nghiên cứu đánh giá quá trình xâm nhập và biến đổi của hợp chất kị nước qua màng tế bào nấm men sinh tổng hợp lactone yarrowia lipolytica

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
oOo






HỒ THỊ THU MINH





NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP
VÀ BIẾN ĐỔI CỦA HP CHẤT KỊ NƯỚC
QUA MÀNG TẾ BÀO NẤM MEN SINH TỔNG HP
LACTONE Yarrowia lipolytica





LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa - 2014

ii


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
oOo




HỒ THỊ THU MINH




NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP
VÀ BIẾN ĐỔI CỦA HP CHẤT KỊ NƯỚC
QUA MÀNG TẾ BÀO NẤM MEN SINH TỔNG HP
LACTONE Yarrowia lipolytica

Chun ngành : CƠNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
Mã số : 60 54 01 04

LUẬN VĂN THẠC SĨ


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TẠ THỊ MINH NGỌC



Khánh Hòa – 2014


i

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.

Tác giả luận văn


Hồ Thị Thu Minh



ii

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ
nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên
cứu tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho cô: TS. Tạ Thị Minh Ngọc -

Giáo viên khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong
suốt quá trình thực hiện luận văn.
Xin cám ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và các cán bộ -
Trung tâm thí nghiệm thực hành Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi
những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè luôn
luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu.


iii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU vii
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1. 1. Giới thiệu về nấm men và màng tế bào nấm men 3
1.1.1. Nấm men ưa béo Yarrowia lipolytica 3
1.1.1.1. Nguồn gốc 3
1.1.1.2. Đặc tính sinh lý 3
1.1.1.3. Ứng dụng 3
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men Y. lipolytica 5
1.1.2.1. Nguồn Cacbon 5
1.1.2.2. Oxy 8
1.1.2.3. Nguồn Nitơ 8

1.1.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 9
1.1.2.5. Ảnh hưởng của pH 10
1.1.3. Khả năng sử dụng cơ chất kị nước ở nấm men Y. lipolytica 11
1.1.3.1. Sự xâm nhập của cơ chất kị nước vào tế bào 11
1.1.3.2. Sự chuyển hóa các cơ chất kị nước đối với nấm men 14
1.1.4. Thành phần và cấu tạo màng tế bào nấm men 14
1.1.4.1. Màng sinh học 14
1.1.4.2. Lipid màng 15
1.1.4.3. Protein màng 16
1.1.4.4. Glucide màng 16
1.1.4.5. Vận chuyển chất kị nước qua màng tế bào 16
1.2. Beta Caroten và công nghệ bao gói BC bằng tế bào nấm men 18
1.2.1. Beta Caroten 18
1.2.2. Công nghệ bao gói beta caroten 21

iv

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Vật liệu 24
2.1.1. Nguồn nấm men 24
2.1.2. Môi trường nuôi cấy 24
2.1.3. Dầu BC 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu 25
Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy 2 chủng nấm men Y. lipolytica và S.
cerevisiae trên các điều kiện sinh trưởng khác nhau 25
2.2.1. Thí nghiệm khảo sát khả năng phát triển của nấm men trên các môi trường thạch
dinh dưỡng khác nhau tại các nhiệt độ khác nhau 25
2.2.2. Khảo sát sự sinh trưởng của các chủng nấm men trong môi trường tiền tăng sinh
YPD…… 26
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng lên sự phát triển của nấm men

Khảo sát ảnh hưởng chủng giống nấm men, môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy
(pH, tốc độ lắc và thể tích lắc) lên hiệu suất chuyển chất qua màng tế bào nấm men 28
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của chủng giống nấm men đến hiệu suất chuyển chất BC.28
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hiệu suất chuyển chất BC 29
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu suất chuyển chất BC 30
2.2.6. Đánh giá sơ bộ khả nắng biến đối của hợp chất kị nước (BC) qua màng tế bào 31
2.3. Phương pháp phân tích 31
2.3.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng) và xây dựng đường cong
sinh trưởng của nấm men trên các điều kiện lựa chọn. 31
2.3.2. Đánh giá tính chất màng tế bào thông qua hàm lượng sterol và tính lỏng của
màng tế bào 31
2.3.3. Tách chiết các chất kị nước và phân tích đánh giá sự biến đổi của chúng bằng
phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS 32
2.3.4. Nhuộm lipid bằng thuốc nhuộm Nil red 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica và S. cerevisiae 34
3.1.1. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men 34
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái của Y. lipolytica trên môi trường YPDA 34
3.1.1.2. Đặc điểm hình thái S. cerevisiae trên môi trường YPDA 35

v

3.1.2. Khảo sát khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica và S. cerevisiae trên các môi
trường thạch dinh dưỡng 37
3.1.2.1. Chủng Y. lipolytica 37
3.1.2.2. Chủng S. cerevisiae 41
3.1.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica và S. cerevisiae trên các môi
trường nuôi cấy khác nhau 45
3.2. Ảnh hưởng của chủng giống tới khả năng thẩm thấu BC qua màng tế bào 47
3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng thẩm thấu BC qua màng tế bào

Y. lipolytica W29 49
3.3.1. Hàm lượng Sterol theo môi trường nuôi cấy 49
3.3.2. Tính lỏng của màng tế bào theo môi trường nuôi cấy 51
3.3.3. Khả năng thấm BC qua màng tế bào theo môi trường nuôi cấy 52
3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng thẩm thấu BC qua màng tế bào Y.
lipolytica W29 nuôi trên môi trường YNBD 55
3.5. Đánh giá sơ bộ khả năng biến đổi của hợp chất kị nước (BC) qua màng tế bào nấm
men 63
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO 71
PHỤ LỤC















vi

DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

v/p Vòng/phút
C Cacbon
N Nitơ
BC Beta Caroten
YPD Yeast Pepton D-glucose
YPDA Yeast Pepton D-glucose Agar
YNBD Yeast nitrogen base D-glucose
YNBDA Yeast nitrogen base D-glucose Agar
YPO Yeast Pepton Oil
YPOA Yeast Pepton Oil Agar
YNBO Yeast nitrogen base Oil/
YNBOA Yeast nitrogen base Oil Agar
YP Yeast Pepton
YPA Yeast Pepton Agar
YNB Yeast nitrogen base
YNBA Yeast nitrogen base Agar
PD Potato D-glucose
PDA Potato D-glucose Agar
R Rice
RA Rice Agar







vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Nguồn C được vi sinh vật sử dụng 7

