SỬ DỤNG HẠT NHÂN TẠO CÂY HOA CÚC (Chrysanthemum morifolium L.) LÀM VẬT LIỆU BAN ĐẦU CHO CHIẾU XẠ TẠO ĐỘT BIẾN

1
SỬ DỤNG HẠT NHÂN TẠO CÂY HOA CÚC (Chrysanthemum morifolium L.)
LÀM VẬT LIỆU BAN ĐẦU CHO CHIẾU XẠ TẠO ĐỘT BIẾN

LÊ TIẾN THÀNH, NGUYỄN TƯỜNG MIÊN, HUỲNH THỊ TRƯNG, LÊ NGỌC TRIỆU

Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp
13 Đinh Tiên Hoàng – Đà Lạt, Email:
Tóm tắt: Trong chọn tạo giống đột biến cây trồng, một số vật liệu in vitro ban đầu thông
thường như cây in vitro, callus, cụm chồi …. thường khó đáp ứng cho quá trình vận
chuyển và bảo quản. Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng tia X để chiếu xạ hạt nhân tạo
cây hoa cúc giống Art trắng (Chrysanthemum morifolium L.) nhằm phát triển phương
pháp mới khắc phục cho các nhược điểm vật liệu in vitro nói trên. Hạt nhân tạo từ đỉnh
sinh trưởng cây hoa cúc Art trắng in vitro 3 – 4 tuần tuổi, kích thước 3 – 5 mm sử dụng
môi trường tạo hạt là MS + 30 g/l saccrose + sodium alginate 3% được dùng làm vật liệu
cho chiếu xạ. Qua thực nghiệm 10 liều chiếu tia X (0, 10, 20,…, 100 Gy),

LD
50
xác định
được là 55 Gy, được sử dụng làm cơ sở cho chiếu xạ tạo đột biến. Khảo sát các liều chiếu
tia X: 0, 10, 20, 30, 40, 50 Gy với số lượng hạt 100 hạt/liều, tái sinh cây in vitro, sau đó
trồng cây trên đồng ruộng lần lượt phát hiện được 1, 7, 3, 1 và 1 thể đột biến tương ứng
với các liều chiếu 10 Gy; 20 Gy; 30 Gy; 40 Gy và 50 Gy. Kết quả nghiên cứu cho thấy
hạt nhân tạo có thể sử dụng làm vật liệu cho chiếu xạ phục vụ công tác tạo giống đột biến
trên hoa cúc nói riêng và mở ra tiềm năng ứng dụng trên các đối tượng khác.
Từ khóa: hạt nhân tạo, đột biến, in vitro, callus, thể đột biến.
I. MỞ ĐẦU
Hoa cúc là loại hoa cắt cành đẹp, đa dạng về màu sắc, bền, dễ bảo quản và vận chuyển
trong thương mại. Đây là một trong những sản phẩm hoa cắt cành có giá trị nhất trên thị trường

hoa tươi thế giới và Việt Nam. Tại Đà Lạt - vùng trồng hoa công nghệ cao trọng điểm ở nước ta,
hoa cúc có đến khoảng 70 chủng khác nhau, chủ yếu là các giống nhập nội khá đa dạng về màu
sắc và hình thái. Tuy nhiên, hiện nay thị trường vẫn thường xuyên có nhu cầu về những chủng
hoa cúc mới có màu sắc, kết cấu đa dạng hơn và đặc biệt là những giống mới có được bản quyền
để phục cho hướng xuất khẩu.
Ngày nay, chọn giống đột biến bằng bức xạ đã được sử dụng nhiều trên thế giới và Việt
Nam. Để chiếu xạ người ta sử dụng nhiều dạng vật liệu khác nhau, đối với cây nhân giống vô tính
các nhà chọn giống thường sử dụng vật liệu là dạng in vitro để có thể rút ngắn thời gian chọn
giống, dễ dàng tách thể khảm sau một vài chu kỳ nuôi cấy (Nguyễn Tiến Thịnh, 2006). Trong
nghiên cứu này chúng tôi ứng dụng kỹ thuật tạo hạt nhân tạo làm vật liệu đầu vào cho quá
trình chiếu xạ bằng tia X nhằm thuận tiện trong việc vận chuyển, bảo quản trong thời gian
thích hợp trước và sau khi chiếu xạ cũng như dễ thao tác chiếu xạ trên đối tượng cây hoa cúc
giống Art trắng (Chrysanthemum morifolium L.), qua đó xây dựng cơ sở để ứng dụng hạt
nhân tạo trong công tác chiếu xạ tạo đột biến về sau.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu:
Từ cây hoa cúc Art trắng in vitro, tiến hành tạo hạt nhân tạo theo qui trình tạm thời của
Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp (CANTI) như sau:

