nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ sinh khối artemia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG



NGUYỄN HỒNG NGÂN


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA
PROTEIN THỦY PHÂN TỪ SINH KHỐI ARTEMIA

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã ngành: 60.54.10


LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
TS. HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO
TS. NGUYỄN ANH TUẤN




NHA TRANG - NĂM 2012

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung thực hiện của luận văn này là kết quả nghiên

cứa của bản thân, không sao chép kết quả nghiên cứu của người khác. Tôi xin chịu
trách nhiệm hoàn toàn nếu có bất kì sự gian dối nào.

Người cam đoan

Nguyễn Hồng Ngân
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình của
các quý thầy cô và đồng nghiệp. Xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám hiệu, các phòng ban chức năng, quý thầy cô giáo đã giảng dạy, giúp
đỡ tôi trong quá trình học tập tại Trường.
Quý thầy cô Trung tâm thí nghiệm Thực hành đã luôn tạo điều kiện tốt nhất
cho tôi trong quá trình thực hiện Luận văn.
Đồng nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong thời gian học tập.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Huỳnh Nguyễn Duy
Bảo và TS.Nguyễn Anh Tuấn đã hướng dẫn khoa học hết sức tận tình và chu
đáo trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành báo cáo Luận văn.
Kính chúc các thầy cô, đồng nghiệp sức khỏe, thành công và hạnh phúc.
Khánh Hòa, ngày 23 tháng 9 năm 2012
Học viên thực hiện


Nguyễn Hồng Ngân


iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ix
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 3
1.1. Artemia 3
1.1.1.Phân loại 3
1.1.2.Vòng đời và đặc điểm sinh học của Artemia 3
1.1.3.Thành phần hóa học của Artemia 4
1.1.4. Tình hình nuôi và sử dụng Artemia trên thế giới 5
1.1.5. Tình hình nuôi và sử dụng Artemia ở Việt Nam 6
1.2. Gốc tự do và chất chống oxy hóa 7
1.2.1. Gốc tự do 7
1.2.2. Chất chống oxy hóa 8
1.3. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến 9
1.3.1. In vitro 9
1.3.1.In vivo 12
1.4. Protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa 13
1.4.1. Khái quát về protein thủy phân 13
1.4.2. Một số nghiên cứu về protein thủy phân trong nước và thế giới 14
1.4.3. Thành phần chống oxy hóa của protein thủy phân 18
1.4.4. Ứng dụng của sản phẩm protein thủy phân 20
1.5. Thủy phân protein 21
1.5.1. Khái quát về quá trình thủy phân protein [13] 21
1.5.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein 22


iv

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 26
2.1.1. Nguyên vật liệu 26
2. 1.1.1. Artemia 26
2.1.1.2. Enzyme protease 26
2.1.2. Hóa chất 27
2.2 Phương pháp nghiên cứu 27
2.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 27
2.2.2. Bố trí thí nghiệm thu và xử lý mẫu 28
2.2.3. Xác định thành phần hóa học của Artemia 29
2.2.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân
bằng enzyme nội tại 30
2.2.5. Chọn loại enzyme protease thích hợp để thu được dịch protein Artemia
thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 31
2.2.6. Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch protein
Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 32
2.2.3. Xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia
thủy phân 38
2.3. Phương pháp phân tích 39
2.2.3. Các máy móc thiết bị sử dụng 39
2.2.4. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 39
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40
3.1. Thành phần hóa học của Artemia 40
3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại 43
3.3. Chọn loại enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy
phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 46
3.4. Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia
thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 49
3.4.1. Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy
phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 49

3.4.1. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân
có hoạt tính chống oxy hóa cao 51
v
3.4.2. Xác định pH thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính
chống oxy hóa cao 53
3.4.3.Xác định thời gian thủy phân thích hợp để dịch thủy phân Artemia có hoạt tính
chống oxy hóa cao 55
3.4. Xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch protein Artemia
thủy phân 58
3.4.1. Khối lượng phân tử của protein 58
3.4.2. Thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch protein Artemia thủy phân 58
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 61
1. KẾT LUẬN 61
2. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62


vi
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Vòng đời phát triển của Artemia 3
Hình 1.2. Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH 10
Hình 1.3. Cơ chế phản ứng tạo màu của nitrite bằng thuốc thử Greiss 11
Hình 1.4. Phản ứng tạo acid uric 11
Hình 1. 5. Phản ứng tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric 12
Hình 1.6. Hỗn hợp protein thủy phân 14
Hình 1.7. Qúa trình hấp thu các acid amin và peptide qua thành ruột 20
Hình 1.8. Qúa trình thủy phân protein và các peptide bằng endoprotease và exopeptidase 22
Hình 1.9. Qúa trình thủy phân để hình thành các peptide có hoạt tính sinh học 23
Hình 2.1. Hình ảnh sinh khối Artemia franciscana 26