Bảng 1.2: Nguồn N được vi sinh vật sử dụng 9

Bảng 1.3: Phạm vi nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật 10

Bảng 1.4: Ảnh hưởng của pH đối với một số vi sinh vật 11

Bảng 1.5: Một số phổ UV-Vis của BC khi chiết trong các dung môi khác nhau 19

Bảng 2.1: Các nguồn nấm men được sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường sử dụng (g/1L môi trường) 25

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của Y. lipolytica 34

Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của S. cerevisiae 35

Bảng 3.3: Hàm lượng BC cùng với các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình tăng sinh 56

Bảng 3.4: So sánh hàm lượng BC theo thực nghiệm và theo mô hình 56

Bảng 3.5: Các thông số cơ bản của mô hình hồi quy cấp 2 57

Bảng 3.6: Kết quả thí nghiệm ở tâm 57

Bảng 3.7: Giá trị ti 58

Bảng 3.8: Phương sai tương thích 59

Bảng 3.9: Kết quả thực nghiệm kiểm chứng theo quy hoạch thực nghiệm 63



viii

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Mô hình cấu trúc màng tế bào 15

Hình 1.2: Khuếch tán qua lớp kép photpholipid 17

Hình 1.3: Khuếch tán qua kênh protein 17

Hình 1.4: Sự vận chuyển các chất qua màng tế bào theo cơ chế chủ động 18

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của BC 19

Hình 1.6: Phổ UV-VIS của BC 20

Hình 2.1 Khảo sát khả năng phát triển của nấm men trên các môi thạch dinh dưỡng 26

Hình 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng lên sự phát triển của nấm
men 27

Hình 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của chủng giống nấm men lên hiệu suất chuyển chất BC
28

Hình 2.4: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên hiệu suất chuyển chất BC
29

Hình 2.5 : Công thức cấu tạo và phổ hấp thụ và phát xạ của Nil red 33

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của Y. lipolytica W29 trên môi trường YPDA ở 27 °C 34

Hình 3.2: Hình thái tế bào Y. lipolytica W29 trên YPDA ở 27 °C 34

Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc Y. lipolytica 0544 trên môi trường YPDA ở 27 °C 35

Hình 3.4: Hình thái tế bào Y. lipolytica 0544 trên môi trường YPDA ở 27 °C 35

Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc của S. cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27 °C
36

Hình 3.6: Hình thái tế bào của S. cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27 °C 36

Hình 3.7: Hình thái khuẩn lạc của S. cerevisiae TBS trên môi trường YPDA ở 27 °C
36

Hình 3.8: Hình thái tế bào của S. cerevisiae TBS trên môi trườngYPDA ở 27 °C 36

Hình 3.9: Khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica W29 trên các môi trường khác nhau ở
các nhiệt độ khác nhau 38

Hình 3.10: Khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica 0544 trên các môi trường khác nhau
ở các nhiệt độ khác nhau 40

Hình 3.11: Khả năng sinh trưởng và phát triển của S. cerevisiae TNS.c trên các môi

trường khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau 42


ix

Hình 3.12: Khả năng sinh trưởng và phát triển của S. cerevisiae TBS trên các môi
trường khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau 43

Hình 3.13: Đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica W29 trên một số môi trường 45
Hình 3.14: Đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica 0544 trên một số môi trường 45

Hình 3.15: Đường cong sinh trưởng của S. cerevisiae TNS.c trên các môi trường 46

Hình 3.16: Đường cong sinh trưởng của S. cerevisiae TBS trên môi trường YPD 47

Hình 3.17: Hàm lượng BC (µg/g) trên 1g sinh khối của hai chủng nấm men 48

Hình 3.18: Hàm lượng sterol tự do của Y. lipolytica W29 trên các môi trường 49

Hình 3.19: Tỉ lệ % sterol tự do và sterol tổng số của Y. lipolytica W29 trên các môi trường 50

Hình 3.20: Tính lỏng màng tế bào nấm men Y. lipolytica W29 được đánh giá thông
qua tính dị hướng huỳnh quang sử dụng DPH ở các môi trường dinh dưỡng khau nhau
52

Hình 3.21: Hàm lượng BC (µg/g) của Y. lipolytica W29 trên các môi trường 53

Hình 3.22: Y. lipolytica W29 sau khi tiếp xúc với BC trên các môi trường khác nhau: (a) môi
trường YPD; (b) môi trường YNBD; (c) môi trường YPO; (d) môi trường YNBO 54

Hình 3.23: Đồ thị (a) và hình chiếu (b) tương ứng của mô hình hồi quy biễu diễn mối
tương quan giữa pH và thể tích lắc 60

Hình 3.24: Đồ thị và hình chiếu tương ứng của mô hình hồi quy biễu diễn mối tương
quan giữa pH và tốc độ lắc 61

Hình 3.25: Đồ thị và hình chiếu tương ứng của mô hình hồi quy biễu diễn mối tương
quan giữa tốc độ lắc và thể tích lắc 62

Hình 3.26: Kết quả tối ưu nhất của các thông số 62

Hình 3.27: Phổ UV-Vis của BC chuẩn 64

Hình 3.28: Phổ UV-Vis của BC trên hai chủng nấm men sau tiếp xúc 64

Hình 3.29: Phổ UV-Vis của BC sau tiếp xúc trên các môi trường nuôi cấy 65

Y. lipolytica W29 65

Hình 3.30: Phổ UV-Vis của BC sau tiếp xúc ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau của Y.
lipolytica W29 trên môi trường YNBD 68

