Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm

Đặt vấn đề
Con người từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hương liệu để phục vụ
cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dược phẩm, thực
phẩm, mỹ phẩm. Những năm qua, nhiều loại chất thơm đã được xác định rõ
về cấu tạo cũng như tính chất hoá học, trong số đó các hợp chất γ-lactone là
những hợp chất tạo ra mùi thơm rất dễ chịu. Các hợp chất này được tìm thấy
trong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩm lên men
tự nhiên. Với giá trị tạo hương thơm, các lactone này đã được sử dụng để
tạo ra các loại nước hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của thực phẩm…
Tuy nhiên việc tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc khó
khăn và ít có hiệu quả kinh tế, vì vậy nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu điều
chế các hợp chất lactone này từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào quá
trình chuyển hoá của vi sinh vật. Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu là
loại nguyên liệu lý tưởng để làm việc trên do thành phần chính của nó là
acid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệt thuận lợi cho việc tổng hợp các
lactone.
Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta có rất sẵn và rẻ nhưng sử
dụng nó cho sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật còn chưa được nghiên
cứu. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các
chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất
thơm” với các mục tiêu sau:
- Phân lập từ tự nhiên và tuyển chọn trong bộ sưu tập giống các chủng
nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm γ-
decalactone.
- Tách chiết γ-decalactone từ môi trường nuôi cấy nấm men và sơ bộ
định tính, định lượng bằng sắc ký khí.
1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
1.1. Đại Cương về nấm men
Nấm men (yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm
có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có những đặc điểm chung sau[3]:

nói chung chúng thường ở trạng thái đơn bào, đa số sinh sản theo cách nảy
chồi, cũng có khi sinh sản theo lối phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng
lên men đường, thành tế bào có chứa mannan, thích nghi với môi trường có
nồng độ đường cao và có tính acid.
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường có
chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ
đường, trong đất vườn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỡ. Là vi
sinh vật thuộc nhóm nhân thật, nấm men có cấu tạo tế bào hoàn chỉnh gồm
có: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân… Kích thước tế bào nấm
men lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, và vào khoảng 2-15 µm do đó có thể
thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Hình thái tế bào nấm men rất đa dạng
và phong phú: hình cầu, hình trứng, hình ô van, hình elip, hình cong, hình
thoi, hình tam giác, hình thận, hình lưỡi liềm, hình mũ…Nấm men có cả hai
hình thức sinh sản hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi,
phân cắt và bằng bào tử: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử bắn ở chi
Sporobolomyces, bào tử áo ở chi Candida. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi
ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces, và nhiều chi nấm men thuộc
bộ Endomycetales.
Nấm men thuộc loại dinh dưỡng hoá năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả
năng thu nhận năng lượng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc lên men kỵ khí
các hợp chất hữu cơ ngoại bào [4]. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển
nấm men cần những nguồn dinh dưỡng như: nguồn cacbon thường là các loại
đường, nguồn nitơ, các nguyên tố khoáng và các chất sinh trưởng. Đồng thời
2
trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men cũng tổng hợp nên các chất
hữu cơ, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất mà con người đã và đang sử dụng
chúng để phục vụ cho đời sống của mình. Rất nhiều loại nấm men được ứng
dụng trong sản xuất như: công nghiệp sản xuất rượu, bia, nước giải khát, sinh
khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipid nấm men, các enzym như
amilase, invertase, lactase, sản xuất ergosterol, acid ribonucleic, riboflavin,

các acid amin như lyzin, cystein, methionin...Cũng có rất nhiều loài nấm men
đã được biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành γ-decalactone và
đã được sử dụng để sản xuất γ-decalactone như: Candida guilliermondii,
Yarrowia lipolytica, Geotrichum klebahni [13], Sporobolomyces odorus,
Rhodotorula glutinus [10]…
1.2. Dầu thầu dầu
1.2.1. Cây thầu dầu [1]
Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu
Euphorbiaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiales, còn có tên gọi khác là: đu đủ
tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hương thét.
Hình thái: Cây sống lâu năm, thân yếu, nhưng có thể cao tới 10-12m.
Lá mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng,
phiến lá hình chân vịt từ 5-9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng cưa
không đều. Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gai
mềm. Hạt hình trứng hơi dẹt. Mặt hạt nhẵn bóng.
Phân bố thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt
Nam, Ấn Độ, Brazin…Người ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-5, với
mục đích chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp. Ngày nay, cây thầu
dầu được trồng ở nhiều nơi trên thế giới.
1.2.2. Dầu thầu dầu
3
Dầu thầu dầu có tên thương phẩm là Castor oil được tách ra từ hạt thầu
dầu bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly.
Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi
vị nhạt. Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam chưa được xác định
rõ ràng. Theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glycerid
chung như stearin, palmitin còn có một một glycerid đặc biệt là ricinolein là
thành phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic).
Ricinoleic là một acid rượu béo có công thức như sau:
C