2
Bước 1: Cắt các chồi ngọn cây hoa cúc Art trắng in vitro 3 – 4 tuần tuổi có kích thước từ 3 –
5mm cho vào cốc chứa dung dịch MS (không chứa CaCl
2
) + 3% sodium alginate + 30g/l
saccrose (gọi tắt là dung dịch alginate), pH 5,6 – 5,8 (dung dịch đã được hấp khử trùng).
Bước 2: Dùng pipet nhựa nòng lớn (đường kính đầu ống 5mm) hút dung dịch alginate và
chồi ngọn vừa cắt, nhỏ vào 1 cốc chứa dung dịch CaCl
2
100 mM; hạt sẽ tạo thành trong dung
dịch này, ngâm hạt sau khoảng thời gian 10 – 15 phút.

Bước 3: Sau khoảng thời gian từ 10 – 15 phút ngâm hạt, gắp hạt ra và rửa nhanh bằng
nước cất vô trùng.
Bước 4: Hạt rửa xong gắp ra tập giấy thấm (đã hấp vô trùng) để thấm nước trên bề mặt
hạt, sau đó gắp hạt vào những bịch nylon nhỏ (đã hấp vô trùng) 20 hạt/bịch, gấp miệng bịch
và dán kín.
Bước 5: Tùy mục đích có thể sử dụng hạt ngay hoặc bảo quản trong thời gian: 2 tháng ở
4 – 10
0
C, 6 tháng ở 2 – 4
0
C.
Tất cả các thao tác từ bước 1 đến bước 4 đều được thực hiện trong tủ cấy mô thực vật
chuyên dụng.
2. Phương pháp nghiên cứu:
Hạt nhân tạo sau khi tạo xong mang sang Nhật và được bảo quản trong điều kiện nhiệt
độ thấp 4 – 10
0
C sau 20 ngày được tiến hành chiếu xạ trên thiết bị máy chiếu tia X (Hitachi
MBR-1520R-3) của Trung tâm nghiên cứu năng lượng Wakasa Wan Nhật Bản (Wakasa Wan
Energy Research Centre – WERC) các liều chiếu: 10 Gy, 20 Gy, 30 Gy … 100 Gy, với suất liều
0,73 Gy/phút, số lượng 100 hạt/liều chiếu, làm lặp lại 3 lần. Hạt sau chiếu xạ được bảo quản
trong điều kiện nhiệt độ thấp 4 – 10
0
C 10 ngày, sau đó hạt được gieo trong điều kiện in vitro
trên môi trường MS nhằm xác định tỉ lệ cây tái sinh, thông qua đó xác định được LD
50
. Các
thực nghiệm này được tiến hành tại WERC vào tháng 05/2009.
Theo quy trình tổng quát cho việc chọn liều chiếu của CANTI, nhằm thu nhận các đột biến
bền, chúng tôi thiết lập việc chiếu xạ trên thiết bị máy chiếu tia X ở các liều 2/10 LD

