Tải bản đầy đủ (.doc) (36 trang)

Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (317.41 KB, 36 trang )

1
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Vi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong công
tác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế. Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiện
cho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.
Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất của
một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus…. Trong
đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B
1
, G
1
, B
2
và G
2
, có thể gây bệnh ở mức vi
lượng.
Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis,
rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới. Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sản xuất
giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết. Do đó,
hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn.
Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxin
nhiễm từ sữa mẹ truyền cho con.
Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vì
aflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong môi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt. Do vậy,
việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxin trong
thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết.
Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch,
cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc
kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải qua nhiều


thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc kí ái lực
miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn tinh
sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên
và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được; quy
trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu
cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích.
Trong số các aflatoxin, aflatoxin B
1
được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng
khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B
1
cao hơn nhiều so
với các aflatoxin khác.
2
Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài
Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho
hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B
1
.
Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính,
cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật nuôi, hơn nữa cấu trúc hoá học lại khá
tương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên
cứu.
Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS.
TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tôi
tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do
Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”.
1.2 Mục đích
Khảo sát khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch.
1.3 Yêu cầu

Xác định các đặc tính của cột ái lực miễn dịch trong việc bắt aflatoxin G1:
• Độ nhạy của cột
• Độ lặp lại của cột
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đại cương về aflatoxin
3
2.1.1 Lịch sử phát hiện
Năm 1960 ở Anh, một vụ dịch bệnh xảy ra làm chết 100.000 gà tây con, khi
mổ xác thấy có xuất huyết hoại tử ở gan kèm tổn thương ở thận mà nguyên nhân
không được biết rõ. Do đó, người ta gọi là bệnh “X” của gà tây.
Sau đó, những vụ tương tự cũng được quan sát thấy trên vịt con ở Áo, gà giò
ở Tây Ban Nha, cá hồi ở Mỹ, trĩ con ở Uganda…Các nhà bác học đã nhanh chóng
tìm ra mối liên hệ giữa các vụ ngộ độc đó với việc cho ăn khô dầu đậu phộng và họ
cũng thấy rằng bệnh này không những xảy ra đối với gia cầm mà còn với cả gia súc,
đặc biệt là heo, bê, cừu…
Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan,
các nhà bác học đã quan sát và phân lập được loài vi nấm Aspergillus flavus trên các
hạt đậu mốc và lúa mì mốc. Việc tinh chế các độc tố từ các loại hạt bị nhiễm nấm
Aspergillus cho ra một loại hợp chất mà trong bản báo cáo của Forgacs và Carl xuất
bản năm 1962, người ta gọi là aflatoxin (A: Aspergillus, fla: flavus và toxin có nghĩa
là chất độc).
Đến nay, aflatoxin được biết là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp qua con đường
polyketide của một số loài nấm thuộc chủng Aspergillus flavus (khoảng 50%
chủng), Aspergillus parasiticus (100% chủng) (Klick và Pitt, 1988)[4], Aspergillus
nomius; ngoài ra còn có Penicillium spp, Rhizopus spp nhưng ít có vai trò gây bệnh
trong thực tế. Ở A. flavus và A. parasiticus, con đường sinh tổng hợp aflatoxin liên
quan ít nhất 16 phản ứng enzyme được mã hóa bởi 25 gen tập trung thành nhóm
trong một vùng DNA 70 kilobase trên nhiễm sắc thể [19].
(1) (2)
Hình 2.1: A. flavus (1) [20] và A. parasiticus (2) [21].

4
Việc khám phá ra aflatoxin đã kích thích các nhà khoa học nhiều ngành tập
trung nghiên cứu về tất cả các mặt của aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới sức khoẻ của
con người và động vật.
2.1.2 Phân loại
Có thể nói Sargeant (1962) là người có công xác định các độc tố này. Chúng
là các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau và có khung hoá học giống với dẫn xuất
của cumarin nên gọi là flavacumarin. Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin, 2
nhân furan và 1 vòng lacton [11].
Hiện người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998)[4].
Các aflatoxin được sản xuất trong tự nhiên gồm 4 loại, kí hiệu AFB1, AFB2,
AFG1 và AFG2 (được gọi tên do tính chất phát huỳnh quang dưới tia UV: B: Blue;
G: Green). Aflatoxin nhóm B và nhóm G khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có 1 nhóm
chức lacton trong khi nhóm G có 2 chức lacton.

