cho tế bào, ngay cả sự hình thành của rễ chính và rễ thứ cấp có thể
không thành công. Hạn chế nghiêm trọng nhất trong vi nhân giống trên môi trường bán
rắn được xem là tỉ lệ sống sót của cây thấp sau khi được chuyển ra vườn ươm bởi vì sự
khác biệt lớn giữa điều ki
ện môi trường in vitro và ex vitro và sự cần thiết phải nuôi cấy
vô trùng bắt buộc phải sử dụng các loại trang thiết bị chuyên biệt và đắt tiền.
Tất cả những khó khăn trên được xem như trở ngại to lớn cho việc ứng dụng rộng
rãi vi nhân giống trong nhân giống các giống thực vật có chất lượng cao
1.1.2 Kỹ thuật nuôi cấy lỏng
Với phương pháp truyền thống thì s

ự tái sinh của mô thực vật thường được thực
hiện bởi việc cho mô thực vật phát triển trên môi trường thạch hay nói cách khác phần lớn
các qui trình nuôi cấy mô thường áp dụng việc điều chỉnh hợp lý tỉ lệ giữa auxin và
Toång quan tài liệu

3
cytokinin trên môi trường rắn hoặc bán rắn để kích thích sự hình thành của mô sẹo, phát
sinh phôi, chồi và rễ,… Tuy nhiên, có rất nhiều giới hạn trong việc nuôi cấy trên môi
trường thạch trong đó quan trọng nhất là sự thành lập các độc tố quanh mô nuôi cấy sau
khi cây đã sử dụng cạn kiệt chất dinh dưỡng trong môi trường này.
Do những hạn chế của nuôi cấy trên môi trường thạch, nhiều nhà khoa học đã
hướng đến việc sử
dụng kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường lỏng. Nuôi cấy trên môi trường
lỏng có nhiều khía cạnh như nuôi cấy huyền phù tế bào để nhân sinh khối và nuôi cấy để
tái sinh cơ quan. Ở đây chỉ một khía cạnh là nuôi cấy trên môi trường lỏng để tái sinh cơ
quan thực vật hoàn chỉnh là được quan tâm. Khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng
toàn bộ bề mặt mẫu cấy tiếp xúc với môi trường giúp nâng cao sự phân chia tế bào và tái
sinh cơ quan, gia tăng hệ số nhân chồi, rễ, củ, và phôi soma. Khi nuôi cấy trong môi
trường lỏng, nồng độ các chất trong môi trường đồng nhất và các hợp chất độc trong môi
trường xung quanh mô nuôi cấy bị biến đổi nhanh chóng trước khi có thể ảnh hưởng đến
mô.
Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, mẫu cấy có thể được cấy trực tiếp vào trong
môi trường lỏng hay sử dụng cầu giấy lọc, bình nuôi cấy có thể
được đặt trên máy lắc
hoặc không. Môi trường sử dụng trong nuôi cấy lỏng cũng tương tự như môi trường sử
dụng trong nuôi cấy trên thạch, chỉ có khác là không bổ sung agar vào trong môi trường
nuôi cấy, do đó các bước chuẩn bị môi trường và tiến hành cấy mẫu cũng gần như tương
tự khi nuôi cấy trên môi trường thạch.
Hiện nay, nuôi cấy trong môi trường lỏng thường sử dụng nhằm mục đích nâng
cao hệ số nhân chồi, PLBs, rễ, củ, nâng cao khả năng phát sinh phôi ở rất nhiều loài thực

vật (Nhut và cộng sự, 2004). Tuy nhiên, nếu chỉ với việc nuôi cấy đơn thuần là trong môi
trường lỏng, mô cấy sẽ bị nhận chìm xuống nước kết quả là sẽ tạo ra sự nghèo thoáng khí
có khi làm mô thực vật chết đi, có hiện tượng trương nước, thủy tinh thể. Hiện nay, có
nhiều giải pháp để kh
ắc phục tình trạng này thông qua một số hệ thống nuôi cấy dựa trên
việc sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng: như các hệ thống Bioreactor, hệ thống ngập chìm
tạm thời, …

Toång quan tài liệu

4
1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời
1.1.3.1 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống
Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều tuân theo những điều kiện
được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999:
• Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh
hình thái của mẫu cấy
• Cung cấ
p sự trao đổi oxy một cách đầy đủ
• Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ
• Hạn chế sự dịch chuyển
• Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động
• Hạn chế sự nhiễm
• Giá thành hạ
Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên
tắc là phải có khả
năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định. Các hệ
thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn
khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống
ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa

polypropylen thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên
giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường.
Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận
chủ yếu sau:
• Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa
mẫu cấy và ngược lại
• Hệ thống timer dùng để
điều khiển chu kỳ ngập
• Hệ thống ống dẫn và van điều khiển
• Các màng lọc thoáng khí
• Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh
Toång quan tài liệu

