Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định lượng human immonodeficiency virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật realtime pcr

i

Tóm tắt
Đặt vấn đề
Phát hiện và định lượng HIV1RNA là một nhu cầu rất cần thiết để có thể chẩn đoán phát hiện sớm nhiễm HIV
trong giai đoạn cửa sổ hay trẻ sơ sinh và nhũ nhi cũng như để theo dõi hiệu quả điều trị trên các bệnh nhân
HIV/AIDS đang được điều trị đặc hiệu. Nhu cầu này có thể giải quyết được bằng các bộ xét nghiệm dựa trên kỹ
thuật sinh học phân tử như PCR và bDNA đã được chấp nhận IVD và có trên thị trường. Tuy nhiên giá thành của
các bộ xét nghiệm này là khá cao, khó có thể đưa vào áp dụng tại các phòng thí nghiệm lâm sàng tại các quốc
gia thu nhập thấp như Việt Nam chúng ta.
Mục tiêu
Có 2 mục tiêu chính: (1) Xây dựng được qui trình xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA dựa trên kỹ
thuật RT real-time PCR, đặt tên là HIV1 RT-TQPCR, sử dụng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng gene gag trên
bộ gene HIV1; (2) Đánh giá qui trình xét nghiệm thông qua đánh giá giới hạn phát hiện, khoảng định lượng, độ
chính xác qua độ lặp lại, độ bền trong lưu trữ, và độ nhạy cảm cùng độ lặp lại cũng như độ tương đồng khi thử
trên mẫu thật so sánh với bộ HIV1 Amplicor làm chuẩn vàng.
Vật liệu và phương pháp
Qui trình xét nghiệm “HIV1 RT-TQPCR” được xây với mồi SK462 và SK431 đặc hiệu gene gag đã công bố và
taqman probe được thiết kế từ sự biến đổi probe SK101 cũng đã được công bố. Các chứng dương HIV1RNA và
các mẫu chuẩn định lượng là RNA phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR đích nhân bản từ
chính gene gag sử dụng mồi SK462 và SK431. Chứng nội sử dụng chung mồi là được phiên mã từ plasmid
pGEM-T Easy đã chèn sản phẩm PCR khuếch đai từ các sợi Oligo có trình tự hai đầu bắt cặp bổ sung được với
trình tự hai mồi SK462 và SK431 nhưng trình tự probe là khác biệt. Bộ tách chiết RNA sử dụng bộ
NK
RNAPREP
của Nam Khoa và bộ tổng hợp cDNA sử dụng bộ
NK
cDNA synthesis của Nam Khoa. Giới hạn phát hiện, khoảng
định lượng, độ lặp lại liên phản ứng cũng như trong phản ứng được thực hiện trên các dãy pha loãng của chứng
dương HIV1RNA. Độ đặc hiệu được đánh giá trên các mẫu huyết thanh người bị nhiễm HBV, HCV, CMV và S.
aureus xác định bằng PCR hay nuôi cấy. Khả năng chống ức chế được thử trên các chất có khả năng ức chế PCR

như hemoglobin, lamivudine, BSA, và DNA bạch cầu người. Độ bền trong lưu trữ được thử trên các mẫu nhiễm
HIV1RNA và theo dõi trong 12 tháng với thử nghiệm mỗi 4 tháng một lần. Thử nghiệm trên các mẫu thật được
thực hiện có so sánh với thử nghiệm sử dụng bộ xét nghiệm Amplicor.
Kết quả và bàn luận
Đã hoàn thiện qui trình thử nghiệm HIV1 RT-TQPCR phát hiện và định lượng HIV1RNA bằng kỹ thuật real-time
PCR sử dụng mồi và taqmanprobe đặc hiệu gene gag của HIV1 genome. Qui trình xét nghiệm này có cung cấp
cả chứng [+] và các chuẩn định lượng dưới dạng RNA do vậy mà có thể đánh giá được độ nhạy của bộ xét
nghiệm cũng như cho được đường chuẩn thật sự từ mẫu chuẩn là RNA. Qui trình xét nghiệm cũng cung cấp cả
chứng nội tại dưới dạng RNA sử dụng chung mồi với trình tự đích nhưng dùng taqman probe để phát hiện có
trình tự và màu huỳnh quang khác biệt taqman probe đích nhờ vậy mà đánh giá được nguy cơ mẫu bị ức chế khi
kết quả phát hiện đích âm tính. Các kết quả đánh giá cho thấy qui trình xét nghiệm có giới hạn định lượng thấp
nhất, còn gọi là độ nhạy, là 60 copies HIV1RNA trong 1ml huyết tương; khoảng định lượng là 10
2
-10
8
copies/ml;
độ ổn định trong phản ứng và liên phản ứng cao đối với các mẫu có giá trị định lượng từ 100copies/ml trở lên;
độ bền trong lưu trữ ít nhất là 12 tháng; không bị chéo với các tác nhân vi sinh khác; có khả năng chống ức chế;
và so sánh với bộ xét nghiệm đã được FDA công nhận IVD là HIV1 Amplicor khi thử trên các mẫu thật cho kết
quả lương tương đương và nếu lấy kết quả xét nghiệm từ bộ xét nghiệm Amplicor làm chuẩn vàng thì độ nhạy và
độ đặc hiệu của qui trình xét nghiệm đạt 100%.
Kết luận
Dựa vào kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đã xây dựng hoàn thiện qui trình phát hiện và định lượng HIV1 trong
huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR với các thành phần cần thiết cho một xét nghiệm real-time PCR
như bộ tách chiết RNA sử dụng bộ
NK
RNAPREP của Nam Khoa và bộ tổng hợp cDNA sử dụng bộ
NK
cDNA
synthesis của Nam Khoa, bộ khuếch đại và định lượng, các bộ chứng và chuẩn định lượng. Đồng thời từ việc

đánh giá qui trình xét nghiệm HIV1 RT-TQPCR phát hiện và định lượng HIV1RNA chúng tôi thu được các thông
số như sau: (1) độ nhạy là 100% (2) độ đặc hiệu: 100% (3) ngưỡng phát hiện: 60 copies/ml huyết tương (4)
khoảng định lượng là 10
2
-10
8
copies/ml (5) độ bền trong lưu trữ ít nhất là 12 tháng (6) có khả năng chống ức
chế. Tuy nhiên để có thể đăng ký được chấp nhận IVD thì cần phải có thêm kinh phí để thử trên các trung tâm
đạt chuẩn ISO 15189 làm xét nghiệm phát hiện và định lượng HIV1RNA trong chẩn đoán.

ii

Abstract
Background
Detection and quantification of HIV1RNA is the necessary requirement from the clinical to detect HIV infection
during the window phase or to confirm the HIV infection in the baby, as well as to follow up the efficacy of the
specific treatment. These requirements could be solved by the using of the IVD approved kits using PCR or bDNA
technologies. However the price of these commercialized kits are very expensive, it could not be easily applied at
the clinical laboratory in the existing conditions of the low-income countries like Vietnam.
Main aims
There are two main aims: (1) Prepare the molecular biology kit named HIV1 RT-TQPCR kit, to detect and
quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR technology using the primers and taqman probe
specific the gag gene on the HIV1 genome; (2) Evaluate the process via the limit of detection, the range of
quantification, the accuracy, the specificity, the elimination of the inhibitors, and the stability of the kits as well
as the sensitivity-specificity and the similarity when testing on the real samples using HIV1 Amplicors as gold
standards.
Materials and methods
The “HIV1 RT-TQPCR” was prepared using the published SK462 and SK431 specific to gag gene, and the
taqman probe was designed from the modification of the published probe SK102. The positive control HIV1RNA
and the standards for quantification was prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy inserted

with the PCR product amplified from the gag gene using primers SK462 and SK431. The internal control RNA
using the same primers of the target was also prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy
inserted with the PCR product amplified from the two constructed oligo with SK462 and SK431 sequence at the
5’end and the middle sequence complementary with the internal control probe. The RNA extraction kit is the
NK
RNAPREP of Nam Khoa and the cDNA synthesis kit is the
NK
cDNA synthesis kit of Nam Khoa. The limit of
detection, the range of quantification, the in testing and the trans-testing reproductibility were tested on the serial
dilution of HIV1RNA. The risk of the cross reaction were tested on the sera taken from HCV, HBV, CMV
infection patients confirmed by PCR, and the sera taken from the S. aureus septicemia patient. The elimination of
the inhibitors were tested of the hemoglobin, BSA, leukocyte DNA and the lamuvidine. The stability of the kit was
tested during 12 months with interval 4 months on the plasma samples pooled HIVRNA.The clinical trial was
done on real plasma sample collected fron HIV infected and non infected patients and the results were analyzed
versus the results get from HIV1 amplicor.
Results and discussions
The process named HIV1 RT-TQPCR to detect and quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR
technology using the primers and taqman probe specific the gag gene on the HIV1 genome was prepared. Since
the process supplied the control [+] and the standards under the RNA, the users could analyzed the real
sensitivity of the testing and the test kit as well as the real quantification graph coming from the RNA not the
cDNA. The internal control was also supplied under the RNA using the sample primers of the target but the
detection probe was difference by the sequence and the fluorophore and this design can help to user monitor the
inhibitors in the sample with HIV1RNA detection negative. The evaluation results demonstrated that the limit of
detection of the process is 60 copies/ml;, the range of the quantification was 10
2
-10
8
copies/ml; the reproductivity
was high with the quantification from 100 copies/ml; the stability of the kit was at least 12 months; no cross
reaction with HBV, HCV, CMV, and S.aureus; the inhibitors was eliminated by testing with the kit; and the