OH O
OH
Acid ricinoleic (12-hydroxy-9-octadecenoic )
Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu thành phần hoá học
của dầu thầu dầu và đã được công bố. Theo các tác giả C.Borch-Jensen và
G.Lakshininarayana dầu thầu dầu có thành phần hoá học như bảng1.
Bảng 1: Thành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,14]
Acid Dầu Brazin (%) Dầu ấn độ (%)
Ricinoleic acid 83-90,00 87,4-90,4
Linoleic 3,19-5,98 2,9-4,0
Oleic 2,96-5,64 2,5-4,0
Stearic 0,68-1,84 0,9-1,3
Palmitic 0,87-2,35 0,8-1,3
Dihydrostearic - 0,5-0,8
Encozenic - 0,6-1,6
Linoleic 0,34-0,91 0,1-1,1
Theo bảng 1 thì thành phần hoá học của dầu thầu dầu có sự khác biệt
theo nguồn gốc tuy nhiên thành phần chính vẫn là acid ricinoleic (chiếm 83-
90,4 %).
4
CH
3
OH
OH
O
O
O
CH
3
T o

ACID
4-HYDROXY-DECANOIC
GAMMA-DECALACTON
1.3. [R]- γ-decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng
Các γ-lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó
γ-decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứu
nhiều nhất. γ-Decalactone là một lactone được tìm thấy lần đầu tiên trong
quả đào và một số loại hoa quả khác. γ-Decalactone là một ester nội phân tử
của acid 4-hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ
70-100
0
C sẽ đóng vòng để tạo γ-decalactone [7].
Ở điều kiện thường γ-decalactone là một chất lỏng trong suốt không
màu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu.
Nó hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong rượu, dầu, ete, etyl
acetat, hexane…Nó có các đặc tính hoá lý sau [6,20]:
+ Công thức phân tử: C
10
H
18
O
2
(M=170)
+ Công thức cấu tạo:
+ nhiệt độ sôi: 281
0
C
+ Tỷ trọng : 0,952
+ Mùi: Hoa quả và bơ sữa.
γ-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực

phẩm. Năm 1974, Uỷ ban hợp tác Châu Âu đã đưa chất này vào danh sách
những hợp chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao
nhất từ 5 –20 ppm. Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụng
trong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-400
ppm[17]. Trên thế giới γ-decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công
5
nghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an
toàn và mùi thơm hấp dẫn đối với người sử dụng. Nó được dùng làm chất
tạo hương thơm cho thực phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa,
sản phẩm làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc [13]...
Trong tự nhiên, γ-decalactone có mặt trong một số loại hoa quả như:
mận 1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20
mg/kg...một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men. Trong phân tử
γ-decalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tự
nhiên người ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là
[R]-γ-decalactone và [S]-γ-decalactone. Tuy nhiên dạng đồng phân quang
học R được tìm thấy nhiều hơn. Người ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vượt
trội này trong nhiều loại quả từ các nước khác nhau trên thế giới[5].
1.4. Tổng hợp γ-decalactone nhờ vi sinh vật [15].
γ-Decalactone được tạo thành bằng hai con đường: tổng hợp sinh học
(biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation). Con đường biến đổi
sinh học là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp
γ-decalactone vì con đường này cho năng suất cao hơn con đường tổng hợp
sinh học.
1.4.1. Con đường tổng hợp sinh học(biosynthetic).
Là con đường tổng hợp γ-decalactone nhờ vi sinh vật trong đó không
sử dụng chất béo hay dầu mỡ. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp
γ-decalactone từ những hợp chất đơn giản. Berger là người đầu tiên đã phát
hiện ra sự có mặt của γ-decalactone trong môi trường nước thịt lên men bởi
các chủng Basidomycetes (nấm đảm). Có rất nhiều báo cáo khoa học về việc