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 27
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu và xử lý mẫu 28
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học của Artemia 29
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein
Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại 30
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn loại enzyme protease thích hợp để thu được
dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 31
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu
được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 33
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để dịch
protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 34
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp để thu được dịch
protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 35
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp để thu được
dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 36
Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa
trong dịch protein Artemia thủy phân 38
Hình 3.1. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng
enzyme nội tại 44
vii
Hình 3.2. Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại45
Hình 3.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng
các enzyme bổ sung khác nhau 47
Hình 3.4. Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme bổ
sung khác nhau 48
Hình 3.5. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng
enzyme Protamex ở các tỷ lệ enzyme/cơ chất khác nhau 49
Hình 3.6. Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme
Protamex ở các tỷ lệ enzyme/cơ chất khác nhau 50
Hình 3.7. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng

enzyme Protamex ở các nhiệt độ thủy phân khác nhau 51
Hình 3.8. Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme
Protamex ở các nhiệt độ thủy phân khác nhau 52
Hình 3.9. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein protein Artemia thủy phân
bằng enzyme Protamex ở các pH khác nhau 54
Hình 3.10. Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme
Protamex ở các pH khác nhau 55
Hình 3.11. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng
enzyme Protamex ở các khoảng thời gian thủy phân khác nhau 56
Hình 3.12. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein Artemia bằng enzyme
Protamex ở các khoảng thời gian thủy phân khác nhau 57
Hình 3.13. Khối lượng phân tử của protein trong dịch protein Artemia thủy phân 58


viii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của Artemia franciscana[8] 4
Bảng 1.2. Thành phần acid amin của Artemia franciscana [8] 4
Bảng 2.1. Điều kiện hoạt động thích hợp và điều kiện xử lý để vô hoạt các enzyme 26
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong phân tích 27
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của sinh khối Artemia 40
Bảng 3.2. Thành phần acid amin của sinh khối Artemia 40
Bảng 3.3. Thành phần acid béo của sinh khối Artemia 41
Bảng 3.4. Thành phần có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân 59

ix
DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu viết tắt Diễn giải

DPPH 2,2 diphenyl-1picrylhydrazyl
DPPH-H 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine
MDA Malonyl dialdehyde
DHA Docosahexaenoic acid
EPA Eicosapentaenoic acid
E/S Tỷ lệ enzyme/cơ chất
TCA Tricloactic acid





1
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây ngành chế biến thủy sản đạt được nhiều thành tựu
đáng ghi nhận. Bên cạnh những giá trị mang lại từ các sản phẩm chủ lực của ngành
như sản phẩm đông lạnh, sản phẩm khô… thì việc nghiên cứu phát triển sản phẩm mới
để sử dụng hiệu quả hơn các nguồn nguyên liệu sẵn có là yêu cầu cấp thiết đặt ra đối
với ngành thủy sản trong điều kiện nguồn nguyên liệu thủy sản khai thác tự nhiên ngày
càng suy giảm.
Không phải là đối tượng thủy sản có giá trị xuất khẩu cao, Artemia hiện đang là
đối tượng được diêm dân nhiều tỉnh miền Trung và miền Tây nam bộ nuôi và coi là
con “xóa đói giảm nghèo”
Artemia là tên của một loài giáp xác nhỏ sống ở những vùng nước mặn có biên
độ mặn rộng từ vài phần nghìn đến 250‰. Với chu trình sinh trưởng ngắn, sau 10 - 15
ngày chúng có thể đạt giai đoạn trưởng thành và tham gia sinh sản. Artemia có thể
sinh sản lần đầu sau 8 ngày phát triển. Mỗi lần đẻ khoảng 300 trứng hoặc con, với chu
kỳ đẻ 4 ngày /lần vì vậy lượng sinh khối Artemia thu được rất lớn. Hiện tại, các nghiên
cứu chế biến Artemia còn rất hạn chế đặc biệt là chế biến Artemia thành thực phẩm
cho người chưa được quan tâm. Artemia chủ yếu được sử dụng dưới dạng sinh khối

tươi dùng làm thức ăn nuôi thủy sản. Phần sinh khối dư thừa hiện chưa được sử dụng
một cách hiệu quả; do vậy việc nghiên cứu chế biến Artemia thành các sản phẩm thực
phẩm là cần thiết nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng loại nguyên liệu thủy sản giàu
protein này.
Hiện nay, có nhiều nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là
các chất có hoạt tính chống oxy hóa từ protein của sinh vật biển. Protein thủy phân có
giá trị sinh học chứa các peptide, acid amin có hoạt tính chống oxy hóa được sử dụng
rộng rãi trong các lĩnh vực như thực phẩm, thực phẩm chức năng, thực phẩm thuốc và
mỹ phẩm. Ngoài ra, protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa được coi là chất
chống oxy hóa tự nhiên nên đáp ứng tốt cho xu thế tiêu dùng các sản phẩm có nguồn
gốc tự nhiên.
Từ các phân tích trên cho thấy “Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của protein
thủy phân từ sinh khối Artemia ” là cần thiết, là một hướng đi mới nhằm khai thác các
2
chất chống oxy hóa tự nhiên từ sinh vật biển và góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng
sinh khối Artemia.
Mục tiêu của đề tài
Thăm dò khả năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ Artemia để làm cơ sở cho
việc nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất chế phẩm có hoạt tính chống oxy hóa từ Artemia.
Nội dung nghiên cứu:
1. Xác định thành phần hóa học của Artemia.
2. Xác định loại enzyme và điều kiện thủy phân thích hợp để thu được sản phẩm
protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa.
3. Xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong sản phẩm protein
Artemia thủy phân.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
Ý nghĩa khoa học:
- Thăm dò và xác định được khả năng sản xuất sản phẩm protein thủy phân có
hoạt tính chống oxy hóa từ Artemia.
- Tạo ra dữ liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên, học viên sau đại

