Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình tạo khối tế bào Thông đỏ Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị ung thư

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HỌC VIỆN QUÂN Y
ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ VIỆT NAM – HÀN QUỐC



BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
TẠO KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ VIỆT NAM (Taxus wallichiana Zucc.)
LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ


CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI




TS. Nguyễn Văn Long
HỌC VIỆN QUÂN Y




Đại tá, GS.TS. Hoàng Văn Lương

Hà Nội – 2011


CÁC CÁ NHÂN VÀ ĐƠN VỊ THAM GIA NGHIÊN CỨU

I. CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:
TS. Nguyễn Văn Long
II. CỘNG TÁC VIÊN CHÍNH:
1. GS.TS Sang Yo Byun
2. PGS.TS Nguyễn Tùng Linh
3. TS Trương Ngọc Dương
4. TS Trịnh Nam Trung
5. TS Vũ Tuấn Anh
6. TS Vũ Bình Dương
7. ThS Nguyễn Trọng Điệp
8. ThS Đào Văn Đôn
9. ThS Nguyễn Thành Chung
10. DS Chử Văn Mến
11. DS Nguyễ
n Văn Thư
12. DS Đặng Trường Giang
13. BS Bùi Khắc Cường
14. BS Nguyễn Hoàng Ngân
15. DS Đặng Linh Chi
III. CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP NGHIÊN CỨU:
1. Trường Đại học Ajou – Hàn Quốc
2. Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương
3. Viện Dược liệu

4. Trung tâm NCƯD Sinh – Y – Dược học – HVQY.
5. Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Dược – HVQY.
6. Bộ môn khoa Giải phẫ
u bệnh lý – Bệnh viện 103 – HVQY





MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CÂY THÔNG ĐỎ 3
1.1.1. Tên khoa học 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 3
1.1.3. Thành phần hóa học 5
1.1.4. Tác dụng sinh học 8
1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT 9
1.2.1. Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai 9
1.2.2. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 12
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt chất trong nuôi
cấy tế bào thực vật
13
1.3. SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ SẢN XUẤT PACLITAXEL 19
1.3.1. Paclitaxel và nhu cầu nguồn nguyên liệu 19
1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật 21
1.3.3. Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sử dụng trong đánh giá chất

lượng sinh khối tế bào thông đỏ
28
1.3.4. Phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từ SKTB thông đỏ 29
CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31
2.1.1. Nguyên liệu và hoá chất 31
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu 32
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.2.1. Xây dựng quy trình tạo sinh khối thông đỏ quy mô phòng thí nghiệm 33
2.2.2. Phương pháp xây dựng TCCS 43
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu độc tính và tác dụng kháng tế bào ung thư của
paclitaxel chiết xuất từ sinh khối thông đỏ
44
2.2.4. Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu 50
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
51
3.1.1. Kết quả xây dựng quy trình tạo callus thông đỏ 51


3.1.2. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng trong bình 250 ml 67
3.1.3. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít 87
3.1.4. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 15 lít 88
3.1.5. Kết quả nghiên cứu thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ 90
3.1.6. Quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ 93
3.1.7. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của sinh khối tế bào thông đỏ 95
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ 129
3.2.1. Kết quả xây dựng TCCS của cành non thông đỏ 129
3.2.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng TCCS của sinh khối thông đỏ 136

3.2.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng TCCS của paclitaxel 142
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 150
3.3.1. Kết quả đánh giá độc tính 150
3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư 160
KẾT LUẬN 171
KIẾN NGHỊ 174
TÀI LIỆU THAM KHẢO 175


DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng 3.1: Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn 52

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn. 54
Bảng 3.3: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy (Đơn vị: mg/l) 55
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy 56
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus 56
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển của
callus 59

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus 60
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus 60
Bảng 3.9: Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH.63
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus 64
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào 65
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus 66
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào
68


Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế bào
70

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế bào
thông đỏ 72

Bảng 3.16 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào
thông đỏ 73

Bảng 3.17: Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát
triển tế bào 74

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào 75
Bảng 3.19: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 76
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào 77
Bảng 3.21: Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm
lượng paclitaxel trong tế bào 79

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm
lượng paclitaxel trong tế bào 80

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào 82

Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ
phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào 83

Bảng 3.25: Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose 85

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường 86

Bảng 3.27: Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít 88
Bảng 3.28: Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 15 lít 89
Bảng 3.29: Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel
trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ 92

Bảng 3.30: Khảo sát điều kiện pha động 97
Bảng 3.31: Chương trình chạy sắc ký 98
Bảng 3.32: Độ lặp lại của hệ thống 99
Bảng 3.33: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ paclitaxel 100
Bảng 3.34: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ baccatin III 100
Bảng 3.35: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel 102
Bảng 3.36: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III 102
Bảng 3.37: Kết quả xác định độ chính xác 103
Bảng 3.38: Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III 104
Bảng 3.39: Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử 104
Bảng 3.40: Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ 106
Bảng 3.41: Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu lá
thông đỏ tự nhiên bằng HPLC 108