50
, 4/10
LD
50
, 6/10 LD
50
, 8/10 LD
50
, 1 LD
50
với suất liều 0,73 Gy/phút. Mỗi thực nghiệm chiếu xạ như
vậy được tiến hành với 100 hạt nhân tạo.
Hạt nhân tạo sau khi tạo xong mang sang Nhật và được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ 4
– 10
0
C sau 20 ngày được tiến hành chiếu xạ trên thiết bị máy chiếu tia X. Hạt sau chiếu xạ
được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thấp 4 – 10
0
C trong 3 ngày, sau đó chúng tôi mang hạt
về Việt Nam và tái sinh cây từ hạt nhân tạo trong điều kiện in vitro trên môi trường MS. Cây tái
sinh từ hạt nhân tạo sau chiếu xạ được nhân nhanh trong điều kiện in vitro để tạo ra số lượng
200 cây/liều chiếu. Việc chiếu xạ thực hiện tại WERC, tái sinh và nhân cây được thực hiện tại
phòng thí nghiệm của CANTI vào tháng 11/2009.
Cây in vitro sau 30 ngày cấy trên môi trường ra rễ (môi trường MS không bổ sung chất
kích thích sinh trưởng) có chiều cao từ 1,6 cm trở lên đem ra tập nắng trong điều kiện vườn
ươm (ánh sáng tán xạ bằng 75% ánh sáng tự nhiên) 1 tuần với số lượng 200 cây/liều chiếu,
sau đó ra cây trên giá thể hỗn hợp (được xử lý bằng formon 5%) theo tỉ lệ đất: xơ dừa: phân
bò mục = 3:1:1; tưới, phun thuốc trừ sâu bệnh định kì, chiếu điện bổ sung vào ban đêm 6
giờ/đêm.
Sàng lọc đột biến ở mức độ kiểu hình (phenotypically mutants): theo dõi sự sinh trưởng

và phát triển của các lô thí nghiệm trên đồng ruộng. Ghi nhận các đặc điểm khác biệt về hình thái
của cây hình thành từ các hạt nhân tạo đã được chiếu xạ so với các cây trong lô đối chứng nhằm

3
phát hiện ra các thể đột biến. Tỉ lệ sống, chết của cây trong toàn bộ quá trình thí nghiệm (từ khi
ra cây trong vườn ươm đến hết thời gian nở hoa) cũng được theo dõi, ghi nhận.
Xử lý số liệu: số liệu được xử lý bằng phần mềm Exell 2007.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Chiếu xạ xác định LD
50
tại WERC:
LD
50
của hạt nhân tạo hoa cúc Art trắng được xác định thông qua dữ liệu ghi nhận trong
bảng sau:
Bảng 1: Ảnh hưởng của liều chiếu lên tỷ lệ sống tại thời điểm 30 ngày của hạt nhân tạo
thuộc loài Chrysanthemum morifolium invitro trên hệ thiết bị máy phát tia X
(tái sinh cây tại Viện Wakasa Wan – Nhật Bản)
Liều chiếu (Gy)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tỷ lệ sống (%) lần 1
100

98 90 85 70 53 40 19 4 0 0
Tỷ lệ sống (%) lần 2
100

97 92 83 63 52 38 17 6 0 0
Tỷ lệ sống (%) lần 3

100

97 90 86 65 50 37 19 3 0 0
Tỷ lệ sống (%) trung bình

100

97,3

90,6

84,6

66,0

51,6

38,3

18,3

4,3

0,0

0,0
Qua bảng số liệu trên, chúng tôi nhận thấy khi chiếu tia X với vật liệu hạt nhân tạo cây
hoa cúc Art trắng in vitro thì tỉ lệ sống của hạt nhân tạo giảm dần khi liều chiếu tăng, ở liều
chiếu 90 Gy và 100 Gy thì 100% hạt nhân tạo đều hoá nâu và chết. Tiến hành vẽ biểu đồ
tương quan giữa tỉ lệ sống của hạt nhân tạo và liều chiếu tia X, căn cứ vào biểu đồ chúng tôi

đã xác định được liều LD
50
cho vật liệu hạt nhân tạo chủng Art trắng của loài Chrysanthemum
morifolium trên thiết bị máy chiếu tia X tương đương với khoảng 55Gy.

Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của liều chiếu lên tỷ lệ sống của hạt nhân tạo thuộc loài Chrysanthemum
morifolium trên hệ thiết bị Máy phát tia X
Từ đó, các liều chiếu xạ tia X để bố trí cho việc chiếu xạ để sàng lọc đột biến tại Việt
Nam được xác định là 10Gy, 20Gy, 30Gy, 40Gy và 50Gy.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

0
10
20
30
40
50
60
70
80

90
100

Liều chiếu (Gy)
T
ỉ lệ sống (%)
Tương quan t
ỷ lệ sống của hạt nhân tạo
Chrysanthemum
và
liều chiếu Xray

4
2. Kết quả tái sinh và nhân cây từ hạt nhân tạo sau chiếu xạ tại CANTI:
Kết quả tái sinh cây in vitro sau 30 ngày từ vật liệu qua chiếu xạ tia X ở các liều chiếu
10Gy, 20Gy, 30Gy, 40Gy và 50Gy như sau:
Bảng 2: Ảnh hưởng của liều chiếu lên tỷ lệ sống tại thời điểm 30 ngày của cây hoa cúc Art trắng
in vitro được tái sinh từ hạt nhân tạo trên hệ thiết bị máy phát tia X (tái sinh cây tại CANTI)
Liều chiếu (Gy) 0 (Đối chứng)

10 20 30 40 50
Tỷ lệ sống (%) 100 97 92 82 61 49
Chiều cao TB (cm)

4,94 4,98

4,46

4,44

2,73

1,67

Kết quả này cũng tương đồng với kết quả các thí nghiệm xác định LD
50
khi liều chiếu
xạ tăng thì tỉ lệ hạt sống giảm. Kết quả khảo sát về chiều cao cây sau 30 ngày cho thấy không
chỉ sức sống mà hình thái cây tái sinh in vitro cũng chịu ảnh hưởng bởi tác động của tia X
theo chiều hướng tỷ lệ nghịch. Sử dụng phương pháp cắt đốt (microcutting) để nhân nhanh
tạo ra số lượng cây 200cây/liều chiếu.
3. Trồng thể nghiệm để chọn lọc đột biến ở mức độ kiểu hình
Tỉ lệ sống của cây trên đồng ruộng được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3: Ảnh hưởng của liều chiếu lên tỷ lệ sống của cây trên ruộng
Liều chiếu (Gy) 0 10 20 30 40 50
Tỷ lệ sống (%) sau 30 ngày trong vườn ươm 85,0

80,0

83,0

76,0

35,0

24,0

Tỷ lệ sống (%) cho toàn bộ thí nghiệm trên ruộng

82,0

80,0

82,5

74,0

31,0

21,5

Kết quả thực nghiệm ra cây in vitro bước đầu cũng cho thấy sức sống của các cây ở liều
chiếu 10Gy, 20Gy là không khác biệt so với cây tái sinh từ hạt đối chứng, cây tái sinh từ hạt
nhân tạo ở liều chiếu 40Gy và 50Gy tỉ lệ cây sống giảm rõ rệt, như vậy với hai liều chiếu
40Gy và 50Gy ảnh hưởng khá mạnh đến tỷ lệ sống của vật liệu khi trồng ra đồng chính do các
cá thể bị sai hỏng bộ máy di truyền quá nhiều dẫn đến mất sức sống quá cao. Qua các số liệu
cũng cho thấy cây chết nhiều tập trung trong giai đoạn vườn ươm.
Cây con sau thời gian 30 ngày cứng cáp có bộ rễ khoẻ chúng tôi đưa trồng trên đồng
ruộng và chăm sóc theo quy trình tạm thời của CANTI. Theo dõi quá trình phát triển của cây
trên đồng ruộng, sau khi trồng 85 – 96 ngày cây nở bông cho các đặc điểm sau:
Bảng 4: Các kiểu biến dị kiểu hình của cây hoa cúc Art trắng sau khi chiếu xạ bằng hạt nhân tạo
STT

Đặc điểm sai
khác
S
ố cây biến dị

Ghi chú
Đ/C

10Gy

20Gy

30Gy

40Gy

50Gy

1 Màu sắc lá 0 0 0 0 01 0 Khảm bạch tạng
2
Hình d
ạng, cấu
trúc hoa
0 0 02 0 0 0
Hoa
méo mó, đài hoa bó
nụ không nở
3 Màu sắc hoa 0 01 05 03 0 01
Các
ph
ổ m
àu vàng, vàng
xanh
Tần số đột biến (%) 0 0,5 3,5 1,5 0,5 0,5
Qua bảng cho thấy: tia X tác động lên khả năng sản sinh đột biến kiểu hình theo quy
luật chung: nếu tác động của bức xạ lên vật liệu ban đầu thấp thì tỷ lệ sống của vật liệu sau

5
chiếu xạ sẽ cao nhưng tỷ lệ đột biến thấp; nếu tác động của bức xạ lên vật liệu ban đầu cao thì
vật liệu sau chiếu xạ có tỷ lệ sống thấp tuy nhiên tỷ lệ đột biến cũng thấp, ở một dải liều chiếu
xạ vừa phải, tỷ lệ sống của vật liệu sau chiếu xạ ở mức trung bình nhưng khả năng thu nhận
được đột biến sẽ cao hơn. Quy luật đó thể hiện ngay trong dải liều được áp dụng để chiếu xạ
(10 – 50Gy) trong nghiên cứu này.
Từ 13 thể đột biến vừa chọn được chúng tôi xác định có 2 thể tiềm năng có thể phục
vụ cho quá trình chọn giống tiếp theo bởi đây là thể đột biến toàn phần về màu cánh hoa và
màu mới tạo ra là đẹp và khác lạ so với đối chứng đó là:
- Thể đột biến ở liều 20Gy có đặc điểm: Xuất hiện cụm hoa có cấu trúc lạ và đẹp, cánh
hoa có cấu trúc đều vào vùng trung tâm hoa, có 1 phần cánh hoa nhỏ không đều nhau, các lá
đài có xu hướng xen vào các cánh hoa. Nhìn chung hoa có cấu trúc giống như hoa thược
dược, hoa chuyển màu vàng tươi
- Thể độ biến ở liều 50Gy có đặc điểm: Hoa chuyển màu vàng, cánh hoa nở không đều,
một số cánh có kích thước nhỏ trong khi các cánh hoa khác lớn hơn.
Chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu để nhân giống in vitro và in vivo hai thể biến dị này
với mục đích tiếp tục khảo sát về mặt di truyền cũng như trồng trọt để xác định độ phân li của
chúng ở các thế hệ sau.

IV. KẾT LUẬN
- Có thể sử dụng hạt nhân tạo với “phôi hạt” là chồi đỉnh cây hoa cúc in vitro làm vật
liệu chiếu xạ.


Hình
ảnh một số đột biến kiểu h
ình sàng l
ọc đ
ư
ợc sau khi chiếu xạ tia X chủng Art trắng :
(a) chủng gốc Art trắng; (b) thể đột biến màu vàng ở liều chiếu tia X 20Gy; (c) thể đột biến
màu vàng ở liều chiếu tia X 50Gy; (d) thể đột biến có sọc vàng ở liều chiếu tia X 20Gy; (e) thể
đột biến cánh hoa ngả vàng ở liều chiếu tia X 10Gy ; thể đột biến lá bạch tạng ở liều chiếu tia
X 10Gy



