chiết tách và tinh chế ubiquinone q.10 từ vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh rhodopseudomonas spp

i

CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ UBIQUINONE Q10 TỪ VI
KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH
RHODOPSEUDOMONAS SPP

Ubiquinon Q-10 thuộc nhóm chất isoprenoid quinon hiện diện ở mọi tế bào sinh
vật. Hàm lƣợng Q-10 trong cơ thể ngƣời sẽ bị giảm dần theo độ tuổi và giảm mạnh
do một số bệnh nhƣ tim mạch, ung thƣ, thoái hoá thần kinh, tiểu đƣờng …[25]. Do
vậy, hợp chất Q-10 đang đƣợc nghiên cứu mạnh mẽ nhƣ là một nguồn nguyên liệu
mới trong lĩnh vực dƣợc phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm. Trong nghiên cứu này, tiến
hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ ánh sáng, nguồn carbon, nguồn nito,
vitamin, dịch chiết cà rốt và dịch chiết cà chua đến sự tăng trƣởng tế bào cũng nhƣ
sản xuất CoQ10 của các chủng vi khuẩn R. Palustris PN16, PN21 và PN31 đƣợc
phân lập tại Việt Nam. Đã khảo sát 4 phƣơng pháp chiết tách CoQ10, trong đó
phƣơng pháp 3 và 4 cho hàm lƣợng CoQ10 cao và tạp chất ít hơn 2 phƣơng pháp
còn lại

SUMMARY

EXTRACTING AND REFINING UBIQUINONE Q10 FROM
RHODOPSEUDOMONAS SPP IS A PRUPLE NON-SULFUR
PHOTOTROPHIC BACTERIA


Coenzym Q10 (CoQ10) funtion in the mitochondrial respiratory chain and serves as
a lipophic antioxidant. There is an increasing interest in the use of CoQ10 as a
nutritional supplement and cosmetic ingredient. It is known that CoQ10 is produced
in a wide variety of organisms, from microorganisms such as bacteria and yeast, to
higher animals and plant. In this study, bacteria strain R. Palustris PN16, PN21 and
PN31 isolated in VietNam produced CoQ10. Optimimization of cultural conditions

such as light source, carbon source, vitamins, carrot juice and tomato juice in order
to improved the production of CoQ10. Of 4 methods selected for CoQ10
extraction, the method 3 and 4 demonstrated highly effective protocol for extracting
CoQ10 from the bacteria.
ii

TÓM TẮT ĐỀ TÀI Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC HÌNH iiv
DANH MỤC BẢNG vi
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1.ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH –
HỌ RHODOSPIRILLACEAE 1
1.1.1. Phân loại vi khuẩn quang dƣỡng tía 1
1.1.2. Khái quát về vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu hùynh 1
1.1.3. Sản phâm từ vi khuẩn quang dƣỡng tía không lƣu huỳnh và ứng dụng 3
1.2.

ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH
RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS
4
1.2.1. Đặc điểm chung của chi Rhodopseudomonas 4
1.2.2. Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris 4
1.3. TỔNG QUAN VỀ UBIQUINON Q-10 12
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu 12
1.3.2. Tính chất vật lý 13
1.3.3. Tính chất hoá học 13
1.3.4. Chức năng sinh lý của Q-10 trong cơ thể sinh vật 15
1.3.5. Sinh tổng hợp ubiquinon Q-10 16
1.3.6. Những ứng dụng của Q-10 trong thực tiễn 20

1.3.7. Các phƣơng pháp sản xuất ubiquinon Q-10 23
CHƢƠNG 2.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
25
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 25
2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 25
2.2.1. Dụng cụ - thiết bị 25
2.2.2. Hoá chất – Dung môi 26
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn quang dƣỡng 26
2.3.2. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho vi khuẩn quang dƣỡng tía
không lƣu huỳnh Rhodopseudomonas palustris 27
2.3.3. Thu nhận sinh khối vi khuẩn 31
2.3.4. Chiết xuất Q-10 từ vi khuẩn 31
2.3.5. Phân tích sản phẩm thu đƣợc 35
2.3.6. Tinh chế và kết tinh Q-10 37
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40
iii

3.1. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY PHÙ HỢP CHO VI KHUẨN
QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG LƢU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS
PALUSTRIS 40
3.1.1.

Nuôi cấy vi khuẩn R. palustris trên môi trƣờng SA
40
3.1.2. Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên sự tăng trƣởng của vi khuẩn R.
palustri ………………………………………………………………………. .41
3.1.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên tăng trƣởng của các chủng R. palustris 43

3.1.4.

Ảnh hƣởng của nồng độ chất dinh dƣỡng lên sự tăng trƣởng của các chủng
vi khuẨn R. palustris
45
3.1.5. Ảnh hƣởng của một số vitamin lên sự tăng trƣởng của vi khuẩn 45
3.2.

CHIẾT XUẤT, CÔ LẬP VÀ PHÂN TÍCH HỢP CHẤT Q-10
48
3.2.1. Kết quả cô lập và định tính Q-10 bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 48
3.2.2. Kết quả định tính Q-10 bằng phƣơng pháp quang phổ 51
3.2.3. Kết quả định lƣợng Q-10 trong các chủng vi khuẩn R. palustris PN16 ,
PN21 và PN31 bằng phƣơng pháp quang phổ 53
3.3. ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC LOẠI VITAMIN LÊN SỰ TỔNG HỢP Q-10 58
3.4.

KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT Q-10
62
3.4.1. Kết quả tinh chế hợp chất Q-10 bằng phƣơng pháp sắc ký cột 64
3.4.2. Đánh giá tính chất của hợp chất Q-10 67
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71



iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris 4
Hình 1.2. Màng quang hợp của Rhodopseudomonas palustris 5

Hình 1.3. Các phƣơng thức biến dƣỡng ở loài R. palustris 6
Hình 1.4. Những con đƣờng tạo năng lƣợng và chuyển hóa carbon và nitơ ở
R. palustris ……………… 6
Hình 1.5. Vị trí các gen liên quan đến quang tự dƣỡng ở R. palustris 7
Hình 1.6. Các gen liên quan đến cố định N
2
ở R. palustris 7
Hình 1.7. Con đƣờng phân giải hợp chất vòng ở R. palustris 8
Hình 1.8. Dòng điện tử trong quang hợp ở R. palustris 10
Hình 1.9. Con đƣờng truyền điện tử trong phức hợp I 11
Hình 1.10. Con đƣờng truyền điện tử trong phức hợp II 11
Hình 1.11. Công thức phân tử coenzym Q-10 14
Hình 1.12. Quá trình sinh tổng hợp para-hydrobenzoat từ tyrosin và 16
phenylalanin 16
Hình 1.13. Con đƣờng axít mevalonic 18
Hình 1.14. Phản ứng hai bƣớc đƣợc xúc tác bởi FPP synthase 19
Hình 1.15. Con đƣờng tổng hợp Ubiquinon từ para-hydroxybenzoat 19
Hình 1.16. Q-10 đƣợc bán tổng hợp từ Solanesol 24
Hình 2.1. Phƣơng pháp chiết xuất Q-10 của Collins 32
Hình 2.2. Phƣơng pháp chiết xuất Q-10 của Paterson & Buddie 33
Hình 2.3. Phƣơng pháp chiết xuất Q-10 của Yoshida 34
Hình 2.4. Phƣơng pháp chiết xuất Q-10 của W Zhong 34
Hình 2.5. Tóm tắt quá trình tinh sạch Q-10 từ phƣơng pháp sắc ký cột 38
Hình 3.1. Hình dạng của vi khuẩn R. palustris dƣới kính hiển vi 40
Hình 3.2. Sinh khối của các loài R. palustris 40
Hình 3.3.Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (I) dƣới ánh sáng thƣờng
chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn. 48
Hình 3.4. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (I) dƣới UV 254 của
chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn. 49
Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (II) dƣới UV 254 của

chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 49
v

Hình 3.6. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (III) dƣới UV 254 của
chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 49
Hình 3.7. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phƣơng pháp (IV) dƣới UV 254 của
chủng PN16 (1); PN21 (2), PN31 (3) và dung dịch Q-10 chuẩn 50
Hình 3.8. Phổ hấp thu tử ngoại của dung dịch Q-10 chuẩn 51
Hình 3.10. Đƣờng chuẩn của nồng độ dung dịch Q-10 theo OD
275
54
Hình 3.11.Đồ thị hàm lƣợng Q-10 trong các chủng vi khuẩn R. palustris đƣợc chiết
xuất từ các phƣơng pháp khác nhau 56
Hình 3.12.Đồ thị ảnh hƣởng của các loại vitamin lên sự tăng trƣởng và tổng hợp Q-
10 ở chủng PN16 60
Hình 3.13.Đồ thị ảnh hƣởng của các loại vitamin lên sự tăng trƣởng và tổng hợp Q-
10 ở chủng PN21 60
Hình 3.14. Đồ thị ảnh hƣởng của tiền tố lên sự tổng hợp Q-10 của các chủng R.
palustris 62
Hình 3.15.Phân đoạn dịch chiết có chứa Q-10 từ sắc ký cột II (C, chuẩn; các chấm
có đánh số tƣơng ứng với các phân đoạn thu nhận trên sắc ký cột II) 65
Hình 3.16.Bột kết tinh Q-10, (a) chiết xuất theo phƣơng pháp III; (b) chiết xuất theo
phƣơng pháp IV 65
Hình 3.17. Hình dạng tinh thể Q-10 dƣới kính hiển vi 66
Hình 3.18 Phổ IR của hợp chất Q-10 chiết từ vi khuẩn R. palustris 67
Hình 3.19. Sắc ký đồ của dung dịch Q-10 tinh sạch định lƣợng (C, chuẩn; 2, Q-10
chiết xuất từ PN21 theo phƣơng pháp III; 3, Q-10 chiết xuất từ PN21 theo phƣơng
pháp IV) ……………………………………………………………………….69

vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1.Ảnh hƣởng của nguồn cung cấp carbon lên sự tăng trƣởng của các chủng
vi khuẩn PN16, PN21 và PN31 42
Bảng 3.2.Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ lên sự tăng trƣởng của các chủng PN16 ,
PN21 và PN31 44
Bảng 3.3.Ảnh hƣởng của nồng độ chất tăng trƣởng lên sự tăng trƣởng của các
chủng PN16 , PN21 và PN31 45
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của vitamin lên sự tăng trƣởng của các chủng vi khuẩn R.
palustris PN16 , PN21 và PN31 46
Bảng 3.5. Quang phổ hấp thu cực đại mẫu Q-10 chuẩn 52
Bảng 3.6. Quang phổ hấp thu cực đại của các mẫu Q-10 sau khi cô lập 52
Bảng 3.7. Nồng độ Q-10 chuẩn với giá trị OD
275
tƣơng ứng 54
Bảng 3.8.Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN16 đƣợc chiết
xuất từ các phƣơng pháp khác nhau 55
Bảng 3.9 Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN21 đƣợc chiết
xuất từ các phƣơng pháp khác nhau 55
Bảng 3.10. Hàm lƣợng Q-10 trong của chủng vi khuẩn R. palustris PN31 đƣợc
chiết xuất từ các phƣơng pháp khác nhau 59
Bảng 3.11.Ảnh hƣởng của vitamin lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi khuẩn R.
palustris PN16 , PN21 và PN31 60
Bảng 3.12.Ảnh hƣởng của nồng độ vitamin E lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi
khuẩn R. palustris PN16 , PN21 và PN31 61
Bảng 3.13.Ảnh hƣởng của tiền tố tự nhiên lên sự tổng hợp Q-10 ở các chủng vi
khuẩn R. palustris PN16 , PN21 và PN31 61
Bảng 3.14.Thông số sắc ký cột để tinh chế dịch chiết Q-10 từ phƣơng pháp (III) và
phƣơng pháp (IV) 64
Bảng 3.15.Một số biện giải về cấu trúc hóa học của Q-10 đƣợc kiểm định bằng phổ

IR …………………………………………………………………….68
Bảng 3.16. Hàm lƣợng Q-10 chiết xuất từ phƣơng pháp (III) 68
Bảng 3.17. Hàm lƣợng Q-10 chiết xuất từ phƣơng pháp (IV) 69

vii

BẢNG VIẾT TẮT
ATP: adenosine triphosphate
Bchl (bacteriochlorophull): diệp lục khuẩn
Bph: bacteriopheophytin
Cyt: cytochrome
LH (light harvesting): Phức hợp hấp thu ánh sáng
NAD: nicotinamide adenine dinucleotide
NADP: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
PHB: poly- -hydroxybutyric acid
RC (reaction center): trung tâm phản ứng
SA: môi trƣờng succinate - acetate
SK: sinh khối
TLC (thin layer chromatography): phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
UQ, Q-10: hợp chất ubiquinone Q-10
VKQD: vi khuẩn quang dƣỡng

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA
KHÔNG LƢU HUỲNH – HỌ RHODOSPIRILLACEAE
1.1.1. PHÂN LOẠI VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA
Vi khuẩn tía là một trong ba nhóm chủ yếu của nhóm vi khuẩn quang dƣỡng
(VKQD) không sinh oxy do chúng có khả năng dùng các chất có thế khử thấp hơn

nƣớc nhƣ các hợp chất khử lƣu huỳnh, hydro phân tử hoặc các hợp chất hữu cơ đơn
giản làm chất cho điện tử để tạo NADPH + H
+
. Chúng có một hệ quang với sắc tố
quang hợp là diệp lục khuẩn và rất nhiều loại carotenoid. Các carotenoid là nhóm
sắc tố quyết định màu sắc của vi khuẩn tía. Chúng thƣờng có màu nâu, màu hồng,
đỏ cam hoặc tím tía. Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các
màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm
nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thƣờng sử dụng chất hữu cơ,
đôi khi sử dụng hợp chất lƣu huỳnh dạng khử hoặc H
2
. Có khả năng di động với
tiêm mao mọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ
G+C là 61-72% [1] .
Molish (1970) là ngƣời đầu tiên đã sử dụng sắc tố để phân loại vi khuẩn tía thành bộ
Rhodobacteria với hai họ Thiorhodaceae. Pfennig và Truper (1971) thay đổi tên bộ
thành Rhodospirillales và tên họ thành Chromatiaceae và Rhodospirillaceae.
Imhoff (1984) chia nhóm VKQD tía lƣu huỳnh thành hai họ là Chromatiaceae,
Ectithiorhodospiraceae và vi khuẩn tía không lƣu hùynh thành họ
Rhodospirillaceae [1] .
1.1.2. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG
LƢU HÙYNH

2

Họ Rhodospirillaceae rất đa dạng về hình thái, cấu trúc tế bào và đặc tính sinh lý
nên chúng là nhóm vi khuẩn phân bố rộng và đa dạng nhất trong VKQD tía nói
chung. Có thể tìm thấy các loài VKQD tía không lƣu huỳnh ở nhiều thủy vực khác
nhau nhƣ môi trƣờng nƣớc ngọt, nƣớc biển, suối nƣớc nóng, khu vực gần bờ, khu
vực trầm tích, hồ ao nƣớc thải và đất ẩm có nhiều ánh sáng [1], [13] .