process gave the same results as the FDA approved for IVD kit, HIV1 Amplicor, when testing on the real samples
HIV [+] and HIV [-] with sensitivity and specificity 100% if the Amplicor was considered as gold standards.
Conclusion
Based on the results of the research we have complete the process with the necessary ingredients for a real-time
PCR tests as the RNA extraction kit and the cDNA synthesis kit, amplification, positive control and internal
control. At the time of the evaluation of HIV1 RT-TQPCR tests, we obtained the following parameters: (1)
sensitivity: 100% (2) specificity: 100% (3) threshold detection: 60 copies/ml plasma (4) the amount is about 10
2
-
10
8
copies/ml (5) durability in storage for at least 12 months (6) is resistant to inhibition. However, in order to be
approved as the IVD kit,the more funding will be needed to try the kit in the laboratories ISO 15189 certified for
testing of HIV1RNA detection and quantification for clinical apliucations.
iii


STT
MỤC LỤC
Trang

PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1
PHẦN 2 ĐẶT VẤN ĐỀ
2
PHẦN 3 TỔNG QUAN
3
1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giớ và tại Việt Nam 3
1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới 3
1.2 Tình hình nhiễm HIV tại Việt Nam 3

2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA HIV 4
2.1
Một số đặc điểm sinh học của HIV
4
2.2 Các type di truyền của HIV 4
2.3 Cấu trúc HIV 6
2.3.1 Hình thể và cấu tạo virus 6
2.3.2 Cấu trúc gene HIV 7
2.4 Sức đề kháng của virus HIV 7
3 TIẾN TRÌNH TỪ LÚC NHIỄM HIV TỚI AIDS 7
3.1
Nồng độ HIV-1 tự do và kháng nguyên p24 trong huyết tương
8
3.2
Sự xuất hiện của các kháng thể kháng HIV-1 trong huyết thanh của bệnh
nhân nhiễm HIV/AIDS
8
3.3
Lượng tế bào miễn dịch T CD4
8
3.4
Các xét nghiệm được sử dụng để phát hiện và theo dõi nhiễmHIV/AIDS
9
4 PHƯƠNG PHÁP REALTIME – PCR 9
4.1 Khái niệm real-time PCR 9
4.2 Real-time PCR ứng dụng định lượng tác nhân vi sinh vật trong mẫu thử 14
5
CHỨNG DƯƠNG, ÂM VÀ CHỨNG NỘI TẠI
15
5.1 Chứng dương 15

5.2 Chứng âm 16
5.3 Chứng nội tại 16
6 PHƯƠNG PHÁP TẠO DÒNG 17
6.1 Mục đích của sự tạo dòng 17
6.2 Các bước cơ bản của phương pháp tạo dòng 17
PHẦN 4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
19
1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19
2 CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ĐƯỢC SỬ DỤNG 20
2.1
Tách chiết RNA với bộ thuốc thử “
NK
RNAPREP” của Nam Khoa
20
iv

2.1.1 Nguyên tắc 20
2.1.2 Phương pháp 20
2.2
Tổng hợp cDNA từ tách chiết RNA với bộ thuốc thử “
NK
cDNA synthesis”
của Nam Khoa
20
2.2.1 Nguyên tắc 20
2.2.2 Phương pháp 21
2.3
Tinh sạch sản phẩm PCR với bộ thuốc thử “Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System” của Promega
21

2.3.1 Nguyên tắc 21
2.3.2 Phương pháp 21
2.4 Tạo vi khuẩn E. coli khả biến 22
2.4.1 Nguyên tắc 22
2.4.2 Phương pháp 22
2.5 Tạo dòng với hệ thống “pGEM®-T Easy” của Promega 23
2.5.1 Nguyên tắc 23
2.5.2 Phương pháp 23
2.6
Tách chiết plasmid với bộ thuốc thử “Wizard® Plus SV Minipreps DNA
Purification system” của Promega
25
2.6.1 Nguyên tắc 25
2.6.2 Phương pháp 25
2.7 Phiên mã DNA thành RNA 26
2.7.1 Nguyên tắc 26
2.7.2 Phương pháp 27
3
PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM REAL-TIME PCR
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1
28
3.1 Mồi và Taqman probe 28
3.1.1
Mồi
28
3.1.2
Taqman probe
28
3.2
Thiết kế các thành phần của qui trình thử nghiệm real-time PCR phát hiện và

định lượng HIV1RNA
28
3.3
Phương pháp pha chế HIV1-TQPCR master mix
29
3.4
Phương pháp pha chế các chứng và chuẩn
30
3.4.1
Chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+] và chuẩn định lượng HIV1-RNA
30
3.4.2
Chế tạo chứng nội HIV1RNA-IC
31
3.4.3 Mẫu huyết tương người bình thường 33
4
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR
33
v

TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

4.1
Các chỉ tiêu phải đánh giá
33
4.2
Phương pháp đánh giá
34
4.2.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 34
4.2.2 Độ lặp lại trong phản ứng 34

4.2.3
Độ lặp lại liên phản ứng
35
4.2.4
Độ đặc hiệu
35
4.2.5
Khả năng chống ức chế
36
4.2.6
Độ ổn định trong điều kiện bảo quản
36
5
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR
THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT
37
5.1
Đối tượng được sử dụng để đánh giá
37
5.2
Phương pháp đánh giá
37
PHẦN 5 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
39
1
KẾT QUẢ PHA CHẾ CÁC THÀNH PHẦN CỦA QUI TRÌNH THỬ
NGHIỆM REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1RNA
39
1.1
Kết quả đánh giá khả năng sử dụng mồi và probe đặc hiệu gene gag của

HIV1 qua kết quả pha chế HIV1-TQPCR master mix
39
1.2
Kết quả chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+]
39
1.3 Kết quả chế tạo chứng nội HIV1RNA-C[+] 40
1.4
Kết quả chứng minh chứng nội HIV1RNA-C[+] pha ở nồng độ 100
copies/10µl là không cạnh tranh hệ thống đích
40
2
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR
TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
41
2.1 Kết quả đánh giá giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 41
2.2 Kết quả đánh giá độ lặp lại trong phản ứng 41
2.3 Kết quả đánh giá độ lặp lại liên phản ứng 42
2.4 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu 44
2.5 Kết quả đánh giá khả năng chống ức chế 44
2.6 Kết quả đánh giá độ ổn định trong bảo quản 45
3
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR
THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT
46
4
QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1RNA RT-TQPCR VỚI CÁC THÀNH
PHẦN VÀ HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG
47
vi

4.1 Tên qui trình thử nghiệm và thành phần 47
4.2 Lưu trữ 48
4.3 Phạm vi áp dụng 48
4.4 Nguyên tắc hoạt động của qui trình thử nghiệm 48
4.5 Trang bị cần thiết 49
4.6 Phương pháp 50
4.6.1 Mẫu thử 50
4.6.2 Phương pháp 50
PHẦN 6 KẾT LUẬN
54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
55
PHỤ LỤC
57


vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT
AIDS Acquired Immuno Deficiency Virus
ARV Anti-retrovirus
bp Base pair
CDC Centers for Diseases & Prevention
Ct Threshold Cycle
cDNA complementary deoxyribonucleic acid
DNA Deoxyribonucleic acid
dATP 2’-deoxyadenosine 5’- triphosphate
dTTP 2’-deoxythymidine 5’- triphosphate
dCTP 2’-deoxycytidine 5’- triphosphate

dGTP 2’deoxyguanosine 5’- triphosphate
dNTP 2’-deoxynuclosid 5’- triphosphat
ELISA Enzyme – Linked Immunosorbent Assay
HIV-1 Human Immunodeficiency Virus type 1
IC Internal Control
OD Optical Density
PCR Polymerase chain reaction
Realtime PCR Realtime Polymerase chain reaction
RNA ribonucleic acide
RT-PCR reverse transcriptase- polymerase chain reaction
UNIADS Joint Unitied Nations Programme on HIV/AIDS
Taq Thermus aquaticus
SIV Simian Immunodeficiency Virus
WHO World Heath Organization
CV Coeficient of variation
SOC Super Optimal Catabolite Repression Broth
IPTG isopropyl-β-D-thiogalactoside
X- gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactoside

viii

DANH SÁCH BẢNG
Số
TÊN BẢNG SỐ LIỆU
Trang
1
Thể tích của các thành phần được lấy từ các nồng độ hay hàm lượng gốc
để pha được các HIV1-TQPCR mastermix cho 10 mix – 50 mix hay 100
mix
29

