Nghiên cứu một số đột biến của virut viêm gan B tại Việt Nam nhằm tìm hướng phòng chống và điều trị

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
*********
TÊN ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu một số đột biến của virut viêm gan B tại Việt Nam nhằm tìm
hướng phòng chống và điều írị.
MÃ SỎ: QG.09.17
CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : PGS.TS.NGÔ GIANG LIÊN
CÁN B ộ THAM GIA : Th.S.Đỗ Thị Vinh An
Th.S.Trần Thu Hà
Th.s. Phạm Đức Ngọc
Th.s. Nguyễn Văn Tuấn
CN . Le Xuân Thịnh
TAI HỌC QUỐC GIA HA NỌI
TRUNG Tâ m t h ô n g tin Thư viê n
00060000^3
BÁO CÁO TÓM TẮT
1. Tên đề tài: Nghiên cứu một số đột biến của virut viêm gan B tại Việt
Nam nhằm tìm hưởng phòng chống và điều trị
2. Mã số : QG.09.17
3. Chủ trì để tà i: TS. Ngô Giang Liên
4. Các cán bộ tham gia:
stt Họ và tên Cơ quan
1 Th.s. ĐỖ Thị Vinh An Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nôi
2 Th.s. Trần Thu Hà Khoa Sinh, ĐHKHTN
3 Th.S.Phạm Đức Ngọc Khoa Sinh, ĐHKHTN
4 Th.S.NguyễnVănTuấn Khoa Sinh học Phân tử, Viện SR Hà
Nội
5 CN. Lê Xuân Thịnh Viện Huyết học Truyền máu Hà Nội
5. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
5.1. Mục tiêu nghiên cứu:

- Xác định các đột biến thuộc gen s của HBV
- Phân tích và tìm những đặc trưng của những đột biến thu thập tại Việt Nam
và so sánh với các đột biến khác trên thế giới
5.2. Nội dung nghiên cứu:
- Thu thập các mẫu nhiễm virut viêm gan B ở Việt Nam
- Bảo quản các mẫu trong điều kiện xác định để dùng cho phân tích ADN
- Tách chiết ADN của virut viêm gan B
- Khuếch đại vùng gen s (300 bp) bàng kỹ thuật PCR
- Xác định trình tự đoạn gen s
1
- Tìm đột biến và phân tích các đột biên đặc trưng cho các mâu tại VN.
- So sánh các đột biến của virut viêm gan B tại Việt Nam với các mấu trong
khu vực và ừên thế giới
6. Các kết quả đạt được:
6.1. Kết quả khoa học:
6.1.1. Thu thập mẫu
Đã thu thập 25 mẫu HBV tò bệnh nhân nhiễm virut viêm gan B đã được xác
nhận từ Trung tâm Huyết học và Truyền máu, Hà Nội. ADN (HBV) từ máu
của những mẫu này đã được tách chiêt dùng cho phản ứng PCR.
6.1.2. Khuyếch đại đoạn gen s
Cặp mồi được sử dụng để phát hiện và khuyếch đại đoạn gen s (300 bp)
chứa vùng quyết định kháng nguyên:
HBV/F:5'-CAAGGTATGTTGCCCGTTTG-3'
HBV/R:5'-ATGTTGTACAGACTTCGCCC-3' được thiết kế theo nghiên
cứu của Thoson và c s (1999). Đoạn ADN đích (300bp) sản phẩm của PCR
đã thu được sau 35 chu kỳ của phản ứng.
6.1.4. Tinh sạch ADN-HBV (300bp) và giải trình tự
6.1.5. Kết quả giải trình tự và so sánh với các mẫu trên thế giới
Đã phát hiện được 10 đột biến ừong các mẫu nghiên cứu. Các đột biến
này có thể chia thành 3 nhóm.

Nhóm 1 bao gồm các đột biến đặc trưng cho mẫu thu thập tại VN : Đột
biến tại vị trí 876 với G biến đổi thành c, ở vị trí 1116 với G biến đổi thành A
và ở vị trí 1130 với c biến đổi thành G. Nhóm 2 bao gồm các đột biến cho các
mẫu thu thập tại VN và 1 số các nước khác: Đột biến tại vị trí 887 với A biến
đổi thành G, ở vị trí 888 vói G biến đổi thành A, ở vị trí 942 với A biến đổi
thành c, ở vị trí 1120 với T biến đổi thành A. Nhóm 3 bao gồm các đột biến
chung cho tật cả ở các mẫu trên thế giới kể cả mẫu từ Việt Nam: ở vị trí 891
với T biến đôi thành c, ở vị trí 897 với A biến đổi thành G và ở vị trí 898 với
G biên đôi thanh A. Những đột biển phát hiện trong nghiên cứu này đều là các
đột biên thay thê nucleotide. Những nghiên cứu gần đây cho thấy tầm quan
trọng của các đột biên ở gen s vì chứa vùng quyết đinh kháng nguyên “a”. Do
I
2
vậy các nghiên cứu về những đột biên thuộc gen s cua HBV rat can cho viẹc
thiết kế các vaccine cho nhiều đột biên và kit chân đoán HB V
6.2. Ket quả : 02 công bổ
6.2.1. Quốc tế: 01 báo cáo khoa học
N Giang Lien, B Khanh Hoa, T Thu Ha (2010), “ The survey of s gene
mutation of Hepatitis B virus circulating in Vietnam”. Poster presentation at
14 th International Congress of Infectious Diseases, March 2010, Myami,
USA.
6.2.2. Trong nước: 01 bài báo
Pham Due Ngoc, Tran Thu Ha, Tràn Thị Lien, Le Xuan Thinh, Nguyen Van
Tuan and Ngo Giang Lien (2010), “ Preliminary study on some s gene
mutation of HBV isolated in Vietnam”. Journal of Science and Technology,
Vol26,No.4S, 2010.
6.3. Đào tạo:
-01 cử nhân sinh học: Trần Thị Thơ (2009)
-01 Nghiên cứu sinh : Trần Thu Hà (2012)
7. Tình hình kinh phí của đề tài:

- Tổng kinh phí được cấp: 100.000.000VND
-N ăm 2009: 50.000.000 VN D N ăm 2010: 5 0 .00 0 .00 0 V N D
KHOA QUẢN LÝ CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
( K ý ™ •
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
SUMMARY
1. Project title: Study on some mutations o f Hepatitis B virus in Vietnam for finding
the way for prevention and treatment
2. Code number: QG-09-17
3. Principal investigator: Dr Ngo Giang Lien
4. List of project members:
No
Name
Office
1
MSc. Đo Thi Vinh An
Bach Mai hospital
2
MSc. Tran Thu Ha
Faculry of Biology, Hanoi University of Science
3 MSc. Pham Due Ngoc
Faculry of Biology, Hanoi University of Science
4
MSc. Nguyen Van Tuan
Faculty of Molecualar Bioiogy, Institute of
Malaria, Hanoi
5
BSc. Le Xuan Thinh
Ceter of Hematology and Blood transfussion
5. Goals of Objectives of the research project

+ Determination of mutations in the s gene region of HBV
+ To analyze these mutations and to compare mutations from samples
collected in Vietnam to others regions in the world.
5.1. Research content
+ To collect samples from blood donor group infected HBV
+ To keep the above samples in good condition for lab assays
+ To extract DNA-HBV
+ To amplify DNA (300bp) in s gene region
+ To sequence PCR product (DNA-300bp)
+ To analyze mutations on s gene
+ To determine the characters of these mutations circulating in VN
To compare mutations from VN with others in the world
6. Main results:
6.1. Results in science and technology
6.1.1. HBVsamples collection
A total of 25 HBV samples collected from screening patients infected HBV
from Center of Hematology and Blood transfusion, Hanoi. HBV-DNA
samples were extracted from serum or peripheral blood for PCR
amplification.
6.1.2. DNA-HB Vamplification
After 35 cycles of PCR reaction, the PCR product (DNA- HBV) fragments
with the size 300 bp was obtained.
6.1.3. HBV-DNA sequencing
The purified DNA were sequencing for mutations analysis
6.1.4. Sequencing analysis
There were ten mutations were found. These mutations could be divided into
three groups. Group 1 consisted of mutations typical only for samples from
Vietnam and they included: the point mutation at nucleotide position 876
with a G to c substitution, the mutation at nucleotide 1116 with a G to an A
substitution, and another point mutation at nucleotide 1130 with a c to G

substitution. Group 2 was composed of mutations that occurred on samples
from Vietnam and those from some other regions in the world, such as a
point mutation at nucleotide 887 with an A to G substitution, the point
mutation at nucleotide 888 with a G to A substitution, the point mutation at
5
4
nucleotide 942 with an A to c substitution, the point mutation at nucleotide
1120 with a T to A substitution,. Group 3 refered to all mutations that found
through out the world, such as a point mutation at nucleotide position 891
with a T to c substitution, the point mutation at 897 with an A to G and the
point mutation at nucleotide 898 with a G to A substitution. Recent studies
have revealed significant diversity in sequence of HBV isolated, accounting
for the point mutations among the four major HBV serotypes and they have
found that mutations occurred at these nucleotide positions resulted in amino
acid residues changed at the certain ‘a’ epitope region .This study is
nếcessary to design new vaccines to various HBV mutants and HBV
diagnostic kit.
6.2. Publication: 02 scientific presentation
6.2.1. International level: 01 scientific presentation
N. Giang Lien. B. Khanh Hoa, T. Thu Ha ( 2010), “ The survey of mutation
of the gene of hepatitis B virus circulating in Vietnam”. Poster presentation
at 14 th International Congress of Infectious Diseases, March 2010, Myami,
USA.
6.2.2. National level: 01 scientific paper
Pham Due Ngoc, Tran Thu Ha, Tran Thi Lien, Le Xuan Thinh , Nguyen Van
Tuan, Ngo Giang Lien (2010), “ Preliminary study on some s gene
mutation of HBV isolated in Viet Nam” . VNU. Journal of Science, Natural
Sciences and technology 26, No. 4S: 613-617
6.3. Staff training:
- 01 BSc in biology : Trần Thị Thơ (2009)

- 01 Ph.D in Cell Biology : Tran Thu Ha will be completed Ph.D study in
2013
7. Budget justification
- Total of financial support: 100.000.000 VND
- Planned budget: 2009: 50.000.000 VND., 2010: 50.000.000 VND
6
I
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

i
CHƯƠNG I : TỎNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Virut viêm gan

^
1. ỉ. 1 Cấu trúc genom và các protein của HBV.
2
ỉ. 1.2.Chu trình nhân lên của HBV
4
1.1.3. Các marker chẩn đoán viêm gan B

5
1.2 Đột biến ở virut viêm gan B
6
1.3. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới 7
1.4. Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam 8
CHƯƠNG 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

9
2.1. Đối tượng nghiên cứu

9
2.2. Phương pháp nghiên cứu 9
2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN 9
2.2.2. Phương pháp quang phổ kế (đo OD) 10
2.2.3. Khuếch đại đoạn ADN (300 bp) vùng gen s của HBV.
10
2.2.4. Giải trình tự đoạn gen s phát hiện đột biến 11
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 12
3.1. Phát hiện và khuếch đại ADN (HBV) bằng PCR

1
3.2. Phân tích trình tự đoạn gen s của HBV 14
Bàn luận

15
Kết luận và kiến nghị


16
Tài liệu tham khảo 17
Phụ lục 1 18
Phụ luc 2 19
Phụ lục 3
20
DANH MỤC HÌNH
Số TT
Tiêu đề hình
Trang
Hình 1
Cấu trúc virut viêm gan B

2
Hình 2
Ảnh điện di sản phấm PCR
11
Hình 3
Kết quả giải trình tự
13-14
DANH MỤC BẢNG
SỐTT
1
rn«A J A I 7
Tiêu đê bảng
Trang
Bảng 1
Tỷ lệ HBsAg dương tính tại 1 số nước lưu hành
HBVthap
7
Bảng 2
Tỷ lệ HBsAg dương tính tại 1 số nước lưu hành
HBV trung bình
8
Bảng 3
Tỷ lệ HBsAg dương tính tại 1 số nước lưu hành
HBV cao
8
Bảng 4
Tỷ lệ nhiêm HBV qua nghiên cứu của một số tác
giả trong nước
8
Bảng 5

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
10
Bảng 6
Kêt quả đo OD
19
Danh mục các chữ viết tắt
ADN
ADNHBV
Anti-HBc
Anti-HBe
Anti-HBs
ARN
cccADN
HBcAg
Gen s
HBeAg
HBsAg
HBV
IU
LHBs
- Axít desoxyribonucleic
- ADN của virút viêm gan B
(Hepatitis B virus DNA)
- Kháng thể kháng kháng nguyên lõi của virút viêm gan B
(Antibody against Hepatitis B core Antigen)
- Kháng thể kháng kháng nguyên e của virút viêm gan B
(Antibody against Hepatitis B e Antigen)
- Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B
(Antibody against Hepatitis B surface Antigen)
- Axit ribonucleic

- ADN vòng đóng tương đương •
(convalently closed circular DNA)
- Kháng nguyên lõi của virút viêm gan B
(Hepatitis B core Antigen)
- Gen bề mặt
(surface gen)
- Kháng nguyên e của vữút viêm gan B
(Hepatitis B e Antigen)
- Kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B
(Hepatitis B swface Antigen)
- Virút viêm gan B
(Hepatitis B virus)
- Đơn vị quốc tế
(International unit)
- Prôtein bề mặt của virút viêm gan B loại lớn
(Large Hepatitis B surface Protein)
MHBs - Prôtein bể mặt của virút viêm gan B loại trung bình
(Medium Hepatitis B surface Protein)
PCR - Phản ứng chuỗi polymeraza
(Polymerase Chain Reaction)
Pre-Si - Gen hoặc prôtein tiền SI
Pre-S2 - Gen hoặc prôtein tiền S2
SHBs - Prôtein bề mặt cùa virút viêm gan B loại nhỏ
(Small Hepatitis B surface Protein)
VGB - Viêm gan B
MỞ ĐẦU
Việt nam là một nước có tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B cao, vói tỷ lệ mang
kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg) 10-25%. HBsAg mang
các thụ thể trung hòa chủ yếu của virut viêm gan B và được sử dụng làm
thành phần chính của vaccine viêm gan B hiện nay. Bệnh này đã trở thành

mối lo ngại đối với sức khỏe cộng đồng, thách thức lớn đối với nhiều quốc
gia trong đó có Châu Á và Châu Phi. Nhiêm virut HBV được xem là nguyên
nhân chính của các bệnh viêm gan, sơ gan và ung thư gan. Việc chẩn đoán,
sàng lọc HBV hiện nay trên thế giới chủ yếu dựa vào việc phát hiện kháng
nguyên bề mặt (HBsAg) của virut được mã hóa bởi gen s.
Genome của HBV có tốc độ đột biến nhanh, ước tính 2.104 thay thế điểm
hàng năm, cao hem nhiều so với các virut ADN khác [1,5]. Các đột biến có
thể xảy ra tât cả các vùng trong genome đặc biệt đột biến thuộc vùng gen s
đàm nhận chức năng tham gia tổng họp nên các kháng nguyên bề mặt
HBsAg cũng thường xuyên đột biến giúp cho virut viêm gan B có thể vượt
qua khả năng sàng lọc của các kít hiện đang được dùng và có rất nhiều khả
năng trên vùng s này xuất hiện các đột biến giúp virut ‘trốn thoát’ khỏi các
cơ chế miễn dịch của cơ thể. Các đột biển này này được biết dưới tên gọi là
đột biến “trốn thoát” hay đột biến trốn thoát miễn dịch Điều này đẫn đến
tình ừạng tăng nguy cơ mắc viêm gan B, tăng lây truyền HBV trong cộng
đồng do tình ừạng mất hiệu lực của vaccine cũng như kít chẩn đoán chuyên
dụng [9].
Chính vì các lý do trên mà các nhà sản xuất vaccine và kít sàng lọc luôn tìm
cách đê đưa ra một loại vaccine cho tính hiệu quả cao cũng như kít chẩn
đaons có khả năng phát hiện nhiều đột biến. Nghiên cửu của chúng tôi hy
vọng phát hiện được một số đột biến trong vùng gen s của virut viem gan B
ở Việt Nam nhăm cung câp một số thông tin ban đầu phuc vụ cho việc cải
tiên các kít chân đoán cũng như hướng sản xuất các vaccine tái tổ hợp trong
tương lai.
Mục tiêu của nghiên cứu đặt ra là:
1. Giải trình tự vùng gen s
2. Phát hiện các đột biên đặc trưng cho các mẫu viêm gan B thu thập tại VN
và so sánh với các chủng trên thế giới
I
1

CHƯƠNG l.TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Virus viêm gan B
Năm 1885, Lurman đã thông báo 191 trường hợp viêm gan sau khi tiêm
chủng vaccine đậu mùa. Năm 1963, Blumberg đã nhận xét bệnh viêm gan B có
tích chất vùng địa lý. Năm 1970, nhà bác học Dane và cộng sự đã phân lập được
virus viêm gan B hoàn chinh gọi là thể Dane . Những năm tiếp theo các dấu ấn
miễn dịch khác của virus viêm gan B như kháng thể HBs, HBeAg, kháng thể HBc,
kháng thể HBe, HBcAg lần lượt được phát hiện [10].
ỉ. 1.1. Cẩu trúc genom và các protein của HBV
Virus viêm gan B (thể Dane) có đường kính từ 40 - 42 nm, là virus thuộc
nhóm có nhân DNA, họ Hepanaviridae. cấu trúc của virus gồm các thành phần cơ
bản sau:
- Phần vỏ: Gồm 2 lớp lipoprotein và các protein màng
Hình 1. Cấu trúc virut viêm gan B
- Phân nhân: Bao gôm các protein được mã hồa bời các gen c (Core), lóp
này mang đặc trưng của kháng nguyên HBc.
- Genome của virus HBV
Partially double-stranded DNA
2
Genom của vừut HBV chỉ có 3.200 cặp bazơ, được tổ chức đặc biệt dưới
dạng vòng mờ dạng sợi kép không hoàn toàn gồm 2 sợi có kích thước khác nhau
(hình). Sợi nằm bên ngoài là sợi âm mã hóa cho toàn bộ thông tin di truyền của
HBV. Genome của HBV chứa các gen mã hóa gối nhau (chồng lớp) gồm 4 khung
đọc mờ s, c, p và X. Các gen s (surface) mã hóa cho kháng nguyên bề mặt
HBsAg bao gồm 3 phần: Tiền SI hay pre Sl, tiền S2 hay Pre S2 và s. Vùng s và
tiền S2 có chiều dài thay đổi tùy theo typ của virut. Các gen s mã hóa cho 3 loại
protein khác nhau là s, M và L [10J.
+ Protein s (small) là protein nhỏ nhất (24kD) trong số các protein bề mặt,
chứa 226 axit amin. Đây là protein chính hay còn gọi là SHBsAg được mã hóa bởi
gen s và được sản xuất với số lượng lớn. Các typ của virut được xác định dựa vào

các typ của SHBsAg nhờ KT đơn dòng. Vùng KN có mặt ở tất cả các typ gọi là
quyết định kháng nguyên “a”. Bốn phân typ chú yếu khác nhau là d hoặc y và W
hoăc r. Hai bô này đươc căp đôi trong đó thành viên của mỗi cãp loai trừ nhau tao
nên 4 phân tvp K-N HBsAg lả adw, adr, ayw và ayr.
+ Protein M (middle) cỏ kích thước trung bình (31kD), 228 axỉt amin do
een tiền S2 và gen s mã hóa còn goi là MHBsAg. Đây lả glycoprotein biểu hiên ờ
2 dang gp33 và gp36 tùy thuỏc vào mức đọ glvcosvl hỏa.
+ Protein L (large) là proteinlowns nhất (39kD), chứa 390 axit amin do các
gen tiền Sl. tiền S2 và s mã hóa, còn đươc goi ]à LHBsAg. Protein này tham gia
vào quá trình gắn virut vào vật chủ, lắp ráp virion và giải phỏng virut ra khỏi tế
bảo.
Gen c (Corel là vùng mã hóa cho protein nucleocapsit. Gen này bao gồm
2 vùng : vùng lõi (C) và vùng tiền lõi (pre Cl.
Protein lõi là chuỗi ngấn (21kD~) gồm 138 axit amin, có khả năng gắn với
axit nucleic. Đây là KN lõi vai trỏ chính là tham gia vào lắp ráp virut.
Protein tiền lõi là chuỗi polipeptit dải (25kD), gồm 212 axit amin. Protein
tiền lõi có đoan tín hiẽu nằm ở đầu amin hướng chuỗi popypeptit tiền lồi mới đươc
tồng hơp vào MLNC của tế bảo. Tai đây, chủng đuơc xử lỵ sau đó dược tiết ra
ngoài MLNC dưới dang HBeAg [6].
3
*
G e n p Ịà gen lớn nhất, chiếm 80% chiều dài của genom, mã hỏa cho
popvpẹptit lỏn f90kDÌ. chứa 832 axit amin. Protein nảy cỏ 2 hoat tính:
ADN- polymerase và enzyme phiên mã neưac (ADN-polvmeras phu thuôc
ARN1. Protein p (polvmeraza) đóng vai trò quan trong trong viêc đỏng gỏi ARN
tiền genom vào capsit cũng như đỏng vai trò làm mồi phiên mã ngươc ARN tiền
gemom thành ADN (-)' đồng thời làm nhiêm vu phân giải khuôn ARN và tồng
hơp sơi ADNÍ+Ì
Gen X là gen có khung đoc mờ nhỏ nhất (0,7kD), mã hỏa cho Protein X
hay HBx là mỏt protein nhỏ (17 kD), chứa 154 axit amin . Protein X có nhiều chức

năng khác nhau như tham gia vào viêc truyè tín hiêu, điều hòa chu trình tế bào.
1.1.2.Chu frinh nhân lên của HBV
Trước hết virut HBV gắn đặc hiệu vào thụ thể nằm trên mặt tế bào
gan. Sau khi cởi bỏ vỏ ngoài, nucleocapsit di chuyển vào vùng nhân. Sau khi
cời vỏ capsit, ADN kép với 2 sợi không bằng nhau được chui vào nhân để
chuyển hóa thành dạng ADN kép khép vòng, siêu xoắn(cccADN). Dạng
này được dùng làm khuôn để tổng hợp 4 loại ARN 3,5; 2,4; 2,1 và 0,7kb.
Các mARN được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất.
mARN 3,5kb gọi là ARN tiền genom dùng để tổng họp genom. Các
mARN còn lại được gọi là dưới genom dùng để tổng hợp các protein khác
nhau trong đó có ADN- polimeraza(P), protein lõi c và tiền c, popypeptit X,
protein bề mặt s và proteinkinaza. Protein lõi c tạo thành nucleocapsit
(HBcAg). Polypeptit tiền lõi được vận chuyể đến MLNC, từ đó chúng được
tiết ra ngoài dưới dạng KN tiền lõi (HBeAg). ARN tiền genom được đóng
gói cùng với ADN-polymeraza của virut và protein kinaza để thành hạt lõi.
ở đây tiền genom được dùng làm khuôn để tổng hợp các chuỗi ADN(-)sợi L
theo cơ chế sao chép ngược [10].
Polymeraza của HBV phân giải ARN tiền genom, chỉ để lại 1 đoạn
ngắn dùng làm mồi cho tổng hợp ADN (+) trên khuôn của ADN (-). Một số
genom trưởng thành sau khi được tổng hợp lại quay về nhân để chuyển
thành cccADN nhằm duy trì một lượng khuôn ổn định cho dịch mã, còn
4
i
phần lớn được lắp ráp hoàn chinh rồi nảy chồi ra ngoài để lặp lại chu kỳ
nhân lên ở tế bào gan khác. Trong quá trinh nhân lên, virut luôn tổng hợp
thừa protein vỏ nên trong huyết thanh người bị nhiễm HBV, ngoài virut
hoàn chỉnh (hạt Dane) còn xuất hiện các dạng không hoàn chỉnh hình cầu
hoặc hình que.
1.1.3. Các Marker chẩn đoán HBV
Thời kỳ ủ bệnh của nhiễm HBV thay đổi tùy thuộc vào từng bệnh nhân,

phụ thuộc vảo số lượng virus xâm nhập, cách lây truyền và các yếu tố của vật chủ.
Trong giai đoạn ủ bệnh, người bệnh không có bất cứ triệu chứng lâm sàng nào, các
triệu chứng như mẩn ngứa, sốt, vàng da thường chỉ gặp trong thời kỳ viêm gan
cấp, thời kỳ này thường kéo dài từ hai tuần đến ba tháng.
Để chẩn đoán nhiễm HBV người ta dựa chủ yếu vào các dấu ấn miễn dịch
được phát hiện trong huyết thanh của bệnh nhân, thường phải sau nhiễm HBV 56
ngày. Các dấu ấn miễn dịch của nhiễm HBV bao gồm:
- H BsA g (Hepatitis B surface Antigen): là kháng nguyên bề mặt viêm gan
B, là dấu ấn miễn địch xuất hiện sớm nhất khi bị nhiễm HBV ( một đến hai tuần
sau khi bị nhiễm virus), giảm dần sau bốn đến tám tuần và thường hết sau khoảng
bốn tháng nhiễm bệnh. HBsAg có một thành phần quyết định kháng nguyên chung
được ký hiệu là a bao gồm a l, a2, a3. Phả hệ của HBsAg từ a sẽ được phân thành
các dưới nhóm ad, ay. Rồi từ ad, ay lại được phân nhóm tiếp thành: adw, adr, ayw,
ayr. Các vùng khác nhau có các phân loại HBsAg khác nhau như phân loại adw
hay gặp ở Châu Mỹ, Châu Âu, vùng Đ ịa Trung Hải hay gặp phân loại ayw. Trong
viêm gan cấp hay gặp phan loại adw, ayw. Tại Anh phân loại ad gặp ở người đồng
tính luyến ái và phân loại ay gặp ở người nghiện chích ma túy.
- Anti HBs (Anti Hepatitis B surface): Là kháng thể chống lại kháng
nguyên bề m ặt cùa virus viêm gan B, thường xuất hiện sau khi mất HBsAg một
tháng. Sự xuất hiện của kháng thể HBs có nghĩa ỉà cơ thể đã có khả năng bảo vệ
chống lại sự tái nhiễm của bệnh.
- HBeAg (Hepatitis B e Antigen): Là một kháng nguyên hòa tan, xuất hiện
ngay sau HBsAg vài ngày, nồng độ của HBeAg tồn tại cùng với nồng độ của
HBsAg trong huyết thanh, giảm sau khoảng mười tuần nhiễm bệnh và thường mất
5
ở vùng ngoài của quyết định kháng nguyên này. Những NC về huyết thanh học ở
trẻ em Thái Lan có ADN- HBV dương tính, tỷ lệ các trường hợp mang đột biến
trên vùng quyết định kháng nguyên (QĐKN) ‘a’ năm 1984 là 7,8% , năm 1989 là
19,6%, năm 1994 tăng cao là 28,1%. Điều dáng lưu ý là tỷ lệ các trường hợp xuất
hiện đột biến ừong vùng QĐKN “a” của HBsAg ở các trường hợp đã tiêm phòng

vaccine cao hơn so với các trường hợp không tiêm phòng vaccine. Một lần nữa,
vấn đề này lại hạn chế sự thành công của các chương trình tiêm phòng mờ rộng.
Tuy vậy đột biến trên gen s còn chưa được nghiên cứu chi tiết, vì vậy tầm
quan trọng của đột biến virut viêm gan B đối với sức khỏe cộng đồng đang là một
vấn đề gây nhiều tranh cãi. Những nghiên cứu và quan sát sâu hom về các điểm nổi
bật của loại virut này là yếu tố cốt lõi để đánh giá chính xác hiệu quả của các chiến
lược chủng ngừa bệnh viêm gan B hiện nay [7,9].
1.3. Tìuh hình nhiễm HBV trên thế giới
Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới, hiện có tới 5-6% dân số toàn thể
giới mang virus viêm gan B (khoảng 400 triệu người), phần lớn số người nhiễm
HBV này thuộc các nước đang phát triển. Dựa vào tỷ lệ HBsAg dương tính và
kháng thể HBs dương tính trong cộng đồng mà tổ chức Y tế thế giới đã chia thành
ba khu vực lưu hành HBV như sau [5,10,6].
+ Khu vực lưu hành HBV thấp: Tỷ lệ HBsAg dương tính: 0,1 - 0,5%,
kháng thể HBs dương tính: 4 - 6% (bảng 1)
Bảng 1. Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV thấp
Khu vực
Tên nước
Tỷ lệ %
Châu Âu
- Tây Âu, Bắc Âu
<0,1-0,5
Châu Mỹ
- Nam Mỷ, Caribe
0,1-1,6
Châu Úc
- Úc, New Zealand
0,1%
+ Khu vựa lưu hành HBV trung bình: Tỷ ỉệ HBsAg dương tính: 2-7%,
kháng thể HBs dương tính: 20-55% (bảng 2).

7
sớm hơn HBsAg. Khi HBeAg, tồn tại trong máu có nghĩa là virus đang được nhân
lên rất manh, lây nhiễm ở thời kỳ này là khá cao.
- Anti HBe (Anti Hepatitis e): Là kháng thể chống lại HBeAg, kháng thể
này thường xuất hiện ngay sau khi HBeAg mất đi. Khi có mặt kháng thể HBe là
dấu hiệu tốt của đáp ứng miễn dịch, khả năng lây truyền ờ thời kỳ này rất thấp.
- Anti HBc (Anti Hepatitis B core): là kháng thể chống lại HBcAg, là dấu
ấn miễn dịch xuất hiện thứ ba sau khi nhiễm HBV. Kháng thể HBc gồm hai loại:
Kháng thể HBc thường tồn tại trong giai đoạn nhiễm cấp và mất dần ữong giai
đoạn hổi phục, kháng thể HBc IgG tồn tại nhiều năm trong huyết thanh của bệnh
nhân đã bị nhiễm HBV[4,2,3].
Các xét nghiệm huyết thanh học phát hiện kháng nguyên và kháng thể của vứut
VGB có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiệnHBsAg với nồng độ thấp.
Xét nghiệm có độ nhạy cao nhất trong chuẩn đoán VGB hiện nay là kỹ thuật PCR
cho phép phát hiện ADN với chỉ 10-3 pg - ml. Kết quả của các xét nghiệm sinh
học phân tử trong chuẩn đoán virut VGB là phương tiện hữu ích để xác định tình
trạng nhiễm virut viêm gan B cấp tính, mãn tính, tiên lượng bệnh, theo dõi điều trị
và đánh giá tình trạng miễn dịch với virut.
1.2.Đột biến ở virut viêm gan B
Gần đây người ta đã phát hiện thấy có rất nhiều thay đổi xảy ra m ột cách
ngẫu nhiên trên protein vỏ, protein tiền lõi và polimeraza của virut viêm gan B.
Một số đột biến điểm xảy ra trên vùng gen tiền lõi ngăn cản quá trình tổng hợp
HBeAg được quan sát thấy ở người có HBeAg âm tính. Đột biến điểm có tần sổ
cao nhất là đột biến thay thế G = A tại vị trí nucleotit 83 trên vùng gen tiền lõi.
Đột biến tiền lõi không những gặp thấy ở nhũng bệnh nhân bị viêm gan B cấp tính
và mãn tính mà còn thấy ở cả người mang virut không có triệu chứng. Người ta
phát hiện ờ vùng s có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên của HBsAg mà quyết
định kháng nguyên này là tác động đích của kháng thể trung hòa sinh ra trong quá
trình miễn dịch tự nhiên cũng như sau khi tiêm phòng vacine. M ột điều thú vị từ
những NC gân đây cho thây các đột biến trên kháng nguyên bề mặt liên quan đên

vaccine không những được phát hiện ở vùng quyết định KN mà còn thấy xuất hiện
6
ở vùng ngoài của quyết định kháng nguyên này. Những NC về huyết thanh học ờ
trẻ em Thái Lan có ADN- HBV dương tính, tỷ lệ các trường hợp mang đột biến
trên vùng quyết định kháng nguyên (QĐKN) ‘a’ năm 1984 là 7,8% , năm 1989 là
19,6%, năm 1994 tăng cao là 28,1%. Điều dáng lưu ý là tỷ lệ các trường hợp xuất
hiện đột biến trong vùng QĐKN “a” của HBsAg ở các trường hợp đã tiêm phòng
vaccine cao hơn so với các trường hợp không tiêm phòng vaccine. Một lần nữa,
vấn đề này lại hạn chế sự thành công của các chương trình tiêm phòng mờ rộng.
Tuy vậy đột biến trên gen s còn chưa được nghiên cứu chi tiết, vì vậy tầm
quan trọng của đột biến virut viêm gan B đối với sức khỏe cộng đồng đang là một
vẩn đề gây nhiều tranh cãi. Những nghiên cứu và quan sát sâu hơn về các điểm nổi
bật của loại virut này là yếu tố cốt lõi để đánh giá chính xác hiệu quả của các chiến
lược chủng ngừa bệnh viêm gan B hiện nay [7,9],
1.3. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới
Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới, hiện có tới 5-6% dân số toàn thế
giới mang virus viêm gan B (khoảng 400 triệu người), phần lớn số người nhiễm
HBV này thuộc các nước đang phát triển. Dựa vào tỷ lệ HBsAg dương tính và
kháng thể HBs dương tính ừong cộng đồng mà tổ chức Y tế thế giới đã chia thành
ba khu vực lưu hành HBV như sau [5,10,6].
+ Khu vực lưu hành HBV thấp: Tỳ lệ HBsAg dương tính: 0,1 - 0,5%,
kháng thể HBs dương tính: 4-6% (bảng 1)
Bảng 1. Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV thấp
Khu vực
Tên nước
Tỷ lệ %
Châu Âu
- Tây Âu, Bắc Âu
<0,1-0,5
Châu Mỹ