Bảng 3.42: Số liệu phổ
13
C-NMR (125 MHz) của các các chất 1 – 6 114
Bảng 3.43: Số liệu phổ
1
H-NMR (500 MHz) của các chất 1 - 6 115
Bảng 3.44: Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau 118
Bảng 3.45: Kết quả chiết xuất paclitaxel với DCM (n=6) 119
Bảng 3.46: Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế

paclitaxel (n=6) 120

Bảng 3.47: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ n-hexan sử dụng để tinh chế
paclitaxel (n=6) 121

Bảng 3.48: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và
hiệu suất tinh chế paclitaxel (n=6) 122

Bảng 3.49: Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 123
Bảng 3.50: Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 124
Bảng 3.51: Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các
giai đoạn chiết xuất, tinh chế 125

Bảng 3.52: Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong cành non thông
đỏ 132

Bảng 3.53: Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ 136
Bảng 3.54: Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ 137


Bảng 3.55: Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông đỏ
137

Bảng 3.56: Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế
bào thông đỏ 139

Bảng 3.57: Kết quả xác định năng suất quay cực của paclitaxel 143
Bảng 3.58: Kết quả xác định độ ẩm trong paclitaxel 143
Bảng 3.59: Kết quả xác định tro toàn phần của paclitaxel 143
Bảng 3.60: Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng của paclitaxel 144

Bảng 3.61: Kết quả định lượng nội độc tố có trong paclitaxel 144
Bảng 3.62: Kết quả xác định sự có mặt của các vi khuẩn trong paclitaxel 146
Bảng 3.63: Kết quả xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong paclitaxel 146
Bảng 3.64: Kết quả xác định hàm lượng % các tạp chất trong paclitaxel 146
Bảng 3.65: Kết quả xác định hàm lượng paclitaxel 147
Bảng 3.66: Tỷ lệ chuột chết sau tiêm Paclitaxel 151
Bảng 3.67: Ảnh hưởng của Paclitaxel đối với trọng lượng cơ thể thỏ (n = 12)
152

Bảng 3.68: Ảnh hưởng của Paclitaxel đối với điện tim thỏ (n = 12) 153
Bảng 3.69: Chỉ số hồng cầu và huyết sắc tố thỏ ở các lô nghiên cứu (n = 12)
154

Bảng 3.70: Chỉ số bạch cầu và tiểu cầu thỏ ở các lô nghiên cứu (n = 12) 155
Bảng 3.71: Hoạt độ AST và ALT (IU/l) của các lô thỏ nghiên cứu (n = 12)156
Bảng 3.72: Nồng độ creatinin và ure máu thỏ ở các lô nghiên cứu (n = 12) 157
Bảng 3.73: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào HEP G2 160
Bảng 3.74: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào HEP 3B 160
Bảng 3.75: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào BT474 161
Bảng 3.76: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào H211 161
Bảng 3.77: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào HTB85 161
Bảng 3.78: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào KG-1 162
Bảng 3.79: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào K-562 162
Bảng 3.80: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào NCE-Z2 162
Bảng 3.81: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào HT29 163
Bảng 3.82: Kết quả thử nghiệm Trypan Blue trên dòng tế bào NCL-N87 163
Bảng 3.83: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HEP G2 164
Bảng 3.84: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HEP 3B 164
Bảng 3.85: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào BT474 164
Bảng 3.86: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào H211 165

Bảng 3.87: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HTB85 165


Bảng 3.88: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào KG-1 166

Bảng 3.89: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào K-562 166
Bảng 3.90: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào NCE-Z2 166
Bảng 3.91: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HT29 167
Bảng 3.92: Kết quả thử nghiệm MTT trên dòng tế bào NCL-N87 167
Bảng 3.93: Tỷ lệ (%) tế bào HEP G2 trong các pha và Apoptosis (sub-G1)169




DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 4

Hình 1.2: Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ 5
Hình 1.3: Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 12
Hình 1.4: Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian 18
Hình 1.5: Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel 23
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định tính
39

Hình 3.1: Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus 53
Hình 3.2: Callus trên các môi trường khác nhau 56
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian 57
Hình 3.4: Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau 62
Hình 3.5: Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch SH
62


Hình 3.6: Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển 68
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 69
Hình 3.8: Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong
bioreactor 91

Hình 3.9: Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ 94
Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu sinh khối thông đỏ xử lý theo phương pháp chiết
lỏng -lỏng (a) và lỏng - rắn (b) 95

Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha
động III sử dụng cột Luna L43 97

Hình 3.12: Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b) 98
Hình 3.13: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b) 99
Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
paclitaxel 100

Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
baccatin III 101

Hình 3.16: Sắc ký đồ các mẫu phân tích 107
Hình 3.17: Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9 116
Hình 3.18: Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột 123
Hình 3.19: Sắc ký đồ các mẫu paclitaxel 125
Hình 3.20: Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ 128
Hình 3.21: Ảnh vi phẫu cành non thông đỏ 130
Hình 3.22: Các đặc điểm của bột cành non thông đỏ 130
Hình 3.23: Sắc ký đồ HPLC của chuẩn (a) và cành non thông đỏ (b) 131

Hình 3.24: Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b)
138

Hình 3.25: Một số hình ảnh tế bào trong nghiên cứu 168
Hình 3.26: Ảnh điện di ADN tổng số 169
Hình 3.27: Sự di cư của tế bào ung thư phổi 170



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt Chú thích
10-DAB 10-deacetylbaccatin III
2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid
2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
CAN Acetonitril
B5 Môi trường Gamborg
BAP 6-Benzyl amino purin
Bu (i) Isobutyl
Bz Benzoyl
CA Caffeic acid
Cs Cộng sự
DCM Dichloromethan
DĐVN Dược điển Việt Nam
FA Ferulic acid
FE Fungal elicitor (elicitor từ nấm)
GA Gibberelic acid
HPOL Hydroperoxid lyase
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao

IAA Indole – 3 acetic acid
IBA Indole – 3 butyric acid
JA Jasmonic acid
KL Khối lượng
KLK khối lượng tế bào khô
Kn Kinetin
MeOH Methanol
MJ Methyl jasmonic
MS Môi trường Murashige – Skoog
NAA 1-Naphtalen acetic acid
PhL Phenylalanin
PL Phụ lục
PVP Polivinyl pyrrolidon
SA Salicylic acid
SD Độ lệch chuẩn
SH Môi trường Hildebrandt
SKTB Sinh khối tế bào
Tc Taxuyunnanine C
TCCS Tiêu chuẩn cơ sở
USP Dược điển Mỹ
VSO
4
Vanadyl sulfat
Xyl Xylosyl

1

MỞ ĐẦU
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý phân bố chủ yếu tại
khu vực dãy núi Hymalaya. Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại các

huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh Lâm
Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m với số lượng cá thể nhỏ. Từ lâu, trong
dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn, viêm phế quản, nấ
c,
tiêu hoá ; cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân
non dùng trị bệnh đau đầu Đặc biệt, trong thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt
chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel (taxol), cephalomannin
hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung thư như baccatin
III, 10-deacetyl baccatin III, deacetyl taxol…. Tuy nhiên, thông đỏ là loài cây
sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong cây thấp. Theo tính
toán của các nhà khoa học, để
điều trị khỏi cho một bệnh nhân cần sử dụng
nguồn dược liệu tương đương với 8 cây thông đỏ 60 năm tuổi. Vì vậy, nguồn
nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đáp ứng đủ nhu cầu điều trị ngày càng tăng,
đồng thời việc khai thác từ cây tự nhiên dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơ tiệt
chủng loại dược liệu quý hiếm này [125].
Ở Việt Nam, các nhà khoa h
ọc đã nhân giống thành công và trồng rộng rãi
thông đỏ tại Đà Lạt để lấy lá sử dụng chiết xuất 10-deacetyl baccatin III làm
nguyên liệu bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Hiện nay, Bộ Khoa học
Công nghệ đã cho phép triển khai nhiều đề tài, dự án về nghiên cứu chiết xuất
phân lập cũng như sản xuất thuốc tiêm paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ
ở Việt Nam nhằm mục đích tạo ra sả
n phẩm thuốc điều trị ung thư phục vụ
cộng đồng. Bên cạnh đó việc ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật để
sản xuất các hoạt chất từ dược liệu nói chung và thông đỏ nói riêng cũng là
hướng nghiên cứu mới có triển vọng [125].
Công nghệ sinh khối tế bào thực vật là công nghệ nuôi cấy các tế bào
trong điều kiện vô khuẩn trong ố
ng nghiệm hay các bình nuôi cấy lớn, nhằm

2

mục đích tạo ra khối lượng tế bào từ đó có thể sử dụng để tách chiết các hoạt
chất [46], [53]. Công nghệ sinh khối tế bào có ưu điểm so với việc gieo trồng
ngoài tự nhiên là: thời gian từ khi nuôi cấy tới khi thu hoạch ngắn, không chịu
ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, dịch bệnh, thời
vụ; ch
ất lượng nguyên liệu ổn định, hàm lượng hoạt chất có thể được cải thiện
hơn so với trồng ngoài tự nhiên. Công nghệ này rất thích hợp cho việc sản
xuất các chất trong thực vật có cấu trúc hoá học phức tạp khó tổng hợp bằng
con đường hoá học hoặc các chất có hàm lượng thấp trong cây tự nhiên. Từ
công nghệ sinh khối tế bào thực vật, các nhà khoa học đã cung cấp cho thị