học, giảng viên, các nhà nghiên cứu, các nhà sản xuất trong ngành thủy sản nói chung
và chế biến thủy sản nói riêng.
Ý nghĩa thực tiễn:
- Mở ra khả năng tận dụng nguồn sinh khối Artemia, nâng cao thu nhập cho diêm
dân nhờ khai thác nguồn protein có giá trị từ Artemia.
- Mở ra khả năng sản xuất sản phẩm mới từ Artemia phục vụ tốt cho các đối
tượng có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt như trẻ em, người già và người bệnh.
- Đa dạng hóa các chất chống oxy hóa tự nhiên từ thủy sản.






3
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN
1.1. Artemia
1.1.1. Phân loại
Artemia thuộc nhóm giáp xác có hệ thống phân loại như sau [10] :
Ngành: Arthropoda
Lớp: Crustacea
Lớp phụ: Brachiopoda
Bộ: Anostraca
Họ: Artemidae
Giống: Artemia
Artemia đã được xác định gồm 6 loài: Artemia salina, Artemia tunisiana, Artemia
franciscana, Artemia perrsimilis, Artemia monica, Artemia urmiana.
1.1.2. Vòng đời và đặc điểm sinh học của Artemia
Để hoàn thành vòng đời của mình, Artemia trải qua nhiều giai đoạn phát triển
khác nhau như giai đoạn trứng bào xác, giai đoạn bung dù, giai đoạn ấu trùng, giai

đoạn lột xác và giai đoạn trưởng thành. Artemia tiền trưởng thành và trưởng thành
được gọi là sinh khối. Vòng đời của Artemia được thể hiện ở Hình 1.1.

Hình 1.1. Vòng đời phát triển của Artemia
4
Artemia có thể sống ở những vùng nước mặn có biên độ mặn rộng từ vài phần
nghìn đến 250‰. Artemia ăn lọc không có tính chọn lựa, thức ăn chủ yếu là các hạt lơ
lửng trong nước và các sinh vật kích thước nhỏ như tảo và vi khuẩn. Với chu trình sinh
trưởng ngắn, sau 10 - 15 ngày chúng có thể đạt giai đoạn trưởng thành và tham gia
sinh sản. Tùy theo điều kiện môi trường, Artemia có sự sinh trưởng và sinh sản khác
nhau, có dòng đơn tính, dòng lưỡng tính, đẻ con hay đẻ trứng. Khi nồng độ muối trong
môi trường sống cao hơn 70‰, dinh dưỡng kém và nhiệt độ cao thì Artemia có xu
hướng đẻ trứng bào xác [9]. Artemia có thể sinh sản lần đầu sau 8 ngày phát triển,
thường là sau 12 - 15 ngày. Mỗi lần đẻ khoảng 300 trứng hoặc con, với chu kỳ đẻ 4
ngày/lần. Trong điều kiện tốt Artemia sống được khoảng 6 tháng [1, 10].
1.1.3. Thành phần hóa học của Artemia
Thành phần hóa học cơ bản của Artemia được thể hiện ở Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của Artemia franciscana[8]
STT Thành phần
Hàm lượng
(% so với trọng lượng khô)
1 Protein 67,80
2 Lipid 8,84
3 Acid amin 5,40
4 Tro 10,20
5 Acid béo 6,76

Sinh khối Artemia có chứa hàm lượng protein khá cao chiếm 67,8% so với trọng
lượng khô, hàm lượng lipid trung bình; nên rất thích hợp để sản xuất sản phẩm từ
protein. Ngoài ra, sinh khối Artemia còn chứa hàm lượng cao các acid amin tự do.

Thành phần của các acid amin tự do trong sinh khối Artemia được thể hiện ở Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Thành phần acid amin của Artemia franciscana [8]
STT Thành phần acid amin Hàm lượng (mg/kg)
1 Alanine 219,04
2 Glycine 41,39
3 Valine
*
3.871,67
4 Leucine
*
1.176,92
5 Isoleucine
*
3.043,80
5
6 Threonine
*
398,04
7 Serine 584,13
8 Proline 810,48
9 Asparagine 5.666,02
10 Methionine
*
3.030,89
11 4-Hydroxyproline 6.215,32
12 Glutamine 81,82
13 Phenylalanine
*
4.144,41
14 Lysine

*
6.502,44
15 Histidine 3.743,73
16 Tyrosine 14.671,89
Tổng hàm lượng acid amin 54.201,99