Hình dạng tế bào ở các loài VKQD tía không lƣu huỳnh có tính đặc trƣng loài:
Rhodobacter, Rhodopeudomonas có hình dạng thay đổi từ hình cầu, hình oval, đến
hình que ngắn; tế bào Rhodospirillum có dạng xoắn; tế bào Rhodocyclus purpureus
có hình vòng hay bán vòng đặc trƣng [1] .
VKQD tía không lƣu huỳnh có hình thức biến dƣỡng linh động. Vi khuẩn có thể
phát triển từ một trong bốn phƣơng cách biến dƣỡng nhƣ quang dị dƣỡng, quang tự
dƣỡng, hóa dị dƣỡng và hóa tự dƣỡng phụ thuộc vào điều kiện dinh dƣỡng trong
môi trƣờng, đặc biệt là nguồn carbon và điều kiện ánh sáng. Hầu hết các loài
VKQD tía không lƣu huỳnh phát triển đƣợc trong điều kiện vi yếm khi đến hiếu khí
và chịu đƣợc áp lực của oxy. Một vài chủng rất nhạy cảm với oxy [13].
VKQD tía không lƣu huỳnh sử dụng đƣợc rất nhiều loại carbon hữu cơ khác nhau
nhƣ acid hữu cơ, rƣợu, đƣờng, acid béo bão hòa mạch thẳng từ 5-8 carbon, hợp chất
hữu cơ có vòng … làm chất cho điện tử và nguồn carbon. Glucose, fructose, acetate,
pyruvate và succinate đƣợc sử dụng phổ biến ở nhiều loài và thƣờng đƣợc đồng hóa
qua chu trình acid tricarboxylic. Nguồn đạm của hầu hết các vi khuẩn tía không lƣu
huỳnh là ammonia, nitơ phân tử và nhiều hợp chất nitơ hữu cơ. Nitrat chỉ đƣợc
đồng hóa bởi vài loài và sự tăng trƣởng trên nguồn đạm này thƣờng thấp hơn các
nguồn đạm khác. Đồng hóa nitrat là một quá trình đƣợc cảm ứng bởi nitrat nhƣng bị
ức chế khi có mặt ammonia và glutamate. Hầu hết các VKQD tía đều có khả năng
cố định nitơ [12] .
Biotin, thiamin, niacin và p-aminobenzoic là nhân tố tăng trƣởng chính ở nhóm
VKQD tía không lƣu huỳnh. Hầu hết VKQD tía không lƣu huỳnh tăng trƣởng mạnh
trong môi trƣờng có bổ sung lƣợng nhỏ cao nấm men hay nguồn dinh dƣỡng phức
tạp [1], [13] .

3

1.1.3. SẢN PHẨM TỪ VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA KHÔNG
LƢU HUỲNH VÀ ỨNG DỤNG
1.1.3.1. Sinh khối

VKQD tía là nguồn protein có giá trị vì giàu vitamin, carotenoid. VKQD tía có thể
dùng làm nguồn dinh dƣỡng bổ sung cho gia súc, phiêu sinh vật, tôm cá và dùng
trong phân bón nông nghiệp [1].
1.1.3.2. Hydro phân tử
Trong điều kiện thiếu nitơ phân tử, hầu hết VKQD tía có khả năng sản xuất hydro
phân tử nhờ enzym nitrogenase. Hydro phân tử đƣợc xem là một trong những nguồn
năng lƣợng có khả năng tái sinh đầy hức hẹn trong tƣơng lai [13].
1.1.3.3. Các sản phẩm sinh hóa khác
Ubiquinon Q-10 (coenzym Q-10) là thành phần quan trọng của chuỗi truyền điện tử
trong các hệ quang ở VKQD, là tác nhân chống oxy hóa, tăng cƣờng sức khoẻ và có
thể dùng để điều trị bệnh tim mạch. Hợp chất này đã đƣợc chiết tách và thƣơng mại
hóa từ Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus và Rhodospirillum
rubrum [1].
Sản xuất carotenoid, diệp lục khuẩn và vitamin B
12
từ Rubrivivax gelatinosa hay
Rhodospirillum rubrum [1].
Polysaccharid và acid poly- -hydroxybutyric (PHB) là vật liệu dự trữ trong tế bào
của nhiều VKQD tía không lƣu huỳnh. PHB là đơn phân để sản xuất chất dẻo sinh
học có thể phân hủy đƣợc bởi vi sinh vật nên có nhiều tiềm, năng ứng dụng trong
sản xuất đồ nhựa, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, … [1], [13].

4

1.2.

ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN QUANG DƢỠNG TÍA
KHÔNG LƢU HUỲNH
RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS

1.2.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CHI RHODOPSEUDOMONAS
Rhodopseudomonas là một chi vi khuẩn thộc họ Rhodospirillaceae. Là vi khuẩn
Gram (-). Chỉ có những loài có tiêm mao mới có khả năng di động. Khuẩn lạc
thƣờng có màu đỏ, nâu vàng. Màng quang hợp nằm bên trong, có dạng túi, dạng
ống hoặc dạng phiến. Sinh sản chủ yếu bằng cách nẩy chồi. Nhiều loài có khả năng
khử sulfid tạo thành sulfat, sulfur và thiosulfat. Vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ
25-35
o
C, pH 6,5 – 7,0. Chúng là vi khuẩn quang dƣỡng kỵ khí [1], [32].
1.2.2. VI KHUẨN RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS
1.2.2.1. Đặc điểm tế bào

Hình 1.1. Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris [41]
Rhodopseudomonas palustris là trực khuẩn Gram (-), màu tía kích thƣớc 0,5 –
0,9 m x 0,6 - 5 m. Có màng quang hợp phía trong, dạng phiến xếp song song với
màng tế bào. Sắc tố quang hợp chính là diệp lục khuẩn a (chlorophyll a).
Chu trình sống của Rhodopseudomonas palustris có hai giai đoạn phát triển chính.
Giai đoạn đầu phân chia tế bào bằng cách nẩy chồi theo kiểu không đối xứng, hình
thành hai tế bào khác nhau; một tế bào di động và một tế bào khác có cuống không
di động. Tiếp đến là giai đoạn biệt hoá tế bào của một hệ thống phức tạp gồm các

5

túi trên màng tế bào chất phía bên trong để giúp vi khuẩn có khả năng quang dƣỡng
hoàn chỉnh [42].