5
Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều
nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi
cấy khác nhau.
1.1.3.2 Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
¾ Hệ thống tilting và hệ thống Rocker
Hai hệ thống này được thiết kế bởi Harris
và Mason (1983). Hệ thống tilting thiết kế một số
bình tam giác đặ
t nghiêng một góc 30 độ đối diện
với nhau; công suất của máy này có đặt khoảng
400 bình tam giác 50 ml hay 320 bình tam giác
125 ml. Hệ thống Rocker có thể xoay 70 bình trụ
tròn miệng rộng có thể tích 910 ml trên các khay
của hệ thống một góc 30 – 40 độ cứ sau mỗi 30
giây. Hai hệ thống này đều không có hệ thống bổ
sung môi trường mới.

¾ Hệ thống ngập chìm hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng
Tisserat và Vandercook (1985) thiết kế một buồng nuôi cấy l
ớn có thể nâng lên hạ
xuống, môi trường được bơm vào và rút ra khỏi buồng nuôi cấy theo chu kỳ nhất định
trong điều kiện vô trùng. Hệ thống nuôi cấy thực vật tự động (APCS, Hình 1) bao gồm hệ
thống ống bằng silicone, hai bơm đẩy, hai bình thủy tinh chứa môi trường, một van inox
ba chiều bằng thép không gỉ, một buồng nuôi cây, và một bản điều khiển có gắn các rờ le
điện. Hệ
thống này có thể sử dụng để nuôi cấy thực vật trong một thời gian dài.
¾ Hệ thống ngập chìm một phần và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng
Trong hệ thống này mô thực vật luôn được đặt nằm trên phía trên giá đỡ (agar,
màn propylene, cellulose). Môi trường lỏng được bổ sung và rút khỏi bình nuôi cây.Chỉ
có phần dưới của mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường. Hệ thống này có 2 mô hình
Hình 1: Hệ thống APCS của
Tisserat và Vandercook
,
1985.
Toång quan tài liệu

6
Mô hình Aitken – Christie và Jones (1987) và Aitken – Christie và Davies (1988)
gồm một hệ thống bình chứa điều khiển bán tự động bằng polycarbonate có kích thước
250 x 390 x 120 mm. (Hình 2A). Trong hệ thống này, chồi Pinus spp. được nuôi trên môi
trường với giá thể agar với hệ thống bổ sung rút và bổ sung môi trường lỏng bằng hệ
thống bơm theo một chu kỳ nhất định. Môi trường lỏng từ nơi chứa tiếp xúc với mẫu cấy
trong khoảng thời gian 4 đến 6 gi
ờ bằng cách sử dụng máy hút chân không, sau đó môi
trường sẽ được rút cạn. Maene và Debergh (1985) đã chứng minh ảnh hưởng tích cực của
việc bổ sung môi trường lỏng hay auxin vào môi trường bán rắn ở giai đoạn cuối của nuôi

cấy invitro.
Mô hình khác do Simonton và cộng sự năm 1991 thiết kế gồm hệ thống bơm điều
khiển bằng vi tính có thể bơm môi trường lỏng vào bình nuôi cấy có thể tích 7 L theo chu
kỳ
(hình 2B). Mẫu cấy được đặt trên một tấm lưới polypropylene gắn vào thành bình nuôi
cấy. Hệ thống có bộ phận điều khiển sự bơm môi trường lỏng và điều tiết mức môi trường
trong những bình nuôi cấy, điều khiển vòng tuần hoàn môi trường theo lịch trình lập sẵn,
thay đổi chương trình theo giai đoạn nuôi cấy và có thể thay đổi được môi trường.


A
B
Hình 2:A:Hệ thống của Aitken – Christie và Davies (1988), B:Hệ thống của
Simonton và cộng sự (1991).
Toång quan tài liệu