* Aicd amin không thay thế
Protein Artemia rất giàu acid amin không thay thế, đặc biệt là giàu tyrosine và
lysine; hàm lượng tyrosine chiếm 27% và hàm lượng lysine chiếm 12% tổng hàm
lượng acid amin. Tyrosine là acid amin giúp trẻ tỉnh táo và tiếp nhận thông tin nhanh;
lysine là acid amin kích thích tiêu hóa tạo cảm giác ngon miệng, gia tăng chuyển hóa,
giúp hấp thu tối đa dinh dưỡng và phát triển chiều cao.
Artemia rất giàu các acid béo không no; hàm lượng các acid béo không no chiếm
68,4% tổng hàm lượng acid béo. Trong đó, hàm lượng các acid béo không no có từ 2
nối đôi trở lên chiếm 45,9% và hàm lượng các acid béo không no có từ 4-6 nối đôi
chiếm 9,2% tổng hàm lượng acid béo không no [8]. Các acid béo không no như
eicosapentaenoic aicd (EPA) và docosahexaenoic acid (DHA) là các acid béo thiết yếu
đối với cơ thể. EPA có tác dụng làm giảm triglyceride và cholesterol, giảm độ nhớt
của máu, chống tăng huyết áp, phòng ngừa bệnh tim mạch và chống viêm. DHA đóng
vai trò quan trọng trong sự hoàn thiện chức năng nhìn của mắt và sự phát triển của hệ
thần kinh; bên cạnh đó DHA còn có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, giảm
triglyceride trong máu và phòng ngừa xơ vữa động mạch.
Vì vậy, nghiên cứu sử dụng Artemia làm nguyên liệu chế biến thực phẩm giàu
dinh dưỡng phục vụ cho con người là hướng đi đầy triển vọng góp phần đẩy mạnh
phát triển thực phẩm thủy sản và nâng cao hiệu quả cho nghề nuôi Artemia.
1.1.4. Tình hình nuôi và sử dụng Artemia trên thế giới
Artemia được biết đến vào những năm 30 của thế kỷ XX khi người ta phát hiện ra
chúng là loại thức ăn sống có giá trị dinh dưỡng cao cho việc ương nuôi giống các loài
6
thủy sản như tôm, cá cảnh, động vật thân mềm. Artemia có thể đáp ứng rất tốt cho nhu

cầu dinh dưỡng trong giai đoạn ấu trùng của các loài tôm, cá.
Các quần thể Artemia được tìm thấy rải rác khắp các vùng nhiệt đới, cận nhiệt
đới và ôn đới. Chúng phân bố dọc ven biển hay cả những hồ nước mặn trong nội địa.
Artemia có nhiều ở vịnh San Francisco và hồ Mono ở Mỹ, vịnh Bohai ở Trung Quốc
và hồ Chaplin ở Canada [1, 8].
Cho đến nay, nguồn cung cấp Artemia chủ yếu là Mỹ, Trung Quốc. Năm 2000,
sản lượng trứng Artemia ở Mỹ đạt 8200 tấn và duy trì ở mức 8314 tấn trong các năm
2001, 2002 [9]. Trong khi đó, sản lượng thu hoạch ở hồ Urmia xấp xỉ 100 tấn và ở
vịnh Bohai từ 800 - 1.000 tấn. Do tình hình khai thác ngoài tự nhiên không ổn định
nên một số nước như Brazil, Australia, Philippine và Thái Lan đã du nhập Artemia từ
Mỹ và ương nuôi trên ruộng muối nên sản lượng Artemia hàng năm đều tăng cao. Một
số khu vực của Đông Nam Á có diện tích sản xuất muối lớn nhưng không có Artemia
phân bố tự nhiên như Thái Lan, Philippine và Việt Nam thì việc chủ động di giống và
thuần hóa loài Artemia thích hợp cho việc nuôi trên ruộng muối sẽ làm tăng thêm
nguồn thu nhập, đáp ứng nhu cầu về trứng và sinh khối Artemia phục vụ cho nghề
nuôi thủy sản.
Hiện nay, sản phẩm Artemia thương mại thường là dạng trứng đóng hộp, phần
sinh khối Artemia chủ yếu được sử dụng ở dạng tươi hoặc chế biến thành thức ăn dạng
bột để ương nuôi các loài thủy sản [10].
1.1.5. Tình hình nuôi và sử dụng Artemia ở Việt Nam
Artemia không phân bố tự nhiên ở Việt Nam, năm 1982 nó được du nhập vào
Việt Nam dưới dạng thức ăn dùng cho ấu trùng tôm càng xanh. Sau đó, Artemia bắt
đầu được thả nuôi thử nghiệm ở Khánh Hòa (1982), Bạc Liêu (1984), Sóc Trăng
(1984), Bình Thuận (1991) và Vũng Tàu (1995). Mặc dù được thả nuôi thử nghiệm ở
nhiều vùng nhưng Artemia được nuôi khá thành công ở vùng ven biển Sóc Trăng, Bạc
Liêu nhờ vào kỹ thuật nuôi Artemia của Viện Khoa học Thủy sản - Trường Đại học
Cần Thơ. Đến năm 1990 đối tượng này được triển khai sản xuất đại trà cho các hộ
diêm dân ở Sóc Trăng và Bạc Liêu. Sóc Trăng và Bạc Liêu trở thành hai vùng nuôi
trọng điểm cung cấp trứng bào xác có chất lượng cao cho thị trường [10]. Ngoài ra,
Artemia còn được nuôi ở một số địa phương khác như Khánh Hòa, Bình Thuận…