Hình 1.2. Màng quang hợp của Rhodopseudomonas palustris [41]
1.2.2.2. Đặc điểm biến dƣỡng [4] [41]
Kiểu biến dƣỡng của R. palustris rất đa dạng, có khả năng thực hiện nhiều kiểu biến
dƣỡng trong cùng một tế bào. Chúng có thể cố định CO

2
, N
2
và chuyển hoá H
2
,
sulfur, acid nhân thơm, đƣờng, hợp chất dị vòng nhƣ benzoat… trong điều kiện kỵ
khí. Vi khuẩn có thể phát triển bằng một trong bốn phƣơng thức biến dƣỡng: quang
tự dƣỡng, quang dị dƣỡng, hoá tự dƣỡng hoặc hoá dị dƣỡng tùy theo điều kiện môi
trƣờng. Ở phƣơng thức phát triển quang tự dƣỡng, R. palustris cố định CO
2
theo
chu trình Calvin nhờ xúc tác enzym ribulose biophosphat carboxylase. R. palustris
có thể sử dụng H
2
S ở nồng độ thấp để làm chất cho điện tử cho sự khử CO
2
nhƣng
nếu ở nồng độ cao H
2
S có tác dụng gây độc với loài vi khuẩn này. Sự phát triển hoá
dƣỡng của R. palustris đƣợc tiến hành thông qua quá trình hô hấp hoặc lên men
[40],[41].

6


Hình 1.3. Các phƣơng thức biến dƣỡng ở loài R. palustris [41]

Hình 1.4. Những con đƣờng tạo năng lƣợng và chuyển hóa carbon và nitơ ở
R. palustris [44]
HÓA TỰ DƢỠNG
QUANG TỰ DƢỠNG
HÓA DỊ DƢỠNG
QUANG DỊ DƢỠNG

7

Trình tự bộ gen của loài R. palustris đã đƣợc giải mã bởi Viện JGI (Joint Genome
Institute) cho thấy sự hiện diện của các gen có vai trò trong quang hợp, hô hấp hiếu
khí, cố định N
2
và phân giải các hợp chất hữu cơ.

Hình 1.5. Vị trí các gen liên quan đến quang tự dƣỡng ở R. palustris [43]

Hình 1.6. Các gen liên quan đến cố định N
2
ở R. palustris [41]
Bộ gen
Rhodopseudomonas palustris
LH II
Oxy hoá thiosulfate
Rubisco dạng II
Gen Hydrogenase
Rubisco dạng I
Cụm gen quang hợp
2 LH
II


LH II
Cụm gen nf
(Vn nitrogenase)


Cụm gen Nif
(Mo nitrogenase)


Bộ gen
Rhodopseudomonas palustris
Cụm gen Anf
(Fe nitrogenase)




8


Hình 1.7. Con đƣờng phân giải hợp chất vòng ở R. palustris [41]
Nhiều yếu tố điều hòa đƣợc khám phá (phytochromes, nhân tố sigma ngoài
màng…). Bộ gen của R. palustris có một cơ chế chống chọi với stress nhƣ có nhiều
bơm kháng thuốc, phản ứng stress oxy hóa tốt, các gen kháng thuốc …
1.2.2.3. Chuỗi truyền điện tử
Chuỗi truyền điện tử trong quang hợp
Quang dƣỡng là phƣơng thức phát triển ƣu thế ở loài vi khuẩn R. palustris. Các vi
khuẩn quang dƣỡng chỉ có một hệ quang hợp. Hệ quang hợp ở vi khuẩn quang
dƣỡng có hai phần chủ yếu:

- Trung tâm phản ứng – RC (reaction center)
Đây là phức hợp protein – sắc tố gắn kết trong màng thực hiện chủ yếu quá trình
quang hợp. RC có ít nhất ba tiểu đơn vị protein là nhẹ (Light), trung bình (Medium)
và nặng (Heavy) cùng nhiều cofactor: 4 Bchl, 2 BPh, 2 quinon và một ion Fe phi
heme và một carotenoid đóng vai trò là nhóm ngoại. Các nhóm ngoại nằm trong
vùng xuyên màng liên kết với phức hợp L và M, hình thành hai nhánh và B. Mỗi
nhánh gồm có một phân tử Bchl của cặp Bchl dimer, một phân tử BPh và một
quinon (Q
A
hoặc Q
B
). Nhánh A chủ yếu liên kết với tiểu đơn vị L đƣợc sử dụng có
chọn lọc làm con đƣờng truyền điện tử. Một electron đƣợc tách ra từ cặp Bchl dimer
Bộ gen
Rhodopseudomonas palustris
Gen phân giải Homoprotocatechuate
Gen phân giải Phenyllacetate
Gen phân giải Protocatechuate
Gen phân giải Homogentisate

9

bị kích thích bởi ánh sáng và đƣợc chuyển qua BPh
A
và Q
A
. Q
B
là chất nhận điện tử
cuối cùng của giai đoạn này [7], [10], [37].