- Nam Mỹ, Caribe
0,1-1,6
Châu Úc
- Úc, New Zealand
0,1%
+ Khu vựa lưu hành HBV trung bình: Tỷ lệ HBsAg dương tính: 2-7%,
kháng thể HBs dương tính: 20-55% (bảng 2).
7
Bảng 2. Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV trung bình
Khu vực
Tên nước
Tỷ lệ%
Châu Á:
-Ấn Độ
2-5
- Indonesia 5,2
Châu Mỹ La Tinh
- Trung Mỹ
2,1-4,1
+ Khu vực lưu hành HBV cao: Tỷ lệ HRsAg dương tính: 8-20%, kháng thể
HBs dương tính: 70-95% (bảng 3).
Bảng 3. Tỷ lệ HBsAg dương tính tại một số nước lưu hành HBV cao
Khu vực
Tên nước Tỷ lệ %
Châu Á
- Trung Quốc (Đài Loan) 14,5
- Thái Lan 25
Châu Úc
- Thổ dân úc
26-28

Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới mỗi năm có khoảng 2 triệu người
chết liên quan đến viêm gan B, 70% - 80% các trường hợp ung thư gan là do viêm
gan virus B, 25% người mang mạn HBV chết vì xơ gan và ung thư gan. Những
người nhiễm HBV thỉ có nguy cơ bị ung thư gan gấp 100 lần so với những người
không bị nhiễm HBV.
1.4. Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam
Việt Nam nằm trong vùng lưu hành HBV cao, tỷ lệ viêm gan B trong quần
thể từ 10-15% và có những vùng trên 20%. Bảng 1-6 dưới đây cho biết tỷ lệ
HBsAg dương tính trong quần thể người khỏe mạnh qua nghỉên cứu của một số
tác giả [2,3].
Bảng 4. Tỷ lệ nhiễm HBsAg qua nghiên cứu của một số tác giả trong nước
Tên tác già, năm nghiên cứu, đối tượng
Tỷ lệ %
Vũ Triệu An (quần thể) - 1987
15
Ngô Quang Lực, Đỗ Trung Phẩn (Quần thể) - 1995
16,5
ề
8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u
2.1. Đổỉ tượng nghiên cứu
Tổng số 25 mẫu bệnh phẩm đã được chẩn đoán nhiễm virut viêm gan B
bằng huyết thanh học HBsAg theo nguyên lý miễn dịch gắn men (ELISA)
thu nhận từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương phục vụ cho nghiên
cứu này.
2.2. Vật liệu và thiết bị NC:
Các hóa chất, sinh phẩm và trang thiết bị được sử dụng tại phòng Sinh
học phân tử, Khoa Sinh học Trượng ĐHKHTN.
- Bộ sinh phẩm tách chiết AND (DNA mini kit) QIAamp
DNA(QIAGEN)

- Taq polymerase invitrogen
- Bộ sinh phẩm giải trình tự AND (BigDye Applied Biosystem
terminator V3.1 Cycle Sequencing kit)
- Thang ADN chuẩn (ladder 100 bp) New England Biolab
- Agarose
- Đệm cho điện di TBE 5x
- Ethidium B rom ite (E B t)
- Đệm cho mẫu (loading buffer 6x
Các máy và thiết bị chính:
- Máy nhân gen (Thermo cycle PCR)
- Máy giải trĩnh tự ADN
- Bộ điện di (mini electrophoretic analysis)
- Pipeman ( 20|il, 20|jl„ 200(il, lOOOịaĩ)
- Các loại ống đong
- Eppendorf tuýp (1,5.,0,5 và 0,2 ml)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.2. ỉ. Phương pháp tách chiết ADN
Có nhiều phương pháp tách chiết ADN, mỗi phương pháp có những
lợi thê riêng, nhưng điều quan trọng nhất là phải tách được phân tử ADN
còn nguyên vẹn, mức độ đứt gãy ADN không đáng kể và ADN phải đủ
sạch. Chúng tôi đã dùng kit QIAGEN để tách chiết ADN.
Eppendorf
ABI Applied Biosy 3.100
Eppendorf
Pirex, Đức
ệ
9
về nguyên lý: Dùng một đệm phá vỡ màng virut, sau đó đưa dung
dịch này qua i mang dạng silicagel liên kết chon lọc giữ lại ADN. Tiếp
đo ADN trên mang được rửa bằng đệm và cuối cùng đẩy ADN ra bằng 1

đệm thôi gen. Các bước tiến hành theo chỉ dân của nhà sàn xuất:
- Cho 20ịi\ dung dịch proteinase K vào tube 15 mi
- Thêm vào tube 200 JJ.1 mẫu huyết thanh trộn đều
- Thêm 200 Jil dung dịch dệm ly giải (AL) trộn kỹ trong 15 giây sau đó
- ly tâm nhanh và ủ 56 ° c (10 phút)
- Sau khi ủ, ly tâm nhanh, cho thêm 200 [li ethanol vào trộn đều
- Cho toàn bộ hỗn dịch trong tube vào cột ly tâm QIA amp và ly tâm
8000vòng/phút trong 1 phút
- Cho tiếp vào cột 500 ịil đung dịch đệm rửa (AW1) đã có ethanol, ly
tâm 14.000 vòng phút trong 3 phút
- Thêm 60 fil nước cất vô trùng hoặc dung dịch (AE) vào cột và ủ ở
nhiệt độ phòng trong 1 phút sau đó ly tâm 8000 vòng phút trong 1 phút.
Lúc này ADN đã được tách chiết và sử dụng cho phản ứng PCR
2.2.2. Phương pháp quang phổ kế (đo OD)
Đe xác đinh nồng độ và độ sạch của ADN tổng số tách chiết được chúng
tôi dùng phương pháp quang phổ kế. Nguyên tắc của phương pháp này
là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sang tử ngoại ở bước sóng 260nm của
các bazơ purin và Pyrimidin, đồng thời cũng kiểm ừa độ sạch của dung
địch ở bước sóng 280nm. Các bước tiến hành như sau:
1. Pha loãng đung dịch ADN thu được trong nước siêu sạch
2. Chuyển dung dịch ADN đã pha loãng sang ống thạch anh nhỏ của
máy quang phổ kế và đo ở bước sóng 260nm-280nm
3. Nồng độ ADN của mẫu đo sẽ được tính theo công thức:
C adn = A 260 X 5 0 X d
Trong đó: CADN là nồng độ ADN tính bằng ịig/nrtl
A260 là chỉ số hấp thụ ánh sáng ở bức sóng 260 ran
d là độ pha loãng của mẫu cần đo
Sau đỏ xác định độ sạch của mẫu bằng tỷ số A260/A280. Khi tỉ số A260/A280
năm ữ o n g khoảng 1,8 - 2,0 A D N tách chiết được đạt tiêu chuẩn (xem
phần phụ lục 1)