O
O
O
O
O
OMe
AFB1
F
C
L
P

O
O
O

O
O
O
OMe
AFG1
F
C
L

F: Vòng furan
C: Vòng cumarin
L: Vòng lactone
P: Vòng pentenone
Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của AFB1 và AFG1.
Các loại aflatoxin khác là do sự chuyển hoá của các aflatoxin trên trong nấm và
trong cơ thể động vật.
 AFB2 và AFG2 là dẫn xuất hydro hoá của AFB1 và AFG1.
 AFB2a và AFG2a là dẫn xuất hemiacetal của AFB1 và AFG1.
 AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của AFB1 và AFB2 tìm thấy trong sữa,
thận và gan động vật.
 Ngoài ra: AFGM1, AFGM2, AFM2a, AFGM2a, AFB3 (parasiticol),
dihydroaflatoxin B3, Ro (aflatoxicol), dihydoaflatoxicol, AFP1, AFQ1…
5
O
O
O
O
O
OMe
O

O
O
O
O
O
OMe
O
O
O
O
O
OH
OMe
O
O
O
O
O
O
OH
OMe
O
O
O
O
O
OH
OMe
O
O

O
O
O
OH
OMe
AFB2 AFG2
AFB2a AFG2a
AFM1 AFM2
Hình 2.3 : Cấu trúc hoá học của các aflatoxin.
2.1.3 Tính chất hóa lí
Aflatoxin dễ bị huỷ bởi những chất kiềm, nhưng tương đối bền với nhiệt. Ở
nhiệt độ cao hơn 100
o
C chỉ khử được phần nào aflatoxin.
Aflatoxin ít tan trong nước, tan trong các dung môi phân cực như:
chloroform, acetonitril, aceton, methanol…
Aflatoxin không tan trong những dung môi hòa tan chất béo như n-hexan,
ether ethylic, ether dầu hoả…
Hầu hết các loại aflatoxin đều phát huỳnh quang ở khoảng bước sóng 440 nm
khi kích thích bởi ánh sáng có độ dài sóng khoảng 365 nm [10].
Các đặc tính lí hóa được trình bày trong phụ lục 1.
2.1.4 Tác động sinh học
Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con
người. Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa
tuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ của cơ thể, môi trường và hàm
lượng chất độc ăn phải.
6
Hấp thu qua đường tiêu hoá là giai đoạn đầu tiên của sự xâm nhập AFB1 vào
cơ thể với 3 kiểu hấp thu qua niêm mạc ruột: khuyếch tán, hoà tan trong lipid và vận
chuyển nhờ protein mang. Sau đó, AFB1 được vận chuyển trong hệ tuần hoàn nhờ

liên kết với các tế bào máu hoặc protein huyết tương (90% ở dạng liên kết với
albumin). Sau khi vào gan qua hệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủ yếu ở
gan [11]. Tại đây, AFB1 có sự chuyển hóa phức tạp:
O
O
O
O
O
OMe
O
O
O
O
OHH
OMe
O
O
O
O
O
O
OMe
O
O
O
O
O
OH
OH
OMe

O
O
O
CH
3
O
O
O
O
O
O
O
OH
OMe
O
O
O
O
O
OH
OMe
O
OO
O
O
OH
OMe
Protein adducts
GLUCURONIDE
Conjugates

DNA adducts
AFB1-8,9-epoxide
Aflatoxicol
AFB1
AFP1
AFQ1
AFM1
AFB2a
Milk
AFB1-dhd
Hình 2.4: Các sản phẩm chuyển hoá cuả AFB1 [13].
Các chất chuyển hóa được cơ thể cố gắng bài thải, như: AFM1 và AFM2 qua
sữa; AFP1 và AFQ1 qua nước tiểu.
Đáng kể, dưới xúc tác của hệ enzyme monooxygenase trong cytochrome P450
(CYP 450) rất phong phú ở tế bào gan, chất tạo thành là AFB1-8,9-epoxide được coi
như chất biến dưỡng có hoạt tính rất cao, có thể gắn với các đaị phân tử (DNA, RNA và
protein) làm rối loạn hoạt động bình thường của tế bào (Swenson, 1975).
7
2.1.4.1 Độc tính cấp của aflatoxin
Nhiễm độc cấp tính khi ăn phải một lượng lớn aflatoxin. Thú non mẫn
cảm hơn thú trưởng thành, gia cầm mẫn cảm hơn gia súc, được biểu hiện theo thứ tự
sau:
Vịt > gà tây > ngỗng > ngan > gà > chó > heo > bò > ngựa > cừu
(Allcroft, 1962) [11].
Tính gây độc cấp thể hiện qua liều gây chết 50% (LD
50
).
Bảng 2.1: LD
50
của AFB1 cho uống một lần duy nhất trên động vật

