Nghiên cứu phương pháp chế tạo một số vật liệu xenlulo cố định enzym phân huỷ protein sử dụng điều trị vết thương

1

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG





NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga
(2010 - 2012)






BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO MỘT SỐ VẬT LIỆU XENLULO
CỐ ĐỊNH ENZYM PHÂN HỦY PROTEIN
SỬ DỤNG ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG

Hà Nội - 2012
2

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
(Theo Nghị định thư Khoa học – Công nghệ với Liên bang Nga)
(2010 - 2012)

Thông tin chung về Nhiệm vụ:
Tên Nhiệm vụ:
Nghiên cứu phương pháp chế tạo một số vật liệu xenlulo cố định enzym phân hủy
protein sử dụng điều trị vết thương
Thời gian thực hiện: 30 tháng
Từ tháng 1 năm 2010 đến tháng 6 năm 2012
Họ tên Chủ nhiệm phía Việt Nam: Huỳnh Thị Hà
Học hàm, học vị, chuyên môn: Tiến sỹ Khoa học Vật liệu
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính
Cơ quan chủ trì Việt Nam :
Viện Công nghệ môi trường, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Họ và tên Chủ nhiệm đối tác nước ngoài: V. N. Filatov
Học hàm, học vị, chuyên môn: GS, TSKH, Hóa sinh
Chức danh khoa học:
Viện trưởng, Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt, Viện Hàn lâm Kỹ thuật Nga.
Địa chỉ: 129344, 17a. Ul. Iskra, Moskva, LB Nga
Xuất xứ thỏa thuận đã có với đối tác nước ngoài:
Thời gian ký kết thoả thuận:

Thỏa thuận với Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt, Viện Hàn lâm Kỹ thuật Nga được
ký ngày 29 tháng 5 năm 2009.
Cấp ký kết thoả thuận:
- Về phía đối tác Nga: do Viện trưởng, Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt, Viện Hàn
lâm Kỹ thuật Nga, GS. TSKH. V. N. Filatov ký.
- Về phía Việt Nam: do Viện trưởng, Viện Công nghệ môi trường, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt nam, PGS. TS. Nguyễn Hoài Châu ký.
3

DANH SÁCH CÁC CÁN BỘ THAM GIA NHIỆM VỤ
STT

Họ và tên Đơn vị Nội dung công việc
1 TS. Huỳnh Thị Hà
Viện Công
nghệ môi
trường, Viện
KH&CN VN
Chủ trì Nhiệm vụ, phụ trách
mảng nghiên cứu phương pháp
chế tạo một số vật liệu xenlulo
cố định enzym phân hủy
protein.
2 PGS. TSKH. Ngô Quốc Bưu
3 PGS. TS. Nguyễn Hoài Châu
4 CN. Đào Trọng Hiền
5 KS. Nguyễn Thúy Phượng
6 KS. Lê Anh Bằng
7 KS. Hoàng Thị Mai
8 TS. Phạm Thị Bích Hợp

Viện Công
nghệ Sinh học,
Viện KH&CN
VN
Đánh giá hoạt tính của enzym
và hoạt tính của vật liệu
xenlulo cố định enzym phân
hủy protein
9 TS. Phí Quyết Tiến
10 Phan Thị Hồng Thảo
11 KS. Vũ Văn Lợi
12 TS. Nguyễn Duy Nhứt
Viện NC&ƯD
CN Nha Trang
Tách chiết enzym từ gan tụy
cua biển Việt Nam
13 PGS. TS. Nguyễn Gia Tiến
Viện Bỏng
Quốc gia
Đánh giá tiền lâm sàng của
băng xenlulo cố định enzym
phân hủy protein.
14 TS. Nguyễn Như Lâm
15 GS. VS. Filatov V. N.
Viện NCVLD
Moskva
Thường xuyên cung cấp thông
tin mới về vật liệu xenlulo,
giúp đỡ xác định phương
hướng nghiên cứu, tạo điều

kiện cho các cán bộ VN tiếp
xúc với các cơ quan và các nhà
khoa học Nga, cung cấp
enzym, hướng dẫn phương
pháp nghiên cứu tính chất và
đánh giá chất lượng sản phẩm,
giảng bài và tham dự hội thảo
tại VN.
16 TSKH. Medusheva E. O.

4

MỤC LỤC
Thông tin chung về Nhiệm vụ: 2
DANH SÁCH CÁC CÁN BỘ THAM GIA NHIỆM VỤ 3
MỤC LỤC 4
СÁС TỪ VIẾT TẮT 7
DANH MỤC BẢNG 8
DANH MỤC HÌNH 11
ĐẶT VẤN ĐỀ 15
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI
NƯỚC 17
1.1. Một số tính chất cơ bản của vật liệu xenlulo và enzym sử dụng trong y học 17
1.2. Vật liệu phủ vết thương trên cơ sở xenlulo cố định enzym 18
1.3. Viện NCVLD Moskva đi đầu trong nghiên cứu chế tạo vật liệu phủ vết thương
hiệu quả cao 23
1.4. Một số tính chất đặc thù của vật liệu phủ vết thương cố định enzym 25
1.5. Đặc tính công nghệ của vật liệu phủ vết thương trên cơ sở xenlulo biến tính do
Viện NCVLD Moskva đề xuất 26
1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước 31

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VÀ QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU 33
2.1. Đối tượng nghiên cứu 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu và quy trình nghiên cứu 33
2.2.1. Lựa chọn các vật liệu vải sợi xenlulo phù hợp cho việc chế tạo băng gạc
điều trị vết thương hiệu quả cao 33
2.2.2. Nghiên cứu biến tính xenlulo bằng periodat natri 36
2.2.3. Nghiên cứu xác định số lượng các nhóm đialđehyt sau khi oxy hóa xenlulo
38
2.2.4. Nghiên cứu đánh giá mật độ các nhóm đialđehyt phân bố trên sợi xenlulo
39
2.2.5. Khảo sát hình thái học và phổ FTIR của các mẫu DAC 41
2.2.6. Nghiên cứu cố định tổ hợp enzym hepatopancrease lên DAC 41
2.2.6.1. Phương pháp cố định chitosan lên DAC 42
2.2.6.2. Cố định enzym HP lên DAC-Chitosan 43
2.2.6.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tham số lên hoạt tính cố định tổ hợp
enzym HP lên vải DAC 43
2.2.6.4. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính phân giải protein của tổ hợp enzym HP
44
2.2.7. Khảo sát quá trình giải phóng enzym 47
2.2.8. Khảo sát quá trình hình thành các hạt micro và nano xenlulo chứa tổ hợp
enzym HP khi tiếp xúc với dung dịch đệm photphat, DMSO 48
2.2.8.1. Khảo sát quá trình giải phóng enzym 49
2.2.8.2. Khảo sát quá trình hình thành các kết tập vi mô DAC - Chitosan - HP
49
2.2.9. Nghiên cứu chế tạo băng gạc Multiferm chứa tổ hợp enzym HP và chitosan
50
2.2.10. Khảo sát phổ nhiệt vi sai và phổ hồng ngoại của các mẫu vật liệu tại các
nhiệt độ khác nhau 50
5

2.2.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của tia bức xạ gama lên hoạt tính phân hủy
protein của tổ hợp enzym HP phụ thuộc vào thời gian bảo quản 52
2.2.12. Nghiên cứu liều độc tính cấp của dung dịch enzym HP 52
2.2.13. Nghiên cứu tác dụng điều trị vết thương của băng gạc chứa enzym HP và
chitosan Multiferm trên động vật thí nghiệm 53
2.2.14. Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzym phân giải protein từ gan tụy một số
loài cua biển Việt Nam 55
2.2.14.1. Lựa chọn vật liệu và phương pháp sàng lọc 57
2.2.14.2. Phương pháp tách chiết enzym từ nội tạng cua ghẹ 58
2.2.14.3. Nghiên cứu tinh chế enzym HP từ nội tạng cua ghẹ 60
2.2.14.4. Xác định hoạt tính protease của tổ hợp enzym hepatopancreas 60
2.2.14.5. Xác định định lượng nồng độ protein 62
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 64
3.1. Lựa chọn các vật liệu vải sợi xenlulo phù hợp cho việc chế tạo băng gạc điều trị
vết thương hiệu quả cao 64
3.2. Nghiên cứu biến tính xenlulo bằng periodat natri 67
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ HIO
4
đến mức độ oxy hóa xenlulo 67
3.2.2. Ảnh hưởng của modul bể đến mức độ oxy hóa xenlulo 68
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên mức độ oxy hóa xenlulo 69
3.3. Nghiên cứu đánh giá một số tính chất của đialđehyt xenlulo 70
3.3.1. Khảo sát hình thái học các mẫu DAC trên kính hiển vi điện tử truyền qua70
3.3.2. Khảo sát phổ FTIR của các mẫu DAC có mức độ oxy hóa khác nhau 72
3.3.3. Kết quả đánh giá mức độ đồng đều về phân bố của các nhóm đialđehyt trên
vải xenlulo biến tính 75
3.4. Nghiên cứu cố định enzym HP lên DAC 78
3.4.1. Nghiên cứu cấy chitosan lên DAC 78
3.4.2. Ảnh hưởng của mức độ oxy hóa xenlulo đến hoạt tính enzym HP 84

