Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm

Website: Email : Tel : 0918.775.368
Đặt vấn đề
Con ngời từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hơng liệu để phục vụ
cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dợc phẩm, thực phẩm,
mỹ phẩm. Những năm qua, nhiều loại chất thơm đặc biệt đã đợc xác định rõ về
cấu tạo cũng nh tính chất hoá học, trong số đó các hợp chất -lactone là
những hợp chất tạo ra mùi thơm rất dễ chịu. Các hợp chất này đợc tìm thấy
trong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩm lên men tự
nhiên. Với giá trị tạo hơng thơm các lactone này đã đợc sử dụng để tạo ra các
loại nớc hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của các loại thực phẩmTuy
nhiên tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc khó khăn và không
mang lại hiệu quả kinh tế cao. Thực tế các -lactone đợc tổng hợp từ nguồn
nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Dầu
thầu dầu là loại nguyên liệu rất lý tởng để làm việc trên do thành phần chính
của nó là acid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệt thuận lợi cho việc tổng
hợp các lactone.
Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nớc ta rất sẵn có và rẻ tiền nhng việc
sử dụng nó cho sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật còn rất mới mẻ. Vì
vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm
men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm với các mục
tiêu sau:
- Phân lập từ tự nhiên các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu
thầu dầu thành chất thơm -decalactone.
- Tuyển chọn các chủng nấm men từ bộ su tập giống của Viện CNTP
- Tách chiết -decalactone từ môi trờng nuôi cấy nấm men và sơ bộ định
tính, định lợng bằng sắc ký khí.
1
Website: Email : Tel : 0918.775.368
phần i: Tổng quan tài liệu
1.1. Đại Cơng về nấm men
Nấm men (yeast, Levure) là tên gọi thông thờng của một nhóm nấm có vị

trí phân loại không thống nhất nhng có những đặc điểm chung sau[3]: nói
chung có tồn tại trạng thái đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi,
cũng có khi sinh sản theo lối phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men
đờng, thành tế bào có chứa mannan, thích nghi với môi trờng có chứa đờng
cao, có tính acid cao.
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trờng có
chứa đờng, có pH thấp, chẳng hạn nh trong hoa quả rau, da, mật mía, rỉ đờng,
trong đất vờn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỡ. Là vi sinh vật điển
hình cho nhóm nhân thật, nấm men có cấu tạo tế bào hoàn chỉnh gồm có:
thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân, ty thể, 1-2 không bàoKích thớc
tế bào nấm men lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, và vào khoảng 8-15 àm do
đó có thể thấy rõ dới kính hiển vi quang học. Hình thái tế bào nấm men rất đa
dạng và phong phú: hình cầu, hình trứng, hình ô van, hình elip, hình cong,
hình thoi, hình tam giác, hình thận, hình lỡi liềm, hình mũNấm men có cả
hai hình thức sinh sản hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy
chồi, phân cắt và bằng bào tử: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử bắn ở chi
Sporobolomyces, bào tử áo ở chi Candida. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi ở
các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces, và nhiều chi nấm men thuộc bộ
Endomycetales.
Nấm men thuộc loại dinh dỡng hoá năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả năng
thu nhận năng lợng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc lên men kỵ khí các hợp
chất hữu cơ ngoại bào [4]. Trong quá trình sinh sống và phát triển nấm men cần
những nguồn dinh dỡng nh: nguồn cacbon, nguồn nitrơ, các nguyên tố khoáng
và các chất sinh trởng. Đồng thời trong quá trình sinh sống nấm men cũng tổng
2
Website: Email : Tel : 0918.775.368
hợp nên các chất hữu cơ, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất mà con ngời đã và
đang sử dụng chúng để phục vụ cho đời sống của mình. Rất nhiều loại nấm men
đợc ứng dụng trong sản xuất nh: công nghiệp sản xuất rợu, bia, nớc giải khát,
sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipit nấm men, các enzym nh