2
Giá trị định lượng HIV1RNA trong 3 dãy pha loãng và giá trị CV
42
3
Giá trị định lượng HIV1RNA trong 3 dãy pha loãng thực hiện trong 3
ngày liên tiếp và giá trị CV
44
4
Giá trị định lượng HIV1RNA trong từng cặp mẫu co và không có thêm
chất ức chế
45
5
Giá trị định lượng HIV1RNA trong 2 mẫu 10
3
và 10
7
thực hiện trong 4
lần cách nhau 4 tháng và giá trị CV
46
6
Giá trị định lượng HIV1RNA trong 44 mẫu HIV1-RNA dương tính và
định lượng được với kit Amplicor và giá trị CV khi so với HIV1 RT-
qPCR
47

ix

DANH SÁCH HÌNH
Số
TÊN HÌNH ẢNH

Trang
1 HIV mô tả từ máy tính 4
2 Hình chi tiết của virus HIV 7
3 Hình ảnh cấu trúc của virus HIV 7
4 Vị trí của các gene trong bộ gene HIV 7
5
Cơ chế hoạt động của SYBR I (1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại thì ống
thứ nghiệm không phát được hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích,
(2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì SYBR I chèn vào và
tập trung trên phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi
nhân được ánh sáng kích thích
9
6 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR 10
7 Tóm tắt cơ chế họat động của Beacon probe trong real-time PCR 11
8 Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe lai trong real-time PCR 12
9
Biển đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang
phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sánh kích thích ở mỗi chu kỳ nhiệt
12
10
Biểu đồ khuếch đại vẽ lên các đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu thử và
các mẫu chuẩn
13
11
Biển đồ chuẩn vẽ lên đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa số lượng
bản DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng. Trong
biểu đồ ở trên này, chúng ta E2-E4-E7 là các ống phản ứng chứa các mẫu
chuẩn còn B4 là ống phản ứng chứa mẫu thử
14
12 Nguyên tắc tổng hợp cDNA từ RNA 20

13
Bản đồ gene của plasmid pGEM-T Easy với vị trí chèn DNA ngay bên trong
gene lacZ
23
14
Plasmid pGEM-T Easy được chèn trình tự DNA sẽ được enzyme cắt giới hạn
NdeI cắt ở đầu SP6 NdeI được sử dụng vì enzyme này chỉ cắt được một điểm
ở đầu SP6 và không cắt được đoạn DNA đã được chèn vào pGEM-T Easy
27
15
Nhờ men T7 RNA polymerase mà DNA được chèn vào plasmid pGEM-T
Esay sau khi duỗi thẳng được phiên mã thành chứng nội tại RNA
28
16
Biểu đồ khuếch đại các pha loãng “HIV1DNA đích” cho vào các HIV1-
TQPCR mix. Kết quả cho thấy các đường khuếch đại có Ct cách đều nhau
khoảng 3-4 chu kỳ. Sơ bộ cho phép kết luận là HIV1-TQPCR mix hoạt động
được mà không cần phải thiết kế lại primers và taqman probe
39
17
(A) Hình bên trái là kết quả điện di chip cho thấy lane 1 là sản phẩm PCR
đích của HIV1 kích thước 140bps khuếch đại từ gene gag của HIV1 genome
trích từ huyết thanh người nhiễm HIV có HIV1RNA [+], và lane 2 là sản
phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+] kích thước 240 bases phiên mã từ
40
x

plasmid pGEM-T Eseay chèn sản phẩm PCR. (B) Hình bên phải là kết quả
điện di chip sản phẩm HIV1DNA-IC kích thước 200bps (lane 1) và sản phẩm
HIV1RNA-IC kích thước 300bps (lane 2) phiên mã từ plasmid pGEM-T

Eseay chèn sản phẩm PCR
18
(A) Biểu đồ khuếch đại dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có (màu đỏ) và không
có (màu xanh) cho thêm 10µl chứa 100 copies chứng nội HIV1RNA-IC trước
khi tách chiết RNA để tổng hợp cDNA rồi chạy real-time PCR. Kết quả cho
thấy cả hai dãy pha loãng ở nồng độ cuối đều cho tín hiệu khuếch đại, chứng
tỏ chứng nội HIV1RNA-IC ở nồng độ 100 copies cho vào thể tích mẫu tách
chiết đã không cạnh tranh với đích. (B) Biểu đồ khuếch đại của chứng nội
HIV1RNA-IC trong các 5 mẫu HIV1RNA-C[+] có cho 10µl chứng nội vào
mẫu, kết quả này chứng minh chứng nội thật sự được khuếch đại khi cho vào
HIV1-TQPCR mix



41
19
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm
lượng copies 1 đến 10
10
copies trong 150µl huyết tương
41
20
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 3 dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm
lượng copies 1 đến 10
8
copies trong 150µl huyết tương
42
21
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm
lượng copies 1 đến 10

8
copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm
trong ngày 1
43
22
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm
lượng copies 1 đến 10
8
copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm
trong ngày 2
43
23
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn dãy pha loãng HIVRNA-C[+] có hàm
lượng copies 1 đến 10
8
copies trong 150µl huyết tương được làm xét nghiệm
trong ngày 3
43
24
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 4 mẫu huyết tương dương tính HBV,
HCV, CMV và S. aureus cho thấy không có tín hiêu khuếch đại dương tính
cho HIV1RNA mà chỉ có tín hiệu khuếch đại dương tính cho chứng nội
(HIV1RNA-IC) chứng tỏ các mẫu thất sự âm tính HIV1RNA. Các chuẩn định
lượng cho đường khuếch đại màu đỏ
44
25
Biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn 4 cặp mẫu huyết tương có pha loãng
HIVRNA-C[+] và trong mỗi cặp có 1 mẫu thêm chất ức chế (đường màu đen)
và 1 mẫu không thêm chất ức chế (đường màu xanh lá)
45

26
Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện
HIV1RNA trong 2 mẫu 10
3
và 10
7
copies HIV1RNA có trong 150µl, thực
hiện ngay sau khi pha.
45
27
Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện
HIV1RNA trong 2 mẫu 10
3
và 10
7
copies HIV1RNA có trong 150µl, thực
45
xi

hiện sau 4 tháng bảo quản
28
Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện
HIV1RNA trong 2 mẫu 10
3
và 10
7
copies HIV1RNA có trong 150µl, thực
hiện sau 8 tháng bảo quản
46
29

Kết quả biểu đồ khuếch đại và biểu đồ chuẩn của xét nghiệm phát hiện
HIV1RNA trong 2 mẫu 10
3
và 10
7
copies HIV1RNA có trong 150µl, thực
hiện sau 12 tháng bảo quản
46

xii

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Hùng Vân đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều
kiện thuận lợi, giúp đỡ con trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Nam Khoa đã hộ trợ kinh phí và tạo
mọi điều kiện thuận để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài.

Đồng cảm ơn tất cả anh chị phòng Kiểm tra Chất lượng, phòng RD và phòng Sinh
học Phân tử Công ty Nam Khoa đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn quý cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công
nghệ trẻ đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn quý cơ quan chủ quản đề tài: Sở khoa học và Công nghệ Tp.
Hồ Chí Minh đã đồng ý và cấp kinh phí cho tôi nghiên cứu đề tài này.