- Phức hợp hấp thu ánh sáng LH
1
và LH
2

Hệ thống LH
1
và LH
2
có chức năng thu gom năng lƣợng bức xạ từ ánh sáng và
chuyển năng lƣợng bức xạ này đến RC. LH
1
hình thành một phức hợp không đối
xứng với RC, gọi là phức hợp lõi RC-LH
1
. Cả hai phức hợp đều có chung một
nguyên lý cấu tạo: Bchl và các carotenoid liên kết không đồng hóa trị với hai chuỗi
polypeptid là và [10], [18].
- Quá trình truyền điện tử trong màng quang hợp
Đầu tiên, sắc tố trong RC thu nhận năng lƣợng ánh sáng từ các phức hợp LH và cho
điện tử. Điện tử đƣợc truyền đến quinon để khử phân tử này thành quinol. Phân tử
quinol sau đó rời khỏi RC, đi qua bể quinon trong màng và di chuyển đến phức hợp
Cyt bc
1
. Phức hợp này oxy hoá quinol thành quinon, các điện tử giải phóng đƣợc
mang bởi các chất vận chuyển điện tử ở dạng hoà tan đến RC và RC trở về trạng
thái ban đầu.
Trong quá trình khử và oxy hóa quinon, một gradient proton xuyên màng đƣợc hình
thành và đƣợc sử dụng vào quá trình tổng hợp ATP bởi ATP-synthase [12], [13],
[32].

10


Hình 1.8. Dòng điện tử trong quang hợp ở R. palustris [10]
Chuỗi vận chuyển điện trong hô hấp
Chuỗi truyền điện tử trong hô hấp gồm có 4 phức hợp protein gắn vào màng.
Phức hợp I : NADH dehydrogenase
Phức hợp enzym này xúc tác phản ứng:
NADH + H
+
+ Q NAD
+
+ QH
2

Enzym này thực hiện đồng thời sự truyền điện tử và bơm proton qua màng. Hai
proton xuất phát từ NADH đƣợc giải phóng vào khoảng gian bào. Phức hợp này sử
dụng một chuỗi các cofactor nội tại để truyền điện tử từ NADH tới Q đồng thời
bơm, proton qua màng.

11


Hình 1.9. Con đƣờng truyền điện tử trong phức hợp I [43]
Phức hợp II : Succinate dehydrogenase
Phức hợp enzym này xúc tác phản ứng
Succinat + Q Fumarat + QH
2

Enzym này không bơm proton. Nó chỉ sử dụng một chuỗi các cofactor nội tại để
truyền điện tử từ succinat tới Q.

Hình 1.10. Con đƣờng truyền điện tử trong phức hợp II [43]
Phức hợp III : Cytochrom bc
1

Phức hợp này xúc tác phản ứng:

12

QH
2
+ 2 cyt c (Fe
3+
) Q + 2 H
+
+ 2 cyt c (Fe
2+
)
Các proton cũng đƣợc bơm qua màng nhờ phức hợp cyt bc
1
. Hai proton tách ra từ
QH
2
đƣợc giải phóng vào khoảng gian bào. Vì Q thu nhận các proton này ở tế bào
chất nên sự hoạt động liên kết của phức hợp III với phức hợp I hoặc với phức hợp II
đều dẫn đến sự bơm proton. Mô hình hoạt động phổ biến của quá trình bơm proton
này đƣợc gọi là chu trình Q (với Q là quinin).
Phức hợp IV : Cytochrome oxydase

Phức hợp này xúc tác phản ứng:
4 cyt c (Fe
2+
) + 4 H
+
+ O
2
4 cyt c (Fe
3+
) + 2 H
2
O
Và thực hiện đồng thời sự chuyển điện tử và bơm proton.
1.3. TỔNG QUAN VỀ UBIQUINON Q-10
1.3.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU
Năm 1957, Frederick Crane cô lập ubiquinon từ tim bò. Cũng trong năm đó, Morton
xác định đƣợc cấu trúc Q-10 từ gan chuột bị bệnh thiếu vitamin A và đặt tên là
ubiquinon [27].
Năm 1958, Karl Folkers cùng cộng sự đã xác định chính xác cấu trúc hóa học của
Q-10 là 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl benzoquinon và lần đầu tiên sản xuất
Q-10 bằng quá trình lên men.
Năm 1961, Q-10 đƣợc quan tâm đến nhƣ là một chất chống ung thƣ đầy tiềm năng.
Yamamura (1964) là ngƣời đầu tiên trên thế giới sử dụng Q-7 (một hợp chất thuốc
nhóm ubiquinon) điều trị chứng tim bị xung huyết ở ngƣời. Mellors và Tappel
(1966) chứng minh hợp chất Q-6 ở dạng khử là một chất chống oxy hóa vô cùng
hiệu quả [22].
Năm 1972, Littarru và Karl Folkers chứng minh những ngƣời mắc bệnh tim thƣờng
bị thiếu hụt Q-10. Giữa thập niên 1970, ngƣời Nhật hoàn thiện công nghệ sản xuất
Q-10 với lƣợng lớn đủ cung cấp cho các thử nghiệm lâm sàng. Năm 1978, Peter
Mitchell đã nhận đƣợc giải Nobel nhờ thuyết hoá thẩm thấu với vai trò vận chuyển