7
¾ Hệ thống ngập hoàn toàn, trao đổi môi trường lỏng bằng áp lực không
khí và không có chức năng thay mới môi trường
Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) mô tả trong đó có cả
những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời được thiết kế gần đây nhất, tất cả đều khá
đơn giản và rất dễ sử dụng. Hệ thống này cho phép toàn bộ mẫ
u cấy được tiếp xúc với
môi trường dinh dưỡng, đồng thời bầu không khí trong bình nuôi được làm mới nhờ sử
dung bộ phận bơm khí có chức năng vừa cung cấp không khí vào môi trường, vừa đẩy
chất lỏng ra vào bình nuôi cây. Mẫu cấy được đặt trong bình nuôi thành một khối, điều
này giúp chúng ta tiết kiệm được thời gian đặt mẫu trên giá đỡ. Môi trường lỏng được đẩy
từ bình chứa môi trường sang bình nuôi cây và ngượ
c lại nhờ một áp lực khí bơm vào
bình chứa chất lỏng. Để tránh sử dụng nhiều ống nối, bình chứa thường thiết kế gồm hai

bình có cùng thể tích. Áp suất vượt mức được đưa qua những van solenoid hay một máy
nén khí nối với công tắt đã được lập trình. Điều này cho phép chúng ta xác định được thời
gian và thời điểm ngập nước vào ngăn chứa cây. Do những hệ thống này không có bình
chứa môi trường mới nên môi trường nuôi cấy phải được thay mới sau 4 – 6 tuần. Tuy
nhiên việc thay đổi này rất nhanh và không cần thiết phải di chuyển mẫu cấy. Các biến
thể khác nhau của hệ thống này đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ
thống RITA
®
(the Recipient for Automated Temporary Immersion system), hệ thống bình
đôi (BIT
®
) và hệ thống Plantima.
a. Hệ thống RITA
®

Hệ thống RITA
®
(hình 3) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa dung tích
1 lít có hai ngăn, ngăn trên chứa mẫu cấy và ngăn dưới chứa môi trường. Một áp suất
vượt mức tác động vào môi trường lỏng ở ngăn dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa
mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian
áp suất vượt mức được duy trì. Trong thời gian mẫu ngập trong môi trường lỏng, không
khí được sục vào trong môi trường lỏng dướ
i dạng những bọt khí góp phần làm xoay trở
nhẹ mẫu cấy và làm mới không gian bên trong bình nuôi cây, áp suất vượt mức sẽ đẩy
không khí trong bình ra ngoài qua một màng lọc khí trên nắp bình.
Toång quan tài liệu

8

Hình 3: Hệ thống RITA
®
, Pha
1: mô không ngập trong môi
trường, Pha 2: hiện tượng ngập
được hoạt hóa, các van mở ra
cho khí đi qua các màng lọc đẩy
môi trường lỏng lên ngập mô
cấy, Pha 3: sự trao đổi khí trong
hệ thống RITA
®
, Pha 4: chu kỳ
kết thúc, các van đóng lại và
môi trường lỏng rút xuống ngăn
bên dưới.





b. Hệ thống bình đôi BIT
®

Hệ thống bình đôi BIT
®
do Escalona và cộng sự (1998) thiết kế chủ yếu phục vụ
cho việc nhân sinh khối cơ quan do có thể tích bình chứa lớn hơn và có giá thành thấp
hơn. Cách dễ dàng nhất để vận hành hệ thống nuôi cấy ngập chìm sử dụng áp lực khí là
nối hai bình thủy tinh có dung tích từ 250 ml - 10 L bằng một hệ thống ống dẫn, và điều
khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa m

ẫu và ngược lại. Akita
và Takayama (1994) đã đưa ra một hệ thống tương tự gọi là hệ thống nuôi cấy điều khiển
mực chất lỏng bán liên tục để nuôi cấy tạo củ Khoai Tây bi. Hệ thống này có sự thoáng
khí bắt buộc bên trong ngăn chứa mẫu cấy, chi tiết này không tìm thấy được trên hệ thống
BIT
®
.





Toång quan tài liệu

9
Hình 5A: Các thành
p
hần của bình Plantima
,
Đài Loan.


Hình 4: Hệ thống BIT
®

c. Hệ thống Plantima
®

Hệ thống này
được thiết kế tổng thể
tương tự như hệ thống
RITA
®
tuy nhiên có thay
đổi và cải tiến một số chi
tiết như hệ thống bơm và
vị trí các filter. Hệ thống
này được sản xuất và
cung cấp bởi công ty
Atech, Đài Loan.