1

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, các chất có hoạt tính sinh học (hoạt chất) ngày càng
được quan tâm do chúng có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người. Việc phát triển các
loại thực phẩm chức năng và dược phẩm mới đòi hỏi phải sử dụng các kỹ thuật mới để
điều chế các hoạt chất này dưới dạng bền vững, không làm giảm đi hoạt tính sinh học của

chúng, đồng thời tăng khả năng hấp thu của cơ thể. Kỹ thuật bao gói vi nang (micro-
encapsulation) đã được ra đời vào những năm 1930 nhằm mục đích này. Đến nay kỹ thuật
này đã được phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm
và dược phẩm.
Hiện nay, nguyên liệu của kỹ thuật bao gói vi nang trong công nghệ thực phẩm
ngày càng đa dạng bao gồm các chất thơm, lipid, enzyme, sắt và các chất vi lượng và
đặc biệt và các hợp chất carotenoid… Carotenoid là chất màu tự nhiên, được tổng hợp
bởi vi sinh vật và thực vật. Các loài động vật sử dụng nguồn carotenoid của thực vật vì
chúng không có khả năng tổng hợp. Các nghiên cứu trong chế độ ăn chỉ ra rằng β-
caroten là một chất hữu ích trong việc chống lại các bệnh ung thư và các bệnh khác
nhờ vào đặc tính chống oxy hóa và là chất tiền vitamin A. Nhưng các carotenoid lại là
những chất rất nhạy cảm với nhiệt, oxy và ánh sáng do cấu trúc hóa học không bão hòa
của chúng. Do đó các nghiên cứu về bao gói các hợp chất carotenoid ngày càng được
quan tâm với nhiều phương pháp bao gói khác nhau trong đó có công nghệ bao gói
bằng nấm men.
Trong suốt nhiều thế kỷ qua, nấm men được sử dụng vào nhiều mục đích kinh
tế khác nhau. Nấm men truyền thống mà đại diện là Saccharomyces cerevisiae là
chủng nấm men được nghiên cứu nhiều nhất và có ứng dụng rộng rãi nhất, đặc biệt
trong các lĩnh vực sản xuất cồn, bánh mỳ … dựa trên khả năng sử dụng và chuyển hóa
đường thành cồn và CO
2
của chúng. Bên cạnh các chủng truyền thống, các chủng nấm
men ưa béo như Yarrowia lipolytica đang ngày càng được quan tâm bởi ứng dụng to
lớn của chúng trong công nghiệp sản xuất các hợp chất thứ sinh (protein, các axit hữu
cơ, chất thơm, lipid …) từ các nguồn chất thải công nghiệp có hàm lượng chất béo cao.
Tuy nhiên, các chất béo này một mặt là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho tế bào nấm
men, mặt khác lại chính là tác nhân cản trở (stress) sinh trưởng của tế bào. Mức độ ức
chế của chúng phụ thuộc vào tính kị nước, độ dài mạch cacbon, cấu trúc đầu kị nước
2

… của bản thân phân tử đó đồng thời phụ thuộc vào tính chất của màng tế bào nấm
men – bức tường bảo vệ tế bào. Hiểu được cơ chế tương tác giữa các hợp chất kị nước
lên màng tế bào nấm men sẽ giúp chúng ta hiểu và từ đó sử dụng tế bào nấm men để
bao gói các hợp chất kị nước, các chất có hoạt tính sinh học và xa hơn nữa là điều
khiển các quá trình chuyển hóa các hợp chất này bởi nấm men nhằm sản xuất/ nâng
cao hiệu quả các quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp mong muốn.
Nhằm góp phần vào việc phát triển công nghệ bao gói vi nang sử dụng tế bào
nấm men, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình xâm nhập và biến đổi
của hợp chất kị nước qua màng tế bào sinh tổng hợp lactone Yarrowia lipolytica”
Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy 2 chủng nấm men Y. lipolytica và S.
cerevisiae trên các điều kiện sinh trưởng khác nhau.
Nghiên cứu quá trình xâm nhập của chất kị nước (ở đây là chất BC) qua màng
tế bào nấm men sinh trưởng trong các điều kiện khác nhau.
Đánh giá sơ bộ khả năng biến đổi của chất kị nước trong tế bào nấm men.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy 2 chủng nấm men Y.
lipolytica và S. cerevisiae trên các điều kiện sinh trưởng khác nhau
Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chủng giống nấm men, môi trường nuôi
cấy và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (pH, tốc độ lắc và thể tích lắc) lên hiệu suất
chuyển chất qua màng tế bào nấm men. Đồng thời đánh giá sơ bộ khả năng biến đổi
của chất kị nước (BC) qua màng tế bào nấm men.


Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả của đề tài này có thể góp phần làm sáng tỏ cơ chế tương tác giữa màng
tế bào nấm men và các hợp chất kị nước cũng như các yếu tố ảnh hưởng tới tương tác
đó, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản hay ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất
hoặc bao gói các hợp chất kị nước có hoạt tính sinh học.
Tính mới của đề tài

Bao gói vi nang dùng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là bao gói
BC hiện nay đều dựa trên tính chất vật lý, hóa lý, hóa học giữa vật liệu vỏ và hoạt chất
lõi. Việc sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gói các hoạt chất (BC) theo phương
pháp vi sinh là vấn đề hoàn toàn mới.
3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1. 1. Giới thiệu về nấm men và màng tế bào nấm men
1.1.1. Nấm men ưa béo Yarrowia lipolytica
1.1.1.1. Nguồn gốc
Yarrowia lipolytica thuộc họ Saccharomycetaceae, và thuộc giới nấm
Ascomyces (dưới họ Saccharomycetoideae). Chúng thường được tìm thấy trên các cơ
chất có nguồn gốc động vật hoặc thực vật mà các nguồn cacbon chính dưới dạng các
ankan; lipid hoặc protein. Y. lipolytica được phân lập đầu tiên trên magarine. Nấm men
này có thể phân lập được từ các thực phẩm giàu lipid và protein [57] như phô mát [55]
hoặc xúc xích [29]. Y. lipolytica là loài chiếm ưu thế trong phô mát carmembert và các
phô mát xanh với nồng độ cực cao 10
6
-10
7
CFU [26].
1.1.1.2. Đặc tính sinh lý
Ngược với Candida albicans và C. tropicalis, Y. lipolytica là nấm men không gây
bệnh. Chúng rất nhạy cảm với nhiệt độ cao từ 32-34 °C [34]. Nhiều nguồn Y. lipolytica
không có khả năng phát triển ở nhiệt độ 32 °C và là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc. Y.
lipolytica đã được Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp chứng
nhận GRAS là sản phẩm tuyệt đối an toàn. Điều này cho phép chúng được sử dụng trong
công nghiệp thực phẩm hoặc dược phẩm.
Đồng thời, đây là một nấm men lưỡng hình. Chúng hình thành các tế bào chồi,
các sợi nấm hoặc giả sợi nấm tùy theo điều kiện nuôi cấy như thông gió, nguồn C hoặc