1

PHẦN 1 MỞ ĐẦU
Tên đề tài
Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện và định lượng Human
Immunodeficiency Virus – 1 trong huyết tương người bằng kỹ thuật
real-time PCR
Chủ nhiệm đề tài
Họ và tên: Nguyễn Việt Quốc
Năm sinh: 18/03/1982 Nam/Nữ: Nam
Học vị: Cử nhân Công nghệ Sinh học Năm đạt học vị:
2005
Cơ quan công tác Công ty TNHH Nam Khoa
Cơ quan chủ trì Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ trẻ
Thời gian thực hiện đề tài 12 tháng
Kinh phí được duyệt 80.000.000 đồng
Kinh phí đã cấp 49.000.000 đồng theo TB số : /TB-SKHCN ngày
Mục tiêu Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định
lượng Human Immunodeficiency Virus – 1 trong
huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR
Nội dung
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Thu nhận mẫu huyết tương dương tính và âm
tính với HIV bằng thử nghiệm ELISA
50 mẫu huyết tương dương tính và 20
mẫu huyết tương âm tính
Thực hiện thử nghiệm với kits Qiagen với
huyết tương thu nhận được
Xác định mẫu huyết tương dương tính

và âm tính với HIV1RNA
Nghiên cứu thiết kế các thành phần của quy
trình thử nghiệm
Xây dựng được các thành phần của quy
trình thử nghiệm
Xây dựng chứng dương và chứng nội tại Xây dựng được chứng dương và chứng
nội tại
Thực hiện thử nghiệm so sánh quy trình nghiên
cứu với bộ Amplicor HIV1 Monitor
Thông số chất lượng của quy trình thử
nghiệm
Hoàn thiện sản phẩm và nghiệm thu đề tài Qui trình hoàn thiện



2

PHẦN 2 ĐẶT VẤN ĐỀ
Đại dịch HIV/AIDS (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) đang là hiểm
hoạ cho toàn cầu. Số người nhiễm HIV/AIDS trên thế giới thay đổi không
ngừng và không thể có con số thống kê chính xác, nhất là trên bình diện thế
giới. Chỉ tính riêng ở Việt Nam, tính đến tháng 5 năm 2008 tổng số người
nhiễm HIV tử vong ở nước ta lên đến 39.180 người. Số trường hợp nhiễm còn
sống là 127.442 trường hợp và số bệnh nhân AIDS tích lũy từ đầu năm đã lên
tới 1.892 trường hợp
[32]
. Tuy nhiên, y học thế giới vẫn chưa tìm ra được vaccin
phòng bệnh đặc hiệu. Thuốc điều trị chỉ có thể ngăn chặn sự nhân lên của
virus nhưng rất dễ bị đề kháng, rất đắt và thường chỉ phổ biến ở các nước phát
triển. Ơ các nước đang phát triển thì việc dùng thuốc điều trị HIV đặc hiệu còn

nhiều hạn chế.
Hiện nay, với sự phát triển của Công nghệ Sinh học, đặc biệt là sinh học phân
tử đã mở nhiều hướng mới cho việc phát hiện và điều trị căn bệnh thế kỹ này.
Các trường đại học, các viện nghiên cứu như Pastuer, các doanh nghiệp đã tiến
hành nghiên cứu, áp dụng các phương pháp hiện đại như PCR, RT-PCR, real-
time PCR trong việc phát hiện và theo dõi điều trị.
Trong các phương pháp chẩn đoán thì RT- real-time PCR là một sự tiến bộ
vượt bậc cho ta độ chính xác cao và thời gian ngắn. Điều này có ý nghĩa quan
trọng đối với các nhà lâm sàng trong việc chuẩn đoán và điều trị các trường
hợp nhiễm HIV1. Và quan trọng hơn nữa nếu chúng ta xây dựng thành công
bộ kits phát hiện và định lượng HIV1 bằng kỹ thuật real-time PCR với giá
thành phù hợp với người có thu nhập thấp như ở Việt Nam chúng ta.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng
quy trình phát hiện và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1
trong huyết tương người bằng kỹ thuật real-time PCR”.
Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của đề tài là: Xây dựng quy trình phát hiện
và định lượng Human Immunodeficiency virus – 1 trong huyết tương
người bằng kỹ thuật real-time PCR


3

PHẦN 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1 TÌNH HÌNH NHIỄM HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM
1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, vào thời điểm tháng 6/1994 trên thế
giới có 985.199 ca AIDS thì đến tháng 12/1996 có 22,5 triệu người nhiễm
HIV và đến tháng 10/1999 có 33,4 triệu người nhiễm HIV
[31]

. Tốc độ dịch
phát triển ở châu Á còn nhanh hơn nữa. Từ tháng 6/1993 có 30.000 ca AIDS
thì đúng 1 năm sau, tháng 6/1994 có 250.000 ca, tức là tăng 8 lần. Năm 1999
có 14,5 triệu người nhiễm. Số người nhiễm HIV/AIDS trên thế giới thay đổi
không ngừng và vì thế không thể có con số thống kê chính xác, nhất là trên
bình diện thế giới. Trong các Hội nghị quốc tế về AIDS gần đây nhất người ta
đánh giá rằng hiện 95% tổng số người nhiễm HIV sống ở các nước đang phát
triển, và 95% những người đã chết vì AIDS cũng ở các nước đang phát triển.
Chương trình phối hợp của Liên hợp quốc về HIV/AIDS (UNAIDS) đã thông
báo đến cuối năm 2006 trên thế giới có khoảng 39.5 triệu người nhiễm HIV
đang còn sống, trong đó phụ nữ chiếm gần 50% (17.7 triệu người) và trẻ em
dưới 15 tuổi là 2.3 triệu người. Tổng số người nhiễm HIV hằng năm vào
khoảng 4.3 triệu người
[ 32]
. Tỷ lệ nhiễm HIV vẫn tiếp tục gai tăng nhiều nơi
trên thế giới, điển hình là các khu vực Nam Á, trung Á và Đông Âu, và cũng
theo thống kê của tổ chức này (UNAIDS) vào thời điểm cuối năm 2007 có
khoảng 30.8 triệu người lớn và 2 triệu trẻ em đang sống với HIV
[30]
. Tại châu
Á, các nước Campuchia, Thái Lan và Myanma được đánh giá là những nước
có tỷ lệ nhiễm HIV cao nhất khu vực, tiếp theo là Indonesia, Nepan, Việt Nam
và Trung Quốc….Chính vì thế đã có nhiều công trình nghiên cứu về phương
pháp hiện và theo dõi điều trị HIV. Hiện tại các nhà khoa học đã nghiên cứu
và tìm ra nhiều phương pháp chuẩn đoán cũng như theo dõi điều trị hữu hiệu.
Thông thường chẩn đoán bằng phương pháp ELISA , ngoài ra các nhà khoa
học nghiên cứu sâu về phương pháp sinh học phân tử, với ưu điểm phát hiện
các trường hợp nhiễm sớm và giúp ích cho quá trình theo dõi điều trị
[35]
. Có

nhiều công trình nghiên cứu và sáng chế liên quan đến các kỹ thuật phát hiện
và địnhlượng HIV1 và cũng từ đó đã có những sản phẩm thương mại có liên
quan như các bộ kit phát hiện và định lượng HIV1-RNA của Roche, của
Abbott.
1.2 Tình hình nhiễm HIV tại Việt Nam

Trường hơp nhiễm HIV đầu tiên ở nước ta phát hiện vào tháng 12 năm 1990
tại thành phố Hồ Chí Minh. Nhưng thực sự dịch HIV/AIDS bắt đầu bùng nổ từ
1993 trong nhóm những người nghiện chích ma túy tại thành phố Hồ Chí
Minh. Sau đó dịch bắt đầu lan ra các tỉnh. Tính đến tháng 12 năm 2002, theo
báo cáo của các tỉnh thành, cả nước đã phát hiện 58.490 trường hợp nhiễm
HIV, 8.718 trường hợp biến chuyển thành bệnh AIDS và 4.834 trường hợp đã
tử vong
[33]
. Tính đến tháng 6 năm 2008, đại dịch HIV ở nước ta đang tăng với
tốc độ gắp hai lần so với cùng kỳ name 2007. Trong các ca nhiễm HIV thì có
tới 83.3% ở độ tuổi từ 20 đến 39, tỷ lệ nhiễm ở nam giới cao gấp 4 lần so với
nữ giới
[32]
. Theo thống kê từ cục phòng chống HIV/AIDS, đa phần các trường