amilaza, invertaza, lactaza, uricaza, sản xuất ergosterol, acid ribonucleic,
riboflavin, các acid amin nh lizin, cystein, methionin...Cũng có rất nhiều loài
nấm men đã đợc biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành -
decalacton và đã đợc sử dụng trong công nghiệp để sản xuất -decalactone nh:
Candida guilliermondii, Yarrowia lipolytica, Geotrichum klebahni [13],
Sporobolomyces odorus, Rhodotorula glutinus [11]
1.2. Dầu thầu dầu
1.2.1. Cây thầu dầu [1]
Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu
Euphorbiaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiales, còn có tên gọi khác là: đu đủ
tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hơng thét.
Hình thái: Cây sống lâu năm, thân yếu, nhng có thể cao tới 10-12m. Lá
mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng, phiến
lá hình chân vịt từ 5-9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng ca không đều.
Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gai mềm. Hạt
hình trứng hơi dẹt. Mặt hạt nhẵn bóng.
Phân bố thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt Nam,
ấn Độ, BrazinNgời ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-5, với mục đích
chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp. Ngày nay, cây thầu dầu đợc
trồng ở nhiều nơi trên thế giới.
3
Website: Email : Tel : 0918.775.368
1.2.2. Dầu thầu dầu
Dầu thầu dầu có tên thơng phẩm là Castor oil đợc tách ra từ hạt thầu dầu
bằng phơng pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly.
Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi vị
nhạt. Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam cha đợc xác định rõ
ràng, theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glycerit chung
nh stearin, palmitin còn có một một glycerit đặc biệt là ricinolein là thành
phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic). Ricinoleic

là một acid rợu béo có công thức nh sau:
Acid ricinoleic (12-hydroxy-9-octadecenoic )
Bảng 1: Thành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,10]
Acid Dầu Brazin (%)
Dầu ấn độ (%)
Ricinoleic acid 83-90,00 87,4-90,4
Linoleic 3,19-5,98 2,9-4,0
Oleic 2,96-5,64 2,5-4,0
Stearic 0,68-1,84 0,9-1,3
Palmitic 0,87-2,35 0,8-1,3
Dihydrostearic - 0,5-0,8
Encozenic - 0,6-1,6
Linoleic 0,34-0,91 0,1-1,1
Theo bảng 1 thì thành phần hoá học của dầu thầu dầu có thay đổi theo
nguồn gốc tuy nhiên thành phần chính vẫn là acid ricinoleic.
1.3. [R]- -decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng
4
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Các -lactone đợc tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó -
decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứu nhiều
nhất. -Decalactone là một lactone đợc tìm thấy lần đầu tiên trong quả đào và
một số loại hoa quả khác. -Decalactone là một ester nội phân tử của acid 4-
hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ 70-100
0
C
sẽ đóng vòng để tạo -decalactone [8].
ở điều kiện thờng -decalactone là một chất lỏng trong suốt không màu,
hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu. Nó hầu
nh không tan trong nớc nhng tan rất tốt trong rợu, dầu, ete, etyl acetat,
hexaneNó có các đặc tính hoá lý sau[7,26]:

+ Công thức phân tử: C
10
H
18
O
2
(M=170)
+ Công thức cấu tạo:
+ nhiệt độ sôi: 281
0
C
+ Tỷ trọng : 0,952
+ Mùi: Hoa quả và bơ sữa.
-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực
phẩm. Năm 1974, Uỷ ban hợp tác Châu Âu đã đa chất này vào danh sách
những hợp chất thơm tổng hợp đợc sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao
nhất từ 5 20 ppm. Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụng
trong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nớc hoa từ 20-400 ppm[23].
Trên thế giới -decalactone đợc sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác
nhau nh thực phẩm, dợc phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an toàn và mùi thơm
5
CH
3
OH
OH
O
O
O
CH
3