trường những sản phẩm có giá trị phục vụ cho ngành công nghiệp Dược phẩm
và thực phẩm [9], [53].
Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên liệu sản xuất paclitaxel từ
nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo hướng ứng dụng công nghệ sinh
khối tế bào thực vật, đề tài: “Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình tạo
khối tế bào thông đỏ Việt Nam (Taxus wallichiana Zucc.
) làm nguyên liệu
sản xuất thuốc điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu:
1. Xây dựng được quy trình công nghệ sinh khối tế bào Thông đỏ Việt
Nam quy mô phòng thí nghiệm.
2. Xây dựng được tiêu chuẩn nguyên liệu cành non thông đỏ, tiêu chuẩn
cơ sở của sinh khối tế bào Thông đỏ Việt Nam và kiểm định hàm lượng hoạt
chất chiết xuất từ sinh khối tế bào Thông đỏ
Việt Nam.
3. Đánh giá độc tính, tác dụng kháng tế bào ung thư của hoạt chất chiết
xuất từ sinh khối tế bào Thông đỏ.

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY THÔNG ĐỎ
Cây thông đỏ (Taxus sp.) hay cây thủy tùng được phân bố khắp các vùng
ôn đới của Bắc bán cầu, có tuổi đời kéo dài hàng trăm năm. Có nhiều loài
thông đỏ trên thế giới trong đó 8 loại được ghi nhận bao gồm: thông đỏ Châu
Âu (T. baccata); thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia); thông đỏ Canada
(T. canadensis); thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis), thông đỏ Nhật Bản (T.
cuspidata), thông đỏ Florida – Hoa Kỳ (T. floridana); thông đỏ Mexico (T.
globosa) và thông đỏ Himalaya (T. wallichiana) – loài thấy có ở cao nguyên
Đà Lạt – Lâm Đồng của nước ta. Ngoài ra, còn có hai giống lai được công
nhận: Taxus × media = T. baccata × T. cuspidata và Taxus × hunnewelliana
= T. cuspidata × T. canadensis.
Tại Việt Nam chủ yếu là loài thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiana
Zucc.) phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành
phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (hình 1.1). Ngoài ra tại các vùng Sapa – Lào Cai,
Mai Châu – Hoà Bình, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Ba Vì – Hà Nội, Sìn Hồ - Lai
Châu còn có thêm loài thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis) [1]. Trong đề tài
này đề
cập tới loài thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiana Zucc.) mọc ở Đà
Lạt được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu tạo sinh khối tế bào.
1.1.1. Tên khoa học
Taxus wallichiana Zucc., thuộc họ Thông đỏ-Taxaceae.
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Thông đỏ (thông đỏ lá dài, thông đỏ nam, hồng đậu sam) là cây bụi hay
cây thân gỗ nhỏ nhiều cành, lá thường xanh, sắp xếp theo hình xoắn ốc,
thường vặn xoắn tại gốc lá t

ạo thành kiểu 2 hàng. Các lá có dạng thẳng hay
hình mũi mác, với dải khí khổng màu lục nhạt hay trắng ở mặt dưới. Các loài
phần lớn là đơn tính khác gốc, ít khi đơn tính cùng gốc. Các nón đực dài

4

khoảng 2-5 mm, tung phấn ra vào đầu mùa xuân. Các nón cái bị suy giảm
mạnh, chỉ có một lá noãn và một hạt. Khi hạt chín, lá noãn phát triển thành áo
hạt nhiều thịt, bao phủ một phần của hạt. Áo hạt khi chín có màu sáng, mềm,
nhiều nước và ngọt, chúng bị một số loài chim ăn và nhờ đó mà hạt được phát
tán khi chim đánh rơi chúng [1].

Hình 1.1: Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)
Tại Việt Nam, thông đỏ phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn D
ương,
Lạc Dương và thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến
1.700 m (hình 1.1). Khu phân bố là các hẻm núi, cạnh khe suối, nơi cây lá
rộng thường chiếm ưu thế, rất ít cây lá kim. Đây là dược liệu có trong sách
đỏ. Hiện nay, do nạn phá rừng bừa bãi nên quần thể thông đỏ tự nhiên hiện
chỉ còn đếm được ở con số hàng trăm cá thể. Mặt khác, vì đặc tính tái sinh
hẹp và thế h
ệ trung gian hầu như không có nên nguy cơ diệt vong của loài cây
rừng thông đỏ rất cao. Hiện nay, tại Đà Lạt đã có nhiều dự án nghiên cứu
nhân giống thành công bằng công nghệ nuôi cây mô và giâm cành. Kết quả đã
phát triển được hàng chục hecta thông đỏ để thu hái lá dùng trong chiết xuất
10-DAB và các dẫn chất khác để bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6].
Photo b
y
: Vu Binh Duon
g