7
Artemia có nhiều loài, Artemia được nuôi rộng rãi ở Việt Nam là loài Artemia
franciscana. Với hàm lượng đạm trên 50%, chất béo trên 10% và hàm lượng acid
béo acid béo không no bậc cao biến động trong khoảng 0,3 - 15mg/100g trọng lượng
khô [36]. Sinh khối Artemia ngày càng trở thành nguồn thức ăn được lựa chọn để
thay thế cho nhiều loại thức ăn sống trong nuôi trồng thủy sản như monia, trùng chỉ,
giun đỏ [10].
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về sử dụng sinh khối Artemia tươi sống
và chế biến thức ăn viên từ Artemia sấy khô làm thức ăn cho các đối tượng tôm sú,
tôm càng, cá kèo, cua biển tại khoa nuôi trồng Đại học Cần Thơ [10]. Tuy nhiên,
mục đích chính của nuôi Artemia hiện nay là thu trứng bào xác làm thức ăn cho ấu
trùng tôm, cá cảnh; còn lại một lượng lớn sinh khối Artemia chưa được sử dụng một
cách có hiệu quả [9]. Đã có một số nghiên cứu tận dụng nguồn sinh khối Artemia sản
xuất thức ăn dạng bột dùng cho nuôi thủy sản [10]; các nghiên cứu sử dụng Artemia
làm thực phẩm dùng cho con người chưa được quan tâm.
Vì vậy, nghiên cứu phát triển thực phẩm cho người đặc biệt là thực phẩm chứa
các hoạt chất sinh học từ sinh khối Artemia mở ra một hướng đi mới góp phần thúc
đẩy nghề nuôi Artemia, nâng cao thu nhập cho diêm dân và đa dạng nguồn thực
phẩm cho con người.
1.2. Gốc tự do và chất chống oxy hóa
1.2.1. Gốc tự do
Gốc tự do là một thuật ngữ khoa học dùng để chỉ các phân tử hóa học có điện tử
độc thân không ghép đôi. Vì chứa điện tử độc thân nên gốc tự do hoạt động rất mạnh
gây ra các tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA… [55].
Trong cơ thể con người gốc tự do được sinh ra do nhiều nguyên nhân khác nhau
như quá trình hô hấp tế bào, cơ chế giải độc ở gan, ảnh hưởng của tia bức xạ, tia tử
ngoại, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm có chứa chất màu tổng hợp và nước có
nhiều chlorine [31].
- Lợi ích của gốc tự do
Trong điều kiện có kiểm soát, gốc tự do là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ

thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần tạo ra prostaglandin - có tác
dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ quá trình dẫn truyền tín
hiệu thần kinh và co duỗi cơ [44, 51].
8
- Tác hại của gốc tự do
Đối với sức khỏe con người: Khi cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sản sinh ra có giới
hạn vì bị cân bằng bởi hệ thống chống oxy hóa có sẵn trong cơ thể. Khi hệ thống
chống oxy hóa của cơ thể bị suy giảm số lượng gốc tự do sinh ra ngày càng tăng, các
gốc tự do thúc đẩy phản ứng lên ty lạp thể gây tổn thương các phân tử bằng cách làm
thay đổi hình dạng, cấu trúc khiến chúng mất khả năng sản xuất năng lượng; gây hủy
hoại màng tế bào và cấu trúc di truyền trong nhân tế bào. Gốc tự do là nguyên nhân
của nhiều căn bệnh nguy hiểm như ung thư, loét dạ dày, viêm khớp, đẻ non [26], thiếu
máu cục bộ, xơ vữa động mạch [38], đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp
không rõ nguyên nhân [53], Alzheimer, Parkinson [50] và bị lão hóa sớm [57].
Trong lĩnh vực thực phẩm: Oxy hóa lipid là mối lo ngại lớn vì nó tạo ra các chất
có phân tử lượng thấp như aldehyd, xeton, alcol, alkan, các acid ngắn mạch… dẫn đến
sự hình thành màu sắc, mùi vị không mong muốn; làm giảm thời hạn sử dụng của thực
phẩm và có khả năng gây độc đối với cơ thể [49].
Vì vậy, nghiên cứu chất chống oxy hóa trở thành vấn đề được ngành dược, thực
phẩm thuốc cũng như ngành chế biến và bảo quản thực phẩm rất quan tâm [47].
1.2.2. Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là các chất có khả năng ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình
oxy hóa chất khác [32]. Chất chống oxy hóa được chia làm hai loại là chất chống oxy
hóa tự nhiên và chất chống oxy hóa tổng hợp.
Chất chống oxy hóa được coi là tự nhiên nếu nó được tách chiết từ nguyên liệu tự
nhiên hay được chuyển hóa bằng con đường sinh học như sử dụng tế bào của chính nó
hoặc sử dụng enzyme. Một số chất chống oxy hóa được thu nhận từ tự nhiên như
retinoids (vitamine A), tocopherols (vitamine E), ascorbic acid (vitamine C),
polyphenols, carotenoids, manganese, zinc, selenium [32]. Protein thủy phân có hoạt
tính chống oxy hóa thu nhận từ quá trình thủy phân protein động thực vật bằng