T o
ACID
4-HYDROXY-DECANOIC
GAMMA-DECALACTON
Website: Email : Tel : 0918.775.368
hấp dẫn đối với ngời sử dụng. Nó đợc dùng làm chất tạo hơng thơm cho thực
phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nớc hoa, sản phẩm làm mềm vải, các
chế phẩm dùng cho tóc [13]...
Trong tự nhiên, -decalactone có mặt trong một số loại hoa quả nh: mận
1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20
mg/kg...một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men. Trong phân tử
-decalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tự
nhiên ngời ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là [R]--
decalactone và [S]--decalactone. Tuy nhiên dạng đồng phân quang học R đợc
tìm thấy nhiều hơn. Ngời ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vợt trội này trong nhiều
loại quả từ các nớc khác nhau trên thế giới.
1.4. Tổng hợp -decalactone nhờ vi sinh vật [18].
-Decalactone đợc tổng hợp qua hai con đờng: tổng hợp sinh học
(biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation). Con đờng biến đổi
sinh học là con đờng chính trong công nghiệp để tổng hợp -
decalactone vì con đờng này cho năng suất cao hơn con đờng tổng hợp sinh
học.
1.4.1. Con đờng tổng hợp sinh học(biosynthetic)
Là con đờng tổng hợp -decalactone nhờ vi sinh vật trong đó không sử
dụng chất béo hay dầu mỡ. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp -
decalactone từ những hợp chất đơn giản. Berger là ngời đầu tiên đã phát hiện
ra sự có mặt của -decalactone trong môi trờng nớc thịt lên men các chủng
Basidomycetes (nấm đảm). Có rất nhiều các báo cáo khoa học về việc tổng
hợp -decalactone nhờ nấm mốc nhng nói chung sản lợng -
decalactone thu đợc rất thấp. Jourdant và cộng sự đã dùng chủng

Sporobolomyces odorus để tổng hợp -decalactone nhng hiệu suất thu đợc rất
6
Website: Email : Tel : 0918.775.368
thấp (1mg/1 liter môi trờng)Tressel và Albrecht đã đa ra ý kiến về việc sản
xuất -decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA. Tuy nhiên có
rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc sinh
lý học với tổng hợp -decalactone.
1.4.2. Con đờng biến đổi sinh học (biotransformation)
-Decalactone và những lactone khác đợc sản xuất trong công nghiệp
bằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ vi
sinh vật. acid ricinoleic đầu tiên bị biến đổi thành acid 4-hydroxy-decanoic
sau đó đóng vòng lacton để tạo ra -decalactone .
Con đờng biến đổi ricinoleic acid tạo

-decalactone
Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym hay
không cần sự xúc tác của enzym là điều cha rõ ràng. Tổng hợp -
decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy mô
công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [9,11,12,13,14, 22,
24, 26]. Những vi sinh vật đã đợc biết là có khả năng chuyển hoá acid
ricinoleic thành -decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm cả vi khuẩn,
nấm men và nấm mốc.
Bảng 2: Một số vi sinh vật đã đợc sử dụng cho sản xuất -decalacton và
một số lactone khác[9, 11, 13, 22, 25 ].
7
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Chủng VSV Năm Nguyên liệu Sản phẩm
Giống Pityrosporum:
P.canis
P.achydermatis

P.orbiculare
P.ovale
1980 Acid oleic
-decalactone
-hexa
-hepta
-octa
Aspergillus oryzae
Geotrichum klebahnii
Yarrowia lipolytica
Candida guilliermondii
Candida albicans
Candida krusei
Candida parakrusei
Candida pseudotropicals
Candida stellatoidea
Candida tropicalis
Candida rugosa
Hansenula saturnus
1982
Dầu thầu dầu
Dầu thầu dầu thuỷ
phân
Acid ricinoleic
-decalactone
Aspergillus niger
Cladosporium suaveolens
Phanerochaetechrysosporiu
m
Pichia etchellsii