5

Tuy nhiên, thông đỏ vẫn là những cây đã được đưa vào sách đỏ thế giới và
sách đỏ Việt Nam để lưu ý bảo vệ [3].
1.1.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chủ yếu từ lá, vỏ thân và cành của loài T. wallichiana
đã được nghiên cứu từ hơn một trăm năm nay bao gồm các nhóm hoạt chất
sau: alcaloid hoặc diterpenoid khung taxan, steroid, lignan, biflavonoid và các
dẫn xuất của đường [82], [136].
1.1.3.1. Các hợp chất vòng taxan diterpenoid
Các hợp chấ
t diterpenoid khung taxan là thành phần tiêu biểu quan trọng
nhất tạo nên hoạt tính của cây thông đỏ. Hiện nay, các nhà khoa học đã phát
hiện được trên 50 chất diterpenoid khung taxan trong loài Taxus wallichiana
Zucc [6]. Trong đó nhiều chất quen thuộc có trong các loài khác thuộc chi
Taxus như: paclitaxel (5), baccatin III (1), 10-deacetyl baccatin III (3). Khung
taxan diterpenoid là một khung gồm 20 carbon, trong đó có 4 loại khung khác
nhau gồm: khung 6-8-6, khung 5-7-6, khung 6-10-6 và khung 6-12 (hình 1.2).
Trong đó, các chất phân lập được đa số thuộc khung 6-8-6 và 5-7-6.

19
20
18
17
16
15
14
13
12

11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1

Khung 6-8-6 Khung 5-7-6
19
20
18
17
16
15
14
13
12 11
10
9
8
7
6
5
4
3

2
1
O
H

19
20
18
17
16
15
14
13
12 11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1

Khung 6-10-6 Khung 6-12
Hình 1.2: Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ

6

Trong 4 bộ khung taxan thì các chất thuộc khung taxan 6-8-6 rất đáng chú
ý với nhiều các hoạt chất quan trọng như baccatin III, 10-DAB, paclitaxel
R
4
R
3
O
R
1
O
OBz
R
5
AcO
R
2

R
1
R
2
R
3
R
4
R
5
TLTK
Baccatin III (1) OH H OAc OH OH [145]
19-Hydroxybaccatin III (2) OH OH OAc OH OH [95]

10-Deacetylbaccatin III (3) OH H OH OH OH [145]
Các hợp chất baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 19-hydroxybaccatin III
có nhiều trong lá thông đỏ. Đặc biệt, trong đó 10-deacetyl baccatin III có hàm
lượng khoảng 0,01 - 0,15% là nguồn nguyên liệu quý dùng để bán tổng hợp
paclitaxel và docetaxel [6].
R
2
HO
R
4
O
Ph
O
O
HO
NH
R
3
OAc
R
1
O

R
1
R
2
R
3
R

4
TLTK
10-Deacetyltaxol (4) OH OH OBz OBz [95]
Paclitaxel (taxol) (5) OH OAc OBz OBz [136]
10-deacetyltaxol-7-xylosid (6) O-Xyl OH OBz OBz [82]
7-Xylosyltaxol (7) O-Xyl OAc OBz OBz [123]
7-Xylosyl-10-Deacetyltaxol C (8) O-Xyl OH C
5
H
11
OBz [122]
Cephalomannin (9) OH OAc OBu(i) OBz [118]
10-deacetylcephalomannin (10) OH OH OBu(i) OBz [95]


7

Trong các hoạt chất tìm thấy tác dụng thì nhóm các chất thuộc bộ khung
6-8-6 chiếm đa số, điển hình là paclitaxel (5). Paclitaxel được tìm ra lần đầu
tiên vào năm 1971 bởi Wani và cs [136] trong loài thông đỏ Thái Bình Dương
(T. brevifolia), sau đó được phân lập ở tất cả các loài thông đỏ khác, trong đó
hàm lượng paclitaxel trong thông đỏ khoảng 0,0045 – 0,015% [3].
1.1.3.2. Các chất khác
a) Các terpenoid khác
Ngoài các taxan diterpenoid, trong thông đỏ còn có các terpenoid khác
như: rhodoxathin (11), vomifoliol (12), dehydrovomifoliol (13) và
deglycosylicariside B
4
(14) [20].
O

O
11

HO
OH
O
O
O
OH
13
12
OH
O
OH
14

b) Lignan
Lignan là những hợp chất tiêu biểu của các loài thuộc chi Taxus nói chung và
loài T. wallichiana nói riêng, hầu hết các loài thông đỏ đều chứa các lignan như:
secoisolariciresinol (15), isotaxiresinol (16) và isolariciresinol (17)… [49].
O
OH
OH
O
15
OH
OH
O
OH
OH

OH
16
O
OH
OH
O
17
OH
OH
OH
OH

Trong nghiên cứu in vitro đã cho thấy rằng larciresinol và isolarciresinol

8

có tác dụng ức chế mạnh yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và taxiresinol được
cho là có tính bảo vệ cao chống lại các tổn thương dạ dày.
c) Các biflavonoid
Các hợp chất flavonoid được tìm thấy ở đây chủ yếu trong thông đỏ là các
flavonoid dimeric kiểu amentoflavone như: Ginkgetin (18), sciadopitysin
(19)… [39], [115], [117].