tổng hợp γ-decalactone nhờ nấm mốc nhưng nói chung sản lượng
γ-decalactone thu được rất thấp. Jourdant và cộng sự đã dùng chủng
6
Sporobolomyces odorus để tổng hợp γ-decalactone nhưng chỉ thu được
1mg/1 liter môi trường…Tressel và Albrecht đã đưa ra ý kiến về việc sản
xuất γ-decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA. Tuy nhiên
có rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc
sinh lý học với tổng hợp γ-decalactone.
1.4.2. Con đường biến đổi sinh học (biotransformation)
γ-Decalactone và những lactone khác được sản xuất trong công nghiệp
bằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ
vi sinh vật. Đầu tiên acid ricinoleic bị biến đổi thành acid 4-hydroxy-
decanoic sau đó đóng vòng để tạo ra γ-decalactone .
Con đường biến đổi acid ricinoleic tạo
γ
-decalactone ở vi sinh vật.
Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym hay
không cần sự xúc tác của enzym là điều chưa rõ ràng. Tổng hợp
γ-decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy
mô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [7, 8, 10, 11,
12, 13, 16, 18, 19]. Những vi sinh vật đã được biết là có khả năng chuyển
hoá acid ricinoleic thành γ-decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm
cả vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.
Bảng 2: Một số vi sinh vật đã được sử dụng cho sản xuất γ-decalactone
và một số lactone khác[8, 10, 12, 16, 19].
7
CH
3
OH
O

OH
CH
3
O
OH
OH
CH
3
O
O
Vi sinh vËt
Acid 4-hydroxy decanoic
Acid ricinoleic
Gamma-decalactone
Năm Chủng vi sinh vật Nguyên liệu Sản phẩm
198
0
Pityrosporum canis
Pit.achydermatis
Pit.orbiculare
Pit.ovale
Acid oleic
γ-decalactone
γ-hexa
γ-hepta ..
1982 Aspergillus oryzae
Geotrichum klebahnii
Yarrowia lipolytica
Candida guilliermondii
Candida albicans

Candida krusei
Candida parakrusei
Candida pseudotropicals
Candida stellatoidea
Candida tropicalis
Candida rugosa
Hansenula saturnus
Dầu thầu dầu
Dầu thầu dầu thuỷ
phân
Acid ricinoleic
γ -decalactone
1989
Aspergillus niger
Cladosporium suaveolens
Phanerochaetechrysosporiu
m
Pichia etchellsii
Dầu thầu dầu
Dầu hướng dương
Dầu dừa
γ-decalactone
γ-octanolied
γ-decanolied
1990 Sporobolomyces odorus
Rhodotorula glutinus
Dầu thầu dầu
γ-decalactone
γ-hydroxy-
decanoic acid

2001
Yarrowia lipolytica
HR 145 (DSM 12397)
Dầu thầu dầu
γ-decalactone
1.4.3. Cơ chế chuyển hoá acid ricinoleic thành γ-decalactone ở vi sinh vật.
Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất là
qúa trình β-oxy hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase
8
(Aox). Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra Acetyl-
CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tế
bào tạo năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật [2].
Quá trình này tạo ra sản phẩm trung gian acid 4-hydroxy decanoic, như đã
biết ở trên acid này có thể đóng vòng để tạo ra γ-decalactone. Yves Wache
[21, 22] và cộng sự đã chứng minh hoạt động của các Aox (Aox1 đến Aox5)
được mã hoá bởi các gen Pox1->Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica có
liên quan đến sự tích tụ và tiêu huỷ lactone. Trong đó gen Pox3 mã hoá
enzym Aox3 (chuỗi ngắn-short chain) có ảnh hưởng lớn nhất đến sự tổng
hợp γ-decalactone. Ở những chủng đột biến cắt đứt gen Pox3 lượng
γ-decalactone tạo thành tăng lên đáng kể so với chủng hoang dã (Từ 50mg/l
lên đến 220mg/l sau 24 h). Ở các chủng hoang dã sự tạo thành 3-hydroxy-γ-
decalactone chiếm phần lớn trong sản phẩm thu được đã gợi ra suy nghĩ rằng
ở chủng hoang dã quá trình β-oxy hoá chịu sự tác động của 3-hydroxy-Acyl-
Coenzym A Hydrogenase.
9
Con đường
β
-oxy hoá biến đổi methyl ricinoleate ở nấm men Yarrowia
lipolytica theo Yves Wache và cộng sự [22]:
Sản phẩm β-oxy hoá khác