Toång quan tài liệu

10

1.1.3.3 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống
Khi dự định sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong thương mại, điều quan
trọng là phải hiểu rõ các đặc điểm về sinh trưởng, quá trình nuôi cấy và chất lượng của
mẫu cấy và so sánh giữa chúng với những mẫu được nuôi cấy trong hệ thống thông
thường.
+ Trong sự nhân nhanh chồi và các đ
oạn microcutting
Sự ngập chìm tạm thời kích thích sự sinh chồi. Aitken – Christie và Jones (1987)
chứng minh rằng khi nuôi cấy trong điều kiện có sự ngập đầy môi trường lỏng chồi cây
Pinus radiata sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với trên môi trường bán rắn. Hệ thống
này cho phép sự sinh trưởng liên tục của chồi mà không cần phải cấy chuyền mẫu cấy.
Chồi thu được khi nuôi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao h
ơn và có chất lượng tốt
hơn so với những chồi thu được trên môi trường bán rắn. Một chứng minh đầy đủ và
thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia
tăng số lượng chồi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chuối (Musa, phụ nhóm AAH). Alvard
và cộng sự (1993) chứng minh rằng sử dụng môi trường lỏng tác động mạnh mẽ
vào sự
phát triển và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân giống Chuối. Sự sinh trưởng của mẫu
cấy theo 4 phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng khác nhau được so sánh với cách
vi nhân giống thông thường trên môi trường thạch, sau 20 ngày nuôi cấy có kết quả như
sau:
Hình 5B: Hệ thống Plantima, a: Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ
ngập; b: Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima.
Toång quan tài liệu

11
• Chồi Chuối trong môi trường nuôi cấy lỏng đơn giản hay trên giá thể bằng
cellulose có sự nhân chồi bình thường hay không có gì khác biệt.
• Chồi trên môi trường bàn rắn có sự ngập một phần và trong môi trường lỏng
có sục khí có hệ số nhân chồi từ 2,2 – 3,1.
• Hệ số nhân chồi cao nhất (>5) thu được trên mẫu nuôi cấy trong điều kiện
nuôi cấy ngập chìm tạm thời.
Các tác giả này đã thu được k
ết quả trên khi sử dụng hệ thống RITA
®
với thời gian
ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ. Một nhóm nhà nghiên cứu Cuba đã thu được kết quả tương
tự trên đối tượng cây Chuối Musa acuminata khi sử dụng hệ thống bình đôi (Teisson và
cộng sự, 1999).
Chồi cây Amelanchier x grandiflora Rehd. ‘Princess Diana’ được nuôi cấy trên hệ
thống ngập chìm tạm thời được mô tả bởi Simonton và cộng sự năm 1991 và so sánh với
chồi nuôi cấy trên môi trường bán rắn hay trong môi trường lỏng c
ủa bình trụ tròn nhỏ và
trên môi trường bán rắn và môi trường nuôi cấy lỏng không tuần hoàn trong bình nuôi cấy
7 L (Krueger và cộng sự, 1991). Thí nghiệm sử dụng môi trường lỏng trong bình nuôi cấy
7 L có sự tiếp xúc với môi trường lỏng theo chu kỳ cho hệ số nhân chồi là cao nhất so với
các nghiệm thức khác. So sánh với quy trình thông thường nuôi cấy trên môi trường bán
rắn trong những bình trụ tròn nhỏ), những mẫu cấy trong môi trường có sự tiếp xúc với
môi trường lỏ
ng theo chu kỳ có hệ số nhân chồi gấp 2,6 lần, trọng lượng chồi gấp 2,1 lần,
chiều cao chồi gấp 1,2 lần.
Trên đối tượng cây mía Saccharum spp. Lorenzo và cộng sự (1998) đã chứng minh
rằng hệ thống nuôi cấy ngập chìm dạng bình đôi đã đẩy mạnh một cách rõ rệt sự hình
thành chồi và kéo dài chồi. Hệ số nhân (23,9 chồi trong 30 ngày) gấp 6 lần so với quy
trình thông thường (3,96 chồi trong 30 ngày; Jimenez và cộng sự, 1995). Kế

t quả tương tự
cũng đã thu được trên ba giống Chuối khác nhau. Tương tự như vậy Escalona và cộng sự
(1999) đã sử dụng hệ thống trên để nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus,
kết quả cũng cho thấy nuôi cấy ngập chìm tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với
Toång quan tài liệu

12
trọng lượng tươi và trọng lượng khô sau 42 ngày nuôi cấy. Hệ số nhân đã được gia tăng
khoảng 300% so với nuôi cấy lỏng và 400% so với nuôi cấy trên môi trường rắn. Có gần
5000 cây Dứa thu được từ một hệ thống như vậy
Đỉnh sinh trưởng của Potinera sp. (một loài Lan), và Mitragyna inermis (Cow tree)
được nuôi trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời APCS (Tisserat và Vandercook,
1985) phát triển nhanh hơn trên môi trường rắn. Dựa trên việc tính trọng l
ượng tươi và thể
tích, cho thấy các chỉ số này được gia tăng bốn lần sau 270 ngày nuôi cấy đối với loài Lan
trên và 1,8 lần sau 45 ngày đối với cây Mitragyna inermsi. Thí nghiệm tương tự được tiến
hành trên đối tượng Callistephus hortensis, một loài hoa Cúc, chồi của cây này không cho
thấy sự khác biệt rõ ràng nào về sự sinh trưởng và phát triển trong điều kiện in vitro,
nhưng khi ra ngoài vườn ươm, những chồi có nguồn gốc từ nuôi cấy trong h
ệ thống ngập
chìm tạm thời sinh trưởng và phát triển mạnh hơn so với những cây trong hệ thống thông
thường.
Đối với cây Cà Phê (Coffea arabica và C. canephora), nhân giống bằng các
microcutting trên môi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi. Hệ số nhân
xấp xỉ 6 – 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự, 1989). Khi sử dụng hệ thống RITA
®