(Ciegler, 1975) [2]
Loài động vật
(Xếp theo thứ tự
mẫn cảm)
LD
50
(mg/ kg thể trọng)
Vịt con 0,3-0,6
Heo 0,6
Cá hồi 0,8
Chó 1,0
Chuột lang 1,4-2,0
Cừu 2,0
Khỉ 2,2
Chuột cống 5,5-17,9
Gà 6,3
Chuột bạch 9,0
Theo bảng trên và bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD
50
trên
động vật (xem phụ lục 2), có thể thấy aflatoxin thuộc nhóm độc tố cực độc. Triệu chứng
nhiễm độc thể hiện qua sự tổn thương ở gan và triệu chứng thần kinh như nằm liệt và co
giật. Chết có thể xảy ra đột ngột sau một thời gian ngắn, thường dưới 72 giờ. Giải phẫu
bệnh cho thấy hoại tử và chảy máu ở nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận cấp, tụ máu ở phổi
[11]. Nguyên nhân gây chết là do gan bị huỷ hoại rất nhanh (necrosis) theo cơ chế phân
tử:
8
O
OO
O

O
OMe
O
O
O
O
O
OH
OH
OMe
enzyme
Gan
O
O
O
CH
O
OH
H
C
H
O
OMe
O
OMe
N
N
H
C=O
CH

R3
R4
N
H
R2 C=O
O
O
O
C
H
O
OH
H
C
H
N
C
H
R1
AFB1
AFB1-dhd
acid
base (pH=7,4)
protein
Di-aldehyd resonance hybrid
Shiff's base
Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của AFB1 ở mức tế bào gan (Cliford and Rees, 1967) [5]
Ở đây, nhóm Dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo
thành kiềm Shiff (Shiff’s base). Các kiềm Shiff có thể ức chế sinh tổng hợp DNA, RNA
dẫn đến ngăn cản tổng hợp protein làm cho hoạt động ở gan bị rối loạn tạo nên tình

trạng nhiễm độc cấp tính.
Như vậy, AFG1 cũng có thể tạo thành kiềm Shiff do cũng mang liên
kết đôi ở vị trí 8,9 ở đầu cùng trên vòng furan. Liên kết này được bão hoà trong cấu trúc
của AFB2 và AFG2, do đó, không thể trực tiếp tạo thành kiềm Shiff nên mang tính độc
ít hơn so với AFB1 và AFG1[5].
2.1.4.2 Độc tính mãn
Thường xảy ra nhiều hơn so với nhiễm độc cấp tính và có tác động dài
hơn do cơ thể có thể chịu đựng được một mức nào đó trong khẩu phần.
Khi có sự nhiễm độc mãn tính, các triệu chứng thấy được là kém ăn và
chậm lớn; gan chịu ảnh hưởng nhiều nhất: gan tụ huyết, xuất huyết. Khi kiểm tra vi thể
thì xuất hiện sự thoái hoá tế bào biểu mô, thoái hoá mỡ gan, tế bào lympho bị thâm
nhiễm. Nhiễm độc kéo dài sẽ gây đột biến, ung thư gan. Nếu nhiễm aflatoxin trong thời
kì mang thai, thai sẽ bị tật, chết hoặc sinh quái thai (Nguyễn Lê Trang, 2003) [2]. Năm
1988, IARC đã xếp AFB1 vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người, đặc
biệt là ung thư gan [22]. Nếu hấp thu 2,5 mg aflatoxin trong 89 ngày sẽ thấy xuất hiện
9
ung thư gan sau một năm. Tại Việt Nam đã có công trình nghiên cứu tìm aflatoxin trong
dịch cổ trướng bệnh nhân ung thư nguyên phát đều có hàm lượng từ 1,1 – 3,5 ppb [13].
Cơ chế phân tử của nhiễm độc mãn tính:
O
OO
O
O
O
OMe
O
O
O
O
N