4

hợp nhiễm HIV ở nước ta là nghiện chích ma túy hoặc liên quan đến ma túy,
con đường lây nhiễm chủ yếu hiện nay là sử dụng chung kim tiêm và quan hệ
tình dục không an toàn; 100% tỉnh /thành nước ta có người nhiễm HIV. Tại
một số địa phương, tỷ lệ người nghiện ma túy quan hệ tình dục với gái mại
dâm cũng đang tăng mạnh như: An Giang (43,3%), Đà Nẵng (35,2%), Cần
Thơ (28,9%) Cũng trong khoãng thời gian này tổng số người nhiễm HIV tử

vong ở nước ta lên đến 39180 người. Số trường hợp nhiễm còn sống là
127.442 trường hợp. Tính riêng đến tháng 05 năm 2008, số bệnh nhân AIDS
tích lũy từ đầu năm đã lên tới 1.892 trường hợp.
Theo số liệu Cục Phòng chống HIV, đến nay đã có 203 điểm điều trị HIV
bằng thuốc đặc hiệu kháng virus (ARV) tại tất cả 63 tỉnh, thành phố. Ngoài ra
ở nước ta, bệnh viện Bình Triệu, công ty dược phẩm Stada Việt Nam, viện
nghiên cứu và điều trị bệnh hiểm nghèo đã và đang nghiên cứu chế tạo ra các
loại thuốc điều trị hữu hiệu cũng như thuốc làm tăng sức đề kháng tránh nhiễm
trùng cơ hội đối với bệnh nhân nhiễm HIV
[31]
. Cụ thể những bệnh nhân nhiễm
HIV/AIDS được điều trị bằng ARV, nếu bệnh nhân đáp ứng tốt với thuốc thì
nồng độ virus tự do trong máu sẽ giảm lại và số lượng tế bào CD4 tăng lên.
Ngược lại, nếu hàm lượng virus tự do trong máu vẫn tăng và số lượng tế bào
CD4 vẫn giảm thì bệnh nhân không đáp ứng với thuốc có thể do nhiều nguyên
nhân như: không phối hợp thuốc, thuốc không có dược tính cao, hay chủng
HIV có những đột biến gây tính kháng thuốc.
Hiện nay các trường đại học, các viện nghiên cứu như Pasteur, các doanh
nghiệp đã tiến hành nghiên cứu, áp dụng các phương pháp hiện đại như PCR,
RT-PCR, real-time PCR trong việc phát hiện và theo dõi điều trị: Trường Đại
Học Y Dược đã và đang nghiên cứu nhiều đề tài như tìm hiểu tình hình kháng
thuốc Antiretro virus (ARV) của virus HIV trên các bệnh nhân nhiễm HIV, đề
tài nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR, PCR nested
để khuếch đại các vùng gen ENV, PRO, RT), phân tích trình tự nucleotid và
phát hiện đột biến kháng thuốc bằng phương pháp so sánh với ngân hàng dữ
liệu quốc tế về tính kháng thuốc ARV. Trường Đại Học Y Hà Nội, tác giả
Đàm Tú Anh nghiên cứu sự lây truyền HIV từ mẹ sang con bằng kỹ thuật RT-
PCR/HIV1 và PCR/HIV1. Viện Pastuer TP. HCM, Ths. Trần Chí Thành chủ
nhiệm đề tài, đang nghiên cứu kỹ thuật PCR trong chuẩn đoán sớm nhiễm
HIV/AIDS ở trẻ (< 18 tháng tuổi) có mẹ bị nhiễm HIV.

2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA HIV
2.1 Một số đặc điểm sinh học của HIV

HIV là một retrovirus thuộc họ lentivirus có vật
liệu di truyền là RNA. Quá trình nhân lên của
HIV qua giai đọan trung gian DNA nhờ
enzyme sao chép ngược. Sau một thời gian ủ
bệnh kéo dài, các lentivirus làm suy giảm hệ
thống miễn dịch kéo dài trong suốt giai đoạn
gây bệnh
[30]
.
2.2 Các type di truyền của HIV

Hình 1: HIV mô tả từ máy tính
()


5

HIV gây bệnh AIDS thường gặp nhất là HIV1 và là tác nhân gây bệnh lan
rộng khắp thế giới. Tác nhân thứ hai là HIV-2, ít gặp hơn và độc lực thấp hơn
nhưng vẫn cho các triệu chứng lâm sàng giống HIV1, tuy nhiên chúng khác
nhau ở một số điểm: Về di truyền: bộ gen của HIV1 và HIV-2 có cấu trúc di
truyền khác nhau. Trên 50%, HIV-2 giống với SIV (gây bệnh ở khỉ). Kháng
nguyên của hai virus này cũng khác nhau. Trọng luợng phân tử của các thành
phần cấu trúc cũng khác biệt. Thời gian không triệu chứng của HIV-2 cũng dài
hơn HIV1. Tỷ lệ nhiễm HIV1 cao hơn HIV-2.
[48]
Những chủng của HIV1 có thể được xếp lớp vào 4 nhóm: nhóm M "chính",

nhóm O "biệt lệ" và 2 nhóm mới, N và P. Nhóm O: xuất hiện giới hạn ở tây –
trung Phi và nhóm N: nhóm cực kỳ hiếm được khám phá năm 1998 ở
Cameroon. Nhóm P: một chủng mới liên quan gần gũi với virus suy giảm
miễn dịch loài linh trưởng ở loài khỉ đột (gorilla) được phát hiện ở một phụ nữ
người Cameroon năm 2009. Hơn 90% người nhiễm HIV1 thuộc nhóm M. Với
nhóm M: có ít nhất 9 phó type di truyền khác biệt nhau của HIV1. Các phó
type này là A, B, C, D, F, G, H, J và K.
Đôi khi, 2 virus có các phó type khác nhau có thể gặp nhau trong tế bào của
một người nhiễm và trộn lẫn với nhau về các chất liệu di truyền của chúng để
tạo nên một virus mới được lai tạo và đôi khi được gọi “giới tính virus”. Nhiều
trong số các chủng virus mới này không thể sống sót lâu dài, nhưng người ta
biết những chủng mà gây nhiễm nhiều hơn một như là “những thể tái tổ hợp
lưu hành” viết tắt CRFs. Lấy ví dụ, thể tái tổ hợp lưu hành A/B là một hổn
hợp của các phó type A và B.
Một trong các thể của CRFs được gọi là A/E bởi vì người ta nghĩ là nó được
tạo ra từ sự lai tạo giữa phó type A và một số phó type E của thế hệ "cha mẹ"
khác. Tuy nhiên, chưa một ai đã từng tìm thấy một thể thuần chủng của phó
type E. Một cách nhầm lẫn, nhiều người vẫn qui cho CRF A/E như là "phó
type E" (trên thực tế nó được gọi chính xác nhất là CRF01_AE).
Các phó type và CFRs của HIV1 thường được kết hợp với các khu vực địa lý
nhất định, phổ biến nhất phó type A và C. Phó type A và CRF A/G chiếm ưu
thế ở phương Tây và Trung Phi, với phó type A có thể cũng gây ra
nhiều vụ dịch ở Nga. Về mặt lịch sử, phó type B là phó type/CRF phổ biến
nhất ở châu Âu, châu Mỹ, Nhật Bản và Australia và là phó type chủ yếu được
tìm thấy trong nhóm MSM bị nhiễm ở châu Âu. Các phó type khác đang ngày
càng trở nên hay gặp và bây giờ chiếm ít nhất 25% số ca nhiễm HIV mới ở
châu Âu. Phó type C chiếm ưu thế ở miền Nam và Đông Phi, Ấn Độ và Nepal
đã gây ra các dịch HIV tồi tệ nhất thế giới và chịu trách nhiệm cho khoảng
một nửa của tất cả các ca bệnh. Phó type D thường giới hạn ở Đông và Trung
Phi. Hiện nay, type CRF01_AE (tái tổ hợp vật chất di truyền giữa typ A và

E) là phân type gây đại dịch ở các nước Đông Nam Á và cũng là phân nhóm
chiếm đến 97% phân typ HIV-1 lưu hành tại Việt Nam nhưng có nguồn gốc
từ Trung Phi. Phó type F đã được tìm thấy ở Trung Phi, Nam Mỹ và Đông
Âu. Phó type G và CRF A/G đã được quan sát ở Tây và Đông châu Phi và


6

Trung Âu. Phó type H chỉ được tìm thấy ở Trung Phi, Phó type J chỉ
có ở Trung Mỹ và K chỉ có tại Cộng hòa Dân chủ Congo và Cameroon.
[49]
Liệu có thể có thêm nhiều phó type sẻ “xuất hiện”: Gần như chắc chắn rằng
các phó type gene mới và CRFs của HIV sẽ được phát hiện trong tương lai, và
thực sự rằng là những phó type mới và CFRs mới sẽ phát triển vì sự tái tổ hợp
và đột biến của virus vẫn tiếp tục xảy ra. Các phó type và CRFs hiện nay cũng
sẽ tiếp tục lây lan đến các khu vực mới khi đại dịch toàn cầu vẫn tiếp diễn
[48]
2.3 Cấu trúc HIV

2.3.1 Hình thể và cấu tạo virus
Trên kính hiển vi điện tử virus HIV có dạng hình cầu lởm chởm, xù xì. Đường
kính khoảng từ 100-120 nanometres, khoảng 60 lần nhỏ hơn một tế bào hồng
cầu
[44]
. Virus HIV hoàn chỉnh có cấu tạo từ ngoài vào trong gồm có 3 lớp:
Bao ngoài: Là màng lipid kép. Trên màng này là các phân tử glycoprotein,
dưới có chứa nhiều các núm (gai nhú) trên bề mặt là các phân tử glycoprotein
có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (Gp160), gồm 2 thành phần: Gp120
đảm nhận vai trò phân tử nhận biết thụ thể CD4+ có trên tế bào lympho CD4
và một số tế bào khác, nhờ đó virus bám được vào tế bào đích. Gp41 (ở HIV2

thì đây là Gp36) là các glycoprotein xuyên qua màng lipid tham gia vào giai
đoạn hòa màng của virus và tế bào nhiễm. Như vậy những phân tử Gp120 và
Gp41 có vai trò giúp cho virus bám và xâm nhập vào tế bào đích. Lớp vỏ bao
mới được tạo thành khi vỏ capsid của HIV nẩy chồi từ protein tế bào chủ
[42]
.
Vỏ trong ( capsid) gồm 2 lớp protein: Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi phân tử
protein có trọng lượng phân tử là 17 kilodalton (P17), P17 này được mã hóa
bởi gene Gag và quy định chất nền che chở. Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi
phân tử protein có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (P24), P24 được mã
hóa bởi gene Gag và cung cấp yếu tố cấu trúc của virus. Ngoài ra còn có vỏ
capsid của nhân (P7 và P6) liên kết với bộ gen RNA và bảo vệ RNA khỏi sự
tiêu hóa bởi nhân. Chất nền tạo một sự liên kết của protein P17 xung quanh vỏ
capsid, bảo đảm cho toàn bộ phần tử của protein vỏ. Hơn nữa bao chung
quanh trong các phần tử của vỏ protein virus là Vif, Vpr, Nef, P7 và enzyme
protease virus.
Lõi HIV được tạo từ 2 sợi RNA đơn giống hệt nhau được bao chung quanh
bởi vỏ capsid hình trụ là protein P24, sợi đơn RNA được kết hợp thành khối
chặt chẽ với protein vỏ capsid P7 và các enzyme cần thiết như: RT (Reverse
transcriptase): còn gọi là enzyme sao chép ngược, là enzyme RNA dạng hoạt
động: P66/51 ở HIV1, và P68 ở HIV-2, đảm nhiệm phiên mã bộ gene virus
thành DNA bổ sung(cDNA). Protearase (P12): Cắt các polyproteine được mã
hoá thành các protein cấu trúc hoặc chức năng. Intergrase (P31 ở HIV1 và
P34 ở HIV-2): Đảm nhiệm sự tích hợp DNA của virus vào nhiễm sắc thể của
tế bào ký chủ, cho phép DNA của virus trở thành 1 phần bộ gen tế bào chủ.
Ngoài ra còn một số gene tổng hợp các protein chức năng điều hòa khác.



7

2.3.2 Cấu trúc gene HIV
Mỗi sợi RNA có khoảng 9200
cặp base với 3 gen cấu trúc
chính là: Gene Gag (groupe
Antigen – Kháng nguyên đặc
hiệu nhóm): mã hóa cho
protein lõi của virus P24,
protein nhân capsid P6 và P7, và P17 bên trong của virus. Gene Pol
(polymerase):mã hóa cho các loại enzyme virus, quan trọng nhất là Reverse
Transcriptase, integrase, protease. Gene Env (enveloppe): mã hóa cho các
glycoprotein vỏ Gp41, Gp120 bao phủ ngoài có vai trò quan trọng trong việc
giúp virus bám và xâm nhập được vào tế bào đích. Ngoài 3 nhóm gene chính,
genome của virus còn có các gene khác mã hóa cho các protein có chức năng
điều hòa và protein có cùng tên với gen mã hóa cho nó: Tat, Rev, Nef, Vif,
Vpr, Vpu. Các LTR (long termina Repeat) là những vị trí lồng ghép trong bộ
gene đặc biệt vùng U3 của R và 5’LTR chứa các chuỗi điều hòa sao chép và là
vị trí khởi đầu cho sự sao chép
[48]
.
2.4 Sức đề kháng của virus HIV

HIV đề kháng với nhiệt độ lạnh, tia gamma, tia cực tím. Sống được 3 ngày
trong máu của bệnh nhân nếu để ở ngoài trời.
Virus HIV dễ bị tiêu diệt bởi alcol 72
o
C, javel, bị bất hoạt ở pH=1 hay pH=13.
Đun nóng 56
o
C trong vòng 30 phút trong môi trường ẩm ước virus dễ bị tiêu
diệt.
3 TIẾN TRÌNH TỪ LÚC NHIỄM HIV TỚI AIDS

Thời gian từ lúc nhiễm HIV đến lúc có chẩn đoán AIDS khá thay đổi. Một số
bệnh nhân biểu hiện triệu chứng sau vài tháng nhiễm, trong khi một số khác
lại không biểu hiện triệu chứng đến 20 năm.
Tiến trình từ lúc nhiễm HIV tới AIDS trải qua 4 giai đoạn: Giai đoạn sơ
nhiễm hay giai đoạn cửa sổ: 2-8 tuần sau khi nhiễm HIV, 20% bệnh nhân có
một số triệu chứng như sốt cao, đau cơ, mệt mỏi, chán ăn, tiêu chảy. Phát ban
đỏ ngoài da xuất hiện ở 50% bệnh nhân. Các triệu chứng này hiện diện 5-10
Hình 4: Vị trí của các gene trong bộ gene HIV
Hình 2: Hình chi tiết của virus HIV Hình 3: Hình ảnh cấu trúc của virus HIV


8

ngày và tự khỏi hoàn toàn. Giai đoạn này mới có kháng nguyên HIV, 2-12
tuần sau kháng thể mới xuất hiện. Giai đoạn nhiễm HIV không triệu chứng:
Sau thời kỳ cửa sổ, bệnh nhân nhiễm HIV rơi vào giai đoạn dài không triệu
chứng lâm sàng. Kéo dài từ 2-10 năm. Giai đoạn nhiễm HIV có triệu chứng:
Trong giai đạn này người nhiễm HIV có các triệu chứng rõ ràng và kéo dài tới
bệnh AIDS: sốt, hạch to, ho, khó thở, sút cân, tổn thương da, niêm mạc, ĩa

chảy, gan to, lách to, nhức đầu, và các bệnh nhiễm trùng cơ hội như candida
miệng, viêm da(không zona,zona), lao phổi. Giai đoạn bệnh AIDS: Khi bệnh
nhân chẩn đoán là AIDS nghĩa là nhiễm HIV giai đoạn cuối.
Thời gian từ lúc xác định bệnh đế khi chết thường không quá 2 năm. Biểu hiện
lâm sàng chính thường là nhiễm trùng cơ hội (ở phổi, hệ thần kinh, hệ tiêu
hoá) hoặc ung thư.

Những chỉ số sinh học lâm sàng như nồng độ virus tự
do và kháng nguyên p24 trong máu, các kháng thể kháng HIV, và số lượng tế
bào T CD4 của bệnh nhân nhiễm HIV thay đổi trong tiến trình bệnh sang giai
đoạn AIDS
[48]
.
3.1 Nồng độ HIV1 tự do và kháng nguyên p24 trong huyết tương

Nồng độ virus tự do trong huyết tương và nồng độ kháng nguyên p24 (một
lọai kháng nguyên cấu thành lõi của HIV) tỷ lệ thuận với nhau, hai chỉ số này
có giá trị rất cao ở giai đọan nhiễm cấp (2-8 tuần đầu). Khi các virus chuyển
sang dạng tiềm ẩn DNA provirus trong các tế bào đích (T CD4 chủ yếu) thì
nồng độ virus tự do và kháng nguyên p24 sẽ giảm dần. Dựa vào chỉ tiêu trên,
người ta có thể phát hiện chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS trực tiếp bằng các
phương pháp sau: Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy tế bào đơn nhân
(PBMC). Phát hiện RNA hoặc DNA provirus của HIV bằng kỹ thuật sinh học
phân tử.
3.2 Sự xuất hiện của các kháng thể kháng HIV1 trong huyết thanh của bệnh
nhân nhiễm HIV/AIDS

Các kháng thể kháng HIV1 sẽ xuất hiện sau 1- 3 tháng so với thời điểm bắt
đầu nhiễm HIV. Khả năng trung hòa của các kháng thể này rất kém cho nên
bệnh vẫn diển tiến, đây là hiện tượng đáp ứng đáp ứng miễn dịch không đầy