enzyme cũng được coi là chất chống oxy hóa tự nhiên.
Chất chống oxy hóa tổng hợp là các chất chống oxy hóa được tạo thành bằng con
đường hóa học. Một số chất chống oxy hóa tổng hợp được sử dụng rộng rãi như
butylated hydrotolene (BHT), butylated hydroanisole (BHA), propyl gallate (PG),
ethoxyquin, nordihydroguai acetic acid (NDGA), 2,4,5-trihydroybutyrophenone
9
(THBP), octyl gallate (OG), tertiary butyl hydroquinone (TBQH, tertiary butyl
hydroquinone (TBQH) [32].
Các nghiên cứu về chất chống oxy hóa tự nhiên và chất chống oxy hóa tổng hợp
cho thấy các chất chống oxy hóa tự nhiên đa dạng hơn, tạo ra nhiều tác động tích cực
đến chất lượng cảm quan khi bổ sung vào thực phẩm và dễ dàng được chấp nhận bởi
người tiêu dùng và các cơ quan y tế [34]. Tuy nhiên, so với các chất chống oxy hóa
tổng hợp thì các chất chống oxy hóa tự nhiên trong thành phần còn có nhiều chất khác
và hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn.
Các thăm dò xu thế tiêu dùng trên thế giới về các chất chống oxy hóa cho thấy,
hiện nay người tiêu dùng ngày càng có xu hướng sử dụng các chất chống oxy hóa có
nguồn gốc tự nhiên vì giá trị dinh dưỡng và tính an toàn của nó [34]. Do đó, nhiều
quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm, đầu tư vào việc nghiên cứu thu nhận và ứng
dụng các chất chống oxy hóa tự nhiên trong các lĩnh vực như thuốc, thực phẩm chức
năng, mỹ phẩm.
1.3. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến
1.3.1. In vitro
1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH
Goldschmidt và Rern (1992) đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm,
hầu như không phân hủy và không phản ứng với oxy đó chính là gốc tự do 2,2
diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH). Gốc tự do DPPH có màu tím như màu của dung
dịch KMnO
4
, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như methanol, ethanol.
Dung dịch DPPH có độ hấp phụ cực đại ánh sáng tại bước sóng 517 nm, sản phẩm khử

của nó là 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH – H) có màu vàng cam.
Nguyên lý
Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH bằng cách cho
hydrogen, làm giảm độ hấp phụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng
sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt
[47, 42]
. Phản ứng trung hòa gốc tự do
DPPH của các chất chống oxy hóa như sau:
10
.
.
.



Hình 1.2. Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH
2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử
Nguyên lý
Khi cho chất có khả năng chống oxy hóa phản ứng với Potassium ferricyanide,
Trichloro acetic acid và Ferric chloride ở 50
O
C trong thời gian 20 phút sẽ tạo thành
phức màu xanh làm tăng độ hấp phụ của hỗn hợp ở bước sóng 700 nm [47]. Sự tăng
độ hấp phụ của hỗn hợp cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của hỗn hợp tăng.
3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng ức chế gốc tự do
nitric oxide
Nguyên tắc
Nitric oxide ( NO ) phản ứng với oxy tạo ra sản phẩm bền vững là nitrite và
nitrate, chất ức chế gốc tự do ( NO ) sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả làm giảm
hàm lượng nitrite tạo thành trong dung dịch nước, nồng độ nitrite trong dung dịch

nước được xác định bằng phương pháp phân tích quang học sử dụng thuốc thử Greiss.
Trong đó, nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo naphthyl
- amino azobenzene sulfonic bền vững và có bước sóng hấp thụ cực đại ở 540 nm. Dựa
trên sự giảm nồng độ nitrite tạo thành tính được khả năng khử gốc tự do ( NO ) của
chất chống oxy hóa [47, 42].

+ AH
→


+ A


DPPH
Màu tím

DPPH-H
Màu vàng
Chất chống oxy hóa
.


11
.

Hình1.3. Cơ chế phản ứng tạo màu của nitrite bằng thuốc thử Greiss
4. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng tạo phức càng cua với
ion sắt II
Nguyên lý
Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Khi cho ion

Fe
2+
tác dụng với thuốc thử Ferrozin sẽ sinh ra phức màu có độ hấp phụ cực đại tại
bước sóng 562 nm
[42]
. Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào phức, không cho kim loại
tồn tại ở dạng tự do nên làm mất khả năng xúc tác của kim loại.
Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử sẽ được đánh giá dựa trên khả năng ngăn
chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe
2+
với thuốc thử Ferrozin.
5. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng ức chế enzyme
Xanthine oxidase
Nguyên lý
Xanthine oxidase là một enzyme oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine
tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O Acid uric có bước sóng hấp phụ
cực đại tại 290 nm
[46]
. Nếu mẫu thử có khả năng ức chế enzyme XO càng cao càng
hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm độ hấp phụ.