1 0 *
2.2.3. Khuếch đại đoạn ADN 300 bp vùng gen s của HBV
Cặp mồi sử đụng để ichuéch dại vùng gen s chứa quyết định kháng nguyên a
được thiết kế theo nghiên cứu của Thomas và Carman (1999) có trình tự:
HBVF- 5-CAAGGTATGTTGCCOGTITG-3’
HBVR- 5'-ATGTTGTACAGACITCGCCC-3'
Tổng thể tích cho 1 phản ứng PCR là 25 |il trong đó 2 |il ADN template với
chu trình PCR như trong bảng 5.
Bảng 5. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Nhiệt độ
Thời gian
Chu kỳ
94° C 5’
1
94° c 30s
35
58° c 40s
72° c
45 s
72° c
7’
1
Kiểm tra sản phẩm PCR
Gel agarose thích hợp cho phân tách các đoạn ADN từ vài chục tới vài trăm
cặp bazơ. Hiệu quả của quá trình khuếch đại và kích thước sản phẩm PCR
điện di được tiến hành điện di trên gel agarose 1,2% nhuộm bằng ethidium
bromide.
Để thu nhận ADN khuôn dùng trong giải trình tự chúng tôi cũng tiến hành
phản ứng PCR với thành phần và chu kỳ như trên, tuy nhiên tổng thể tích
cho một phản ứng là 50 |il và sản phẩm được điện di trên agarose 0,8%

2.2.4. Giải trình tự vùng gen s dài 300 bp, phát hiện đột biến.
Chọn các mẫu ADN(HBV) có các băng gọn, sáng cho tinh sạch trước khi
giải trình tự (các bước tinh sạch ADN( phụ lục 2)
Chúng tôi sử dụng bộ kit sinh phẩm và máy của hãng Applied BIO (USA).
Phản ứng giải trình tự nucleotide dựa trên phương pháp kết thúc chuỗi
dideoxy sử dụng Big Dỵe terminator(các bước tiến hành xem phần phụ lục
3). Kêt quả được xử lý bằng phần mềm sequencing nalysis MEGA 4.0
11
I
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phát hiện và khuếch đại ADN (HBV) bằng PCR
Sau khi tách chiết, ADN được xác định nồng độ và độ sạch bằng phương
pháp quang phổ kế. Chúng tôi chon những mẫu ADN có kết quà đo OD nằm
trong khoảng 1,8-2,0 là những mâu đạt tiêu chuẩn và sử dụng như ADN
template cho phản ứng PCR. Đoạn gen có kích thước 300 bp thuộc gen s
(chứa vùng quyết định kháng nguyên “a” được khuếch đại sau 35 chu kỳ
phản ứng (hình 2).
1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10
Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Thang ADN chuẩn (lOObp)
Giếng 1,2,4,5,6,7,9,10: ADN (HBV)
Sản phẩm PCR sau khi thu lại từ gel agarose qua kiểm tra độ tinh sạch
sẽ được sử dụng làm khuôn giải trình tự. Qua phân tích trình tự một số các
đột biến đã được phát hiện. Dưới đây là bảng so sánh trình tự ADN các mẫu
HBV Việt Nam với trình tự của một số mẫu từ ngân hàng gen:
12
3.2. Phân tích trình tự đoạn ADN thuộc gen s của HBV
Mẫu số 1 chủng kiểu dại (từ ngân hàng gen)
Mẫu từ số 2 đến số 18 từ ngân hàng gen
Mẫu số 19,20,21,22 của Việt Nam

Các nucleotide có mầu đỏ đậm là các vị trí đột biến đặc chưng của mẫu Viêt
Nam cụ thể như sau:
1. Vi trí 876 (thứ tư trên hê sen) đôt biến G thành c (Các mẫu trên ngân
hàns sen không thấy dôt biến, chỉ có ở mẫu của Viêt Nam).
2. VỊ trí 887 đột biến A thành G (Như một số mẫu ở ngãn hàng gen).
3. Vị trí 888 đột biến G thành A (Như một số mẫu ở ngân hàng gen).
4. VỊ trí 891 đột biến T thành c (Tất cả các mẫu ở ngân hàng gen đều có).
5. Vị trí 897 đột biến A thành G (Tất cả các mẫu ở ngân hàng gen đều có)
6. Vị trí 898 đột biến G thành A (Tất cả các mẫu ở ngân hàng gen đều có)
7. Vi trí 942 đồt biến A thành c (Chỉ có môt số trên ngân hàns sen có đôt biến
này).
8. Vi trí 1116 đôt biến G thành A (Các mẫu trên neân hàng gen khôm thấy
đồt biển, chỉ có ở mẫu của Viêt Namì.
9. Vị trí 1120 đột biến T thành A (Tất cả các mẫu ở ngân hàng gen đều có).
10. Vỉ trí 1130 đôt biến c thành G (Các mẫu trên mân hàns sen không thấy
dôt biến. chỉ có ỏ mẫu của Viêt Nam)
13