đủ
[28]
.
Chẩn đoán phát hiện nhiễm HIV/AIDS ở người hiện nay đang sử dụng kỹ
thuật ELISA và Westernblot để phát hiện sự tồn tại của kháng thể kháng HIV1
trong huyết thanh. Tuy nhiên các kỹ thuật này rất dễ cho kết quả âm tính giả
do bỏ soát giai đoạn “cửa sổ “ của bệnh nhân khi kháng thể chưa được tổng
hợp. Do đó trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV/AIDS người ta dựa vào các chỉ
tiêu RNA virus tự do, kháng nguyên p24, DNA provirus bằng kỹ thuật sinh
học phân tử
[48]
.
3.3 Lượng tế bào miễn dịch T CD4
Việc xác định tương đối giai đoạn nhiễm HIV/AIDS được dựa vào sự suy
giảm của chỉ số tế bào miễn dịch T CD4: Giai đoạn mới nhiễm (2-6 tuần), số
lượng tế bào T CD4 giảm nhẹ. Giai đoạn ủ bệnh kéo dài trong nhiều năm, số


9

lượng tế bào TCD4 giảm dần. Giai đoạn AIDS, số lượng tế bào T CD4 thấp
hơn 500 tế bào/µl máu.
3.4 Các xét nghiệm được sử dụng để phát hiện và theo dõi nhiễm HIV/AIDS
Các phương pháp xét nghiệm sử dụng cho chẩn đoán nhiễm HIV là kiểm tra
sự thể hiện của kháng thể bao gồm kiểm tra nhanh và kiểm tra để chứng thực,
ước định sự tiến triển của bệnh, dự đoán và đưa ra các phép chữa bệnh (số
lượng tế bào lympho CD4, số lượng virus HIV), và từ đó có thể ước định
phương pháp thích hợp để điều trị. Trong thời gian qua nhiều phương pháp
được sử dụng để phát hiện và định lượng HIV được sử dụng ở Việt Nam và
thế giới như là: kỹ thuật ngưng kết hạt vi lượng (Microtiter Particle

Agglutination), kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme ELISA (Enzyme – Linked
Immunosorbent Assay), các thử nghiệm khẳng định như là: thử nghiệm miễn
dịch điện di Western blot, thử nghiện miễn dịch huỳnh quang (Immuno –
Fluorescence Assay IFA). Hiện nay, nước ta Bộ Y tế đã ban hành Hướng
dẫn thực hiện xét nghiệm tải lượng HIV1 trong theo dõi điều trị HIV/AIDS
(Quyết định số 1921/QĐ-BYT, ngày 05/6/2013, của Bộ Y tế).
[49]

4 PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

4.1 Khái niệm real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị
được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là
real-time; và do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm
không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để
xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của
phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng
khuếch đại. Như vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA
đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết
quả khuếch đại trong ống phản ứng
được hiển thị cùng lúc với phản ứng
khuếch đại xảy ra để người làm thí
nghiệm có thể thấy được
[9]
.
Huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA:
Khởi thủy ethidium bromide được sử
dụng cho nguyên tắc real-time PCR
này, nhưng sau này các nhà khoa học
sử dụng SYBR I vì các ưu điểm vượt

trội hơn như màu huỳnh quang nền rất
thấp, khả năng chèn vào sợi đôi cao
nhưng không làm cho sợi đôi bị gắn
chặt vào nhau khi bị biến tính nhờ vậy
mà ảnh hưởng ít lên hiệu quả PCR.
Nguyên tắc của kỹ thuật này là khi
không có sự hiện diện sản phẩm
khuếch đại của PCR, chất huỳnh quang
bị phân tán trong dung dịch PCR mix,
Nguồn sáng

kích thích

Hình
5
: Cơ ch
ế hoạt động của SYBR I (1) Khi ch
ưa có
sản phẩm khuếch đại thì ống thứ nghiệm không phát được
hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích, (2)
Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì
SYBR I chèn vào và tập trung trên phân tử DNA , làm
cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi nhân được ánh
sáng kích thích
(1) (2)
Ánh sáng
hùynh quang

10

do vậy mà tube phản ứng sẽ không bị phát huỳnh quang hay chỉ phát huỳnh
quang không đáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Nhưng khi có sự
hiện diện sản phẩm khuếch đại của PCR thì màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào
và tập trung trên các sợi đôi DNA của sản phẩm khuếch đại và sẽ làm cho tube
phản ứng bị phát huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích.
[9]

Probe làm chất phát huỳnh quang, đó là những đoạn oligonucletides sợi đơn
có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích
(trong PCR, đó là sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích). Sử dụng probe
làm chất phát huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là khi có mặt sản phẩm khuếch
đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc
hiệu của sản phẩm khuếch đại, và khi có sự bắt cặp này thì sẽ có sự phát
huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích. Có
nhiều loại probe được sử dụng, thông thường nhất là taqman probe, beacon
probe và probe lai.
Cơ chế phát huỳnh quang
của Taqman probe trong
các chu kỳ nhiệt có thể
tóm tắt như sau:
(1) Khi chưa có sự xuất
hiện của sản phẩm
khuếch đại đặc hiệu từ
DNA đích thì Taqman
probe vẫn còn nguyên
vẹn do vậy mà huỳnh
quang phát ra được từ
reporter ở đầu 5’ sẽ bị

quencher ở đầu 5’ của
probe hấp phụ, ống thử
nghiệm sẽ không phát
được huỳnh quang khi
nhận được nguồn sáng
kích thích. (2) Khi bắt
đầu có sự xuất hiện sản
phẩm khuếch đại đặc
hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn
nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng
hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa
quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng
nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh
thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi
nhận được nguồn sáng kích thích
[9]
.
Beacon probe là probe có trình tự dài khoảng 25-40 bases, có đầu 5’ gắn với
reporter và đầu 3’ gắn với quencher. Probe có trình tự 15-39 bases ở giữa là bổ
sung với một trình tự đặc hiệu trên một sợi của DNA đích, còn hai đầu của
R Q
R Q
R

Q

R
Q
R

Q

Ánh sáng kích thích
[1]
Khi chưa có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc
hiệu, Taqman probe không phát được huỳnh
quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì
hu
ỳnh quang phát ra bị quencher hấp
ph
ụ hết

[2]
(a) Khi có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu,
Taqman probe sẽ bắt cặp trên trình tự đặc hiệu
của sản phẩm khuếch đại ở giai đoạn nhiệt độ
b
ắt cặp sau giai đoạn biến tính

[2]
(b) Taqman probe s
ẽ trở th
ành trình t
ự cản đầu
3’ khi Taq polymerase kéo dài mồi để bắt đầu
t
ổng hợp sợi bổ sung

[2]
(c) Nh
ờ có hoạt tính 5’
-
3’ exonuclease nên
Taq polymerase sẽ cắt bỏ Taqman probe làm
reporter bị cắt rời xa quencher và nhờ vậy mà
huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ không còn
b
ị quencer hấp phụ nữa

[2]
(d
) Giai đo
ạn phát huỳnh quang của reporter
xảy ra trong suốt quá trình Taq polymerase
kéo dài mồi để tổng hợp sợi bổ sung
Hình 6: Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong real-time PCR


11

probe thì mỗi đầu có một
trình tự 5-6 bases bổ sung
với nhau làm cho probe tạo
thành cấu trúc hình kẹp tóc
do trình tự của hai đầu bắt
cặp nhau. Cơ chế hoạt động
của Beacon probe được tóm

tắt như sau: (1) Ở giai đoạn
nhiệt độ biến tính, cấu trúc
kẹp tóc của Beacon probe
không còn nên nếu ở giai
đoạn này reporter nhận
nguồn sáng kích thích thì nó
sẽ phát huỳnh quang. (2) Ở
giai đoạn nhiệt độ bắt cặp,
nếu chưa có mặt sản phẩm
khuếch đại đặc hiệu, Beacon
probe sẽ không phát được
huỳnh quang khi nhận được
nguồn sáng kích thích vì
cấu trúc kẹp tóc của hai đầu
đã làm cho repoter gần với
quencer khiến tất cả huỳnh
quang phát từ reporter đều bị
quencher hấp phụ. Nhưng
nếu có mặt sản phẩm khuếch
đại đặc hiệu, Beacon probe
sẽ bắt cặp vào trình tự đặc
hiệu trên sợi đích của sản
phẩm khuếch đại, nhờ vậy
reporter cách xa quencher
nên reporter phát được
huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích. (3) Trong giai đoạn nhiệt độ kéo
dài, enzyme Taq polymerase không thủy giải Beacon probe mà chỉ làm tách
Beacon probe khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự
mà probe bắt cặp vào. Cuối giai đoạn kéo dài, Beacon probe tách khỏi sợi đích
và trở lại cấu trúc kẹp tóc nên không cho reporter phát được huỳnh quang nếu

nhận được nguồn sáng kích thích.
Trong kỹ thuật dùng probe lai, người ta dùng 2 probe. Probe lai 1 có đầu 3’
gắn một chất phát huỳnh quang D (donnor), và probe lai 2 có đầu 5’ gắn một
chất phát huỳnh quang A (acceptor). Để tránh không cho probe lai 2 này có
thể kéo dài khi nó bắt cặp lên sợi khuôn, người ta thường gắn thêm một gốc
phosphate ở đầu 3’. Hai probe lai này được thiết kế sao cho khi bắt cặp trên
sợi khuôn thì đầu 3’ của probe lai 1 chỉ cách đầu 5’ của probe lai 2 khoảng từ
3-5 bases, ngoài ra phải chọn D và A sao cho huỳnh quang từ D phát ra có độ
dài sóng trùng với nguồn sáng kích thích của A để làm cho A phát ra được
Hình
7:
Tóm tắt cơ chế họat động của Beacon
probe trong real-time PCR
R

