PHÂN LẬP GEN LTP Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG
KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG






ĐỀ TÀI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ĐỀ TÀI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
PHÂN LẬP GEN LTP Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH
CÓ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN KHÁC NHAU
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Lệ
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2012
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
NỘI DUNG BÁO CÁO
NỘI DUNG BÁO CÁO
1. MỞ ĐẦU
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
M Đ UỞ Ầ
M Đ UỞ Ầ

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
-
Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek): kinh tế và dinh
dưỡng
-
Cải tạo đất
-
Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cây đậu
xanh.
-
Việc chọn các giống chịu hạn và nâng cao tính chịu hạn
của cây đậu xanh là vấn đề cần thiết.
- Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính chịu hạn
của cây trồng rất phức tạp do nhiều gen quy định, trong
đó có gen LTP (Lipid Transfer Protein)
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
M Đ UỞ Ầ
M Đ UỞ Ầ
- LTP tham gia vào quá trình sinh tổng hợp biểu bì ở
thực vật giúp hạn chế sự mất nước trong điều kiện khô
hạn.
- Gen LTP điều khiển và tổng hợp nên protein tương ứng
tham gia xúc tác sự vận chuyển phospholipid giữa các
lớp màng tế bào, hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc
lớp biểu bì giúp cây hạn chế mất nước.
- Nhằm xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng
chịu hạn ở gen LTP nên chúng tôi tiến hành đề tài
“Phân lập gen LTP ở hai giống đậu xanh có khả
năng chịu hạn khác nhau”.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

MỞ ĐẦU
MỞ ĐẦU
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Phân lập gen LTP ở hai giống đậu xanh địa phương có
khả chịu hạn khác nhau từ genome.
1.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tách DNA tổng số từ lá non của hai giống đậu xanh TS
(Tân Sơn) và BK (Bắc Kạn).
- Khuếch đại gen LTP bằng phản ứng PCR với cặp mồi
đặc hiệu.
- Tách plasmid tái tổ hợp mang gen LTP ở hai giống đậu
xanh TS và BK.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
-
Hai giống đậu xanh địa phương Tân Sơn (TS) và Bắc
Kạn (BK)

TS
BK
Hình 2.1. Hình ảnh hai giống đậu xanh TS va BK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp tách DNA trực tiếp từ lá non đậu

xanh (theo Gawel và Jarret, 1991)
2.2.2. Khuếch đại gen LTP đặc hiệu bằng phản ứng PCR
(theo Mullis và cs, 1985)
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi khuếch đại gen LTP
Gen Cặp mồi Trình tự mồi Kích thước sản
phẩm PCR (bp)
LTP LTP – F
LTP – R
ATGGCTAGCCTGAATGTTGC
TTACTTGATGTTAGCGCAGTT
350
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
CỨU
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước khử ion 11
2 PCR Buffer (10X) 2,5
3 MgCl
2
(25 mM) 2,5
4 DNTP
S
(25 mM) 2
5 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2
6 Mồi ngược (10 pM/µl) 2
7 DNA khuôn (50 ng/µl) 2

8 Taq polymerase (unit/µl) 1
9 Tổng thể tích 25
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
CỨU
Các bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng
1 94
0
C 3 phút 1 Biến tính
2 94
0
C
52
0
C
72
0
C
30 giây
1 phút
1 phút
30
Biến tính
Gắn mồi
Tổng hợp chuỗi

3 72
o
C 10 phút 1 Tổng hợp chuỗi
4 4
0
C
∞
Ổn định mẫu
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Thôi gel bằng bộ kit của hãng Bioneer
2.2.4. Tách dòng gen LTP
Quy trình tách dòng gen được thực hiện như sau:

Gắn gen LTP vào vector tạo dòng pBT
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR
Hình 2.2. Sơ đồ tách dòng gen LTP ở đậu xanh
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn


2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Buffer T4 ligase (10X) 2
2 DNA 6
3 Vector pBT 1
4 Enzyme T4 ligase (2 unit/ µl) 1
5 Nước khử ion 10
Tổng thể tích 20,0
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT
Lai ở 22
0
C trong 1,5 giờ tạo vector tái tổ hợp
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
CỨU
2.2. PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng
E.coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp ở 42
0
C
đúng 1 phút.
- Nuôi khuẩn: Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong
môi trường LB lỏng, có bổ sung ampicilin, qua đêm.
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng.
2.2.5. Tách plasmid tái tổ hợp bằng bộ kít của hãng
Bioneer.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TÁCH DNA TRỰC TIẾP TỪ LÁ
NON ĐẬU XANH
1 2
1.TS, 2. BK
Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số của hai giống đậu xanh TS và BK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI GEN LTP BẰNG
PHẢN ỨNG PCR
M 1 2
←350 bp
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LTP của hai giống
đậu xanh TS và BK
M. Marker 1kb; 1. TS; 2. BK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. KẾT QUẢ TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR
M
1 2
← 350 bp
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kết quả thôi gel của hai giống đậu xanh TS và BK
Marker 1kb; 1. TS; 2. BK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.4. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN LTP Ở ĐẬU
XANH
M 1 2
← 350 bp
Hình 3.4. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen LTP của hai giống
đậu xanh TS và BK
Marker 1kb; 1.TS; 2. BK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. KẾT QUẢ TÁCH PLASMID TÁI TỔ HỢP

1
2
Hình 3.5. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp mang gen LTP
ở hai giống đậu xanh TS và BK
1. TS, 2. BK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
- Đã tách chiết thành công DNA tổng số từ lá non của
hai giống đậu xan TS và BK.
- Khuếch đại thành công gen LTP ở hai giống đậu xanh
TS và BK bằng phản PCR với kích thước khoảng 350
bp.
- Chọn được dòng vi khuẩn E.coli DH5α mang vector
tái tổ hợp (pBT –LTP) và tách được plasmid mang
đoạn
gen LTP ở hai giống đậu xanh TS và BK.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.2. KIẾN NGHỊ
Xác định trình tự gen LTP của các giống đậu xanh
đã
tách dòng để tìm kiếm chỉ thị phân tử liên quan đến
tính
chịu hạn của cây đậu xanh nhằm phục vụ công tác
chọn
tạo giống đậu xanh chống chịu tốt.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn