Nghiên cứu Proteinaz được tiết ra từ các vi khuẩn gây bệnh côn trùng trong phức hệ cộng sinh tuyến trùng - vi khuẩn

ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC Tự NHIÊN
NGHIÊN CỨU PROTEINAZ Được TIẾT RA TỪ
CÁC VI KHUẨN GẦY BỆNH CÔN TRÙNG TRONG PHỨC
HỆ CỘNG SINH TUYẾN TRỪNG-VI KHUAN
MÃ SỐ: QT -01 - 15
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: TS. Trịnh Hổng Thái
đai họ c QUOC GIA HÀ N ỏ r
TRUNG TÂM t h ô n g Tin thư viện
D ĩ / 2 Ỹ Z s
CÁC CÁN BỘ THAM GIA:
1. ThS. Phan Thị Hà
2. CN. Lưong ThuỲ Dương
3. T rịnh T hị T ha nh H ươ ng
H A N ỘI - 2004
1.01 CAM ON
c I m u
V
It'll .XI li chan i l i j i i l i ( a m tin I n l i t ( i n i / n ( I n c f)ji
hoc (
2
HOC XI11 llủ Xnt, Hon kìm a hục-Cònạ li'Jic. ỉ ) ll(J( ilI,x .
Hun (itáiii iiicii ! rườnạ i)ụi Ihn KliOil hoc l ự nliicn. IỈUII Chú
nhiệm Khoa Si/ilì học, riiònx Klioa học- Côiiiỉ Iiạhệ vù riỉònỊi
lủi vụ l rườiiỵ DI1KIITN ilã AVI duyệt vù cunạ cáp kinh phí
di' thực h iậi (ít' lủi.
Ch lì IIX lôi xin chã II ! hủ nil cùm (in Till II i> lâm 67;//”
iiíịIìc smli hoc, DllQdllN. Tritníi tủm Sinh học phún íử YÙ
Côn lị iHịliệ lữ hào dã lạo mọi íliứu kiợn cá/ì ỉíìicĩ rỡ traiiy ihicl
bị cũni’ như ý úp dỡ VC (iìuycn lìióiì clc clí' lủi ill ực Ini'll vó kcí
quà.

Cu ố i CÙIIỈ>, chúng lói ctlnỵ xiII cam tin TS. i\'^nycii
>\\oc Cháu, riìòiìíị Tityừìì irùnỵ. Viện Sinh tlìúi và 'Lùi nguyên
Sinh vật dữ nhiệt lình cô 177. cuiìíị cấp mủn vật sử dụn^ IroniỊ
nghiên cửu
c m TRÌ ĐỂ I VI
TS. Trịnh Hóng Thái
MỤC LỤC
Báo cáo túm lắt
Abstract
Háo c;í<) chi licì
I. MÓ ĐẦU
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
III. KẾT QUA NGHIÊN c ứ u
1. Protein của vi khuân Xcnorhabđus
1.1. Nghiên cứu lính chất
1.2. Tinh sạch mộl phần pmleina/ lừ XciHirlutỉhỉu.s sp. XS4 và
Xcnoìhabdits sp. CA
2. Pioleinaz của vi khuẩn Pholorhabdưs
2.1. Ntzhicn cứu tính chất của protcina/
2.2. Tinh sạch prolcina/
IV. BÀN LUÂN
V. KẾT LUÂN
VI. KIẾN NGHI
VU. TÀI LIÊU THAM KHẢO
PHI' LỤC
Phu lục 1 :Ánh điên di
Phu lục 2: Các bài báo khoa học
TÓM TẮT CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN cứ u KHOA HOC CỦA
CÁ NHẨN
SCIENTIFIC PROJECT

PHIẾU ĐANG KÝ KẾT
QUẢ NGHIÊN c Cu KHOA HÓC'
BAO CAO TOM TĂT
Ten dỏ tài: Nghiên cứu proleinaz dirợc Iici la lừ các VI khuân i:áv benh Lt'II
trùng trong phức hệ cộn II sinh lu veil trìiriLi-\ 1 khuãn
Người (hực hiên:
• Chú trì dề tài: TS. Trinh Hóna Thái. Khoa Sinh hoc. Trưừriii Đại hoc
KHTN
• Các cán bộ tham gia:
ThS. Phan Thị Mà: Trung tâm Cóng nuhộ Sinh học. ĐI1QGHN
CN. Lương Thuỳ Dương: Khoa Sinh hoc, Trườn2 Đai hoc Khoa học
Tự nhiên.
- Trịnh Thị Thanh Hương: Khoa Sinh học, Trường Đai hoc Khoa học
Tự nhiên.
• Cơ quan chú trì: Trường Đai học Khoa hoc Tư nhien
Nội dung nghiên cứu đã đãng ký:
• Nuôi cấy vi khuẩn phân lập từ tu vốn trùnu
• Nghiên cứu thành phần và một số tính chất của protcinaz do vi khuán tiết
ra.
• Tinh sạch proteinaz chú yêu bằng phương pháp sắc ký
• Nghiên cứu một số tính chất của proteinaz
Các kết quả chính đà đat được:
• Phân lâp các chủng vi khuẩn từ tuyến trùng Steincrnema và
Heterorìiabdiús, nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập được.
• N»hiên cứu một số tính chất của proteinaz ngoại bào từ các VI khuan gây
bệnh côn trùng.
• Tinh sạch một phán proteinaz ngoại bào từ VI khuẩn.
Sản phẩm khoa học đã hoàn thành:
• Một báo cáo tóm lát tham gia Hội nghị khoa học Khoa Sinh hoc và Hội
no hi khoa hoc Trường Đại học Khoa học tự nhiên. s

• 4 bài báo khoa hoc. trong đó 2 bài báo đăne trons Tap ch 1 Di truyen
ứng dụng và 2 bài báo khoa học dã gứi đănii irons Tap chí Khoa học cua
ĐHQGHN.
6. Kêt quà đào tạo:
• 3 sinh viên tham gia nghiên cứu khoa học và đã có háo cáo được trình
bày trong Hội nghị khoa học sinh viên Khoa Sinh học tháns 3 năm 2002.
• 1 học viên cao học đang thực hiện luân an.
7. Tóm tát kết quả nghiên cứu:
7.1. Proteinaz của vi khuẩn Xenorhabdus sp.XS4
• Hoạt độ proteinaz mạnh nhát ớ pH 8. Sau khi xứ lý ỏ- 60"c trone 20 phút,
hoạt độ enzym còn khoang 50% hoạt đô ban đáu.
• Trong số các ion kim loại hoá trị hai được niíhiẽn cứu, en/ym bị ức chẽ
mạnh bới Hg2+, sau đó đôn Cu2+ và Zn2\ Ngược lại, các ion Ca:‘. Mìr' va
Mn2+đã làm tăng hoạt độ enzym, nhất là C V\
• Các proteinaz ngoại bào của Xenorhabíhts sp. XS4 thuộc nhóm proicma/
kim loại đo bị ức chẽ mạnh bới EDTA và o-phenanthroline.
7.2. Proleinaz cứa vi khuan Xenorhabdus sp.CA
• Hoại độ proleinaz mạnh nhất ử pH 8. Sau khi xứ lý ứ 60"c Iiong 10 plúu,
hoat độ enzym còn khoảng 15% hoạt đô ban đấu.
• Trone số các ion kim loai hoá trị hai được nghiên cứu. enxym bị úc -he
mạnh bói Hg:\ sau đó đến Zn:+. Co:* và Cir'. Ngược lại. các lon CV' vu
Mg;+ đã làm tàng hoạt độ enzym.
• Xenorhabdits sọ. CÁ dã tiết ra mỏi trường nuôi cay các pioteinaz thuóc
nhóm xôrin.và nhóm kim loại' Điện di Iren gd polyau'ylamil đã cho phép
nhãn thấv môi bănu protcina/. chủ yêu bị ức chủ bới ca HDTA vá PMSI
7 ì IV otcma/ cua VI khuân Plinỉ(>rliahiltt.\ iimuncsi < !I\ 11 p
• Honl clộ cn/ym manh nhái lí pỉis. lỉn/vnì kcm ívn VOI nhicl. Sau S phm II .1
60"C hoại lính cn/vm L!Ktm ili nhanh c11 <>n
LL
cln

U M 1
khoang N 1
r
• Thử mlì hưone cua uk chai ức chi' il.k liiL‘11 nh- >n 1 chi> i!u_\ ciì/\in h ư-
mạnh iVvi 11)1 A vã r\lSI'. in'Hi! i!*» ư, dk' m.tnli nil/ll Km ỉ I )TA
• Trong số các ion kim loại hoá trị hai được thư, en/ym bị ức chê manh bới
Hg2\ sau đó đến Cu2". N r \ Zn2+. Co:~ và Pb:\ Nạược lại. các lon Mn:'.
Ca2+ đã làm tăng hoat đó enzvm.
• Proteinaz của VI khuán Photorhakdus limúnescens Hp đã được tách và tinh
sạch qua các bước: kết tủa băng axeton. sắc ký qua cột DEAE Sephadex A-
50 và cuối cùng qua cột Mini Q PE 4.6/50. Kết quá thu được 5 đính protein
có hoạt tinh enzym. Trong đó một dinh protein đã được gìn đi phân tích trình
tự axit amin.
8. Tinh hình sử dụng kinh phí:
• Tổng kinh phí được cáp:
28.000.000 d
Trong đó:
- Vật tư vãn phòng:
- Hội nghị:
900.000 d
900.000 đ
- Chi phí thuê mướn:
14.200.000 d
- Chi phí nghiệp vụ chuyên môn:
12.000.000 d
KHOA QUẢN LÝ
(Ký và ghi rõ họ tên)
ìiừ nội, niịủv 11 lliúiiíi 10 Iiăm 2004
CHÚ TRÌ ĐÍÌ TÀI
(Ký và ị»hi rồ ho tên)

I S. Trịnh Hồng Thái
( O Q I AN CHI TRI ĐI TAI
Drió HlỄU TRUỎNÔ
a b st r a c t
Title: Investigation of proteinases from L-ntomopalhogenic bacteria in symhyonl
complex of nematode-bacteria
Coordinator: Dr. Trinh Hong Thai
Kev implementors:
MSc. Phan Thi Ha, Centor of Biotechnology, VNU
BSc. Luong Thuy Duong, Faculty of Biology. Hanoi University 111
Science.
BSc. Trinh Th] Thanh Huong, Faculty ol Biology, llanoi liniVLTsilN ol
Science.
Budget and contents:
Budget: Investigation of proteinases from enlomopathoccmc bacteria to
evaluate the role of pathogenic 1 actors in the symbiont complcx of
ncmatode-bacteria.
Contents:
+ Isolate and preliminary classification of hactcria 11 (>111 nematode
+ Analysis of the compositions and characterization of
extracellular proteinases from the haclcria.
+ Purification of protemases using the various chromatography
techniques.
+ Characterization of proleinases 1mm ihc baclcna.
Main results:
Results 111 sciencc .Hill technology:
f isolalc .Uhl [Vrc 11 m IIUIIV L I.INSII KalKMi t'i cnlonx'p.ilhoLviiK KkK ti.i:
Xi'!ìtn'li(ihihi\ tiihl riii'icrlitilhlii'-
+ So n ic p in k 'ina sL s were pmiliol I M ill \< r- a . iì h i tt' ,111,1 ! ’■ . Ill
II si lie the dirom.iiv’iirapln IIIL-Itii "I" "I ỊỊi-l Iill "I I. I"ỉi c\v •

+ Characterization of proteinases: their pH optimum was 8. temperature
optimum was c. the proteinasesvvere less stable in mcLihatini: ai 60 c.
Proteinases were strongly inhibited by EDTA and PMSF.
Results in training:
+ 3 student s scientific papers in Student Scientific Conference of
2002.
+ 1 MSc. Students will present her thesis in December 2004.
Publications:
+ Trinh Hong Thai, Trinh Thi Thanh Huong. I Alone Thuy Duoim.
Phan Thi Ha, (2002). Xenorhabdus sp. CA: characterization of
extracellular proteinases from enlomopaihogcnic bacteria.
Genetics and Applications (Biotechnology Number) pp. 1-5.
+ Trinh Hong Thai, Trinh Thi Thanh Huong, Phan Thi Ha, (2002 ).
Characterization of extracellular proteinuses from
entomopathogenic bacteria {Xeiioihabdits sp. XS4). Genetics and
Applications (Biotechnology Number) pp. 6-12.
+ Trinh Hong Thai, Trinh Thi Thanh Huong, Luong Thuy Duong.
Phan Thi Ha, (2004).: Composition of extracellular proteina.ses
produce by entomopathogenic bacteria (Xenoiliiibihts sp. CA) J.
of Science. Natural Sicence (in press).
+ Trinh Thi Thanh Huoniz. Trinh Hong Thai. (2004).
Characterization of extracellular proicinases from bacteria
Photoi'habclus luminesce/is HP. J. of Scicncc. Natural Siccikj
(Biological number) (in press).
BÁO CÁO CHI TIÊT
I. M Ở ĐẨU
Xenovhahdus và Photorhabdus là các VI khuân còng sinh với tuyên trùng
Stemem em a và Heterorhabditis tương ứng. Tuyến trùng ký sinh còn trùng dã được
chứng minh có tác dung gáy chết đối VỚI nhiểu loại sâu hai cây trông [6], Tuyến trùng
cam nhiễm mang trong ống tiêu hoá cua mình vi khuân còng sinh tao nên phức hộ

tuyen trung-vi khuân có khả năng ký sinh gãy bênh cỏn trùng. Khi iiập còn trùn1',
tuyên trùng có khả nãng xâm nhập qua lớp biểu hi ngoài của côn trùne đẽ vào xoan'’
míiu va giai phong V] khuan Xe/ioiiicibdus và Photorìiưbdus. Vi khiũin nhãn lòn ru
nhành, giêt côn trùng và trợ giúp cho sự sinh sán cua tuyến trùnu [2.13J. Trono qua
tnnh nay, VI khiuin đtì tạo ra CBC Săn phâm tríio đỏi thứ cáp như chiu khánư sinh I i I \ii
các cnzym thủy phân như lipaza [17] và proteinaz [12.14,15,16]. N°ười ta cho răníi các
■san pham truo doi thư cảp nay thcim giíì vào sư sinh sán và phát tricn cim luvcn irĩm1’
trong côn trùng bằng cách ức chế sự phát triển cua các sinh vât khác va tao ra các chat
dinh dưỡng do hoạt động của các enzym thủy phán.
Trong công trình này, chúng tỏi đã tiến hành nghiên cứu các pmlcmnx do VI
khuẩn Xentìrhabclus và Photorliabcliis tiêl ra nhăm lìm hi cu vai trò hệnh sinh ma
cnzym này trong quá trình gây bệnh côn trùng cua phức hộ cộn« sinh (LIyen Irùnii-vi
khuẩn
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
Vi khu an Xenorhơbdus sp. XS4 và Xenoihahiìus SỊ). CA dược phan lập từ Uiycn
irùna Steinernema sp. XS4 và Slcinniiciỉia carpocitpsm1. tương ứng. Vi khu.UI
rii(>i(i/h(ih(his hunincsccns Hp (.lược phân lập ùr Iiivcn trùne Ilci('inỉh,ih(!iii.\ sp li"
Phòii" Tuy ủ 11 trù ne. Viện Sinh thái \ à Tài niiuvcn Sinh vái, Nyhia Đn-Iir I.1CỈ11. II.ỉ
Nội CII11U. cáp.
Vi khuân được phân lập trẽn mõi inrờii!: \B1A - moi Iru-'IIL! (.linh ikrơiii:
(> ' cao lỉm, ^ pcpion, I 5 n lhach. dan IIƯOV dcn liu. tici tiling 11 >>I1;J 3 <> phui "
Iinn co chứa 2511112 Bromothvmol Blue \a 40illi; rriplk-iụltetra/^lium ( lil'M’hlc. I ' i i
một khuán lạc, cày vào mỏi trườno dinh Hirfino • V-
, ' g a ương không có agar. Nuôi cáy đưov thực hiện
>rẹn máy lắc ồn nhiệt 220 vông/phú, 6 3<rc. lác qua dóm Sau do. : ml d.ch ! Ị
dược chuyến vào lOOml môi trường dinh dưông như (rén và lác ỏ 30' c trong 48 o,a.
Dịch nuôi cấy sau 48 giò đươc ly tám 10.000 ròng/phú. trong 10 phút + c. Ihu
lấy dịch trong, sau đó lọc qua màng 0 .22 pm và sử dụng cho nghiên cứu pro.ema/.
Tinh sạch mô, phẩn proteinaz qua cộ. sác ký ,rao đõ, a„„,n. Dịch nuôi cấy dư,.,
híp phụ trẽn cột DEAE Sephadex A-50: (1.6.10cm,. Cột đưạc cân băng vo, dóm Tns-

HC1 20mM, pH 8,0. Các protein không hấp phụ trên CỘI được rứa vái cùng dóm trẽn.
Sau đó thôi các protein híp phụ trên cột sứ dung cùng loa, đèm trẽn có chứa N ad v i
các nồng độ (M): 0,1; 0,2; 0.3; 0,4; 0,5 và ] 0.
Các phân đoạn có hoạt tính proteinaz thu được từ cột DEAE Sephadex AÕ0
được dôn lại và loại muối, sau đó được tinh sạch tiếp qua cột Mini Q PE 4.6/50
Xác định hoạt độ của protcinaz: hoạt độ' proteinaz đã được xác định theo
phương pháp Kunitz có cải tiên như đã mô tả trước đây [16]
Định lượng protein theo phương pháp Bradford sử dụng albumin huyết thanh ho
làm chuẩn.
Điên di protein trên gel polyacylamit có SDS (SDS-PAGE) theo phương phá,,
cùa Laemmli (1970) [10].
Điện di proteinaz theo phương pháp của Heussen vù Dovvdlc (1980) dược thực
hiện như đã mỏ ta từ trước [16],
III. KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u
1. Protcinaz của vi khuẩn Xenorìiabdus
1.1. Nghiên cứu tính chất của proteinaz
l .1.1. pH thích hop của proteinaz
Sir thine các đệm có nỏnii (.lộ 0,2 M đè xác đinh pl í thích hop cun proicnu/ d,ì
cho Ihây: với xs. cn/ym hoạt đónt: mạnh (V pl 1 «s. ớ pll 10. hoại dọ L'11/vm Lii:im manh
chí còn khoáng MYi so vó'i hoạt đo cưc dai. Với mail CA. hoai độ của ni/vm il.it a IV
l ỉ a i ( í p l ] s . T u i p ] I
7
. h o a i d ô b ă n li k h o a n g
9 0
' r s o \ O I
111
t;i( đ o U I V ( X u ( l ì m l i I I
■ xs
« CA
Hình If Ảnh hướng của pH đến hoat độ proteinaz cùa vi khuẩn cóng sinh với

tuvên trùng Xeiiorluibclus sp.
1.1.2. Ảnh hưởng của các chát ức chê dặc hiệu nhóm đến hoạt đô enzym
Các chất ức chế đặc hiệu nhóm được sử dụng gổm: PMSF. pCMB, EDTA. o-
phenanthroline với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phán ứng là 10''M. Két qua cho
thấy enzym bị ức chế mạnh bới EDTA, hoạt độ chí còn khoáng dưới 20r/( so vói đói
chứn° (hình 2). EDTA là hai chất ức chế đặc hiệu vói nhóm proteina/, kim loại.
Ịn x s
B C A
PMSF pCMB EDTA o-phc ĐC
Các chất ức chế đặc hiệu
Hình 2: Ảnh hướng cùa các chai ức chế dặc hiệu nhóm len hoại
độ protcinaz của vi khuẩn Xenorluibclus sp.
1.1.3.Ảnh hiring của ion kim loai hoá trị hai (lẽn hoai (lộ enzym
T ro ng số 8 IOI1 kim loại h oa trị hai dirợc ihir (C a \ M g M n . ỉ:L-; • < " ■ ( 11 ■
/.ir ' li"-1'), en/.ym bị ức chõ m ạn h bới llu sau do đón c u \à /.II - iv-Ht"- L,u
lon C r ' \à M e : ' (-tã làm lang hoại đ ọ e n /v n i, rõ rộl nhái la ( ;i
Bảngl: Anh hường cùa các inn kim loai hoá tri hai đến hoạt dó
proteinaz của Xenorhabdus sp.
lon kim loai
Nổng độ cuối
Hoạt độ tương đối (rt )
cùng (M)
xs CA
Đối chứng
100
100
Ca2+
10'3
105,0
1 14.4

Mg2+ 10 3 104,1
111.4
M n2+ 10 3 92,1 70.56
Fe2+ 10 3 99,0
97.08
Co2+
103 60,6
61.04
Cu2+
103
32.6
57.29
Zn2+
10'3
26,1
49.17
Hg2+
1 0 3
0
25.28
1.1.4. Độ bén với nhiệt Ở60°c
Giữ dung dịch en/ym ớ 60°c, sau những khoang thời gian nhai clịnh làm !anh
nhanh chúng và xác định hoạt độ proteinaz ở 37°c. Kết quả cho thây hoạt đỏ cn/ym
giảm dần theo thời gian sử lý à 60"c (hình 3). Vứi xs. sau 20 phút, hoạt (lo con
khoản^ 50% so với hoạt độ ban đầu. Tuy nhiên, với CA, en/ym kém bén hơn, đe da»
được giá trị trên chí sail chưa đôn 10 phut.
Tlioi L'ian (pluit)
H ìn h .ì . Su- h icr. <1 I,.u . .ló p rm o in:,/ M U v i k lu ú n V n r , M>
ihco thoi eian \ứ lv t’ M I (
1.1.ĩ . 1’h a n lú-l, th à n h p h u n pw trìm r bm vi d ư n di

■
Để đi sâu phân tích thanh phán prote.naz có trong dịch nuôi ca> VI khuân, chúng
tôi đã tiến hành điện di trên gel polyacrylamit có SDS va có cư chát gelatin n.K, (hình
4). Các băng enzym được nhận thấy trên bán gel nằm trong 3 vùng (I. II vu III) vơi d;>
di động điện di tương ứng bằng: (0-0,08), (0,09-0.20) và (0.25-0.31) . Trong đó các
bãng trong vùng II thê hiện hoạt độ mạnh nhất, chúng bị ức chế manh bới cá FDTA YU
PMSF. Ngược lại, hai loai chất ức chế này đều không ức chẽ' các băng trong vùng I.
1 2 3 4
Hình 4. Điện di proteinaz trên gel polyacrylamit có SDS và có cư chất gelatin
0,1%: ảnh hưởng của EDTA và PMSF lên hoạt độ của proteinaz trong dịch nuôi cây vi
khuẩn Xenoì ìtabdns sp. CA.
Chú thích trên hình điện di: giếng 1: đối chứng nước; 2: EDTA; 3: PMSF; 4:
DMSO
Đổ đánh giá ảnh hườn 2 của các ion kim loại hoá trị hai dối VỚI các ban'_í
proteinaz bị ức chế bới EDTA, mẫu nghiên cứu đươc điên di trôn gel polyacrylamit có
SDS và có cơ chất gelatin 0,19c. Chuẩn bị mẫu như sau: mảu được u VỚI EDTA với
non ° độ cuối cùnu trons hỏn hợp phán ứng bằng 10 'M tron í: 10 phút, sau đó bổ SUMII
ion kim loại với nồng độ cuối cùng bằng 10 'M; 2.5. 10 'M và 5. 10 VI. Kốt qua ctã
cho Ihãv: các ion Ca:+. Ba:+. M s:+. M rr\ Pb2+ đã làm tãne rõ rệt hoai đõ cn/.ym thuoc
\ùno ỊỊỊ các IOI1 N r l, C d: '. F c: *. C u: \ G r f ihê hiện anh hiro'ne khõnti rõ ràntỉ. ĐÍCII
ilíiV’ lưu V là: các ion Ca:‘. Ba:\ MíZ:\ Mn:+ chi anh tiuonu đón hoạt do cua b;m;j
prolciĩri/. 0 còn Pb7 * chi có lác dune dõi với bung 0.31. Tuy nil ill'll, chúng tôi chư.i
lìm 111"IV ion kim loai nào co tác tiling khui phục hoai tinh cua các bany cn/\m Mill- II
(hình ỉ phu lục).
1.2. Tinh sạch mật phân proteinaz từ Xenorhabdỉts sp. XS4 va Xenorhabdưs
sp. CA
Đê có thê tách các protein có hoạt tính proteinaz ra khói các protein khác tmnu
dịch nuôi cấy, chúng tôi đã xử dụng các phương pháp sãc ký theo các con đưong sau
đây:
Dịch nuôi cấy vi khuẩn

^ t)ó n g khó
Dịch cô đặc 10 lần
ký qua cột Scph adex G-100
Các phân đoạn có hoạt
tính enzym
^ S á c kv qua cót D E A E Sephadex A-50
Các Phân đoạn có hoat tính enzym
Quv trình 1
Dịch nuôi cấy vi khuẩn
4,S àc kv cót D EAE Sepliadi-X A-50
Các phân đoan có hoạt tính cnz\'in
Quy trình 2
Trong hai quy trình tinh sạch, quy trình 2 đơn gián hơn và cho kết quá tương dưưnii
với quy trình 1. Vì vạy, quy trình 2 đã được lựa chọn để tinh sạch proteinaz có trong
dịch nuôi cấy vi khuẩn Xeuorhabdus sp. Kết quả trên hình 5 cho thấy: các phân đoạn
có hoạt tính proteinaz chủ yếu là nhũng phân đoạn không hấp phụ trôn cột và đưoc rửa
khỏi cột trong một số lần rửa đẩu tiên bằng đệm Tris-HCl 2QmM, pH 8,0 . Proiemaz đã
được tách ra khỏi các protein hấp phụ trên cột.
0 10
P h ù n đi»ạn
20 30
4 fl Síi
(a)
(b)
Hình 6 : sắc ký trao đổi ion dịch nuôi cây vi khuẩn Xoưuhabdus sp. trẽn cột
DEAE Sephadex A-50 (a: xs, b: CA). Cột được cán băng với đệm Tns-HCl 2()mM. pi I
8.0. Thỏi protein hấp phụ trên cột hãng cùng đêm liên có NuCl ơ các nòng đỏ (Mj: 0.1;
0 °- 0 3' 0 4' 0 -V và 1,0. Tốc dó chay: 30 ml/ íĩiờ. The lích mỏi phân đoan: 3 ml.
Hấp phụ ờ 280nm,

NaCl. ■ Hoạt độ proteina/. 0 protein dộc.
2. Proteinaz của vi khuẩn Photorhahdus
2.1. Nghiên cứu tính chất của proteina/,
2.1.1. pH thích họp của proteinaz
Hoạt độ enzym được xác định trong các đệm có pH khác nhau: đém Sorensen
0 2M pH 6,0; pH 7,0 và pH 8.0; đệm Briton 0,2M pH 9,0 và pH 10.0 . Kết qua xác đinh
ánh hướng của pH lên hoạt độ enzvm được trình bày tron2 hình 6 .
Hình 6 : Ảnh hưởng của pH đến hoat độ proteinaz dịch ngoại bào
vi khuẩn p.himinesceiis lỉp
Trên hình 6 la thấy hoạt độ enzym đạt cực đai khi xác định tại pll 8,0. Hoạt d;»
của enzym giảm dần ở pH 7,0 và 6,0. đặc biệt giam manh ở pH 9,0 và 10,0. Như vây
pH thích hợp cho hoạt độ của enzym la 8,0.
2 1.2. Ảnh hưởng các chất ức chế đặc hiệu nhóm đến hoạt dô enzym
Các chất ức chí đặc hiọu được nghiên cứu là: PMSF. pCMB. EDTA. (1-pho.
Enzvm dược ú vói các chãi ức ché đặc hiệu với nóng độ cuối cùng irons h>>" hl,p b;llls
10 'M 1,011.' 1(1 phút. SỈIM dó xác dịnh hoai độ enzym Ihco phưong pháp Kunil/. KOI >|U.I
VC ánh hướng của các chái ức chẽ đạc hiíu lẽn hoại lính enzym duoc ch, r.1.1 hình 7
Hình 7' Anh hương cua. C3.C chât irc chc đăc hiêu nhóm đén hoíit dỏ protcinu/
dịch ngoại bào vi khuẩn p.luminescetìs Hp
- Kết quả trên đã cho thấy enzyrn bị ức chế mạnh nhã' bời EDTA (ức chẽ tỏi 87';
oạt tính), sau đó đến PMSF (ức chế 28%). Các chất còn lại không ảnh hướrm tới ho;.it
độ của enzym.
2.1.3.Ảnh hưởng của ion kim loại hoá trị hai đến hoạt độ enzyni
Các ion kim loại được nghiên cứu gồm: Mn2+. Ca2\ Fe2\ Cd:+, Ra:\ M ít’.
Pb2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Cu2+, và Hg2+. Ion kim loại được bổ sung vào dịch enzym với
nồng độ 10 1 M, ủ hỗn hợp trong 10 phút. Xác định hoạt độ proteinaz dã cho thấy các
ion Mn2+, Ca2+ có tác dụng tăng cường hoạt độ enzvm. Ngược lai. các ion Pb2', Co2'.
Zn2+, Ni2+, Cu2+, và Hg2+ ức chế hoạt đô enzym trong đó ion Hg2+ tác dụng mạnh nhất
(ức chế 68%). Các ion còn lại ảnh hướng khổnc rõ ràng tới hoạt độ cnzym (hình 8).
Mil te lit l’h /n C'|| !-)<■

< '.K h'H k in I' ‘.li
llình s- Anh liiro'Ui: ciut C.K' I' 'II k Im loại hoa 111 lu I len 111 UI 1 I ỉ'1 Ị 'I! 'U 11!,1 , 11K í I
ịlt.,ui hào \ 1 kliuâii r.lim un , (■/;• H r
2.1.4. Độ bén vói nhiệt ở 60"c
Enzym được ú ớ 60"c trong các khoảng thời gian 0. 5. 10. XI 311. 40. 5». 6(1
phút Sau mỏi thời gian ú. enzym đuực lấy ra va cho ngay vào 4T . Xác dịnh hoái dọ
proteinaz theo phương pháp Kunitz, ta có kết quả trẽn hình 9
Hình 9: Độ bển nhiệt của proteinaz trong địch ngoại bao vi khuán
p.luminescens ỉĩp
Kết quả cho thấy: sau 5 phút ủ 60°c hoạt tính enzvm giảm di nhanh chóng, chí
còn 50% và sau 10 phút ú 6 0 °c hoạt tính enzym chi còn 24% so với hoạt dò han dấu.
Có thể kết luận ràng enzym trong dịch ngoại bào do vi khuẩn p.luminescent up li cl ra
không bền với nhiệt độ.
2.1.5. Phán tích thành phán proteinaz bằng điện di
Bằng phương pháp điện di enzym chúng tỏi đã thu được kết quá vẽ thành phan
protcinaz trong dich nghiên cứu (hình 2 phụ lục).
1
Dưa vào kết quá điện di củ the chia các proteina/ thanh 3 khu vực lớn. Khu VƯU
I gổm các proteinaz có dò di dộng điện di (Rf) từ 0,03 đốn 0,08 Iron” dó có ha! bãim
en/.vm chính: hãn li I có Rí 0.03 và bãnu 2 LÓ 0,08. Khu vưc II chứa các pmtcma/ có
dô di đôn11 clicn di lừ 0.2^ đèn 0,39 va cn/.vm o' khu vực III có (tộ di đọni: (liện di (' ỹ
Điên di cn/vm ủ VỚI các chat ức chẽ dặc hiệu chúnLi tôi nhan thây PMSÍ- ƯL chõ các
prolcm i/ nãm iron í! kìm VIIV I và II. còn 1:1) ỉ A úc ché manh L.tv pioicin.1/ khu \!k I
\'à moi phan khu VIIV III. Như vay. cac pmtciiKi/ ihui'v. khu MR I hi Ưv d v Km .1
HDTA va PMSI
,™ „ r Jhư!n?,c" c;k ion kim h'“ ■"h'“ - P'V— o.
tit ,"^n
T.
ds'h0 lMy: nhin chuns- * «"*•
z

CO 1C dụng khôi phục và lãm lăng hoa, lính cua các bang e n ,™ thunc khu vục ỉ và III
sau khi bị úc chê tói EDTA. Trong đó, các ion Mg= s £ Ca ; M„"
z
hién úi,
dụng rõ rẹt lén bãng 0,08. còn Mg=*và Co-’* co tóc dung rõ rệt lén tang 0.03.
2.2. Tinh sạch proteinaz
Protemaz của vi khuấn dã đưạc tinh sạch qua các bước: kê, lua háng axclõn. VK
ký qua CỘI DEAE Sephadex A-50 và cột Min, Q PE 4.6/50. Kot quá ituặc Irinh b.,v
trên hình 10 và 11.
;p
QỊŨ
ệ
o
<o-
♦a
*&■
ỏ
Ế
ĩi 1
. m a
o
co
G
H- 0.6
ểí
- 0.4
<o-
*5
- 0.2
ũb

r—
'<õ
0
Z
0 10 20 30 40
Phân đoan
50
60
Hình 10: sác ký trao đổi ion dịch nuôi cấy vi khuẩn p.ìuminesccns llp trẽn CỘI DF.AK
Sephadex A-50. Mẫu lên cột: dịch nuôi cấy vi khuân p.ỉumnicsccns ///; dã dược tua
bằng 3 thê tích axètón. Cột được cân bằng với dận Tris-HCl 20 mM, pf [ 8.0. Protein hấp
phụ tròn cột dược rút xuống bằns dệm tiên có NaCl ỏ các nồng độ (M): 0,1; 0,2; 0,3 va 1,0.
Tòbdộ cháy: 30 ml/íiiờ. Thế tích mỏi phân đoạn: 3ml.

NaCI, 0 Hoạt dộ en/.vni.
Dịch nuôi cây vi khuán. sau khi tua bán SI axêiôn. được chay qua cột DÍÍAK
Scphadcx AÕO (hình 10), hoạt độ cn/.ym manh nhãì dược rút xuống cột à nony ilo
NaCI 0.2M. Các phân doan na\ dược don lại, sau k lì 1 loại imioi. được ch.iv Lị LUI mi
Mini Q PI: 4.6/30 (hình 1 1 ). Kcl C]uá dã thu được 5 đinh có hoai đó protcinu/. Tron^
đó dinh chù yếu đã dược iiửi cĩI phân tích trình lự axil amm.
HP302c401; I u v 1 280nm
HP302c40I: I Cone
HP3(J2c40 I: I Fractions
mAU
5.0
4 (J
3.0
I 4 8
I
81)

00
40
2.0
0,0
6.52
e t ;
I VV.I IC j .Ì 4 5 (, ? s 4 Ml 1 I 12 Lí M IS If, 17 w J,|C 0
0 0 _ 5 .0 10.0 15.0 2 0 .0 ml
IIp )■'Ị 1 ; 1 ['in nr,T;i(jni PFAK1
■ ■ -:" f Ares H-iigh*:
ml mAU * ml rriAU
: - " . c ~i -1 r i . 4 3'
Total number of detected peaks = 107
Total area = 144.9562 mAU*ml
A rea in e v a l u a t e d p e a k s = 18.5742 mAU+ml
r i 'r i o f ; 5 k 5 r 0 j / t o *. i : 5,:e a = c .12 8137
fotal peak width = 0.91 :t.j
Calculat e d f I CHI : HI' c 1 : ■ .? 1 : 1 "JV 3 2 1 0 nil.
Baseline : HP302c401 : : 7V? 210r.rr.9C3, BASF.
r. j.’iiiL'e r Ol : ■ : : o
Maximum number of pea-:5: 20
Hình 11. Tinh sạch proteinaz của vi khuẩn p.luminescent Hp qua cột Mini Q PE
4.6/50. Cột được cân bằng với đệm Tris-HCI 20 mM, pH 8.0 (đệm A). Protein hấp phu trên
cột được rút xuống bằng đêm trẽn có NaCl IM (đệm B) với gradient 0-40rr B. Tốc độ chay:
0.8 ml/phút.

NaCl, OD2l5nm. ■ - Hoat đỏ enzyin.
OAI HOC QUỎC - A NO'
THUNG TÁr/ THỘNG Tir^j -H IJ ■/iẸN
IV. BÀN LUẬN

Nhu váy, trong mỏi Iruóng nuôi cấy vi khuân X tm riú M m va ri„.,„rhaMu> dã
tạo ra các proteinaz. Các enzyni này hoạt động mạnh a pH 8 và đirợc phán loại thuiy
nhóm proleinaz kim loại dựa Irên lính chát bị ức chế dác hiệu bói EDTA theo phán loai
cúa Hartley (1960) [9].
Proteinaz kim loại là enzym được tìm thấy ớ nhiều loai vi khuán gãy bệnh con
trùng như: Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis và Sen alia murcesccns
[11,12]. Proteinaz kim loại cung được tìm thấy ờ các vi khuấn cóng sinh với tuvón
trùng thuộc các chủng Xenorhabdus [14,15,16] và Photorhabdus [12,15.16],
Các nghiên cứu từ trước đều cho biêt vi khuấn cộr)2 sinh với tu yen tiùn° tiẽt ra
một lượng lớn proteinaz trong môi trường nuôi câv [4,12,14.15.161- Các proteinaz na\
được phân loại thuộc proteinaz kiềm với pH thích hợp bàng 8 và thuộc nhóm protein,!/
kim loại do chúng bị ức chế mạnh bởi ẸDTA. chúng không bị ức ché bới
PMSF[14,16]. Tuy nhiên, rất ít công trình nghiên cứu đi sâu phân lích thành phấn
proteinaz ngoại bào của vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng. Trong nghiên cứu này.
chúng tồi nhận thấy proteinaz ngoại bào của Xenorhabchts sp. CA. không những bị ức
chế mạnh bởi EDTA mà còn bị ức chế mạnh bởi PMSF. Bàng kỹ thuật điện di
protcinaz, chúng tôi đã xác đinh được thành phần của proteinax, tronti dó bán 12
protcinaz có hoạt đổ mạnh nhất thuộc vùng II bị ức chế mạnh bới cá EDTA và PMSI\
còn các bàng proteinaz trong vùns III bị ức chế mạnh bới PMSF nhưng cũng bị ức chó'
một phấn bới EDTA. Nghiên cứu ảnh hưởng của các lơn kim loai đốn hoạt độ proteina/
dã cho thấy các ion Ca2\ Ba2+. Mg2\ Mn:+ có tác tiling khôi phục hoạt tính cua ban.:
0.25 sau khi bị ức chế bới EDTA. còn Pb2+ chí có tác dung với hãng 0,31. Vì vây. có
thế cho rànơ hai băng này thuộc loại proteinaz kim loại-xêrin như dã dược tìm thây ơ
vi khuẩn Bacillus pumihts [5].
So sánh °iữa các chùim VI khuẩn dược nghiên cứu Xí’ii(>rh(ib(lu.\ và
PlìoỊorlnihdus. chú ne lôi nhàn 1 hâ> prolcina/. ngoai hao cua cluiiiy đcu hoa! il.mL’
manh oplis kém hen \iVi nhiệt. lín/vm hi ức chõ manh h.li i;i)l.\ va I'M,SI'.
Ptvin tích I hành’ pli.ìn pioiemu/ ba ny dicn ill il.ì cho [ha_\ L\I Xrncì ÌUIÌUÌII- .1
riio iorliuhiln s dcu co chưa kìni! protcm a/ hi irc LỈÌC h.M H ) I A \ ;i ['MSI- II: í:
urơn- này da ihn.vc 1’hnm Thi IV,MI H ull va llcniẠk l 'rK.nok | | " 7-Ị' tim ilú> •