13

proton của Q-10. Lars Ernster (1977) mô tả đầy đủ, chi tiết về tầm quan trọng của
Q-10 nhƣ là chất chống oxy hoá và là nhân tố tiêu huỷ các gốc tự do [15].
Vào đầu những năm 1980, các nghiên cứu lâm sàng trên Q-10 gia tăng đáng kể về
số lƣợng cũng nhƣ về quy mô sản xuất Q-10 tinh sạch. Hiện nay, Nhật Bản đứng
đầu trong việc sản xuất Q-10 phục vụ cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cũng nhƣ
dƣợc phẩm.
1.3.2. TÍNH CHẤT VẬT LÝ
Q-10 là chất bột tinh thể màu vàng đến màu cam, không mùi, không vị, dễ tan trong
cloroform và carbontetrachloride, tan tự do trong dioxane, ether và hexane, tan một
phần trong acetone. Hầu nhƣ không tan trong nƣớc, methanol và ethanol. Hợp chất
này bền vững ở nhiệt độ thƣờng khi đƣợc bảo quản trong vật chứa đậy kín và chắn
sáng nhƣng bị phân huỷ từ từ và trở nên sẫm màu khi tiếp xúc với ánh sáng, đặc biệt
khi ở dạng dung dịch. Nhiệt độ nóng chảy của Q-10 là 48
0
C – 52
0
C, bị nhiệt phân
(pyrolysis) từ từ khi bị đun lên ở nhiệt độ 120
0
C hoặc cao hơn [17].
1.3.3. TÍNH CHẤT HOÁ HỌC
Theo IUPAC (The International Union of Pure and Applied Chemistry), ubiquinon
là tên của nhóm hợp chất thuốc họ quinon có đặc điểm cấu tạo chung gồm vòng
nhân 2,3-dimethoxy-5-methyl benzoquinon và chuỗi bên multiprenyl. Ký hiệu viết
tắt của nhóm hợp chất này là Q-n với n là số lƣợng đơn vị isoprene [22]. Q-10 còn
có tên gọi là ubiquinon-50, coenzym Q 10 (Q-10), ubidecarenone, coenzym Q 50,
mitoquinon, vitamin Q 10 hoặc Q-10. Tên gọi hoá học là 2,3-dimethoxy-5-methyl-

6-decaprenyl-1,4-benzoquinon. Công thức hoá học của Q-10 là C
59
H
90
O
4
với phân
tử lƣợng là 863,36 g/mol. Công thức cấu tạo của Q-10 đƣợc biểu diễn nhƣ sau:

14


Hình 1.11. Công thức phân tử coenzym Q-10
Về cấu trúc, phân tử Q-10 có một vòng benzoquinon với một chuỗi isoprenoid gồm
10 đơn vị prenyl. Hai nhóm quinon trong vòng benzoquinon quyết định khả năng
khử và oxy hoá thuận nghịch của phân tử này giữa dạng quinon (dạng khử) và dạng
quinol (dạng oxy hóa). Khả năng oxy hóa khử thuận nghịch này giúp Q-10 tham gia
vào các quá trình vận chuyển điện tử và H
+
trong tế bào sinh vật. Đuôi isoprenoid
làm cho Q-10 không phân cực mạnh, có khả năng hoà tan nhanh chóng trong các
pha không phân cực. Phần kỵ nƣớc có nhiệm vụ neo giữ, định vị Q-10 ở màng tế
bào và định hƣớng Q-10 từ chất cho điện tử đến chất nhận điện tử.
Q-10 là một hợp chất khử mạnh nên phản ứng mạnh với các tác nhân oxy hoá. Khi
tiếp xúc với các hợp chất có tính kiềm, Q-10 chuyển thành dạng ubichromenol, một
dạng sản phẩm phân hủy. Chính vì thế trong quá trình chiết xuất Q-10 từ tế bào sinh
vật không thể sử dụng tác nhân kiềm mạnh để phá vỡ màng tế bào.
Coenzyme Q-10
Ubiquinol (CoQH
2

)
Semiquinone radical (CoQH )
Ubiquinone (CoQ)

15

1.3.4. CHỨC NĂNG SINH LÝ CỦA Q-10 TRONG CƠ THỂ SINH VẬT
Tính tan trong lipid cùng với khả năng nhận điện tử ở đầu benzoquinon quyết định
một số chức năng sinh lý của Q-10 trong cơ thể sinh vật:
Vai trò coenzym trong chuỗi vận chuyển điện tử và proton dẫn đến quá trình sinh
năng lƣợng ATP cho tế bào
Tất cả các chuỗi truyền điện tử nằm trên màng tế bào đều chứa các quinin. Một bộ
phận nhỏ ubiquinon liên kết chặt với các protein trong chuỗi và phần còn lại ở dạng
tự do để khuyếch tán quanh màng nên đƣợc gọi là bể quinin (Q pool). Đầu
benzoquinon của coenzym Q-10 có khả năng tiếp nhận và cho điện tử từ các chất
nhận điện tử trung gian trong các quá trình hô hấp hiếu khí, trao đổi chất hiếu khí,
trao đổi chất oxy hoá, hô hấp tế bào…Thông qua các quá trình này, năng lƣợng của
tế bào là ATP đƣợc tạo ra để cung cấp cho sự xây dựng, phát triển và duy trì sự
sống tế bào [16].
Giữ hoạt lực oxy hoá khử của màng
Vòng quinin của Q-10 có thể tồn tại ở dạng oxy hóa (quinin) hoặc dạng khử
(quinol). Trong hầu hết các màng sinh học, các enzym đã xác định đều có khả năng
khử quinin và oxy hoá quinol. Tỷ lệ phần trăm của dạng quinol trong các màng
khác nhau và trong huyết tƣơng biến đổi trong khoảng 30 – 90% phụ thuộc vào
trạng thái trao đổi chất của tế bào [33]. Sự thay đổi vị trí với quá trình oxy hoá/khử
của Q-10 có thể làm thay đổi tính chất về mặt cấu trúc và hoạt tính enzym trong
màng [10].
Vai trò chất chống oxy hoá nội sinh của tế bào
Ở dạng bị khử QH
2