N
O
O
OMe
OH
NH
2
O
OPO
3
O
3
PO
NH
N
+
--
DNA
O
OH
O
3
PO OPO
3
-
-
O
O
O
O

N
N
H
O
O
OMe
OH
NH
2
O
OPO
3
O
3
PO
NH
N
--
CHO
AFB1-N7-Gua
AP Site

AFB1-FAPY
DNA Adduct
AFB1-8,9-exo epoxide
AFB1-N7-Gua
DNA Adduct
Hình 2.6: AFB1-8,9-epoxide gắn vào DNA (Smela và ctv, 2001) [14].
AFB1-8,9-epoxide gắn kết đồng trị lên DNA ở vị trí N7 của một
guanine. Do cầu nối glycoside mất ổn định, nhóm purine có thể bị tách khỏi DNA. Hoặc

khả năng khác là vòng imidazole trong cấu trúc purine bị mở ra thành cấu trúc
formamidopyrimidine (AFB1-FAPY) ổn định và tồn tại trong điều kiện sinh học. Các
điểm đột biến do AFB1 thường nhận thấy là sự đảo chuyển GC TA (dị hoán). Điểm
nóng của đột biến đã được phát hiện là ở vị trí thứ ba trong đơn vị mã (codon) 249 của
gen p53. Gen này mã hoá cho một phosphoprotein có hoạt tính tăng cường hoặc kiềm
chế phiên mã của một số gen có chức năng kiểm soát chu trình nhân lên của tế bào, để
ngăn ngừa tế bào tăng sinh thành tổ chức bất thường, có thể dẫn đến hình thành u. Khi
cấu trúc DNA bị biến đổi, tế bào phản ứng lại bằng cách thể hiện nhiều phosphoprotein
p53 để ức chế sự sao chép của DNA bị biến đổi. Nếu thời gian sửa chữa lại DNA kịp
10
thời (do một số enzyme) trước khi DNA biến đổi được sao chép, bảo tồn di truyền được
ổn định. Các chất độc di truyền tác động trực tiếp hay gián tiếp đều làm tăng mức
protein p53 tế bào. Khi AFB1 tác động vào gen p53 làm protein p53 bị biến đổi, mất
hoạt tính, hậu quả là tế bào tăng trưởng không kiểm soát dẫn đến hình thành khối u
(Bennett và Klich, 2003) [14]. Liên quan giữa nhiễm siêu vi viêm gan B (HBV), ung thư
tế bào gan và vai trò của p53 cũng đã được khảo sát và nghiên cứu nhiều. Với bệnh
nhân trong nước tiểu có AFB1-N7-Gua, tỉ lệ phát ung thư tế bào gan cao hơn 3 lần so
với trường hợp âm tính. Với bệnh nhân có kháng nguyên bề mặt HbsAg trong huyết
thanh, tỉ lệ này là 6 lần cao hơn bệnh nhân âm tính HbsAg. Và nếu xuất hiện cả AFB1-
N7-Gua và HbsAg, tỉ lệ này cao gấp 60 lần [14].
2.1.5 Sự hiện diện của aflatoxin trong thực phẩm
Theo tài liệu của FAO, không có thực phẩm nào được xem như an toàn tuyệt
đối khỏi sự nhiễm độc tố vi nấm, và sự nhiễm độc tố này xảy ra ở mọi giai đoạn từ lúc
cây trồng còn ở ngoài đồng đến khi thu hoạch, chế biến, bảo quản và vận chuyển. Và
theo ước tính của FAO, hơn 25% sản phẩm nông nghiệp trên thế giới bị nhiễm độc tố vi
nấm [4]. Hầu hết các số liệu liên quan cho thấy sự nhiễm aflatoxin thường xảy ra nhất ở
đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng, bắp và các loại hạt khác như gạo, lúa mì, đậu
nành, hạt bông vải… Theo Carlos A. Muro-Cacho (2004), sự tiêu thụ aflatoxin của con
người từ 0 – 30000 ng/kg/ngày, trung bình từ 10 – 200 ng/kg/ngày [15].
Nước ta có điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm thích hợp cho sự phát triển vi nấm