khuân B aà lỉu s punu lus. Tuy nh., 11. Uu> V, d u n . 1’MSI . i , Í.K M,:.
DFP. một chất ức chế đặc hiệu proteinaz xérin. Vì vậy. các hang protoina/ nà} được
xếp vào loại proteinaz kim loại-xẽrin.
Vc vai tro cua proteinaz: protcinaz la enzvm có vai trò I'iit cỊUíin tron° tronơ quá
trinh sinh trương va phat tnen cua sinh vật. Đỏi với phức họ cộng sinh tuvên I['ùn°-\|
khuẩn, khi phức hệ này xâm nhập vào cỏn trùng, vi khuân nhân lên vã tiết ra một so
protein trong đó có proteinaz. Các proteinaz được cho là có vai trò quan trọns tham £ia
vào quá trình diệt côn trùng băng cách làm két tủa các protein máu và phá huv các te
bào máu của côn trùng [7], Ngoài độc tính của nó. các san phám ihuv phán cua
proteinaz còn cung cấp chất dinh dưỡng cho SƯ phát triển của tuyến trims. Cùns VỚI
proteinaz, các protein khác, đặc biệt là các protein đõc do vi khuán tạo ra đã được
chứng minh có vai trò quan trọng trong quá trình gây bênh còn trùng [3.8Ị. Đóng thời
với việc nghiên cứu các proteinaz của Xenorhabdus sp. XS4, chúng tỏi đane tiên hành
nghiên cứu các protein độc và sư tương tác của hai loại protein này nhằm tìm hướrm
ứng dụng có hiệu quả tao chế phẩm diệt côn trùng gây hại. Các nghiên cứu dang được
tiếp tục thực hiện có nhiều triển vọng.
V. KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu proteinaz ngoại bào của vi khuẩn cộng sinh với tuyên trùng, chứng
tỏi rút ra một số kết luận sau:
1. Vi khuán cộng sinh với tuyến trùng đã tạo ra một lượng lớn proteinaz khi
nuôi cấy trong môi trường nhân tạo.
2. Proteinaz hoạt động mạnh nhất tại pH8. Enzym kém bén với nhiệt.
3 Tron*7 số các 1011 kim loại hoá trị hai được nghiên cứu, cn/.ym bị ức ch-':
mạnh bời Hg2+. sau đó đến Cu:+ và Zn2\ Ngược lại. các ion Ca2'. Mg:‘
đĩ làm tăn ° hoạt độ enzvm của vi khuán Xenorhabdus, còn Mn* da lam
tăn° hoạt dô enzym của vi khuẩn Pliotorìuilhliix.
4 Thành phấn proteinaz ngoai bào cua vi khuan Xcnorhahdus và
Photorhalnlits khá da dang và phong phú. Trong dó có (hành phan
p i o l e i n u / k i m l o . i l x c n n t lc i c h ú n g h i ứ c c h é m a n h h ( í i I
i \ )

I A \ a P M S I - .
VI. KIẾN NCỈH1
Dc „ hị úop UK a, V.U nsh iín aru ca, linh đ,:„ a u rn-u :,n,/ .1, null I.
nghK-n cứ,i sự mon. I.K' piíra lw l a " -,u klul;m ■ " "
111 yen trùng.
VII. TÀI LIÊU THAM KHẢO
1. Akhurst R.J., 1982. Antibiotic activity of Xenorhalulus spp bacteria
symbolically associated with insect pathogenic nematodes of the families
Heterorhabditidae and Steinernematidae. J. Gen. Microbiol 128: 3061- 3065.
2. Akhurst R.J., Dunphy G.B 1993, Tripartite interactions between symbolically
associated entomopathogenic bacteria, nematodes and their insect hosts. In:
Parasites and Pathogens of Insects. Beckagc N Thompson s Fedenci B. (Eds).
Academic Press, NewYork, Vol. 2 p. 1-23.
3. Bowen D.J and Ensign J.C 1998. Purification and characterization of a hight
molecular weight insecticidal protein complex produced by the
entomopathogenic bacterium Photorhabdus litmittescens. Appl. Enviror.
Microbiol., 64 (8 ): 3029-3035.
4. Caldas c., A. Cherqui, A. Pereira, N. Simoes, 2002. Purification and
characterization of an extracellular protease from Xenorhabdus liematopliila
involved in insect immunosuppression. Applied and Environmental
Microbiology, 68(3): 1297-1304.
5. Phạm Thị Trân Châu and Urbanek H., 1974. Serine neutral proteinase from
Bacillus pnmilus as metalloenzyme. Acta Microbioloqica Polonica Ser. B. 6,
(23):21-25.
6 . Nguyễn Ngọc Châu, 1998. Nghiên cứu sử dụnc tuyên trùng trong phòng trừ sinh
học sâu hại cây trổng ơ Việt Nam. Tạp chí khoa học và công nghệ. XXXVI (3):
24- 29.
7. Fly ° c. Keene K. and Roman H.G., 1980. Insect pathogenic properties of
Serratia marcesccus: phaue-resistant mutants with a decreased resistance lo
Cccropid immunity and a decreased virulence to Drosophila. J. Gen. Microbiol

120: 173- INI.
^ Guo [ I' 11 io lu R.O Orr G.L., Schalcr B.W Sticklaml J.A Sukhapimki K
Woods worth A.T ami IVlcll J.K ưholcrliaìnlus limiinc.u rii.s W-I-I
insecticidal aetivit) consists of at Icasl IWO similar hill ilisliiK! prolcmv Ỉ Bm I
Clicm 274 ( 14): ỌS4:
w 1 hilley B.S., 1% 0 . Prouvlyuc Cn/YIIK'S. Ann, ki'\. B i.hem 2') I;
10. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly ol the
head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680- 685.
11. Morihata K.,1974. Comparative specificity of microbial proteinases. Adv.
Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol,, 41: 179- 243.
12. Ong K.L., F.N. Chang, 1997. Analysis of proteins from different phase variants
of the entomopathogenic bacteria Photorhabdus luminescens by two dimension;'1
zymography. Electrophoresis. 18:834-839.
13. Poinar G.O., 1990. Taxonomy and biology of Steinerncmatidac and
Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nematodes in Biological Control.
Gaugler R., Kaya H.K,
(Eds). CRC Press, Boca Raton, p 23- 61.
14.■ Schmidt T.M., B. Bleakley, and K.H. Nealson. 1988. Charatcrization of an
extracellular protease from the insect pathogen 'Xenorhabdus lumincscens.
Applied and Environmental Microbiology, 54(11):2793-2797.
15. Trịnh Hồng Thái, Nguyen Hoài Hà, Phạm Thị Trân Châu, 1999. Bước đầu nghiên
cứu proleinaz của vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng Steinernema carpocapsae TL
và Heterorhabditis sp. TK3. Tạp chí sinh học, 21 (lb): 173- 179.
16. Trinh H Thai, Boigegrain R.A., Brehelin M., 2001. Purification and
characterization of the extracellular proteasc trom the inscct pathogen
Photorhabdiis lnminescưns. J. Genetics and Applications. Specical Issue:
Biotechnology, p. 10- 17.
17 H Dowds B.C.A., 1993. Phase variation in Xenoviiabdtts luminesce". :
cloning and sequencing of the lipase gene and analysis of its expression in
primary and secondary phases of the bacterium. J. BactenoL 175: 1665- 1673.

PHỤ LỤC