Xanthine Acid Uric
Hình 1.4. Phản ứng tạo acid uric
12
1.3.1. In vivo
1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào hàm lượng Malondialdehyde
Malondialdehyde (MDA) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid
màng tế bào nên được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của
màng tế bào.
Nguyên tắc

MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho MDA
phản ứng với acid thiobarbituric ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ 90-100
O
C trong
thời gian từ 10-15 phút sẽ tạo phức màu hồng. Phức màu được hòa tan trong dung môi
hữu cơ như butanol sau đó được đo phổ hấp phụ tại bước sóng 532nm. Dựa trên sự
giảm cường độ hấp phụ của phức tính được khả năng chống oxy hóa của chất cần
nghiên cứu
[52]
.
Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric được biểu diễn như sau:

Malondialdehyde Acid Thiobarbituric Phức NIFES (màu hồng)
Hình 1. 5. Phản ứng tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric
2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên sự khử Glutathione
Glutathione là thành phần thiết yếu của tế bào, nó đóng vai trò quan trọng trong
các chuyển hóa của cơ thể, với các chức năng chính bao gồm: Chất chống oxy hóa,
tăng cường miễn dịch, giải độc, tăng cường năng lượng, làm trắng da và mờ vết nám.
Sự thiếu hụt glutathione trong các sinh vật sống sẽ dẫn đến sự rối loạn và tổn thương
các mô, là nguyên nhân của các bệnh lý như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh phổi, bệnh
tiêu hóa, Alzheimer, tiểu đường…. Khi cơ thể khỏe mạnh, mỗi tế bào trong cơ thể sản
sinh đủ glutathione để bảo vệ cơ thể khỏi ô nhiễm môi trường, stress và các chất độc
hại khác.


13
Nguyên lý
Mức độ glutathione của tế bào được xác định bằng cách cho hỗn hợp chứa
glutathione đã được đồng hóa phản ứng với thuốc thử Ellman (5-5 dithiobis-
2nitrobenzoic acid). Hỗn hợp được đo ở bước sóng 412 nm, độ hấp phụ của hỗn hợp

được so sánh với đường cong glutathione chuẩn, từ đó tính được hàm lượng glutathion
trong mô [52].
3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng ức chế enzyme catalase
Catalase là enzyme đóng vai trò phân hủy hydroperoxide (H
2
O
2
) trong hầu hết
các cơ thể sinh vật. Enzyme catalase có nhiều trong peroxisome của tế bào và xúc tác
phản ứng chuyển hóa H
2
O
2
thành nước và oxy; bảo vệ tế bào khỏi sự phá hủy của
hydroperoxide và hydroxyl.
Nguyên lý
Hoạt tính của enzyme catalase được xác định theo phương pháp của Aebi bằng
cách cho hỗn hợp chứa enzyme catalase phản ứng với H
2
O
2
trong đệm phosphat. Tỷ lệ
H
2
O
2
bị phân hủy được xác định bằng cách đo độ hấp phụ của hỗn hợp tại bước sóng
240 nm. Hoạt tính chống oxy hóa của enzyme được đánh giá dựa trên sự giảm hàm
lượng H
2

O
2
[52].
Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng được sử dụng
rộng rãi trong đánh giá hoạt tính chống oxy hóa; nhằm tìm ra những hợp chất có khả
năng ức chế gốc tự do cũng như ngăn chặn các quá trình sinh ra nó, những hợp chất
này được gọi là các chất chống oxy hóa. Các chất chống oxy hóa có thể được sản sinh
tự nhiên trong cơ thể như các enzyme superoxide dismutase, catalase, glutathione
peroxidase; có sẵn trong các loại thực phẩm như vitamin E, vitamin C và các hợp chất
thuộc họ phenolic như flavonoid, stilbene, lignan, tannin hoặc các chất chống oxy hóa
được hình thành từ quá trình chế biến thực phẩm như các acid amin, các dipeptide và
tripeptide
Mặc dù hiện nay có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa nhưng
đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng
lực khử được sử dụng rộng rãi vì đây là các phương pháp đơn giản, có độ tin cậy cao,
ít tốn kém và dễ áp dụng.
1.4. Protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa
1.4.1. Khái quát về protein thủy phân
Protein thủy phân là hỗn hợp sản phẩm thủy phân protein, bao gồm các acid amin
tự do, các polypeptide, các peptide với chiều dài mạch khác nhau và cả các protein
chưa bị thủy phân [21, 22].
14