, Q-10 là một chất chống oxy hoá hiệu quả. QH
2
có thể ức chế sự
peroxid hoá lipid khi màng tế bào và các lipoprotein có trọng lƣợng thấp (LDL)
đƣợc đặt dƣới điều kiện có ôxy.
Tham gia duy trì trạng thái bền vững và linh động của màng
Dạng Q-10 ở dạng tự do trong màng tƣơng tác vật lý với các chuỗi acid béo của
lipid. Chuỗi polyisoprene của Q-10 có thể cuộn gấp thành một cấu trúc ngắn hơn và

16

dày hơn thông qua đó tham gia vào việc duy trì trạng thái bền vững và linh động
của màng tế bào. [13]
1.3.5. SINH TỔNG HỢP UBIQUINON Q-10
Q-10 đƣợc tổng hợp ở tế bào qua ba bƣớc quan trọng: (1) tổng hợp p-
hydroxybenzoat; (2) tổng hợp nhánh bên isopren từ acetyl Co A và (3) hình thành
Q-10. Enzym hydroxymethyiglutaryl (HMG)-CoA redutase đóng một vai trò quan
trọng trong việc điều hoà tổng hợp [11], [16], [21], [25].
1.3.5.1. Sự tổng hợp cấu trúc p-hydroxybenzoat
Hợp chất para- hydroxybenzoat đƣợc tổng hợp từ tyrosin và phenylalanin qua 3
bƣớc: hydroxyl hoá carbon, O-methyl hoá và loại nhóm carboxyl

Hình 1.12. Quá trình sinh tổng hợp para-hydrobenzoat từ tyrosin và
phenylalanin [11]
(1, Phenylalannyl; 2, Những tiền chất Tyrosin; 3, para-hydroxyphenylpyruvat; 4,
para-hydroxyphenylactat; 5, para-hydroxycinnamat; 6, para-hydroxybenzoat)

17

1.3.5.2. Sự tổng hợp nhánh bên polyprenyl

Nhánh bên polyprenyl (isoprenoid) của ubiquinon đƣợc tổng hợp từ acetyl-CoA
thông qua một trình tự phản ứng đƣợc gọi là con đƣờng acid mevalonic (Hình 1.12),
dẫn tới sự hình thành farnesyl diphosphat (EPP)
Acetyl CoA
HMG CoA
Mevalonate
HMG CoA reductase
GPP
IPP DMAPP
FPP
FPP synthase
All-trans-GGPP synthase
All-trans-GGPP
Isoprenylated
proteins
Trans-prenyltranferase
Solanesyl-PP
Nonaprenyl-4-hydroxy-
benzoate-tranferase
Nonaprenyl-4-hydroxy-
benzoate
Ubiquinone
cis-prenyltranferase
Polyprenyl-PP
Dolichol
Squalene synthase
Squalene
Cholesterol

Hình 1.13. Con đƣờng axít mevalonic [11]

18

Trong con đƣờng axit mevalonic, isopentenyl (IPP) đƣợc chuyển thành
dimethylallyl diphosphat (DMAPP) nhờ xúc tác của enzym IPP isomerase. IPP
cũng có thể đƣợc trùng hợp với DMAPP và với genaryl diphosphat (GPP) để hình
thành (E, E)-fanesyl diphosphat (FPP) nhờ sự xúc tác từ đầu đến cuối của enzym
prenyltransferase (Hình 1.13).


Hình 1.14. Phản ứng hai bƣớc đƣợc xúc tác bởi FPP synthase [11]
Nhánh bên có 6 đơn vị isopren đƣợc tổng hợp nhờ enzym hexaprenyl diphosphast
(HexPP) synthase. Enzym này xúc tác tổng hợp chuỗi HexPP bằng cách thêm 3
phân tử IPP vào FPP nhƣng không thể xúc tác bƣớc tổng hợp GPP hoặc FPP từ
DMAPP và IPP. FPP đƣợc cung cấp bởi FPP synthase [15], [16].
Nhánh bên có 7 đơn vị isoprene đƣợc tổng hợp nhờ enzym heptaprenyl diphosphat
(HepPP) synthase. Enzym này xúc tác tổng hợp chuỗi OctPP bằng cách thêm 4
phân tử IPP vào FPP giống với enzym HexPP synthase là nó không tổng hợp các
chất từ C
5
C
10
C
15
[21].
Nhánh bên có 8 đơn vị isopren đƣợc tổng hợp nhờ enzym octaprenyl diphosphat
(OctPP) synthase. Enzym này xúc tác tổng hợp chuỗi OctPP bằng cách thêm 5 phân
tử IPP vào FPP. Các enzym nonaprenul và decaprenyl diphosphat synthase xúc tác
sự kéo dài của chuỗi bên từ GPP đến C
45

-P [25].