3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym HP 86
3.4.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym HP 87
3.5. Quá trình giải phóng enzym 88
3.5.1. Ảnh hưởng của pH 88
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzym HP 91
3.6. Khảo sát quá trình hình thành các hạt micro và nano xenlulo chứa tổ hợp enzym
HP khi tiếp xúc với dung dịch đệm photphat, DMSO 93
3.7. Nghiên cứu chế tạo băng gạc Multiferm VN chứa tổ hợp enzym HP 96
3.8. Khảo sát phổ nhiệt vi sai và hồng ngoại của các mẫu vật liệu tại các nhiệt độ
khác nhau 98
3.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của tia bức xạ gamma lên hoạt tính phân hủy protein của
tổ hợp enzym HP được cố định trên DAC 101
3.10. Nghiên cứu tác dụng điều trị vết thương của băng gạc chứa enzym HP trên
động vật thí nghiệm 104
3.10.1. Nghiên cứu liều độc cấp tính của dung dịch enzym HP và kết quả mô bệnh
học gan, lách của chuột thí nghiệm được cho uống enzym HP 104
3.10.1.1. Kết quả nghiên cứu liều độc tính cấp trên chuột nhắt trắng (LD50)
104
3.10.1.2. Kết quả mô bệnh học gan, thận khi uống dung dịch enzym HP 105
3.10.2. Kết quả nghiên cứu trên vết bỏng ở thỏ thực nghiệm 107
3.10.2.1. Diễn biến vết thương bỏng ở nhóm 1 107
6

3.10.2.2. Diễn biến vết thương bỏng ở nhóm 2 109
3.10.2.3. Diễn biến vết thương bỏng ở nhóm 3 112
3.10.2.4. Diễn biến vết thương bỏng ở nhóm 4 113
3.10.3. Kết quả giải phẫu bệnh vết thương bỏng 116
3.10.3.1. Đặc điểm mô bệnh học vết bỏng thực nghiệm trước khi đắp thuốc 116
3.10.3.2. Thay đổi mô học sau khi đắp gạc thuốc 116
3.11. Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzym phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt

Nam 120
3.11.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của proteaza 121
3.11.2. Tách phân đoạn enzym bằng cồn theo các tỷ lệ thể tích khác nhau 121
3.11.3. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến khả năng làm sạch proteaza 122
3.11.4. Tách phân đoạn tổ hợp enzym proteaza sử dụng màng siêu lọc 122
3.11.5. Tách chiết tổ hợp enzym proteaza từ gan tụy cua biển dùng (NH
4
)
2
SO
4
123
3.11.6. Xác định hoạt tính enzym proteaza và hàm lượng protein 124
3.12. Nghiên cứu tinh chế tổ hợp enzym phân hủy protein tách chiết từ cua ghẹ Việt
Nam 124
3.12.1 Nghiên cứu tinh chế tổ hợp enzym phân hủy protein………………… 124
3.12.2 Xác định hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch. . . . . . . . . . . . . . . . . 130
3.12.3 So sánh thành phần enzyme chiết tách từ cua ghẹ Việt Nam với chế phẩm
enzyme công nghiệp của Nga…………………………………………… … 133
KẾT LUẬN 136
KIẾN NGHỊ 137
TÀI LIỆU THAM KHẢO 138
PHỤ LỤC 142
7

СÁС TỪ VIẾT TẮT

ADCTA – 2-amino-4,6-dichlor-2-triazin
APS – amonium persunfat
APTES - 3-aminopropyl triethoxysilan

BSA – bovine serum albumin
DAC – đialđehyt xenlulo
DAC-Enz – đialđehyt xenlulo -enzym
DAC-Chit-EnzHP – đialđehyt xenlulo-chitosan-enzym hepatopancreat
DAAO – D-Amino Acid oxidaza
DMSO – dimethilsunfoxit
DTGA – phương pháp nhiệt vi sai
ĐHT – đỉnh hấp thụ
CĐHT – cường độ hấp thụ
FT-IR – quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier
GO – grafen oxit
HĐP – hoạt độ proteaza
HP - hepatopancreas
HPLC – sắc ký lỏng phân giải cao
HTSH – hoạt tính sinh học
HTSLH – hoạt tính sinh lý học
LMW – low molecular weight
MCM-41 – mesoporous silica
MMW – medium molecular weight
NSOM – kính hiển vi quang học trường gần
NVS – nhiệt vi sai
OD – mật độ quang
PEG – polyethylen glycol
PGP – phân giải protein
PU – proteolytic unit
SDS – sodium dodecyl sunfat
SBA-15 – mesoporous silica
SEM – hiển vi điện tử quét
TCA – trichlor acetic axit
TĐA – trao đổi anion

TEM – hiển vi điện tử truyền qua
TLPT – trọng lượng phân tử trung bình
TRIS base – 2-amino-2-hydroxymethyl-propan-1,3-diol
TES – dung dịch đệm: Tris-EDTA- trong dung dịch CaCl
2
TTC – 2,3,5-triphenyltetrazol clorua
VNCVLD – Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt

8

DANH MỤC BẢNG

STT

Số bảng

Tên bảng Trang

1 1.1
Động học phân hủy thủy phân của vật liệu mang cố định
enzym trong dung dịch đệm phosphat so với vật liệu mang
chưa cố định enzym
26
2 1.2
Hiệu quả điều trị vết thương của băng DAC được cố định
enzym tripsin và băng DAC được cố định tổ hợp enzym
hepatopancreat so sánh với băng không chứa enzym
29
3 2.1
Một số đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ FTIR của các mẫu

DAC được oxy hóa với mức độ khác nhau
40
4 2.2
Các tham số của đường chuẩn phụ thuộc Mật độ quang –
Hàm lượng tyrosin cho phép xác định hệ số tyrosin
45
5 2.3
Các loại băng gạc được chế tạo 50
6 3.1
Độ thông thoáng, độ mao dẫn và độ ngậm nước của vải xô
xenlulo y tế Việt Nam trước và sau khi xử lý oxy hóa so
sánh với vải xô xenlulo của Nga
64
7 3.2
Độ cứng uốn và tải lực kéo đứt của vải xô xenlulo y tế
Việt nam trước và sau xử lý oxy hóa so sánh với vải xô
xenlulo của Nga
65
8 3.3
Ảnh hưởng của nồng độ HIO
4
lên quá trình oxy hóa
xenlulo
67
9 3.4
Ảnh hưởng của chỉ số modul bể oxy hóa lên quá trình hình
thành DAC
68
10 3.5
Ảnh hưởng của thời gian oxy hóa lên hiệu quả oxy hóa

xenlulo
69
11 3.6
Ảnh hưởng của nồng độ axit periodic và chỉ số modul bể
oxy hóa lên mức độ oxy hóa xenlulo trong cùng thời gian
phản ứng
70
12 3.7
Tỷ số cường độ của các cặp đỉnh hấp thụ (ĐHT) đialđehyt
xenlulo phụ thuộc vào mức độ oxy hóa xenlulo, xác định
trên phổ FTIR
73
13 3.8
Tỷ số cường độ của các cặp đỉnh hấp thụ (ĐHT) trên các
phân đoạn của sợi đialđehyt xenlulo
76
14 3.9 Các mức oxy hóa DAC được sử dụng trong nghiên cứu 78
15 3.10
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào mức độ
78
9

oxy hóa DAC
16 3.11
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào trọng
lượng phân tử chitosan (Mẫu không rửa enzym –đợt 1)
79
17 3.12
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào trọng
lượng phân tử chitosan (Mẫu rửa enzym –đợt 1)