O
O
O
O
O
O
OH

OH
OH
OH
18
O
O
O
O
O
O
O
HO
OH
OH
19

d) Các steroid
Các hợp chất steroid quen thuộc cũng được phát hiện trong loài T.
wallichiana như: β-sitosterol (20), stigmasterol (21)… mà hoạt tính của các
chất này đã được biết đến [20], [115], [142], [145].

HO
20
HO
21

Ngoài ra các đường khử, acid kojic và tanin… đã được phát hiện trong tất
cả các loài thông đỏ [142] nhưng không mang nhiều ý nghĩa và không được
chú ý nghiên cứu nhiều, được xem là các tạp chất cần loại bỏ trong quá trình
phân tách.

1.1.4. Tác dụng sinh học
Cao lá thông đỏ, cho chuột cống trắng cái uống liều 100 và 500 mg/kg,
trong những ngày 1-7 sau khi giao hợp, có tác dụng ức chế sự thụ thai đến
60% và 80% tương ứng [3].
Vỏ cây, lá và hạt thông đỏ có độc tính cao.

9

Alcaloid taxin từ thông đỏ gây các triệu chứng độc: nôn, tiêu chảy, mê
sảng, có tác dụng ức chế tim làm giảm lực co cơ tim, giảm nhịp tim và phong
bế nhĩ thất do tác dụng ức chế kênh natri và calci [3].
Phân đoạn flavonoid từ lá thông đỏ gồm 3 biflavonoid (sciadopitysin,
gingetin và sequoiaflavon) có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương và
giảm đau mà không gây ngủ.
Đặc biệt paclitaxel phân lập từ cây thông đỏ có tác dụng diệt tế bào ung
thư mạnh vớ
i các loại ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư dạ dày, ruột.
1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT
1.2.1. Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai
1.2.1.1. Một số khái niệm cơ bản
Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuôi cấy và tạo khối lượng lớn tế bào
thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện nuôi cấy vô
khuẩn mà không cần thâm canh gieo tr
ồng. Các tế bào khi nuôi cấy vẫn giữ
nguyên được các đặc tính vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất hay các
chất chuyển hóa thứ cấp sinh ra từ các tế bào gần như được giữ nguyên [9],
[73], [111].
Nguyên tắc của công nghệ sinh khối dựa trên cơ sở tính toàn năng
(totipotent) và tính biệt hóa của một số tế bào thực vật. Khi được đưa vào môi
trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp, các tế bào thự

c vật có thể phát
triển thành một cơ quan, một cây hoàn chỉnh hoặc một khối lượng lớn dòng tế
bào đó. Dựa trên cơ sở đó, công nghệ nuôi cấy mô thực vật có thể tạo ra cây
từ đỉnh sinh trưởng được tách ra. Sau đó, cây được nhân nhanh tạo ra nhiều
mầm cây con, từ đó có thể kích thích tạo rễ và phát triển thành cây hoàn
chỉnh. Người ta nuôi cấy tạo mô sẹo (callus) từ một mô bất kì củ
a cây. Sau
đó, biệt hóa thành mô sinh trưởng, tạo mầm, tạo rễ và cuối cùng cũng phát
triển thành một cây mới hoàn chỉnh [57], [112].
Khác với nuôi cấy mô, công nghệ sinh khối tế bào thực vật không nuôi

10

cấy tạo ra cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi các tế bào để tạo ra sinh khối và có thể
sử dụng cho chiết tách các hoạt chất sinh học. Quá trình này cũng bắt đầu từ
việc tạo ra callus từ những mô khác nhau của thực vật. Sau đó, chúng được
làm mất tính biệt hóa và được thuần hóa trong môi trường dinh dưỡng thích
hợp. Cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống bình nuôi cấy (bioreactor ).
Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực v
ật, đặc tính của tế bào được giữ
nguyên như ban đầu. Các quá trình sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với
tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên, trong đó có việc tổng hợp và tích lũy
hoạt chất [53], [59].
1.2.1.2. Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật
- Công nghệ sinh khối tế bào thực vật không chịu tác động của các yếu tố
tự nhiên như
địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai do toàn bộ quy
trình tạo sinh khối được tiến hành trong phòng thí nghiệm hoặc nhà máy.
Điều này giúp khắc phục được ảnh hưởng bất lợi của điều kiện tự nhiên tới
năng suất, chất lượng sản phẩm và loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi gieo

trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phụ
c vụ sản xuất [9], [19].
- Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh khối tế bào rút ngắn
hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên. Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến hành
tạo callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình) đến việc nuôi cấy trong môi
trường lỏng phải mất khá nhiều thời gian. Tuy nhiên, sau khi đã lựa chọn
được điều kiện, môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất m
ột mẻ sinh
khối thường khoảng từ 15 - 50 ngày. Như vậy, thời gian đã rút ngắn rất nhiều
so với trồng cây ngoài tự nhiên nên chủ động được nguồn nguyên liệu phục
vụ sản xuất [9]. Theo Guilk và cs (2006) trong nghiên cứu xây dựng quy trình
tạo sinh khối dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) sản xuất alcaloid
nhân indole, thời gian cho 1 mẻ nuôi cấy sản phẩm là 20 ngày [56]. Trong khi
sản xuất sinh khối thông đỏ Châu Âu (Taxus baccata) cần thời gian thích hợp
cho 1 chu kỳ nuôi cấy trong môi trường lỏng là 28 ngày [107].

11

- Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo công nghệ sinh khối tế bào thực
vật rất ổn định. Vì các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, thành phần
môi trường, cường độ ánh sáng đều được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo cho tế
bào phát triển tốt, hàm lượng hoạt chất ổn định. Do đó, sản phẩm thu được có
chất lượng ổ
n định đáp ứng được yêu cầu sản xuất theo tiêu chuẩn GMP [7],
[57], [59].
- Trong quá trình tạo sinh khối tế bào thực vật, có thể điều khiển quá trình
sinh tổng hợp để các hoạt chất có hàm lượng cao hơn so với nuôi trồng ngoài
tự nhiên, nên kỹ thuật này phù hợp với các dược liệu có hàm lượng hoạt chất
thấp hoặc các chất rất khó tổng hợp hóa học được như: taxol, vinblastin,
vincristin, shikonin, reserpin Nghiên cứu về sinh kh

ối tế bào thông đỏ cho
thấy khi sử dụng các biện pháp kích thích làm tăng hoạt chất thì hàm lượng
hoạt chất cao hơn trong cây tự nhiên từ 10 - 15 lần [148]. A. Y. Khosroushahi
[72] khi nuôi cấy tế bào thông đỏ đã tối ưu điều kiện và môi trường nuôi cấy.
Kết quả hàm lượng paclitaxel đã cải thiện rất nhiều so với ban đầu.
- Đối với các dược liệu quí hiếm sản xuất theo công nghệ này thì giá thành
sả
n xuất sẽ thấp hơn. Vì trong thời gian ngắn có thể tạo ra một khối lượng lớn
sản phẩm trong khi chi phí nguyên liệu cho nuôi cấy thấp [111], [132].
1.2.1.3. Những khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào, đó là thành phần
môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ oxy hòa tan,
pH môi trường và đặc điể
m cấu tạo của hệ thống bình nuôi cấy). Chi phí đầu
tư dây truyền sản xuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật khác
với nuôi cấy nấm và vi khuẩn nên hệ thống các bình nuôi cấy (bioreactor) cần
phải thiết kế riêng cho phù hợp với từng loại tế bào [109], [119]. Hàm lượng
các hoạt chất trong sinh khối tế bào còn thấp, đặc biệt là với các tế bào có
nhiều nhóm hoạt chất cùng tồ
n tại thì việc kích thích tăng riêng rẽ hàm lượng
từng nhóm chất rất khó khăn [9]. Những khó khăn trên đang được các nhà

12

khoa học tập trung nghiên cứu khắc phục.
1.2.2. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật
Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật thường được tiến hành theo năm
giai đoạn kế tiếp nhau [9] (Hình 1.3).
* Giai đoạn 1: Tạo callus
Callus là dòng tế bào ban đầu, chưa biệt hóa được tạo ra trong phòng thí

nghiệm, tương tự như những tế bào gốc tạo ra để hàn gắn vị trí tổn th
ương của
cây. Callus được hình thành từ các mô, các tế bào được tách ra từ cơ thể thực
vật nhờ tác động của chất kích thích sinh trưởng. Trong giai đoạn này, ngoài
thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thì kỹ thuật vô khuẩn được xem
là yếu tố quan trọng nhất [9].
* Giai đoạn 2: Duy trì nuôi cấy callus trong môi trường thạch mềm
Việc duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch mềm đảm bảo cho tế bào
thích nghi hoàn toàn với
điều kiện sống mới (tách ly hoàn toàn ra khỏi cơ thể
mẹ). Đồng thời, nó làm cho tế bào có hình thái mềm, xốp, có đủ sức sống và
đặc biệt làm mất khả năng biệt hoá thành các cơ quan bộ phận khác. Điều này
tạo thuận lợi cho cấy chuyển tế bào sang môi trường nuôi cấy lỏng.


Hình 1.3: Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật
a - Tạo callus; b - Duy trì nuôi cấy callus; c - Nuôi cấy trong môi trường
lỏng; d - Khu
ếch đại qui mô nuôi cấy; e - Thu hoạch sinh khối.
a
b
c
d
e

13

* Giai đoạn 3: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng
Đây là bước rất quan trọng, quyết định tốc độ phát triển cũng như hàm
lượng hoạt chất của sinh khối. Trong giai đoạn này, phải khảo sát đầy đủ các

yếu tố ảnh hưởng như: điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, nhằm mục
đích cho sinh khối phát triển nhanh nhất, hàm lượng hoạt chấ
t trong sinh khối
cao nhất [7], [116].
* Giai đoạn 4: Nâng cấp quy mô nuôi cấy (scale-up)
Sau khi đã tìm được các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp, để tăng
khối lượng sản phẩm, các tế bào phải được nuôi cấy trong hệ thống các bình
nuôi cấy có thể tích khác nhau tùy theo quy mô. Ở giai đoạn này, các yếu tố về
điều kiện sản xuất như loại bình nuôi cấy, kiểu cánh khuấy, phân áp oxy hòa tan
là những yếu tố
cần phải khảo sát. Trong quy trình sản xuất taxol và shikonin,
người ta đã sử dụng các bioreactor 10.000 và 75.000 lít [119], [125].
* Giai đoạn 5: Thu hoạch khối tế bào
Thu hoạch khối tế bào là bước cuối cùng trong quy trình nuôi cấy. Thông
thường, các hoạt chất được tích lũy chủ yếu trong tế bào nên phương pháp lọc
lấy tế bào là cách phổ biến để thu sản phẩm. Tuy nhiên, có một số trường hợp
hoạt chất lại được giải phóng ra ngoài môi trườ
ng nên việc thu hồi các hoạt
chất mất nhiều công sức và chi phí tốn kém [111]. Các hoạt chất sau khi tách
chiết sẽ được nghiên cứu tác dụng sinh học và bào chế sản phẩm.
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng
hoạt chất trong nuôi cấy tế bào thực vật
1.2.3.1. Môi trường nuôi cấy
* Loại môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường là một trong hai nhóm yếu tố quyết định thành
công c
ủa quá trình tạo sinh khối. Môi trường nuôi cấy phù hợp sẽ thúc đẩy tế
bào phát triển. Đồng thời, môi trường cũng ảnh hưởng tới các quá trình sinh
lý, sinh hóa của tế bào, làm tăng năng suất và hàm lượng hoạt chất. Các nhà

14

khoa học đã thiết lập được một số môi trường nuôi cấy cơ bản với những
thành phần và tỷ lệ muối vô cơ khác nhau [47]. Môi trường thường được sử
dụng nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là Murashige - Skoog (MS). Bên
cạnh đó còn có nhiều loại môi trường khác như B5, Nitsch, White [46].
* Vai trò của một số yếu tố trong môi trường nuôi cấy
- Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon là nguồn cung cấp toàn b
ộ năng lượng cho tế bào phát triển
khi nuôi cấy trong điều kiện các tế bào đã bị tách li hoàn toàn ra khỏi cây. Các
đường thường được sử dụng là glucose, saccharose, maltose, fructose , có thể
sử dụng riêng lẻ hay kết hợp trong quá trình nuôi cấy [130].
Nồng độ và loại đường không những ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế
bào mà còn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp. Vì
khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy làm tăng áp lực thẩm thấu và tác
động vào tế bào thì nó kích thích làm tăng tổng hợp các phytoalexin [11],
[102]. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào Coleus blumei Benth. cho thấy khi
dùng saccharose 7,5% trong môi trường nuôi cấy, thì hàm lượng hoạt chất là
3,3 g/l, nếu dùng saccharose 2,5% thì hàm lượng hoạt chất chỉ đạt 0,8% [94].
Vì vậy, trong thực nghiệm, phải tối ưu hóa loại và nồng độ đường nhằm đảm
bảo cho tế bào phát triển tố
t nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất.
- Hormon thực vật
Hormon thực vật hoặc các chất kích thích sinh trưởng rất cần thiết đối với
các tế bào chưa biệt hoá để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dòng tế bào.
Hormon thực vật thường dùng trong sinh khối gồm 2 nhóm chính:
+ Nhóm khung auxin: gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 1-
naphtalenacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric
acid (IBA) thường xuyên được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1 – 50

µM dùng làm chất kích thích tăng trưở
ng trong nuôi cấy tế bào. Đặc biệt,
trong sinh khối tế bào, NAA và 2,4-D là những chất không thể thiếu nhất là ở