và sản sinh độc tố trong thực phẩm, nhất là aflatoxin. Do đó, vấn đề an toàn thực phẩm
được đặt ra nhằm hạn chế những thiệt hại về kinh tế (gây chết đàn vịt, gà, lợn…) cũng
như bảo đảm an toàn thực phẩm cho người, vì những dạng chuyển hóa của aflatoxin còn
độc tính vẫn có thể hiện diện trong gan, sữa, trứng, là những thức ăn hằng ngày của
người.
2.1.6 Giới hạn về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc
Aflatoxin hiện diện trong thực phẩm như là một sự nhiễm bẩn tự nhiên nên
con người không thể kiểm soát để ngăn chặn chúng. Dựa vào nhiều yếu tố như: số liệu
giám sát, sự phân bố aflatoxin trong thực phẩm, dữ liệu về độc chất học, phương pháp
phân tích và tiêu chuẩn cho phép của các quốc gia có quan hệ mua bán với nhau mà
từng quốc gia, từng khu vực trên thế giới ra các quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin
tổng cộng tối đa cho phép trong các loại thực phẩm và thức ăn gia súc khác nhau.
11
Bảng 2.2: Quy định hạn chế mức nhiễm aflatoxinB1 trong thực phẩm ở Pháp [14]
Loaị thực phẩm Đối tượng sử dụng Giới hạn (ppb)
Sữa nước Trẻ em < 3 tuổi 0,03
Sữa bột Trẻ em < 3 tuổi 0,3
Sữa nước Thông dụng 0,05
Sữa bột Thông dụng 0,5
Dầu ăn và các chất béo 5
Thực phẩm Trẻ em và thiếu niên 1
Thực phẩm Các loaị 10

Ở Việt Nam, giới hạn về hàm lượng aflatoxin cho phép có trong thực phẩm
hiện đang áp dụng theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm ban
hành kèm theo quyết định số 867/1998 / QĐ-BYT.
Bảng 2.3: Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm ở Việt Nam
STT Tên độc tố vi nấm Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối
đa cho phép (ppm)
1 Aflatoxin tổng số hoặc B1 Thức ăn 10

2 Aflatoxin M1 Sữa 0.5
3 Các độc tố vi nấm khác Thức ăn 35
Bảng 2.4: Hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm.
Loại vật nuôi AFB1 (ppb) AFT tổng (ppb)
Gà con từ 1-28 ngày tuổi

20

30
Nhóm gà còn lại

30

50
Vịt con từ 1-28 ngày tuổi Không có

10
Nhóm vịt còn lại

10

20
Lợn con theo mẹ từ 1-28 ngày tuổi

10

30
Nhóm lợn còn lại

100


200
Bò nuôi lấy sữa

20

50
(Ban hành theo quyết định số 104/2001 QD-BNN của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển
Nông Thôn ngày 31-10-2001).
2.2 Các phương pháp phân tích aflatoxin
2.2.1 Phương pháp sinh vật học
Phương pháp này đã được sử dụng đầu tiên, chủ yếu dựa vào tính mẫn cảm
của một số loài sinh vật được thử nghiệm với aflatoxin. Đây là phương pháp định tính
hay bán định lượng, không chuyên biệt đối với từng độc tố nhưng đơn giản và dễ thực
hiện.
12
Thử nghiệm độc tính trên phôi gà (Chicken Embryo Bioassay): Chiết mẫu
bằng chloroform cô đặc có nồng độ khoảng 200-300 ng/ml, sau đó tiêm vào buồng khí
hoặc lòng đỏ của trứng gà Leghorn trắng đã thụ tính và ấp trong 5 ngày, phôi gà sẽ chết
trong vòng 2 ngày nếu có aflatoxin. Thử nghiệm này đã được đưa vào tiêu chuẩn AOAC
[10].
Ngoài ra, độc tính của aflatoxin còn được thử nghiệm trên vịt con mới sinh,
ấu trùng của loài giáp xác, tế bào động thực vật nuôi cấy, trên vi khuẩn Bacillus
megaterium, trên cá hồi…[10]
2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lí
Các phương pháp này dùng phát hiện và định lượng aflatoxin nhanh, chính
xác và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương pháp sinh học; hiện nay được dùng
chủ yếu trong các phòng thí nghiệm.
Các giai đoạn cơ bản:
2.2.2.1 Lấy mẫu