(a)

(b) (c)
(d)

(e)

(f)

6

- Liều LD
50
đối với vật liệu hạt nhân tạo cây hoa cúc Art trắng in vitro chiếu xạ bằng
máy phát tia X tương đương với khoảng 55Gy.
- Thông qua tỷ lệ đột biến kiểu hình và tỷ lệ sống, liều chiếu 20Gy và 30Gy bằng tia X
tỏ ra có hiệu quả hơn trong việc sản sinh đột biến.
- Bước đầu tạo được một số thể biến dị kiểu hình có màu sắc khác biệt so với giống gốc
từ chiếu xạ bằng máy phát tia X có tiềm năng phát triển giống.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Amano E (2004). Practical suggestions for mutation breeding, Mutation breeding Manual,
Forum for nuclear cooperation in Asia (FNCA)
[2] Arunyanart S, Soontronyatare, Mutation induction by gamma and X-ray irradiation in tissue
cultured lotus, Plant cell, Tiss Org Cult 70, pp.119-122.2002.
[3] Đào Thanh Bằng, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Thị Phương Đoài, Lê Thị Liễu, Nguyễn
Phạm Hùng, Chiếu xạ in vitro một phương pháp hiệu quả để chọn tạo giống hoa cúc, Tuyển tập
báo cáo hội nghị khoa học và công nghệ hạt nhân toàn quốc lần thứ IX, NXB khoa học và kỹ
thuật, trang 750-758.2011.
[4] Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh, Kết quả tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống
cúc bằng đột biến thực nghiệm, Báo cáo khoa học Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003
(cuốn 2), trang 976-980.2003.
[5] Mandal AKA, Chakrabarty D, Datta SK, Application of in vitro techniques in mutation
breeding of Chrysanthemum, Plant Cell, Tiss Org Cult 60, pp.33-38.2004.
[6] Nguyễn Tiến Thịnh, Lê Văn Thức, Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong phân lập đột biến ở
cây trồng nhân giống sinh dưỡng, Hội nghị khoa học- Công nghệ sinh học thực vật trong công
tác nhân giống và chọn tạo giống hoa, NXB Nông nghiệp, trang 155-160.2006.

USING ARTIFICIAL SEEDS OF CHRYSANTHEMUM (Chrysanthemum
morifolium L.) AS INPUT MATERIAL FOR IRRADIATION
TO INDUCE MUTANTS

THANH LE TIEN, MIEN NGUYEN TUONG, TRUNG HUYNH THI, TRIEU LE NGOC

Centre for Application nuclear techniques in industry
13st Dinh Tien Hoang – Da Lat , Email:

Abstract: In mutation breeding, it is often difficult to transport and maintain with the ordinary
in vitro input materials like in vitro plantlets, callus, protocorms, etc. In this study, we
developed a new method to solve the above-mentioned disadvantage of the ordinary materials
by using the artificial seed of White Art Chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium L.) to
irradiate by X Ray. Artificial seed was made from the 3-4 week age in vitro plantlet’s the 3 –
5mm meristems as embryo with the cover of seed included Morashige and Shook basal medium
containing 30 g/l saccrose and Na-alginate 3%. They were irradiated X-Ray with the doses of 0,
10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100Gy to induce mutation, the results showed LD
50
to be 55
Gy. Investigation effects of X ray irradiation on transplanted plants from irradiated seeds using
doses of 0, 10, 20, 30, 40, 50 Gy with 100 artificial seeds per dose. After multiplication of
plants by in vitro technique and screening on farm, we achieved 1, 7, 3, 1 and 1 mutants
respectively corresponding with doses of 10, 20, 30, 40 and 50 Gy. The result of this research

7
proves that artificial seeds can be able to use as input material for irradiation to induce the
mutants in Chrysanthemum and opens up the expansive potential to apply for other objects.