1989
Dầu thầu dầu
Dầu hớngdơng
Dầu dừa
-decalactone
-octanolied
-decanolied
Sporobolomyces odorus
Rhodotorula glutinus
1990
Dầu thầu dầu
-decalactone
-hydroxy-
decanoic acid
Yarrowia lipolytica HR 145
(DSM 12397)
2001
Dầu thầu dầu
-decalactone
8
Website: Email : Tel : 0918.775.368
1.4.3. Cơ chế chuyển hoá acid ricinoleic thành -decalactone ở vi sinh vật.
Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất là qúa
trình -oxi hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase (Aox).
Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra Acetyl-CoA, chất
này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tế bào tạo năng
lợng ATP cung cấp cho hoạt động sống của VSV [2]. Quá trình này tạo ra sản
phẩm trung gian acid 4-hydroxy decanoic, nh đã biết ở trên acid này có thể
đóng vòng để tạo ra -decalactone. Yves Wache [27,28] và cộng sự đã chứng
minh hoạt động của các Aox (Aox1 đến Aox5) đợc mã hoá bởi các gen Pox1-

>Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica có liên quan đến sự tích tụ và tiêu huỷ
lactone. Trong đó gen Pox3 mã hoá enzym Aox3 ( chuỗi ngắn-short chain )
có ảnh hởng lớn nhất đến sự tổng hợp -decalactone. ở những chủng
đột biến cắt đứt gen Pox3 lợng -decalactone tạo thành tăng lên
đáng kể so với chủng hoang dã ( Từ 50mg/l lên đến 220mg/l sau 24 h ). ở các
chủng hoang dã sự tạo thành 3-hydroxy--decalactone chiếm phần lớn trong
sản phẩm thu đợc đã gợi ra suy nghĩ rằng ở chủng hoang dã quá trình -oxi
hoá chịu sự tác động của 3-hydroxy-Acyl-Coenzym A Hydrogenase.
Con đờng

-oxi hoá biến đổi methyl ricinoleate tạo -decalactone ở
nấm men Yarrowia lipolytica theo Yves Wache và cộng sự [28]:
9
Website: Email : Tel : 0918.775.368
+ Sản phẩm tạo thành:
1: Dec-3-en-4-Olide
2: -Decalactone
3: Dec-2-en-4-Olide
4: 3-hydroxy--Decalactone
5: 3-keto--Decalactone
+ Hệ enzymes:
Aox: Acyl Coezym A oxidase
Ahy: Acyl Co A Hydratase
Hdh: 3-hydroxy -Decalactone
Thi : 3keto acyl Co A thiolase.
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả
2.1. Nguyên vật liệu và phơng pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị
Dầu thầu dầu : Đợc mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công
nghiệp. Dầu ở dạng thô, đợc khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng ở

Bắc Ninh.
10
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Acid ricinoleic : Do viện Công nghiêp Thực Phẩm cung cấp
Chủng giống: 64 chủng nấm men trong bộ su tập của viện CNTP đợc
tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu.
Lá cây, đất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa
đợc lấy ở viện CNTP, vờn thực vật trờng Đại học Dợc, công viên Pasteur,
Công viên Lê-nin, Hoài Đức Hà Tây
Hoá chất :
+ Etyl acetat (Trung Quốc)
+ Agar
+ Môi trờng khô Yeast nitrogen base (Difco)
+ Dịch chiết Malt-glu 20
0
Bx
+ (NH
4
)
2
SO
4
+ n-Hecxan ( Trung Quốc)
+ -Decalactone chuẩn
+ HCL 37%
Thiết bị và dụng cụ:
+ Box cấy vô trùng Bioblock scientific ( Pháp )
+ Nồi hấp áp lực Himayamatoko (Nhật )
+ Máy lắc ống nghiệm IKA* KS 130 basic ( Nhật )
+ Máy lắc bình tam giác Lab-line ( Mỹ )

+ Máy ly tâm Universal 16 Hettich
+ Lò vi sóng LG ( Hàn Quốc )
+ Kính hiển vi quang học E clipse E 600 Nikon ( Nhật )
+ Máy sắc ký khí Aligent 6890 A/ USA
+ Đĩa petri, ống eppendoff, ống nghiệm có nắp vặn, ống fancol, pipet,
bình tam giác
11