Mục đích: Lấy mẫu đại diện cho lô hàng hay đối tượng khảo sát.
Thông thường, tuỳ theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần
phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác
nhau. Các mẫu này được tiến hành đồng nhất và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích
hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích aflatoxin, thường từ 20-100g tuỳ thuộc vào
loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu.
2.2.2.2 Chiết aflatoxin
Lấy mẫu
Chiết aflatoxin
Tinh chế aflatoxin
Cô đặc mẫu
Phát hiện và định lượng aflatoxin
13
Mục đích: Tách aflatoxin cần tìm từ khối mẫu gồm nhiều chất
phức tạp.
Sự lựa chọn dung môi cho việc chiết mẫu tuỳ thuộc vào tính chất
hóa học của aflatoxin cũng như tính chất của các thành phần khác.
Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên, sử dụng các dung
môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane hoặc isooctane nhằm tách chất béo
trước khi tiến hành chiết aflatoxin.
Chiết aflatoxin: do aflatoxin tan được trong các dung môi hơi phân
cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với
các dung môi hữu cơ như dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform,
hay methanol. Thông thường, hỗn hợp dung môi hoặc những dung môi với một lượng
nhỏ nước và acid được thấy là hữu hiệu nhất. Trong khi độ hoà tan của aflatoxin trong
nước thấp, dung môi có nước có thể thấm vào các mô ưa nước làm cho sự chiết tách
hữu hiệu hơn.
Quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc
thông thường trong 30 phút hoặc dùng máy xay tốc độ cao trong 1-3 phút.
Một số phương pháp chiết:

• Chiết bằng dung môi chloroform-Phương pháp EEC
(European Economic Community)
• Chiết bằng dung môi methanol
- Phương pháp BF (Best Food)
- Phương pháp VICAM
2.2.2.3 Làm sạch mẫu
Mục đích: Loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùng
aflatoxin trong dịch chiết mẫu để tránh ảnh hưởng đến việc xác định aflatoxin cũng như
việc tạp chất sẽ làm bẩn cột, mất thời gian rửa cột và làm giảm tuổi thọ của cột.
Các kĩ thuật làm sạch
 Tủa các tạp chất không mong muốn: thường dùng để làm
sạch các dịch chiết có nguồn gốc thực vật. Các hoạt chất dùng là các muối kim loại
nặng, ví dụ Pb(CH
3
COO)
2
, AgNO
3
, Zn(CH
3
COO)
2
, CuCO
3

14
 Phương pháp chiết pha lỏng-lỏng: thực hiện trong phễu
chiết bằng cách chuyển aflatoxin từ dung môi chiết (acetone hay methanol) vào dung
môi khác (ví dụ như chloroform).
 Loại tạp bằng sắc kí hấp phụ: Kĩ thuật này hiện nay đã được

phát triển và dùng rất nhiều do ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốt trên nhiều
loại mẫu khác nhau. Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế
tạo sẵn chứa các chất nhồi LC-CN có khả năng bắt tốt các aflatoxin ở hàm lượng thấp.
Thể tích đưa vào cột rất ít (1-3ml), khả năng loại tạp rất cao, thích hợp cho phân tích
bằng HPLC [12]. Tuy vậy, với những giá rắn từ các chất không phân cực như: C
18
, C
8
,
C
2
, cyclohexyl, phenyl, florisil…liên kết với aflatoxin hoặc với các tạp chất theo cơ chế
kỵ nước không có tính chọn lọc, phân giải kém trong nhiều trường hợp, và không lý
tưởng khi aflatoxin chiếm tỉ lệ nhỏ so với tạp chất [14].
2.2.2.4 Cô đặc mẫu
Chất chiết sau khi được làm sạch thường được cô đặc bằng cách
cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi
chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ. Cặn được hòa tan vào một lượng thể tích nhỏ
trước khi qua giai đọan xác định.
2.2.2.5 Phát hiện và xác định hàm lượng
Các phương pháp sắc kí thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc
phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua
lớp sắc kí. Pha tĩnh có tính liên kết với aflatoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do
các đặc điểm lí hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng.
Bảng 2.5: Các phương pháp sắc kí trong phân tích aflatoxin.

×