nguồn nitơ, pH… [67].
Y. lipolytica có khả năng đồng hóa nhiều loại đường như glucose, galactose
hoặc mannitol nhưng chúng không có khả năng đồng hóa saccharose do thiếu enzyme
invertase [12]. Ngược lại, nấm men này có khả năng sử dụng các chất kị nước như
ankan (như hexadecane, decane), các acid béo (như acid palmitique, acid rininoleique,
acid laurique), và các triglyceride (trioleine, tripalmitine). Y. lipolytica cũng có thể sử
dụng acetate như một nguồn C duy nhất [12].
1.1.1.3. Ứng dụng
Nhờ những tính chất đặc biệt được mô tả ở trên và sự có mặt của các công cụ di
truyền trong nấm men, Y. lipolytica được coi như một mô hình sinh học với đầy đủ các
ứng dụng công nghệ sinh học. Các acid hữu cơ, chất thơm, enzyme (protease, lipase,
4

esterase và phosphatase), protein đơn bào “single cell proteins”, dầu đơn bào “single
cell oils” là những sản phẩm chính có thể được sinh tổng hợp bằng Y. lipolytica được
thay đổi về mặt di truyền học 64], [14], [24], [62]. Các ứng dụng trong lĩnh vực môi
trường của Y. lipolytica cũng được nghiên cứu [10]. Cụ thể như:
Trong sản xuất enzyme [12]
Y. lipolytica được coi là giải pháp thay thế S. cerevisiae để sản xuất protein.
Chúng có khả năng sản sinh các protein khác nhau với hiệu suất cao bao gồm các
protease, lipase, RNase, esterase, phosphatase gắn với các điều kiện đặc biệt. Ví dụ
như: với pH môi trường nuôi cấy thay đổi, nó tiết ra hai loại protease [12]: khi nuôi
trong môi trường chứa pepton và pH 6 thì sẽ sản sinh ra 1 - 2 g/L protease kiềm
(AEP), còn khi pH môi trường dưới 4,5 thì protease acid (AXP) sẽ được sản sinh ra.
Trong sản xuất acid hữu cơ [27]
Y. lipolytica có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại acid hữu cơ như acid α-
cetoglutarique, acid pyruvic, acid citric và acid isocitric. Các acid này có thể được tổng
hợp bởi nấm men từ các nguồn C khác nhau như glucose, ankan, glycerol, ethanol…
Y. lipolytica có thể tiết ra môi trường một lượng lớn acid α-cetoglutarique lên đến
108,7 g/L. Sản phẩm này phụ thuộc đặc biệt vào thiamin khi nuôi cấy trên môi trường

glucose. Còn trong môi trường chứa glucose và glycerol nhưng vắng mặt thiamin thì
Y. lipolytica tiết ra acid pyruvic. Tỷ lệ acid pyruvic tổng hợp được chiếm 75 – 80% so
với acid α-cetoglutarique (20 – 25%). Nồng độ acid pyruvic do Y. lipolytica tiết ra có
thể lên đến 50 g/L.
Sản xuất chất thơm
Sử dụng Y. lipolytica để sản xuất chất thơm như γ-decalacton, chất thơm « note
verte » như hexanal. Năm 1983, Farbood & Willis là người đầu tiên mô tả con đường
chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành γ-decalacton, kể từ đó Y. lipolytica không
ngừng được nghiên cứu sản xuất ra lactone [52], [53] và ngày này, chúng là loại nấm
men sử dụng nhiều nhất trong sản xuất lactone. Các con đường chuyển hóa và tổng
hợp lactone ban đầu được nghiên cứu trên loài nấm men này cách đây không lâu và Y.
lipolytica được xem như mô hình tốt cho các nghiên cứu cơ bản về cơ chế có liên quan
đến chuyển hóa sinh học.
Ứng dụng trong xử lý môi trường
5

Như chúng ta đã biết, Y. lipolytica có khả năng sử dụng các chất kị nước, vì
vậy chúng được sử dụng trong xử lý sinh học của việc ô nhiễm dầu mỏ hoặc dầu trong
đất, trong môi trường nước và trong xử lý hoặc làm tăng giá trị của rác thải công
nghiệp [11]. Nấm men này cũng có thể được xem như nguồn dung nạp kim loại nặng
(đồng, niken, kẽm) và có khả năng khử độc.
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men Y. lipolytica
1.1.2.1. Nguồn Cacbon
Y . lipolytica là nấm men hiếu khí bắt buộc có khả năng phân hủy một cách hiệu
quả các chất kị nước như n-ankan, acid béo, chất béo và các loại dầu theo các con
đường chuyển hóa đặc biệt [26]. Trình tự bộ gen của các loài nấm này đã được xác
định có mối quan hệ xa với nấm men truyền thống S. cerevisiae. Tuy nhiên, cơ chế di
truyền thì khác xa đáng kể. Đặc biệt, bộ gen có sự mở rộng của hệ protein và gen liên
quan đến việc sử dụng các chất kị nước [60, 63].
 Đường

Y. lipolytica có khả năng phân hủy nhiều loại đường hexose như glucose,
fructose và mannose. Vận chuyển các monosaccharid, glucose, fructose hay mannose
trong S. cerevisiae là quá trình khuếch tán, tuy nhiên có thể khác nhau trong các loại
nấm men khác nhau. Đối với Y. lipolytica hệ thống vận chuyển glucose hoạt động
không phụ thuộc vào nồng độ glucose trong môi trường [23, 28].
Các hexose nội bào đi vào chu trình đường phân sau giai đoạn photpho hóa.
Glucose, fructose và mannose được photphoryl hóa bằng hexokinases. Hầu hết các
hexokinases bị ức chế bởi threalose -6P, một thành phần quan trọng trong thủy phân
glucose ở S. cerevisiae. Hexokinases ở Y. lipolytica chưa được bị ức chế bởi trehalose
[28].
Nồng độ glucose cao không ảnh hưởng đến tốc độ hô hấp, hàm lượng và tỉ lệ
phân tử của cytochrome hoặc tính chất của ti lạp thể trong Y. lipolytica. Tuy nhiên, sản
xuất Y. lipolytica IMUFRJ 50682 dưới sự kiềm chế hay không kiềm chế glucose thì
không phụ thuộc vào chất cảm ứng. Sucrose không thể được sử dụng bởi chủng Y.
lipolytica hoang dã bởi vì thiếu enzyme chuyển hóa sucrose [51].
 Acid hữu cơ
Rodrigues và Pais [54] đã chỉ ra rằng Y. lipolytica có khả năng sử dụng axetic,
lactic, propionic, malic, succinic, citric và acid oleic như nguồn C và năng lượng duy
6

nhất, trong nhiều trường hợp, khả năng này không phụ thuộc vào độ pH của môi trường.
Khi nấm men phát triển trong môi trường chứa đường và acid citric hoặc acid lactic thì có
sự tăng trưởng diauxic và việc sử dụng hai loại acid này phải chịu sự kiềm chế bởi
glucose. Propionic, acid butyric và sorbic cũng ảnh hưởng ức chế đến sự phát triển men.
Hầu hết các chủng Y. lipolytica phát triển rất hiệu quả trên acetat như nguồn C duy
nhất. Nồng độ natri axetat lên đến 0,4% được dung nạp tốt, nồng độ cao hơn làm giảm tốc
độ tăng trưởng và nồng độ cao hơn 1,0% thì ức chế sự phát triển [12].
 Rượu
Theo Barth và Gaillardin [12], Y. lipolytica sử dụng ethanol như nguồn C ở nồng
độ lên đến 3%. Và nồng độ cồn cao hơn thì rất độc hại. Một số dehydrogenas NAD

+
- và
NADP
+
đã được nghiên cứu Y. lipolytica. Có thể tồn tại hai loại dehydrogenas NAD
+
khác
nhau về mặt đặc hiệu. Tổng hợp của cả hai enzyme dường như không bị kiềm chế bởi
đường hoặc cảm ứng bằng ethanol [13].
Glycerol cũng có thể được sử dụng như một nguồn C trong điều kiện hiếu khí
bởi nhiều loại nấm men [6], được đồng hóa thông qua con đường glycerol -3 -
phosphate hoặc dihydroxyacetone. Một số nấm men được cho là đồng hóa glycerol
qua dihydroxyacetone. Ban đầu, glycerol được oxy hóa thành dihydroxyacetone bởi
glycerol dehydrogenase và sau đó được phosphoryl hóa thành phosphate
dihydroxyacetone bởi dihydroxyacetone kinase [66]. Papanikolaou và cộng sự [50] đã
sử dụng thành công glycerol thô trong việc nuôi Y. lipolytica và sản xuất acid citric.
Môi trường glycerol ban đầu cao (40 g.L
-1
) với N hạn chế dẫn đến bài tiết acid citric
lên đến 35 g L
-1
(sản lượng 0,42 - 0,44 g acid /g glycerol tiêu thụ). Sản xuất lipid cũng
được nghiên cứu cùng nguồn C [49].
 Chất kị nước
Nấm men Y. lipolytica thường được phân lập từ môi trường có chứa chất béo,
chẳng hạn như sản phẩm sữa, môi trường ô nhiễm và gia cầm sống và đặc biệt phù hợp
với chất kị nước.
Aguedo và cộng sự [5] đã nghiên cứu các tính chất bề mặt của Y. lipolytica
W29 bằng các thử nghiệm MATS và quan sát thấy đặc tính ưa nước của bề mặt của
các tế bào phát triển trong đường hoặc dầu, với tính cho/nhận điện tử trong sự có mặt

của methyl ricinoleate. Ngược lại, chủng Y. lipolytica khác (Y. lipolytica IMUFRJ
50.682), được phân lập từ Vịnh Guanabara ở Rio de Janeiro, Brazil, cho thấy sự bám
7

dính của tế bào rất cao đối với các dung môi không phân cực, một dấu hiệu của tính kị
nước cao [7], cho thấy sự hiểu biết về cơ chế của chất kị nước thay đổi từ chủng này
đến chủng khác.
Trong quá trình lên men hydrocacbon, pha dầu được phân tán dưới dạng giọt trong
pha nước và sự tương tác bề mặt là xu hướng để tạo thành các giọt dầu. Những giọt nhỏ
kết hợp liên tục và phân phối kích thước của nó phụ thuộc vào tương tác bề mặt, thể tích
phần hydrocacbon và cường độ khuấy. Gutierrez và Erickson [31] quan sát thấy sự giảm
đường kính trung bình của các giọt dầu đồng thời với sự giảm tương tác bề mặt trong môi
trường trong quá trình tăng trưởng của Y. lipolytica trong hexadecan do hiện tượng sản
xuất tác nhân hoạt động bề mặt bởi nấm men. Trong thực tế, Cirigliano và Carman [21] đã
phát hiện và cô lập một chất nhũ hóa có khả năng ổn định hệ nhũ tương nước/dầu, trong
môi trường phát triển ankan của Y. lipolytica. Chất nhũ hóa sinh học này được gọi là
Liposan bao gồm 83% carbohydrate và 17% protein. Một chủng Y. lipolytica khác cũng
có khả năng sản xuất chất nhũ hóa sinh học, với thành phần tương tự, chỉ có mặt của
glucose như nguồn C, cho thấy việc sản xuất các tác nhân hoạt động bề mặt là một đặc
tính cấu thành của nấm men này [10].
Bảng 1.1: Nguồn C được vi sinh vật sử dụng [2]
Nguồn C Các dạng hợp chất
Đường Glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột,
galactose, lactose, mannite, cellobiose, cellulose,
hemicellulose, chitin
Acid hữu cơ Acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao,
acid béo bậc thấp, aminoacid
Rượu Ethanol
Lipid Lipid, phospholipid
Hydrocarbon Khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin

Cacbonate NaHCO
3
, CaCO
3

Các nguồn C
khác
Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid
nucleic

8

1.1.2.2. Oxy
Tăng trưởng Y. lipolytica và bài tiết chất chuyển hóa bị ảnh hưởng bởi các yếu
tố môi trường khác nhau. Lượng oxy cần cho vi sinh vật này là một thông số quan
trọng. Trong quá trình nuôi cấy liên tục Y. lipolytica N1, nhu cầu oxy cho sự tăng
trưởng và tổng hợp axit citric được tìm thấy phụ thuộc vào nồng độ sắt trong môi
trường [38]. Việc bổ sung các perfluorocarbons (PFCs) vào môi trường nuôi cấy Y.
lipolytica đã được báo cáo như một phương pháp mới để tăng cường sự hấp thu oxy
[9]. Tính thấm oxy trên PFC thì cao hơn nhiều so với trong nước với khả năng hòa tan
cao hơn 10-20 lần. Khi tăng nồng độ PFC và tốc độ lắc thì Y. lipolytica có tốc độ tăng
trưởng cao hơn. Amaral và cộng sự [8] cũng quan sát thấy một phân vùng lạ của tế bào
giữa các pha dung dịch và pha PFC hữu cơ, với sự ưa thích bất ngờ của các tế bào với
các dung môi hữu cơ.
Các phản ứng thích nghi của Y. lipolytica đến stress oxy hóa gây ra bởi các chất
oxy hóa hydrogen peroxide, menadione, và juglone đã được nghiên cứu bởi Biryukova
và cộng sự [17]. Sự thích ứng của các tế bào nấm men đối với các tác nhân oxy hóa có
liên quan với sự gia tăng hoạt động của enzyme catalase tế bào, superoxide dismutase,
glucose-6-phosphat dehydrogenase, và glutathione reductase, các enzyme chính liên
quan đến bảo vệ tế bào để chống lại quá trình stress oxy hóa. Lopes và cộng sự [42] sử

dụng lò phản ứng sinh học áp lực để tăng khả năng hòa tan oxy trong môi trường nuôi
cấy Y. lipolytica. Tăng oxy có khả năng gây ra sự cảm ứng của các enzyme chất chống
oxy hóa như superoxide dismutase, liên quan đến các cơ chế phòng thủ của tế bào
chống lại sự oxy hóa một cách hiệu quả và các tế bào có thể đối phó với tăng áp suất.
Khi áp suất dưới 6 bar thì khối lượng sinh khối và tốc độ phát triển tăng tương ứng 5
và 3,4 lần.
1.1.2.3. Nguồn Nitơ
Ý nghĩa chủ yếu của nguồn N là cung cấp cho tế bào nguyên liệu để hình thành
các nhóm amin (-NH
2
) và imin (-NH-) để tổng hợp nên protein và các hợp chất khác của
nguyên chất. Nấm men đồng hóa được các hợp chất acid amin và N vô cơ: dễ đồng hóa
hơn cả là ion NH
4+
và amoniac NH
3
với lượng sử dụng lớn nhất là 20 – 35 mg nitơ/ 10
9

tế bào. Nguồn N được coi là tốt nhất và được đồng hóa hoàn toàn là ure:


NH
2
-
CO
-
NH
2
+

H
2
O
2NH
3
+ CO
2

Urease

9

Nấm men có thể tự tổng hợp các acid amin. Tuy nhiên nếu cho các acid amin
vào môi trường thì quá trình sinh sản và phát triển của tế bào sẽ nhanh hơn. Nấm men
đồng hóa các acid amin bằng cách amin hóa (tách NH
3
ra khỏi các chất), do đó các
nguồn N khác nhau sẽ có ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng acid amin trong tế bào nấm
men.
Nguồn N thường được vi sinh vật sử dụng là protein và các sản phẩm phân huỷ
của protein (peptone, peptide, aminoacid ), muối ammone, nitrate, N phân tử (N
2
),
purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide.
Bảng 1.2: Nguồn N được vi sinh vật sử dụng [2]
Nguồn N Các dạng hợp chất
Protein và các sản
phẩm phân giải
của protein
Peptone, peptide, aminoacid (một số vi sinh vật tiết

men proteinase phân giải protein thành các hợp chất phân tử
nhỏ hơn rồi mới hấp thu được vào tế bào)
Ammone và muối
ammone
NH
3
, (NH
4
)
2
SO
4,
(dễ được hấp thu)
Nitrate KNO
3
(dễ được hấp thu)
N phân tử N
2
(với vi sinh vật cố định N)
Các nguồn N khác Purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (chỉ
một số nhóm vi sinh vật mới có thể đồng hoá được)

1.1.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc không những đối với sự sinh sản của vi sinh vật
mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (ảnh hưởng đến tốc độ của các phản ứng
hóa học và sinh hóa học).
Nấm men là những vi sinh vật ưa mát (chúng có nhiệt độ tối ưu ở khoảng 25
°C, nhưng cũng có thể thích nghi ở 0 °C) nhưng có một số nấm men có thể phát triển
được ở 45 °C.
Nhiệt độ thường gây cho vi sinh vật những chiều hướng sau. Đối với nhiệt độ thấp thường

không làm chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả năng chuyển hóa các hợp chất,
làm ức chế hoạt động các hệ enzyme, làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì
thế làm vi sinh vật mất khả năng phát triển và sinh sản. Nhiều trường hợp vi sinh vật sẽ bị
chết. Khả năng gây chết của chúng hết sức từ từ chứ không như nhiệt độ cao. Nhiệt độ cao
10

thường gây chết vi sinh vật một cách nhanh chóng, do gây biến tính protid, làm hệ
enzyme tức không hoạt động được, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt.
Bảng 1.3: Phạm vi nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật [2]
Vi sinh vật Nhiệt độ thấp
nhất
Nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ cao
nhất
Vi sinh vật không quang hợp
Bacillus psychrophilus -10 23-34 28-30
Micrococcus cryophilus -4 10 24
Psedomonas fluorescens 4 25-30 40
Staphylococcus aureus 6,5 30-37 46
Enterococcus faecalis 0 37 44
Escherichia coli 10 37 45
Thermoplasna acidophilum 45 59 62
Bacillus stearothermophilus 30 60-65 75
Pyrolobus fumarii 90 106 113
Vi khuẩn quang hợp và vi khuẩn lam
Rhodospirillum rubrum - 30-35 -
Anabaena variabilis - 35 -
Osillatoria tenuis - - 45-47
Synechococcus eximius 70 79 84
Nấm
Candida scottii 0 4-15 15