Hình 1.6. Hỗn hợp protein thủy phân
Nguyên liệu để sản xuất protein thủy phân có thể là protein đã qua tinh chế hoặc
nguyên liệu thô giàu protein [22]. Trong quá trình sản xuất protein thủy phân, điều
quan trọng nhất là không làm giảm đi các tính chất chức năng của protein ban đầu
[35]. Do đó, các phương pháp sản xuất cũng như các thông số của quá trình thủy phân
cần được chọn lọc và kiểm soát nghiêm ngặt nhằm hạn chế tối đa việc làm biến tính
protein [41, 43]. Nhiều nghiên cứu đang hướng đến ứng dụng những kỹ thuật mới,

hiện đại, điều kiện vận hành nhẹ nhàng để thu được sản phẩm chất lượng cao [54, 53].
1.4.2. Một số nghiên cứu về protein thủy phân trong nước và thế giới
1. Nghiên cứu trong nước
Trong nước có nhiều công trình công bố về ứng dụng enzyme trong sản xuất các
sản phẩm thủy phân, các công trình nghiên cứu tập trung chủ yếu ở các lĩnh vực như
sản xuất nước mắm ngắn ngày, sản xuất dịch đạm thủy phân, bột đạm thủy phân,
pasta, bột dinh dưỡng. Một số công trình nghiên cứu ở trong nước như sau:
- Ngô Thị Mại và Nguyễn Thị Dự (1991) đã thủy phân cá bằng bổ sung enzyme
Bacillus subtilis. Kết quả cho thấy khi bổ sung 0,3% chế phẩm B. subtilis vào chượp
thì thời gian chế biến nước mắm giảm xuống còn 30 - 35 ngày trong điều kiện tự nhiên
của mùa hè, sản phẩm thu được là dịch đạm có hàm lượng acid amin cao [14].
- Nguyễn Văn Lệ (1996) công bố nghiên cứu về sản xuất bột đạm thủy phân từ
đầu tôm và từ cá bằng cách sử dụng enzyme protease tách chiết từ đầu tôm. Kết quả
thu được bột đạm có hàm lượng acid amin cao, có mùi thơm đặc trưng [11].
- Vũ Ngọc Bội (2004) đã công bố các nghiên cứu về thu nhận và sử dụng
protease B. subtilis S5 trong sản nước mắm ngắn ngày và sản xuất bột đạm thủy phân
từ nguyên liệu cá cơm. Kết quả thu được bột đạm có hàm lượng acid amin tự do cao
hơn, mùi thơm hơn và đạt các chỉ tiêu vi sinh vật; bên cạnh đó nước mắm cá cơm cao
15
đạm sản xuất bằng cách sử dụng enzyme B. subtilis S5 để thủy phân có hàm lượng,
thành phần acid amin cao hơn nước mắm cốt sản xuất bằng phương pháp truyền thống
và các phương pháp khác [2].
- Đỗ Văn Ninh (2004) đã công bố nghiên cứu về sản xuất dịch đạm thủy phân từ
cá mối và pasta cá bằng cách sử dụng enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá và gan
mực. Kết quả nghiên cứu cho thấy bột protein cá thủy phân có hàm lượng nitơ acid
amin cao, có đầy đủ và cân đối các acid amin không thay thế và tương đối đủ khoáng
chất; lượng acid amin tự do trong bột protein thủy phân cao gấp 16 lần so với thịt cá
tươi. Từ bột đạm protein thủy phân có thể sản xuất bột dinh dưỡng cao đạm bằng cách
phối chế với các loại bột đậu, bột gạo, dầu ăn, khoáng và các vitamin. Nghiên cứu
cũng cho thấy có thể sản xuất pasta cá bằng cách phối chế bột đạm protein thủy phân

với tinh bột, đường, sorbitol và các loại gia vị khác [16].
- Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) công bố các nghiên cứu về sử dụng protease từ
đầu tôm bạc nghệ trong sản xuất bột đạm thủy phân từ thịt cá mối. Kết quả nghiên cứu
cho thấy bột đạm thủy phân thịt cá mối bằng enzyme có hàm lượng các acid amin cao,
có mùi thơm đặc trưng [20].
- Lý Thị Minh Phương (2008) nghiên cứu sản xuất chế phẩm dịch thủy phân từ
thịt hàu biển. Kết quả nghiên cứu cho thấy thịt hàu thủy phân bằng enzyme Allzyme
FD thu được dịch thủy phân có hàm lượng acid amin cao, có mùi thơm đặc trưng và
đảm bảo các tiêu chuẩn về vi sinh vật [17]. Kết quả phân tích acid amin cho thấy dịch
thủy phân hàu chứa hàm lượng cao acid amin phenylalanine, tyrosine và lysine.
- Lâm Tuyết Hận (2009) nghiên cứu sản xuất bột cá thủy phân bằng cách sử dụng
enzyme protease thu từ nội tạng cá chẽm làm xúc tác cho quá trình thủy phân thịt cá.
Kết quả thu được bột cá có giá trị dinh dưỡng cao, mùi thơm đặc trưng, hòa tan tốt
trong nước và khả năng tạo gel cao [7].
- Huỳnh Dự (2010) nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân từ phế liệu mực để bổ
sung vào thức ăn nuôi cá. Kết quả thu được dịch thủy phân có hàm lượng acid amin
cao, dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ; khi bổ sung vào thức ăn nuôi cá cho thấy tốc độ lớn của
cá nhanh hơn [5].
- Triệu Minh Hiển (2010) nghiên cứu chế biến bột đạm từ sinh khối Artemia
bằng phương pháp sử dụng enzyme protease. Kết quả thu được sản phẩm bột đạm thủy