80
18 3.13
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào trọng
lượng phân tử chitosan (Mẫu không rửa enzym –đợt 2)
81
19 3.14
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào trọng
lượng phân tử chitosan (Mẫu rửa enzym –đợt 2)
82
20 3.15
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào trọng
lượng phân tử chitosan (Mẫu không rửa enzym –đợt 3)
82
21 3.16
Kết quả phân tích hoạt tính enzym phụ thuộc vào trọng
lượng phân tử chitosan (Mẫu rửa enzym –đợt 3)
83
22 3.17 Mức độ oxy hóa của một số vật liệu DAC 84
23 3.18
Hoạt tính còn lại của tổ hợp enzym HP của Mẫu M3-
D5
sau khi ngâm trong dung dịch đệm với thời gian khác nhau

88
24 3.19
Hoạt tính còn lại của tổ hợp enzym HP của Mẫu M4-
D5
sau khi ngâm trong dung dịch đệm với thời gian khác nhau

89

25 3.20
Hoạt tính còn lại của tổ hợp enzym HP của Mẫu Nga sau
khi ngâm trong dung dịch đệm với thời gian khác nhau
90
26 3.21
Quá trình phân hủy thủy phân của enzym HP cố định trên
vải DAC (3,12%) phụ thuộc vào thời gian thủy phân
93
27 3.22
Hoạt độ enzym trên mẫu băng DAC-Chit-EnzHP
(“Multiferm”)
96
28 3.23
Kết quả phân tích nhiệt vi sai của một số mẫu DAC được
cấy chitosan rồi sau đó cố định enzym hepatopancrease
100
29 3.24
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và
Multiferm Nga đo sau khi được chế tạo
101
30 3.25
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và
Multiferm Nga, đo ngay sau khi được chiếu xạ gama
101
31 3.26
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và
Multiferm Nga, đo sau khi chiếu xạ gama một tháng
102
32 3.27
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và

Multiferm Nga, sau 2,5 tháng chiếu xạ gama
102
33 3.28
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và
Multiferm Nga, đo sau 4 tháng chiếu xạ gama
102
10

34 3.29
Hoạt độ enzym của băng Multifern Việt Nam và
Multiferm Nga, đo sau 7,5 tháng chiếu xạ
103
35 3.30 Kết quả nghiên cứu liều độc cấp tính trên chuột nhắt trắng 104
36 3.31 So sánh diễn biến tại chỗ vết bỏng nhóm 1 107
37 3.32 Sự thu hẹp vết bỏng nghiên cứu của nhóm 1 (cm
2
) 108
38 3.33 Diễn biến tại chỗ vết bỏng nhóm 2 110
39 3.34 Sự thu hẹp vết bỏng nghiên cứu của nhóm 2 (cm
2
) 111
40 3.35 So sánh diễn biến tại chỗ vết bỏng nhóm 3 112
41 3.36 Sự thu hẹp vết bỏng nghiên cứu của nhóm 3 (cm
2
) 113
42 3.36a
Diễn biến tại chỗ vết bỏng nhóm 4
113
43 3.36b
Sự thu hẹp diện tích vết bỏng (cm

2
) nhóm 4
114
44 3.37 Biến đổi mô học ở nhóm 1 117
45 3.38a Diễn biến mô học của nhóm 2 và 3 theo thời gian 118
46 3.38b
Diễn biến mô học theo thời gian hai vùng trên tiêu bản
sinh thiết
119
47 3.39 Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của enzym 121
48 3.40
Tách phân đoạn enzym bằng cồn theo các tỷ lệ thể tích
khác nhau
121
49 3.41
Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch
proteaza
122
50 3.42
Kết quả đo hoạt tính của dịch chiết tách theo các phân
đoạn (NH
4
)
2
SO
4

123
51 3.43
Xác định hàm lượng protein trong các phân đoạn

(NH
4
)
2
SO
4

123
52 3.44 Hoạt tính proteaza và hàm lượng protein 124
53 3.45
Kết quả xác định hàm lượng protein trong các mẫu dịch
enzym HP
129
54 3.46
Kết quả xác định hoạt tính enzyme của các mẫu dịch
enzym HP
130
55 3.47 Hiệu suất thu hồi giai đoạn 1 bằng kết tủa phân đoạn 130
56 3.48 Hiệu suất thu hồi giai đoạn 2 trên cột IRA 420 131
11




DANH MỤC HÌNH

STT Số
hình
Tên hình Trang
1 1.1

Tương tác giữa enzym trypsin với cơ chất protein phosphoryl
hóa dưới tác dụng của graphen oxit được chức năng hóa bằng
polyethylen glycol có nhóm amin ở cuối.
23
2 1.2 Nguyên lý cố định enzym trên vật liệu xenlulo 24
3 1.3 Sơ đồ cố định enzym trên sợi xenlulo 27
4 2.1
Thiết bị xác định độ mao dẫn của vật liệu xenlulo theo chuẩn
GOST 10681-75
34
5 2.2 Thiết bị xác định độ cứng uốn PT-2 theo tiêu chuẩn 36
6 2.3
Quá trình hình thành các gốc alđehyt trên sợi xenlulo bằng
phản ứng oxy hóa periodat
38
7 2.4 Phổ FTIR của một mẫu DAC có mức độ oxy hóa 17% 40
8 2.5
Cơ chế hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin đầu
cuối của phân tử enzym và gốc cacbonyl của đơn nguyên
DAC
42
9 2.6
Đường chuẩn tyrosin dùng để xác định hoạt tính PGP của
enzym
45
10 2.7
Động học quá trình phân hủy thủy phân của vật liệu xenlulo
cố định enzym trong dung dịch đệm phosphat pH = 6,0
47
11 Ghẹ xanh (Portunus Pelaicus) 57

12 2.8 Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 63
13 3.1 Vải sợi tổng hợp viscose 66
14 3.2
Vải sợi tổng hợp không dệt do CT CP DANAMECO sản
xuất
66
15 3.3 Vải carboxymethyl xenlulo không dệt 66
16 3.4 Vải xô cotton tự nhiên 66
17 3.5 Vải xô cotton pha polyeste 66
18 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ HIO
4
lên quá trình oxy hóa xenlulo 68
19 3.7
Đường cong phụ thuộc của mức độ oxy hóa vải xenlulo vào
chỉ số modul
68
20 3.8 Sự phụ thuộc mức độ oxy hóa vào thời gian phản ứng 69
21 3.9 Sợi xenlulo tự nhiên trước khi oxy hóa 70
22 3.10 Sợi xenlulo tự nhiên với các mao quản kích thước nano 70
23 3.11 Sợi xenlulo sau oxy hóa 6,1% 71
24 3.12 Sợi xenlulo sau oxy hóa 17,3% 71
12

25 3.13
Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier của một số mẫu đialđehyt
xenlulo có mức độ oxy hóa khác nhau
72
26 3.14
Tỷ số cường độ của các cặp đỉnh hấp thụ phụ thuộc vào mức
độ oxy hóa xenlulo

74
27 3.15
Phổ FT-IR của các mẫu vải DAC có mức độ oxy hóa khác
nhau
74
28 3.16
Biến thiên của các cặp tỷ số CĐHT theo chiều dài của sợi
đialđehyt xenlulo
77
29 3.17
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai lần làm mẫu chitosan
79
30 3.18
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (trước khi rửa mẫu-đợt 1)
80
31 3.19
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (sau khi rửa mẫu-đợt 1)
81
32 3.20
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (trước khi rửa mẫu-đợt 2)
81
33 3.21
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (sau khi rửa mẫu-đợt 2)
82
34 3.22

So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (trước rửa mẫu-đợt 3)
83
35 3.23
So sánh hoạt tính PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác
nhau với hai loại chitosan (sau khi rửa mẫu-đợt 3)
83
36 3.24
Hoạt độ PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác nhau với
chitosan TLPT thấp
85
37 3.25
Hoạt độ PGP của các mẫu có mức oxy hóa khác nhau với
chitosan TLPT trung bình
85
38 3.26
Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme sau khi cấy chitosan
và cố định enzyme HP trên mẫu có mức oxy hóa 1.71%
86
39 3.27
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzym sau khi cấy
chitosan và cố định enzym HP trên mẫu có mức oxy hóa
1.71%
87
40 3.28
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzym sau khi cấy
chitosan và cố định enzym HP trên mẫu có mức oxy hóa
3.12%
87
41 3.29