Q

R Q
Khi không có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, ở giai đọan nhiệt độ
bắt cặp, Beacon probe sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được
nguồn sáng kích thích vì cấu trúc chân tóc của hai đầu đã làm cho
repoter gần với quencher khiến tất cả huỳnh quang phát từ reporter đều
bị quencher hấp phụ.
Khi có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp,
Beacon probe bắt cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi đích của sản phẩm
khuếch đại, nhờ vậy reporter cách xa quencher nên reporter phát được
huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích.
R Q

Cu
ối giai đọan kéo d
ài, Beacon probe tách kh
ỏi sợi đích v
à tr
ở lại cấu
trúch chân tóc nên không cho reporter không được hùynh quang nếu
nhận được nguồn sáng kích thích
R
Q
Trong giai đ
ọa
n nhi
ệt độ kéo d
ài, enzyme Taq polymerase đư
ợc sử dụng
không thủy giải Beacon probe mà chỉ làm tách Beacon probe khỏi sợi
đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt
c
ặp v
ào.



12

huỳnh quang có độ dài sóng khác biệt với
huỳnh quang phát ra từ D. Để hệ thống hoạt
động được thì thiết bị real-time phải phát
được nguồn sáng kích thích D, nhưng CCD

hay cảm quang phải có kính lọc để chỉ ghi
nhận huỳnh quang phát ra từ A chứ không
phải từ D. Cơ chế hoạt động của hybridization
probes được tóm tắt như sau: Ở giai đoạn
nhiệt độ bắt cặp, nếu không có sản phẩm
khuếch đại đặc hiệu thì D của probe lai 1 phát
huỳnh quang do nhận được nguồn sáng kích
thích, nhưng thiết bị real-time không ghi nhận
được huỳnh quang này vì bước sóng phát ra
từ D không đi qua được kính lọc để đến CCD
camera hay cảm quang. Nếu có sản phẩm
khuếch đại hiện diện thì probe lai 1 và probe
lai 2 bắt cặp được vào sợi khuôn, do vậy mà
huỳnh quang phát ra từ D sẽ là nguồn sáng
kích thích A, làm cho A phát huỳnh quang và
thiết bị real-time sẽ ghi nhận được huỳnh
quang này nếu lượng sản phẩm khuếch đại đạt
đủ ngưỡng để huỳnh quang phát ra từ A qua
được kính lọc để đến được CCD camera hay
cảm quang của thiết bị real-time. Cơ chế hoạt động của probe lai như vậy nên
kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật FRET real-time (Fluorescence Resonance
Energy Transfer)
[9]
.
Khi phân tích một đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) sau khi
hoàn tất được các chu kỳ nhiệt, chúng ta sẽ thấy một thông số hết sức quan
trọng luôn đi kèm với nó, đó là chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle). Chu kỳ
ngưỡng hay Ct là
chu kỳ nhiệt mà ở
tại thời điểm này

thiết bị real-time
ghi nhận được tín
hiệu huỳnh quang
phát ra từ ống
phản ứng bắt đầu
vượt qua cường độ
huỳnh quang nền.
Để có thể xác định
được cường độ
huỳnh quang nền,
thiết bị real-time
thường ghi nhận
cường độ tín hiệu
huỳnh quang xuất
Hì
nh
9
: Biển đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ
huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sánh kích thích ở mỗi
chu kỳ nhiệt
Giai đo
ạn ủ

Giai đo
ạn lũy thừa

Giai đo
ạn b
ình nguyên

Đường nền (base line)
Cường độ huỳnh quang nền
Cường độ huỳnh quang
Đư
ờng biểu diễn

khuếch đại
5 1
0

1
5

2
0

2
5

3
0

3
5
Chu kỳ ngưỡng (Ct)
Chu k
ỳ nhiệt

Chu kỳ nền
Hình 8: Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe lai

trong r
eal
-
time PCR

Khi chưa có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, huỳnh quang
phát ra từ D của probe lai 1 không kích thích được A của
probe lai 2 vì chúng ở cách xa nhau
D

A

Khi có m
ặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Probe lai 1 v
à probe lai
2 bắt cặp lên sợi khuôn làm cho D rất gần A nên huỳnh quang phát
ra từ D (có bước sóng trùng với bước sóng nguồn sáng kích thích
của A) sẽ được A hấp phụ rồi chuyển sang phát huỳnh quang với
bước sóng khác biệt với bước sóng phát huỳnh quang của D
A

D

D
A

D A
Trong g
iai đo

ạn kéo d
ài,
Taq polymerase
vì không có ho
ạt
tính 5’-3’ exonuclease nên sẽ tách các probe lai 1 rồi probe
lai 2 khỏi sợi khuôn, do vậy là A tách rời D nên D không còn
nhận được buồn sáng kích thích từ D nữa và A sẽ không còn


13

hiện trong ống phản ứng trong một số chu kỳ đầu, chúng ta gọi là các chu kỳ
nền (basal cycle), và lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này
làm cường độ huỳnh quang nền. Đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh
quang nền này được gọi là đường nền (base line). Chu kỳ ngưỡng là trị số
được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biển diễn
khuếch đại. Do được tính toán như vậy nên chu kỳ ngưỡng thường là một số lẻ
(ví dụ: Ct = 28.35) chứ ít khi là một số chẵn. Có những ống phản ứng có Ct
sớm và cũng có những ống phản ứng có Ct xuất hiện muộn hơn, và câu hỏi
được đặt ra là lý do nào đã làm được như vậy? Câu trả lời chính xác là do số
lượng bản DNA đích ban đầu (starting quantity, Sq) có trong ống phản ứng
nhiều hay ít. Nếu
trong ống phản ứng
số lượng DNA đích
nhiều thì sẽ cần ít chu
kỳ nhiệt hơn để đạt
đến số lượng bản sao
đủ để ống phản ứng
cho được tín hiệu

huỳnh quang mà máy
sẽ ghi nhận được, còn
nếu số lượng DNA
đích ít hơn thì cần
nhiều chu kỳ nhiệt
hơn. Đây chính là
một đặc điểm vượt
trội của real-time
PCR so với PCR cổ điển, vì nhờ dựa vào đặc điểm này mà người làm thí
nghiệm xác định được số copies của tác nhân đích có trong mẫu thử, một
thông số mà PCR cổ điển không thể nào làm để có được kết quả chính xác.
Tuy nhiên để real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban
đầu có trong mẫu thử, người làm thí nghiệm phải thực hiện real-time PCR các
mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng
lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng,
và thường thì các mẫu chuẩn là các mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10
chứa số lượng DNA đích ban đầu. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt của real-
time PCR, trên biểu đồ khuếch đại, các mẫu chuẩn và các mẫu thử sẽ có các
đường biểu diễn khuếch đại của nó và tương ứng với các đường biểu diễn
khuếch đại này, các mẫu chuẩn và mẫu thử đều có một chu kỳ ngưỡng (Ct).
Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản
DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn được gọi là đường biểu diễn chuẩn
(standard curve). Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ
xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn trên trục
tung) và chu kỳ ngưỡng của ống phản ứng chứa số lượng bản DNA đích này.
Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct còn trục hoành (X) là số lượng bản
DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn. Do các mẫu chuẩn thường được
pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10, nên số lượng bản DNA đích trong các
Đường biểu diễn khuếch
đại của các mẫu chuẩn

Đường biểu diễn khuếch
đại của các mẫu thử
Hình 1
0
: Biểu đồ khuếch đại vẽ lên các đường biểu diễn khuếch đại
của các mẫu thử và các mẫu chuẩn