Saccharomyces cerevisiae 1-3 28 40
Mucor pusillus 21-23 45-50 50-58

1.1.2.5. Ảnh hưởng của pH
Phản ứng pH môi trường tác động trực tiếp lên vi sinh vật. Ion hydro nằm trong
thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào. Tùy theo nồng
độ của chúng mà làm tăng hay giảm nồng độ thẩm thấu của tế bào với những ion nhất
định. Mặt khác chúng cũng làm ức chế phần nào các enzyme có mặt trên thành tế bào.
Sự phát triển của vi sinh vật có thể rất nghiêm ngặt ở môi trường acid hay môi
trường kiềm. Đối với vi khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển trong môi trường
11

trung tính hoặc kiềm yếu. Đối với nấm men và nấm mốc thì phát triển ở môi trường
acid.
Nếu nồng độ proton trong dung dịch vượt qua mức bình thường đối với vi sinh
vật nào đó thì sự sống bị ức chế.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm phần lớn chúng ta sử dụng những môi trường
có pH đối với vi khuẩn 7 - 7,6; đối với nấm men và nấm mốc 3 - 6,0.
Bảng 1.4: Ảnh hưởng của pH đối với một số vi sinh vật [1]
pH môi trường
Loài vi sinh vật
pH tối thiếu pH tối ưu pH tối đa
Saccharomyces cerevisiae 4 5,8 6,8
Streptococcus lactic 4,0 – 5,1 7,9
Lactobacterinus casei 3,0 – 3,9 - 7,1
Escherichia coli 4,4 6,5 – 7,8 7,8
Clostridium amylobacter 5.7 6.9 – 7.3
Vi sinh vật gây thối
Bacillus mensentericeus 5,8 6,8 8,5
Clostridium putrificum 4,2 7,5 – 8,5 9,4

Vi khuẩn cố định đạm
Azotobacter chroccoccum 5,6 6,5 – 7,8 8,8 – 9,2
Vi khuẩn nitrat
Nitrosomonas 3,9 7,7 – 7,9 9,7
Nitrosobacter 3,9 6,8 – 7,3 13,0
Nấm mốc 1,2 1,7 – 7,7 9,2 – 11,1
1.1.3. Khả năng sử dụng cơ chất kị nước ở nấm men Y. lipolytica
1.1.3.1. Sự xâm nhập của cơ chất kị nước vào tế bào
Các chất kị nước không tan trong nước xâm nhập vào tế bào qua thành và màng
tế bào đòi hỏi các thay đổi về mặt hình thái và sinh lý, nhất là các tính chất của bề mặt
tế bào có liên quan tới sự kết dính của các giọt nhỏ lipid trên thành tế bào (tính kị nước
trên bề mặt) hoặc sự tạo thành các chất nhũ hóa (các chất hoạt động bề mặt). Về bản
chất, các tương tác giữa phân tử kị nước và tế bào gồm ba giai đoạn: giai đoạn tiếp xúc
12

và hấp thụ trên bề mặt tế bào, giai đoạn thấm qua cấu trúc thành tế bào và màng
plasmic và giai đoạn nhả hấp thụ để đi vào tế bào chất.
Sự tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào
Để đi được vào trong tế bào, các chất kị nước phải tương tác với bề mặt tế bào.
Hai giả thuyết đã được phát triển để giải thích cho sự vận chuyển một phân tử ít tan
trong nước vào trong tế bào:
+ Sự hòa tan hoặc giả hòa tan của hợp chất được xem xét khi có mặt của các
chất hoạt động bề mặt.
+ Sự kết dính trực tiếp ở thành tế bào.
Trong trường hợp của Y. lipolytica, hai cơ chế này được làm rõ. Y. lipolytica có
thể sản xuất các chất hoạt động bề mặt khi chúng được nuôi cây trên môi trường cơ
chất kị nước. Sự kết dính giữa cơ chất kị nước và tế bào có thể làm tăng khả năng kị
nước của bề mặt tế bào. Và sự thay đổi khả năng kị nước này sẽ tương quan với sự
hình thành các chỗ lồi trên bề mặt của các tế bào được nuôi cấy trong n-ankan. Cấu
trúc này cũng có thể quan sát ở C. tropicalis, nó phụ thuộc vào pha tăng trưởng và sẽ

được cảm ứng bởi ankan hoặc acid oleic [26].
Tính thấm của thành tế bào
Các cơ chế thấm qua thành tế bào của các chất kị nước vẫn còn ít được biết đến.
Osumi và cộng sự [47] đã quan sát trên kính hiển vi điện tử quét và thấy rằng bề
mặt của C. Tropicalis trở nên sần sùi khi tăng trưởng trong môi trường ankan trong khi
đó bề mặt của nó sẽ trơn nhẵn nếu nguồn C là glucose. Trên các mặt cắt của mấm men
được quan sát dưới kính hiển vi cắt lớp, tại các chồi lipid xuất hiện các kênh, bền khi rửa
với dung môi hữu cơ, ló ra khỏi bề mặt tế nấm men. Các chồi lipid cũng được quan sát
thấy ở Y. lipolytica được nuôi cấy trong môi trường methyl oleate như là nguồn C duy
nhất [43].
Dường như các loại nấm men có thể thay đổi cấu tạo thành tế bào của chúng
khi có mặt của các chất kị nước nhằm tăng khả năng đồng hóa chúng. Giả thiết này
được củng cố khi quan sát Y. lipolytica trong môi trường ankan sẽ có thành tế bào với
chiều dày lớn trong môi trường glucose [39].
Tính thấm của màng tế bào chất
Cơ chế thấm của các acid béo mạch dài qua màng tế bào chất vẫn còn đang được
tranh cãi [60]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng các acid béo tự do có thể thấm qua màng lipid
13