Quá trình giải phóng enzym của mẫu M3-D5 sau khi ngâm
trong dung dịch đệm phosphate có pH 6.2 và 7.8 tại 45
o
C
88
42 3.30
Độ mất hoạt tính của mẫu M4-D5 sau khi ngâm trong dung
dịch đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 và 7.8 tại 37
o
C
89
43 3.31
Độ mất hoạt tính của mẫu M4-D5 sau khi ngâm trong dung
dịch đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 và 7.8 tại 45
o
C
89
44 3.32
Độ mất hoạt tính của mẫu Nga sau khi ngâm trong dung dịch
đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 và 7.8 tại 37
o
C
90
45 3.33 Độ mất hoạt tính của mẫu Nga sau khi ngâm trong dung dịch 90
13

đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 và 7.8 tại 45
o
C
46 3.34

Độ mất hoạt tính của mẫu M3-D5 sau khi ngâm trong dung
dịch đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 tại 37 và 45
o
C
91
47 3.35
Độ mất hoạt tính của mẫu M4-D5 sau khi ngâm trong dung
dịch đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 tại 37 và 45
o
C
91
48 3.36
Độ mất hoạt tính của mẫu Nga sau khi ngâm trong dung dịch
đệm phosphate thủy phân có pH 6.2 tại 37 và 45
o
C
92
49 3.37
Tốc độ suy giảm hoạt tính của băng phủ vết thương cố định
enzym HP phụ thuộc vào thời gian thủy phân trong dung
dịch DMSO 15% và trong nước tinh khiết
93
50 3.38
Sợi đialđehyt xenlulo cố định enzym HP bắt đầu bị thay đổi
kết cấu dưới tác dụng của quá trình phá hủy thủy phân sau
một ngày
94
51 3.39 Quá trình phân hủy thủy phân DAC cố định enzym HP 94
52 3.40 Quá trình phân hủy thủy phân DAC cố định enzym HP 95
53 3.41 Quá trình phân hủy thủy phân DAC cố định enzym HP 95

54 3.42
Quá trình phân hủy thủy phân của DAC (mức độ ôxy hóa
6%) chứa tổ hợp enzym HP trong dung dịch đệm phôtphat
pH 7,4 sau 72 giờ phản ứng
95
55 3.43
Xenlulo biến tính với mức oxy hóa 3,12% được cấy chitosan
và sau đó cố định enzym HP
97
56 3.44 Băng multiferm do VCNMT chế tạo 98
57 3.45
Băng gạc multiferm do Viện CNMT chế tạo trước (a) và sau
khi (b) chiếu tia gama 25 kGrey
98
58 3.46
Phổ NVS của một mẫu băng phủ vết thương DAC-Chit-
EnzHP
99
59 3.47
Tốc độ suy giảm hoạt tính của tổ hợp enzym HP cố định trên
DAC có mức độ oxy hóa khác nhau, so sánh với “Multiferm
của Nga”.
103
60 3.48
Tốc độ suy giảm hoạt tính của tổ hợp enzym HP cố định trên
DAC có mức độ oxy hóa khác nhau, so sánh với “Multiferm
của Nga”
103
61 3.49 Cho chuột nhắt trắng uống dung dịch enzym HP 105
62 3.50 Chuột nhắt trắng sau 72h uống dung dịch enzym HP 105

63 3.51
Hình ảnh mô học gan chuột nhắt trắng cho uống dung dịch
enzym HP 0,5%
106
64 3.52
Hình ảnh mô học thận của chuột nhắt trắng cho uống dung
dịch enzym HP 0,5%
106
65 3.53 Hình ảnh điều trị vết bỏng trên thỏ 108
66 3.54 Đặc điểm vết thương bỏng ở nhóm 1 theo thời gian 109
67 3.55 Đắp gạc thuốc của nhóm 2 110
68 3.56 Đặc điểm vết thương bỏng ở nhóm 2 theo thời gian 111
14

69 3.57 Thỏ được đắp gạc thuốc của nhóm 3 112
70 3.58 Đặc điểm của vết thương bỏng nhóm 3 theo thời gian 113
71 3.58a Đắp gạc thuốc M3D5 và M3D5-2 114
72 3.58b
Tổn thương hai vùng A và B ngày thứ 3 và ngày thứ 7 sau
bỏng
115
73 3.58c Đặc điểm tổn thương bỏng ngày thứ 15 và ngày thứ 25 115
74 3.59 Mô bệnh học vùng bỏng sâu 116
75 3.60
Mô bệnh học vùng đắp BETA ngày thứ 5 (1), ngày thứ 10 (2)
và ngày 24 (3)
116
76 3.61a Diễn biến mô bệnh học ở các vùng nghiên cứu theo thời gian 119
77 3.61b Diễn biến mô bệnh học ở các vùng nghiên cứu theo thời gian 120
78 3.62

Thiết bị siêu lọc cho phép thu nhận phân đoạn protein có
TLPT trong dải 10 kDa - 100 kDa trong đó chứa toàn bộ tổ
hợp enzym HP
122
79 3.63
Điện di xác định trọng lượng phân tử enzym thuộc phân đoạn
40 - 70 % (NH
4
)SO
4

123
80 3.64
Sơ đồ quy trình tách chiêt tổ hợp enzym HP bằng phương
pháp tách phân đoạn với cồn etylic
125
81 3.65
Sơ đồ quy trình thu nhận tổ hợp enzym HP bằng phương
pháp tách phân đoạn với sunfat amoni có nồng độ giảm dần
126
82 3.66
Sơ đồ quy trình tinh chế tổ hợp enzym HP trên cột TĐA
Amberlit IRA-420
127
83 3.67 Phổ điện di của các tổ hợp enzym HP 129
84 3.68 Sơ đồ thu hồi bằng kết tủa phân đoạn 131
85 3.69 Sơ đồ thu hồi trên cột IRA 420 132
86 3.70.
Sơ đồ quy trình công nghệ tinh chế tổ hợp enzym phân giải
protein từ gan tụy cua biển sử dụng cột trao đổi anion

Amberlite IRA-420
132
87 3.71.
Điện di đồ protein các mẫu enzym VN trên gel
polyacrylamide 10%
133
88 3.72
Điện di đồ mẫu tổ hợp enzyme hepatopancrease chế phẩm
của Nga
134
89 3.73
Bột tổ hợp enzym HP tách từ gan tụy cua biển Việt Nam sau
khi sấy đông khô
134
15

ĐẶT VẤN ĐỀ
Những thập niên cuối thế kỷ trước các nhà y học đã đặt rất nhiều hy vọng vào
việc sử dụng các enzym phân hủy protein (proteaza) để làm sạch các vết thương hoại
tử - có mủ, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của quá trình diễn biến vết thương. Enzym
phân hủy protein được xem như một con “dao mổ sinh học”, có khả năng làm sạch và
loại bỏ nhanh các chất hoại tử ra khỏi vết thương nhưng không gây đau đớn cho bệnh
nhân. Tuy nhiên kinh nghiệm ứng dụng enzym trong điều trị sau nhiều năm đã cho
phép khẳng định rằng việc đưa enzym trực tiếp vào vết thương dưới dạng tự nhiên đã
làm thất vọng các nhà y học. Bởi vì hoạt tính của enzym trên vết thương suy giảm rất
nhanh: sau 15 – 20 phút có thể mất hoạt tính hoàn toàn dưới tác dụng của các tác nhân
antiproteaza có mặt trong vết thương. Ngoài ra, proteaza không có khả năng phân giải
collagen, do đó thực tế không thể làm sạch vết thương mủ - hoại tử một cách hoàn
toàn. Nhưng nếu sử dụng proteaza đồng thời với collagenaza sẽ ảnh hưởng xấu đến
quá trình hình thành lớp keo trên vết thương. Hơn nữa, môt phần đáng kể enzym phân