hệ số nhân tương tự có thể được đạt tới chỉ trong vòng 5 – 6 tuần (Berthouly và cộng sự,
1995). Ngoài ra sự gia tăng số lượng chồi cũng ghi nhận trên nhiều đối tượng khác như
Nho Vitis vinifera L. (Harris và Stevenson, 1982; Harris và Mason, 1983), cây

Arctostaphylos uva ursi (L), Amelanchier alnifolia Nutt, cây Thuốc Lá Nicotiana
tabacum ‘Xanthi-nc’ và cây Fuchsia (Fuchsia hydrida ‘Swingtime’) (Stevenson và
Harris, 1980).
+ Trong sự tạo củ bi in vitro
Sự sinh trưởng và sự hình thành củ Khoai tây Solanum tuberosum L. được đẩy
mạnh bởi tình trạng ngập chìm tạm thời trong hệ
thống bình đôi (Akita và Takayama,
1994). Số củ bi hình thành xấp xỉ 500 – 960 củ sau 10 tuần nuôi cấy nhiều hơn những kết
quả trong các công trình trước đó (chỉ khoảng 220 củ trong một lần nuôi cấy (Akita và
Takayama, 1993). Trọng lượng tổng số và tính đồng nhất của củ cũng được gia tăng.
Toång quan tài liệu

13
Ngược lại trong điều kiện nuôi cấy ngập liên tục, không có bất cứ sự hình thành củ nào.
Teisson và Alvard (1999) đã kiểm chứng lại hiệu quả của nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên
sự tạo củ Khoai tây bằng cách tiến hành thí nghiệm trên hệ thống RITA
®
đôi dựa trên
nguyên tắc hệ thống bình đôi. Ba củ bi được hình thành trên một đốt trong 10 tuần nuôi
cấy. Năm mươi phần trăm củ có trọng lượng lớn hơn 0,5 g. Hệ thống này rất có hiệu quả
và nhanh chóng do có từ 3 đến 4 chồi nảy lên từ một củ. Một số kết quả tương tự cũng thu
được trên 3 giống Khoai tây khác (Teisson và Alvard, 1999).
+ Trong sự phát sinh phôi
- Gia tăng sự phát sinh phôi
Các hệ thố
ng nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được chứng minh thành công hơn
trong nuôi cấy phát sinh phôi khi được so sánh với các hệ thống thông thường sử dụng
môi trường rắn hay nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác. Tisserat và Vandercook
(1985) thống kê sự sinh trưởng của phôi cây Cà-rốt và cây Chà Là (Phoenix dactylifera)
trong hệ thống APCS trong đó thời gian ngập chìm là 5 – 10 phút sau mỗi 2 giờ. So sánh

với những cây nuôi cấy trên môi trường rắn, sự sinh trưởng gấp 1,9 lần trong trường hợp
cây Cà-rốt, và 4 lần đối v
ới cây Chà Là trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời.
Thêm vào đó chất lượng cũng như số lượng của phôi soma và cây con Cà-rốt được nâng
lên. Tương tự một số giống Cà Phê cũng được thử nghiệm, sự phát sinh phôi trong hệ
thống ngập chìm tạm thời hiệu quả hơn trong nuôi cấy lỏng lắc (Berthouly và cộng sự,
1995).
- Sự phát triển phôi
Quy trình nhân và chất lượng của phôi soma trên nhiều đối tượ
ng khác nhau đã
được cải tiến bằng nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Đối với cây Citrus deliciosa, Cabasson
và cộng sự (1997) so sánh hiệu quả của những hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự phát
triển của phôi soma. Phôi soma lấy từ nuôi cấy huyền phù được chuyển sang môi trường
bán rắn, sau đó cấy trở lại trong hệ thống nuôi cấy huyền phù hay nuôi cấy ngập chìm tạm
thời. Khoảng 60% phôi soma nuôi cấy trên môi trường bán rắn phát tri
ển đến giai đoạn lá