rất nhanh ở pH sinh lý. Đối với nấm men, sự thấm qua của các acid béo như acid lauric,
acid oleic trong tế bào S. cerevisiae và Y. lipolytica đã được chứng minh là dựa trên sự
khuếch tán đơn giản ở nồng độ cao 10 µM và dựa trên các chất tải không sử dụng năng
lượng ở nồng độ thấp hơn. Kiểu vận chuyển có điều kiện theo nồng độ acid béo trong
môi trường cũng được quan sát bởi [16] ở S. uvarum và Y. lipolytica khi sử dụng
phương pháp đánh dấu bằng phóng xạ. Đối với C. tropicalis, việc vận chuyển oleate ở
các tế bào phát triển trong môi trường có chứa oleate đạt bão hòa và diễn ra nhanh hơn
so với ở các tế bào sinh trưởng trong môi trường có glucose. Điều này cho thấy việc vận
chuyển các chất kị nước có tính cảm ứng.
Tính thấm bị động qua màng của các chất béo phụ thuộc vào nhiều yếu tố [33]
+ Gradient pH.

+ Sự phân phối tương đối của các vùng cố định các acid béo ở hai bên của
màng tế bào.
+ Sự chuyển đổi các acid béo tự do thành chất dẫn xuất không thấm qua màng
tế bào (este CoA).
+ Sự phân hủy các acid béo trong tế bào.
Tính thấm của các acid béo qua màng tế bào có thể thực hiện dễ dàng nhờ sự acyl
hóa bởi các enzyme Acyl-CoA synthetase (ACS). Đối với S. cerevisiae, 6 enzymes ACS
đã được làm rõ đặc tính và được đặt tên Faa1p, Faa2p, Faa3p, Faa4p, Fat1p và Fat2p.
Các enzyme Faap xúc tác hoạt động của các acid béo từ 8 đến 12 C; enzyme Fat1p thì
chuyên biệt xúc tác lên các mạch có số C lớn hơn 20 trong khi các cơ chất của Fat2p còn
chưa được xác định [18].
Tóm lại, tính thấm các acid béo qua màng tế bào có thể diễn ra nhờ tác động
của protein màng tế bào hoặc có thể là sự khuếch tán đơn giản qua màng phospholipid,
qua các kênh có bản chất protein.
Sự nhả các acid béo khỏi màng tế bào để đi vào tế bào chất
Do có ái lực lớn đối với lớp kép phospholipid, tốc độ nhả các acid béo ra khỏi
màng diễn ra chậm hơn tốc độ kết hợp chúng vào màng cũng như tốc độ dịch chuyển
của chúng bên trong màng.
Một nhóm protein nội bào có khả năng kết hợp với acid béo (FABP) dường như
cần thiết để tạo điều kiện dễ dàng cho việc chuyển các acid béo từ bề mặt trong của màng
vào tế bào chất. Động học của sự nhả phụ thuộc vào chiều dài của mạch acid béo [32].
14

1.1.3.2. Sự chuyển hóa các cơ chất kị nước đối với nấm men
Sự dị hóa các cơ chất kị nước đối với nấm men là sự chuyển hóa phức tạp bao
gồm nhiều chu trình chuyển hóa diễn ra ở các bào quan khác nhau của tế bào.
Các cơ chất kị nước, một khi thấm qua màng tế bào, được hoạt hóa dưới dạng
Coenzyme A (CoA), sau đó được vận chuyển bởi nhóm protein FABPs tại khu vực
oxy hóa cấp1 của chúng. S. cerevisiae cũng biểu đạt một protein loại acyl-CoA kết hợp
với protein được mã hóa bởi gen ACB1. Đó là một protein gồm 86 đến 103 acid amin

sẽ kết hợp với acyl-CoA của mạch 14-20 C nhưng không phải với acid béo tự do. Các
triglycerid được thủy phân thành glycerol và acid béo tự do. Các ankan bị oxy hóa đến
các acid béo tự do tương ứng bởi các enzyme của hệ thống oxy hóa đơn ankan
(AMOS): citochrom P450 và NADPH-citochrom P450 reductase, các ancol oxydase,
andehyde dehydrogenase.
Tiếp theo, các acid béo dưới dạng este của CoA được phân cắt thành acetyl
CoA và propionyl-CoA trong trường hợp mạch ankan lẻ thông qua quá trình β-oxy hóa
ở peroxysome. Nhìn chung mạch acyl của acid béo có thể được sáp nhập vào quá trình
tạo thành lipid màng tế bào sau khi kéo dài và không bão hòa. Tùy thuộc vào điều kiện
các acid béo tự do cũng có thể tự tích lũy trong các hạt lipid.
Oxy hóa các acyl-CoA trong các peroxysome được thực hiện bởi enzyme acyl-
CoA oxydase (Aox) được mã hóa bởi các gen POX. Đối với Y. lipolytica, có 6 gen,
POX1 đến POX6, đã được phân lập và được nghiên cứu đặc tính [63], [64], [65].
Chủng đột biến của W29, cắt bỏ 4 gen pox2, pox3, pox4, pox5 (Y. lipolytica
MTLY37) không có khả năng mọc trên môi trường methyle oleat như là nguồn C
chính.
Sản phẩm cuối cùng của sự oxy hóa các acid béo ở nấm men là acetyl-CoA. Sản
phẩm này đi vào trong chu trình glyoxylate mà enzyme chính là isocitrate lyase ICL1,
hoặc đi ra các thể hạt để sáp nhập vào chu trình citrate hoặc chu trình methylcitrate trong
trường hợp mạch C có số C lẻ.
1.1.4. Thành phần và cấu tạo màng tế bào nấm men
1.1.4.1. Màng sinh học
Màng tế bào được tạo thành từ lớp lipid kép dày khoảng 7,5 nm, chúng hình
thành mặt phân cách giữa tế bào và môi trường tế bào. Vì vậy, nó ngăn chặn các phân
tử nội bào đi ra ngoài và các phân tử tự do bên ngoài đi vào trong tế bào. Màng tế bào