hủy protein được đưa lên vết thương dưới dạng tự do sẽ bị rửa ra dễ dàng khỏi bề mặt
tổn thương cùng với tiết dịch do tính chất hút nước cao của băng gạc từ vật liệu
xenlulo. Có lẽ chính vì những hiện tượng nêu trên mà ở vào những thập niên cuối thế
kỷ trước việc sử dụng enzym để điều trị vết thương mủ - hoại tử đã bị hạn chế rất
nhiều. Tuy nhiên, do khả năng làm sạch nhanh vết thương và không gây đau đớn cho
bệnh nhân khi thay băng, vấn đề sử dụng các chế phẩm hoạt tính sinh học (HTSH)
trong điều trị vết thương vẫn là một đề tài nghiên cứu đầy hứa hẹn, buộc các nhà khoa
học nghiên cứu hoàn thiện các loại băng gạc cố định enzym.
Vào những năm cuối của thế kỷ 20 đã xuất hiện một số giải pháp điều trị sử dụng
enzym phân hủy protein để phân hủy chất hoại tử bằng cách cấp liên tục proteaza vào
vị trí tổn thương hoặc sử dụng enzym được cố định trên các vật liệu mang khác nhau.
Tuy nhiên các kết quả đáng khích lệ thu được vẫn không cho phép mở rộng khả năng
ứng dụng của phương pháp điều trị, chủ yếu là do công nghệ sản xuất các loại băng
gạc này đòi hỏi chi phí cao, đồng thời vẫn không giải quyết được vấn đề duy trì hoạt
tính cao của enzym với tác dụng kéo dài trong quá trình điều trị vết thương.
Có thể nói trong công nghệ sản xuất vật liệu phủ vết thương các nhà khoa học
Nga thuộc Viện Nghiên cứu vật liệu dệt Moskva là những người đi đầu trong việc
khắc phục những trở ngại nêu trên bằng cách oxy hóa một số lượng nhất định các đơn
nguyên glucopyranose trên phân tử xenlulo nhằm tạo ra các nhóm đialđehyt để liên kết
hóa học với các phân tử enzym, đồng thời lượng enzym còn lại được hấp phụ tiếp lên
lớp enzym đã được liên kết cộng hóa trị với xenlulo. Nhờ vậy đã chế tạo được nhiều
chủng loại vật liệu phủ vết thương cố định enzym có tác dụng kéo dài và hiệu quả điều
16

trị cao, cho phép giảm thiểu hàng trăm lần tải lượng thuốc trên bệnh nhân, đồng thời
thể hiện hiệu ứng giảm đau (Atraumatic) cho bệnh nhân khi thay băng.
Thực hiện nhiệm vụ hợp tác KHCN với Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt Moskva
theo Nghị định thư chúng tôi nghiên cứu chế tạo vật liệu phủ vết thương trên cơ sở
xenlulo cố định enzym phân hủy protein. Bản báo cáo này trình bày kết quả nghiên
cứu chế tạo băng gạc xenlulo cố định enzym hepatopancreat (HP) từ gan tụy cua biển

nhằm điều trị các vết thương mủ - hoại tử và các vết loét lâu lành. Sản phẩm băng gạc
xenlulo cố định enzym HP đã được thử nghiệm điều trị tổn thương bỏng trên thỏ thí
nghiệm. Kết quả thu được cho thấy băng gạc do chúng tôi chế tạo có khả năng điều trị
bỏng tốt hơn so với chế phẩm betadine thường được sử dụng ở nước ta, đồng thời đạt
chất lượng điều trị không thua kém băng “Multiferm” cùng chủng loại của Nga.
Kết quả thu được mở ra khả năng nghiên cứu chế tạo các vật liệu cố định các
chất hoạt tính sinh học khác nhau như các enzym phân hủy protein, các loại thuốc cầm
máu nhanh và chống viêm nhiễm, các chất khử trùng, khử độc tố v.v để đưa vào áp
dụng trong thực tiễn y học ở nước ta.
17

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1. Một số tính chất cơ bản của vật liệu xenlulo và enzym sử dụng trong y học
Các hệ polyme cố định enzym ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực
công nghệ sinh học hiện đại [1-4] như công nghệ hóa sinh, hóa dược, y học lâm sàng,
nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, sản xuất cồn, xử lý ô nhiễm môi trường Một
số đặc tính độc đáo của enzym như hoạt tính tác dụng mang tính đặc hiệu cao, tính
chọn lọc tuyệt đối cao đối với từng cơ chất (substrate specificity) và các tính chất đặc
thù khác, khẳng định triển vọng ứng dụng của chúng. Mặc dù các enzym có khả năng
cho hiệu quả ứng dụng cao trong lĩnh vực y học và công nghiệp khác nhau, chúng thể
hiện một số điểm bất lợi: tính không bền vững, dễ bị tác động bởi các yếu tố môi
trường, thể hiện tính chất kháng nguyên và gây sốt [5,6]. Các chế phẩm enzym tự
nhiên thường đắt và hiếm, chúng dễ dàng bị cơ thể đào thải hoặc tiêu hóa. Những cái
đó làm hạn chế đáng kể khả năng ứng dụng rộng rãi của enzym. Để khắc phục những
hạn chế nói trên có thể cố định (immobilization) enzym lên các vật liệu mang tự nhiên
hoặc vật liệu tổng hợp. Cố định enzyme là một phương tiện trong đó enzym được
chuyển thành chất xúc tác dị thể được giới hạn trong một không gian nhất định và có
thể được sử dụng lại nhiều lần mà vẫn duy trì được độ sạch, đồng thời sản phẩm của
phản ứng xúc tác không bị nhiễm enzym [7,8]. Các phương pháp cố định enzym và

các tính chất của chúng đã được nghiên cứu nhiều trong những thập kỷ gần đây [9-11].
Enzym thường được cố định trên vật mang không tan phục vụ cho mục đích làm
buồng phản ứng sinh học, thiết bị cảm biến sinh học, vật liệu xúc tác trong y học, công
nghiệp thực phẩm và dược phẩm, xử lý ô nhiễm môi trường v.v
Trong lĩnh vực y học, đặc biệt là trong điều trị vết thương, vật liệu mang enzym
trên cơ sở xenlulo được sử dụng nhiều nhất nhờ tính chất tương hợp sinh học và khả
năng đảm bảo vệ sinh tuyệt vời của xenlulo. Đồng thời, xenlulo không tương tác hóa
học với các chất sinh học, trong khi ít nhiều tham gia vào quá trình làm sạch vết
thương như hút tiết dịch, bảo vệ vết thương khỏi sự nhiễm bẩn từ không khí và duy trì
chế độ nhiệt trong môi trường vết thương. Việc đưa các thuốc điều trị cố định trên
xenlulo vào vùng tổn thương không gây ra bất kỳ hiệu ứng phụ nào, cho phép giải
quyết đồng thời một số vấn đề như nâng cao hoạt tính của chế phẩm, giảm thiểu lượng
enzym tiêu hao, loại bỏ các tác dụng không mong muốn của chế phẩm lên các mô lành
xung quang vùng tổn thương [10].
Xenlulo tự nhiên là vật liệu hữu cơ phổ biến nhất trên Trái đất. Chất polyme tự
tái sinh này có mặt trong tất cả các loài thực vật trên đất liền, dưới biển và còn được
18

tổng hợp bởi các vi sinh vật. Tổng sinh khối xenlulo trong tự nhiên được tổng hợp mỗi
năm là khoảng từ 500 - 1000 tỷ tấn.
Khảo sát các thành tựu trong lĩnh vực vật liệu phủ vết thương cố định enzym,
phải thừa nhận rằng một khối lượng lớn (hơn 2000) các chủng loại vật liệu điều trị tổn
thương đã được điều chế bằng các công nghệ khác nhau trong những thập kỷ gần đây.
Tuy nhiên, đa số các vật liệu phủ vết thương này dễ bị vô hoạt hoặc chỉ có tác dụng
ngắn đối với các ổ nhiễm trùng trên các tổn thương. Có vô số các cách thức và nguyên
lý công nghệ đưa thuốc lên vật liệu băng gạc. Trong mọi trường hợp, ý tưởng và
nguyên lý thể hiện tác dụng điều trị của vật liệu phủ vết thương là phải làm sao tạo ra
được một kho chứa mà trong đó vật hấp thu là một polyme rắn (vải sợi, màng phim,
bọt xốp v v ) để có thể đưa vào đó thuốc chữa bệnh hoặc chất hoạt tính sinh học. Từ
kho chứa này, một chế phẩm thuốc hoặc hỗn hợp chất hoạt tính sinh học có thể được

giải phóng ra và đi vào cơ thể. Nguyên lý hình thành kho chứa các thuốc chữa bệnh có
thể khác nhau (liên kết ion hoặc liên kết cộng hóa trị, hấp phụ vật lý trên bề mặt sợi
vải, kết nối thành các tổ hợp polyme có khả năng xâm nhập vào cấu trúc xốp của vật
liệu vải sợi). Theo nguyên lý hình thành kho chứa, dạng liên kết giữa thuốc và vật nền
có tính chất quyết định đối với công nghệ hóa học chế tạo các vật liệu kho chứa này.
Trong số 3 nguyên lý công nghệ nói trên, công nghệ cố định thuốc lên polyme
vật liệu mang bằng liên kết cộng hóa trị là phức tạp nhất, bởi vì nó đòi hỏi trên polyme
phải được gắn các nhóm chức năng hoặc biến tính hóa học nó. Trong mọi trường hợp,
hoạt tính sinh học của thuốc chỉ thể hiện một khi nó có tính linh động, có khả năng di
chuyển từ kho chứa vào môi trường cơ thể (cụ thể là vết thương) và thể hiện tính năng
chữa bệnh tại đó.
1.2. Vật liệu phủ vết thương trên cơ sở xenlulo cố định enzym
Hiện nay trong lĩnh vực y học xenlulo được sử dụng làm vật liệu phủ điều trị vết
thương, làm vật mang để cố định enzym và các chế phẩm thuốc khác dưới dạng băng
gạc, sợi cắt đoạn ngắn với kích thước không dưới 200 m, hoặc dưới dạng bột xenlulo
[12-14]. Các hãng sản xuất vật liệu phủ vết thương trên nền sợi xenlulo hàng đầu thế
giới là Abbott, B. Brown, C.R. Bard, Bayersdorf, Conva-Tech, Johnson & Johnson,
Kendall-Gelener (Taiko), Minesota Mining & Enzymufan-churil (3M), Smith
Beachem Clip, Smith & Nephew, Sherwood Medical.
Các vật mang trên cơ sở xenlulo là vật liệu có tính tương hợp sinh học cao do đó
có thể tiếp xúc dễ dàng với bề mặt da, tuy nhiên do kích thước lớn và mức độ liên kết
kém giữa chất hoạt tính sinh học và vật liệu mang làm cho các hoạt chất gắn trên đó
mất tác dụng nhanh chóng, do đó việc ứng dụng bị hạn chế. Để có thể phòng ngừa và
19

điều trị vết thương và các bệnh khác một cách có hiệu quả trước hết đòi hỏi chất mang
phải thấm được qua lớp da, vì vậy nó phải có kích thước nano hoặc ít nhất là cỡ micro
[15-18].
Một khi các enzym dạng tự do được giải phóng vào dịch vết thương chúng bị
mất hiệu lực rất nhanh, vì vậy việc điều trị đòi hỏi phải sử dụng lượng enzym lớn. Để

giảm lượng enzym tiêu hao, các nhà khoa học đã chế tạo ra loại vật liệu phủ được cấy
enzym có tác dụng điều trị kéo dài. Loại vật liệu phủ vết thương chứa enzym này có
khả năng đề kháng cao trước những biến đổi của các yếu tố môi trường, nhưng hoạt
tính phân hủy protein của chúng vẫn thấp hơn đáng kể so với hoạt tính của các enzym
dạng tự do.
Trong bản quyền sáng chế của Nga công bố năm 1979 [19] một loại vật liệu
màng được giới thiệu với chất mang là triacetat xenlulo được cố định enzym phân hủy
protein (tripsin hoặc -chymotripsin), trong đó triacetat xenlulo chiếm từ 80 – 90% và
còn lại là enzym. Vật liệu màng nói trên được điều chế bằng cách nhũ tương hóa dung
dịch nước của enzym phân hủy protein vào trong dung dịch ete xenlulo trong dung
môi hữu cơ không tan trong nước, rồi sau đó tiến hành đổ khung tạo màng. Trong vật
liệu màng đó enzym tồn tại dưới dạng các bao thể siêu tinh vi, cho phép phân hủy các
thành phần hoại tử trên vết thương với thời gian kéo dài nhờ khả năng giải phóng từ từ
các liều lượng enzym nhỏ ra khỏi màng phim. Tuy nhiên, một khi enzym được giải
phóng vào dịch vết thương dưới dạng tự do nó thể hiện tất cả các tính chất của enzym
nguyên khai với tất cả các nhược điểm vốn có như khả năng đề kháng kém đối với các
tác nhân ức chế, các biến đổi về pH và nhiệt độ môi trường, đồng thời thể hiện tính
chất kháng nguyên và gây sốt. Ngoài ra, vật liệu màng này còn có những nhược điểm
đáng chú ý như sau:
- Tỷ lệ tiêu hao enzym rất cao - chiếm nhiều phần trăm trọng lượng màng;
- Việc sử dụng màng còn bị hạn chế bởi nguy cơ hoạt tính enzym có thể bị vô
hiệu hóa trong dung môi hữu cơ sử dụng trong quá trình điều chế màng phim.
Các nhà khoa học thuộc một số nước phương tây đề xuất phương pháp điều chế
vật liệu có hoạt tính sinh học dưới dạng hạt với chất mang như là dextran hoặc chitin,
chitosan, được cấy enzym như tripsin hoặc chymotripsin, với tỷ lệ như sau: chất mang
từ 80 – 80,5% và còn lại là enzym ([20,21,22]). Phương pháp được tiến hành theo các
bước như sau:
- Chuẩn bị vật liệu dạng hạt (chất mang) từ chitin hoặc chitosan hoặc dextran
bằng cách cho trương trong nước;
20

- Chuẩn bị dung dịch hoạt hóa 2-amino-4,6-dichlor-2-triazin (ADCTA) trong
aceton rồi pha loãng bằng nước tại nhiệt độ 50
0
C;
- Trộn hai thành phần trên với nhau để hoạt hóa tại nhiệt độ 50
0
С; điều chỉnh
pH bằng Na
2
CO
3
+ HCl
- Lọc và rửa tủa bằng dung dịch nước-aceton để thu nhận vật liệu hoạt hóa và
bảo quản trong dung dịch đệm phosphat ở nhiệt độ 2
0
C;
- Chuẩn bị enzym (tripsin) trong dung dịch đệm phosphat và tiến hành cấy
enzym lên vật liệu mang đã được hoạt hóa bằng ADCTA;
- Rửa vật liệu hoạt hóa rồi sau đó dùng dung dịch đệm borat và acetat có chứa
muối NaCl;
- Cuối cùng sấy đông lạnh vật liệu đã được cấy enzym.
Vật liệu đề xuất thể hiện hiệu ứng tác dụng kéo dài, nhưng enzym chứa trong đó
khó tan vào dịch vết thương và thể hiện tính kháng nguyên. Vật liệu này có nhược
điểm là giá thành và hàm lượng enzym cao (chiếm 20% trọng lượng vật liệu). Ngoài ra
phải có thiết bị đặc biệt để bảo quản trong một dung dịch đệm đặc biệt ở nhiệt độ thấp
2
0
C.
Các nhà khoa học Anh Quốc giới thiệu một loại băng gạc phủ vết thương bao

gồm lớp bảo vệ (vải không dệt), lớp hấp thụ dịch (bông hút nước) và lớp tiếp giáp vết
thương (vải không dệt, màng polyuretan hoặc polyetylen hoặc triacetat xenlulo có
chứa bột đồng) mà trên đó được phủ một lớp enzym [23]. Vật liệu phủ này khi tiếp
xúc với dịch vết thương, lớp enzym bị vô hiệu hóa rất nhanh giống như enzym nguyên
khai, vì vậy đã không tìm được ứng dụng rộng rãi.
Theo một patent của Đức [24], quá trình chế tạo vật liệu phủ vết thương cố định
enzym được thực hiện như sau:
- Trước tiên vải sợi xenlulo được hoạt hóa bằng cách tạo ra nhóm đialđehyt trên
các phân tử monosaccarit xenlulo cho tới khi nồng độ các nhóm này đạt giá trị 0,0625
– 3,125 mg-đương lượng trên một gram vật mang.
- Vật mang đã hoạt hóa sau đó được cho phản ứng với các enzym thích hợp trong
dung dịch đệm có pH 6,5 - 7,5 tại nhiệt độ phòng trong vòng 8 -16 giờ, sau đó rửa và
sấy khô.
Phương pháp có nhược điểm thường hay gặp là hoạt tính enzym trên vết thương
giảm nhiều so với enzym ở dạng tự do. Trước hết, đó là vì lượng enzym được cố định
trên xenlulo hoàn toàn bằng liên kết hóa học (liên kết cộng hóa trị) mà không có các
21