PHẦN II: Thực nghiệm và kết quả
+ Sản phẩm tạo thành:
1: Dec-3-en-4-Olide
2: γ-Decalactone
3: Dec-2-en-4-Olide
4: 3-hydroxy-γ-Decalactone
5: 3-keto-γ-Decalactone
+Hệ enzym:
Aox: Acyl CoezymA oxidase
Ahy: Acyl Co A Hydratase
Hdh: 3-hydroxy-γ-Decalactone
Thi : 3keto acyl Co A thiolase.
10
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị
• Dầu thầu dầu : Được mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công
nghiệp. Dầu ở dạng thô, được khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng
ở Bắc Ninh.
• Acid ricinoleic : Do viện Công nghiệp Thực Phẩm cung cấp
• Chủng giống: 81 chủng nấm men KFP trong bộ sưu tập của viện
CNTP được sử dụng để tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu,
chủng giống JMC2320( Yarrowia lipolytica ), chủng PDT7.
• Lá cây, đất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa
được lấy ở viện CNTP, vườn thực vật trường Đại học Dược, công viên
Pasteur, Công viên Lê-nin, Hoài Đức Hà Tây…
• Hoá chất :
+ Etyl acetat (Trung Quốc)
+ Agar
+ Môi trường khô Yeast nitrogen base (Difco)
+ Dịch chiết Malt-glu 20

0
Bx
+ (NH
4
)
2
SO
4
+ n-Hecxan ( Trung Quốc)
+ γ-Decalactone chuẩn
+ HCL 37%
• Thiết bị và dụng cụ:
+ Box cấy vô trùng Bioblock scientific ( Pháp )
+ Nồi hấp áp lực Himayamatoko (Nhật )
+ Máy lắc ống nghiệm IKA* KS 130 basic ( Nhật )
+ Máy lắc bình tam giác Lab-line ( Mỹ )
11
+ Máy ly tâm Universal 16 Hettich
+ Lò vi sóng LG ( Hàn Quốc )
+ Kính hiển vi quang học E clipse E 600 Nikon ( Nhật )
+ Máy sắc ký khí Aligent 6890 A(USA)
+ Đĩa petri, ống eppendorf, ống nghiệm có nắp vặn, ống falcon, pipet,
bình tam giác…
2.1.2. Một số môi trường sử dụng cho nghiên cứu
• Môi trường 1:
+ Chất khoáng (*) : 100 ml
+ Nguyên tố vi lượng (**) : 200 µl
+ Dịch chiết nấm men 5 % : 2 ml
+ (NH
4

)
2
SO4 : 5 g

+ Thêm nước vừa đủ : 1lit
(*) Thành phần chất khoáng (trong 1 lit)
KH
2
PO
4
: 850 mg
K
2
HPO
4
: 150 mg

MgSO
4
.7.H
2
O : 500 mg
NaCl : 100 mg
CaCl.6.H
2
O : 100 mg
(**) Thành phần nguyên tố vi lượng (trong 1 lit)
H
3
BO

3
: 500 µg
CuSO
4
.5.H
2
O : 400 µg
KI : 100 µg
FeCl
3
. 6 H
2
O : 200 µg
12
MnSO
4
.4H
2
O : 400 µg
Na
2
MoO
4
.2H
2
O : 200 µg
ZnSO
4
.7H
2

O : 400 µg
• Môi trường 2: môi trường yeast-nitrogen 10%
+ Yeast nitrogen base w/o amino acid (Difco): 6,7g
+ Nước cất vừa đủ 100 ml
Yeast nitrogen base w/o amino acid: Là môi trường khô của hãng Difco
gồm có: các acid amin, các vitamin và các muối vô cơ cần thiết cho sự phát
triển của nấm men.
• Môi trường 3:
+ Pepton 2g
+ Dầu thầu dầu 10g
+ Tween 80 20 µl
+ Nước cất vừa đủ 100 ml
• Môi trường 4:môi trường làm sạch lần một:
+ Dịch Malt –gluco 20
0
Bx : 100 ml
+ Agar : 20g
+ Nước cất vừa đủ : 1lit
Hấp ở 120
0
C/ 20 phút, sau khi để nguội tới 80
0
C bổ xung 0,1 % acid
lactic và đổ thạch đĩa.
• Môi trường 5: môi trường làm sạch lần 2
Thành phần như môi trường làm sạch lần 1 nhưng không bổ xung acid
lactic.
• Môi trường 6: môi trường phân lập và giữ giống
13