thành phần liên kết khác tham gia (như liên kết hấp phụ và liên kết cơ học). Sở dĩ như
vậy chủ yếu là do quá trình oxy hóa xenlulo thành đialđehyt đã được diễn ra một cách
không được kiểm soát, dẫn đến số lượng các đơn nguyên đialđehyt được tạo ra vượt
quá số lượng cần thiết, làm cho các phân tử enzym có mặt dễ dàng tiếp cận với nhóm
đialđehyt để hình thành liên kết azomethin.
Nhiều kết quả nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt Moskva [5,15,16,17)
đã chỉ ra rằng tính chất liên kết của enzym cũng như các chất HTSH khác với nền
xenlulo được xác định bởi mức độ oxy hóa và bởi số lượng các nhóm chức được tạo ra
trên vật liệu mang. Trong lĩnh vực công nghệ enzym người ta biết rằng quá trình cấy
một khối lượng lớn các protein lên vật mang có thể dẫn đến hiệu ứng che chắn không
gian [15,16], gây cản trở cho các phản ứng hóa học. Khả năng bắt giữ phân tử enzym
(hoặc các chất HTSH khác) của vật mang có thể được mô tả bằng tỷ số của mức độ

oxy hóa chất mang trên số lượng các phân tử enzym được cấy trên đó (tỷ số cố định
đảo). Mức độ oxy hóa của chất mang trong các patent công bố thường dao động trong
khoảng từ 0,5% (tương ứng 0.0625 mg-eq/1g chất mang) đến 25% (tương ứng 3.125
mg-eq/1g) (một mg-eq của một đơn nguyên đialđehyt monosaccarit trong phân tử
xenlulo bằng 80 mg), trong khi số lượng các phân tử enzym được cấy biến thiên trong
khoảng từ 0.02%/1g của chất mang đã được oxy hóa 0.5%/1g đến 0.5%/1g của chất
mang đã được oxy hóa 25%/1g. Như vậy, tỷ số cố định đảo được biểu diễn như sau:
- Giới hạn dưới: 0.5% / 0.02% = 25
- Giới hạn trên: 25% / 0.5% = 50
Kết quả thực nghiệm thu được cho thấy mức độ cố định enzym không tỷ lệ thuận
với mức độ oxy hóa xenlulo, cụ thể là tỷ phần enzym được cố định càng giảm khi mức
độ oxy hóa tăng.
Trong patent của Anh Quốc [25] mức độ oxy hóa xenlulo cao trong khi tỷ lệ cố
định đảo nhỏ, nghĩa là lượng enzym cố định ít. Do đó hầu như tất cả số lượng các phân
tử tripsin đã được liên kết cộng hóa trị qua cầu nối azomethin HC=N. Năng lượng
liên kết của cầu nối azomethin tương đối lớn, dao động trong khoảng 393 – 583
kJ/mol, vì vậy các phân tử enzim (tripsin) được cố định tương đối bền vững trên bề
mặt phân tử xenlulo. Được biết, phân tử lớn của protein (thí dụ, tripsin có khối lượng
phân tử 24 kDa) có thể ức chế, làm chậm quá trình tiếp cận giữa các nhóm chức của
phân tử protein và phân tử xenlulo để tạo cầu nối azomethin. Do vậy, sự xâm nhập của
một phân tử lớn như tripsin vào trong phân tử chất mang đã được oxy hóa một phần
cũng như sự cố định của enzym là một quá trình diễn ra chậm, thường kéo dài từ 8 - 16
22

giờ (WIPO Patent WO/2002/002155, 01.10.2002 [26]). Điều đó cũng đòi hỏi phải có
lượng dư lớn các nhóm andehyt so với các nhóm amin để tạo liên kết hóa học.
Nhưng như đã nói ở trên, các cầu nối azomethin có liên kết tương đối bền vững
so với lực Van der Vanxơ, nên khó có thể bị phá vỡ trong dịch tiết vết thương, vì vậy
hiệu ứng điều trị của vật liệu phủ này không cao và phụ thuộc trực tiếp vào quá trình
thủy phân alđehyt xenlulo đã được liên kết hóa học với tripsin và khả năng hòa tan vào

dịch vết thương của các oligome được tạo ra sau đó, nghĩa là phụ thuộc vào sự hình
thành các hạt nano xenlulo cùng với các phân tử enzym được cố định trên đó.
Kết quả thực nghiệm thu được trên vật liệu phủ vết thương chế tạo theo patent
Anh Quốc ở trên cho thấy hiệu quả điều trị của nó không cao, bởi vì hầu hết tripsin đã
được liên kết hóa học bền vững với xenlulo, dẫn đến hoạt tính của enzym bị suy giảm
mạnh.
Nhằm mục đích chế tạo vật liệu chuyên sử dụng cho các buồng phản ứng sinh
học (bioreactor), làm đầu dò cảm ứng sinh học hoặc làm vật liệu sắc ký ái lực, trước
khi cố định các chất hoạt tính sinh lý học (HTSLH) lên vật liệu xenlulo, các nhà khoa
học Nhật Bản (US Patent 50 153 87, May 14 1991[27]) đã hoạt hóa màng xenlulo
bằng cách cho tác dụng với một hợp chất có công thức Cl-SO
2
-R, trong đó R là một
gốc alkyl hoặc một phenyl, có khả năng tạo liên kết hóa học bền vững giữa chất
HTSLH và phân tử xenlulo. Quá trình hoạt hóa màng xenlulo được các tác giả thực
hiện như sau: 100 ml dung dịch hỗn hợp phản ứng, trong đó chứa khoảng 0,3 – 0,5
mol p-toluen sunfonyl clorua trong dung môi (aceton hoặc acetonitryl) , thêm vào đó 1
g màng xenlulo với sự có mặt của một lượng bazơ (pyridin hoặc triethylamin) tương
đương 1,5 – 3,0 đương lượng p-toluen sunfonyl clorua, và cho phản ứng tại nhiệt độ
40 – 60
0
C trong khoảng 1 – 2 giờ. Quá trình cố định chất HTSLH lên màng xenlulo
đã được hoạt hóa có thể được thực hiện như sau: hòa tan chất HTSLH vào trong một
dung dịch đệm không chứa nhóm amin bậc I và có pH 6 - 8 (đệm phosphat), sau đó
cho dung dịch chạy quay vòng qua màng dưới áp suất dư tại nhiệt độ phòng trong thời
gian một vài giờ và cuối cùng rửa màng bằng dung dịch đệm.
Có thể thấy vật liệu xenlulo cố định ezym được chế tạo theo patent này, như đã
nói tới ở trên, chủ yếu nhằm sử dụng cho mục đích chế tạo bioreactor hoặc biosensor
v.v , và trong thực tế không thể sử dụng chúng làm băng gạc điều trị vết thương do
lực liên kết hóa học giữa enzym với sợi xenlulo ở đây lớn hơn đáng kể so với liên kết

azomethin, vì vậy để tổ hợp enzym-xenlulo có thể phân hủy protein đòi hỏi phải cho
dịch protein liên tục chảy quay vòng qua lớp màng xenlulo.
23

Mới đây các nhà khoa học Trung Quốc [28] đã công bố kết quả nghiên cứu về
tương tác giữa các proteaza serin (trypsin, chymotrypsin và enzym K) với lớp màng
2D của graphen oxit (GO) được chức năng hóa bằng polyethylen glycol có gốc amin ở
cuối (PEG-NH
2
) như được mô tả trên hình 1.1.








Hình 1.1. Tương tác giữa enzym trypsin với cơ chất protein phosphoryl hóa dưới tác
dụng của graphen oxit được chức năng hóa bằng polyethylen glycol có nhóm amin ở
cuối.
Các tác giả đã cho thấy GO nếu được chức năng hóa bằng PEG-NH
2
có thể làm
tăng đáng kể hoạt tính và tính bền nhiệt của proteaza trypsin một cách rất chọn lọc,
trong khi hầu như không có tác dụng đối với chymotrypsin và K-proteaza. Đồng thời
các tác giả phát hiện ra rằng một khi được chức năng hóa với PEG-NH
2
, màng GO sẽ
tương tác tĩnh điện với cơ chất protein đã được phosphoryl hóa (xem hình vẽ), tạo điều

kiện cho các đoạn axit amin trên phân tử protein dễ dàng tiếp cận với tâm hoạt động
của proteaza trypsin. Bằng cách ghép nối enzym với graphen oxit được chức năng hóa
với PEG-NH
2
các tác giả cho biết có thể tăng hoạt tính của trypsin lên 30 – 40 lần so
với trường hợp enzym được cố định bằng liên kết hóa học trên các vật mang khác,
trong khi khả năng chịu nhiệt của enzym cũng tăng đáng kể: 60 - 70% hoạt tính của
trypsin vẫn còn được giữ lại trên graphen sau khi xử lý nhiệt độ tại 80
0
C.
1.3. Viện NCVLD Moskva đi đầu trong nghiên cứu chế tạo vật liệu phủ vết
thương hiệu quả cao
Trong lĩnh vực sản xuất băng gạc điều trị vết thương, các nhược điểm nêu ở phần
trên đã được các nhà khoa học Nga thuộc Viện Nghiên cứu vật liệu dệt khắc phục [29-
34] bằng cách oxy hóa có kiểm soát một số lượng nhất định các đơn nguyên
glucopyranose trên phân tử xenlulo nhằm tạo ra các nhóm đialđehyt để liên kết cộng
hóa trị với các phân tử enzym, đồng thời lượng enzym cần thiết còn lại sẽ được hấp
phụ tiếp lên lớp enzym đã được liên kết hóa học.

P - Phosphat, điện tích (-)
R – Arghinin, điện tích (+)
K – Lysin, điện tích (+)
Trypsin, điện tích âm (-)
24

Các vật liệu mang trên cơ sở xenlulo có kích thước nano hoặc micrô chỉ mới bắt
đầu được biết đến trên thế giới những năm gần đây [35-38]. Tuy nhiên, trong thực tiễn
lâm sàng ở nước Nga từ vài ba thập kỷ trước đã xuất hiện một số chế phẩm thuốc chữa
bệnh được cố định trên xenlulo, trong đó nổi bật nhất là chế phẩm Dalcex - Tripsin, và
đã tạo ra một thế hệ vật liệu phủ vết thương mới trên cơ sở xenlulo tự nhiên mà trên

sợi của nó được cố định các phân tử thuốc [15, 17, 26, 29,30].
Bằng cách oxy hóa với Periođat natri một số gốc đường trên phân tử xenlulo có
thể được oxy hóa để tạo ra các nhóm alđehyt trên phân tử xenlulo để chúng liên kết
cộng hóa trị với nhóm amin đầu cuối của enzym proteaza như được mô tả trên sơ đồ
hình 1.2 dưới đây:







Hình 1.2. Nguyên lý cố định enzym trên vật liệu xenlulo
Vật liệu xenlulo cố định enzym thu được, khi tiếp xúc với dịch vết thương có thể
thủy phân thành các mảnh xenlulo với kích thước không vượt quá 100 nm trên đó
được cố định chế phẩm thuốc [39]. Điều kiện quan trọng để thu nhận các chế phẩm
thuốc cố định trên xenlulo có hoạt tính cao là nhóm chức của enzym tham gia liên kết
cộng hóa trị với nhóm chức của vật mang không được có mặt trong thành phần của
tâm hoạt động của enzym và cũng không được có mặt gần khu vực đó.
Như vậy, vật liệu dệt từ xenlulo tự nhiên dưới dạng sợi có kích thước vi mô đã
được sử dụng làm vật mang cho các phân tử thuốc. Đó là các vật liệu y học được tạo ra
bằng phương pháp mô phỏng phân tử. Khi tiếp xúc với dịch vết thương vật liệu mang
sẽ bị phân hủy thủy phân và khi đó một số mảnh khối của xenlulo với kích thước cỡ
hàng chục nano mét trên đó gắn phần tử thuốc sẽ được tách ra và tan vào dịch vết
thương. Thuốc được sử dụng ở đây trước hết là các enzym có hoạt tính sinh học và
tính chọn lọc cao.
Như được biết, trong cơ thể con người có vô vàn các loại enzym khác nhau,
trong đó có nhiều loại có vai trò và chức năng vô cùng quan trọng. Bằng cách nào đó
mà các phân tử enzym thể hiện hoạt tính một cách chọn lọc có định hướng, thì cho đến
nay vẫn còn là một câu hỏi [3-5]. Tuy nhiên, chính khả năng thể hiện hoạt tính có định

Xenlulo

Đial
dehyt xenlulo


Dalcex
-
Tripsin


Enz
–

NH
2


[IO
4
]
-
1


O



C

C


O H H O
O

CH
2
OH

H

O




C

C


N H H O

Enz

O

CH

2
OH

H

O



O


O

O

CH
2
OH

H

O


HO
HO

25

hướng của các phân tử enzym đã khẳng định sự cần thiết sử dụng chúng trong vật liệu
phủ vết thương.
Có thể nói, khái niệm “công nghệ nano phân tử - molecular nanotechnology” do
Drexler đưa vào đầu tiên đã mô tả một cách đầy đủ công nghệ “lắp ráp phân tử” mà
nhờ đó đã xuất hiện các vật liệu y học cho phép tạo ra vật liệu phủ vết thương thế hệ
mới. Trên sợi xenlulo vi mô, bằng cách gắn vào đó các phân tử enzym, hocmôn, các
chất làm ngừng chảy máu và các chất HTSH khác có thể thu nhận một số lượng lớn
các hợp chất để từ đó tạo ra các chế phẩm y học khác nhau có khả năng điều trị bệnh
với hiệu quả đặc biệt cao. Công nghệ nano trong y học là một phần quan trọng trong
lĩnh vực công nghệ nano hiện nay, bởi vì đó là sự tác động của các vật liệu mới,
phương pháp mới lên cơ thể sống, đó là sự xâm nhập của vật liệu nano vào bên trong
cơ thể sống và sự tương tác giữa chúng với nhau. Trong y học công nghệ nano có hai
hướng chủ yếu – đó là chẩn đoán và điều trị. Trong lĩnh vực điều trị các nhà khoa học
hy vọng rằng ứng dụng đáng kể nhất của y học nano sẽ được nhanh chóng khẳng định
trong quá trình giải quyết vấn đề dẫn thuốc đến các tế bào mục tiêu.
1.4. Một số tính chất đặc thù của vật liệu phủ vết thương cố định enzym
Một trong những đặc trưng quan trọng của tổ hợp đialđehyt xenlulo – enzym
(DAC –Enz) là quá trình phân hủy thủy phân của vật mang chứa enzym phụ thuộc vào
mức độ oxy hóa của DAC. Tổ hợp DAC-Enz, trong đó một phần enzym được liên kết
cộng hóa trị với xenlulo, được xem như một kho chứa mà từ đó enzym có thể được
tách ra khỏi vật mang một cách có điều tiết. Trong trường hợp đó enzym không được
giải phóng ra dưới dạng nguyên khai mà đi cùng với một mảnh nano xenlulo dễ hòa
tan, do đó thể hiện hoạt tính sinh học tương tự như enzym nguyên khai. Tốc độ giải
phóng enzym ra khỏi vật liệu xenlulo được đặc trưng bởi một hàm đa thức phụ thuộc
số mũ [5]:
A

/A
0
= a

1
.exp(-k
1
) + a
2
.exp(-k
2
),
Trong đó: A
0
– hoạt tính enzym trên vật liệu mang tại thời điểm ban đầu; A

- hoạt tính
enzym còn lại trên vật liệu mang tại thời điểm ; a
1
và a
2
– hệ số thực nghiệm; k
1
và k
2

hằng số tốc độ phân hủy thủy phân, hay nói cách khác – hằng số tốc độ giải phóng
enzym từ vật liệu xenlulo vào dung dịch của các thành phần enzym có liên kết hóa học
và enzym có liên kết không hóa học tương ứng.
Hằng số tốc độ phân hủy thủy phân (k
1,2
) có thể xác định dễ dàng dựa trên giá trị

1/2

– thời gian bán hủy của tổ hợp DAC-Enz (thời gian một nửa khối lượng enzym
trên DAC được giải phóng vào dung dịch): k
1,2
= ln2/(
1/2
)
1,2
. Bằng cách thay đổi mức
độ oxy hóa xenlulo có thể nhận các giá trị 
1/2
khác nhau: mức độ oxy hóa tăng, thời