Nghiên cứu quy trình phân tích dư lượng các hợp chất ô nhiễm cơ brôm (PBDEs) trong mẫu cá sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
* * * * * * * * *
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH D ư LƯỢNG CÁC HỢP
CHẤT Ô NHIÊM C ơ BRÔM (PBDEs) TRONG MÀU CÁ
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHIÉT PHA RẮN (SPE) VÀ
SẮC KÝ KHÍ KHÓI PHÓ (GC-MS)
MÃ SÓ: QT-09-65
CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI: TS. Phạm Mạnh Hoài
CÁC CÁN Bộ THAM GIA: CN. Hoàng Phương Mai
CN. Nguyễn Hoàng Mai
sv. Nguyễn Thị Hồng (K52A-Hóa học)
ĐAI HOC QUÒC <v- -A NỤI
TRUNG TẨM THÔNG 1IN THƯ VIẺN
00060000/ 10/;
1
Mục lục
Báo cáo tóm tắt 2
Danh mục các bảng 6
Danh mục các hình 7
1. Mở đầu 8
2. Tổng quan 9
2.2. Hàm lượng các hợp chẩt cơ brôm
11
2.3. Chuẩn bị mẫu 12
2.3.1. Chiết 13
2.3.2. Làm sạch dịch chiết i 7
2.4. Phương pháp phân tích 18
3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19
3.1. Nội dung nghiên cứu 19
3.2. Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 19
3.2.2. Phạm vi nghiên cứu 20
3.2.3. Chuẩn bị mẫu 21
3.2.4. Phương pháp phătt tích 24
3.2.5. Phương pháp đánh giá 26
3.2.6. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm 27
4. Kết quả và thảo luận 27
4.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 27
4.2. Khảo sát loại dung môi chiết mẫu cá 28
4.3. Khảo sát dung môi chiết với pha nước 30
4.4. Khảo sát hiệu suất thu hồi chất phân tích khi rửa axit H2SO4 31
4.5. Tối ưu hóa thể tích dung môi rửa giải ra khỏi cột chiết pha rắn 44% H2S0 4-Silica/LC-
SI "
.

.

.

31
4.6. Hiệu suẩt thu hồi trên nền mẫu thật 33
4.7. Kích thước và hàm lượng mỡ các mẫu cá
33
4.8. Hàm lượng các PBDE trong các mẫu cá lấy tại các địa điểm nghiên cứu
34
5. Kết luận 34
6. Tài liệu tham khảo 35
PHỤ LỤC 37
5
Danh mục các bảng

Bảng 2.1. Chiết, hấp thụ và phân tích các mẫu sinh học 12
Bảng 2.2. Chiết, hấp thụ và phân tích các mẫu lỏng 14
Bảng 3.1. Thông tin về các mẫu cá 20
Bảng 3.3. Chương trình nhiệt độ của thiết bị sắc ký 23
Bảng 3.4. Thời gian lưu và chế độ quan sát ion chọn lọc đối với các PBDE 23
Bảng 4.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị (n = 5 )

27
Bảng 4.2. Hiệu suất thu hồi sử dụng 2 loại dung môi chiết là n-hexan và axeton nitrin

27
Bảng 4.3. Hiệu suất thu hồi sử dụng 2 loại dung môi chiết với pha nước là n-hexan và
hỗn họp n-hexan : etyl axetat (3:2)
28
Bảng 4.4. Hiệu suất thu hồi các chất phân tích sau khi rửa axit sulíủric đặc (n = 3 )

29
Bảng 4.5. Hiệu suất thu hồi (n = 3) các PBDEs trên nền mẫu cá (thêm chuẩn 5 ng/g)

31
Bảng 4.6. Hàm lượng mỡ các mẫu cá 32
Bảng 4.7. Hiệu suất thu hồi PCB 209 (%) và hàm lượng PBDEs (ng/g thịt) trong mẫu cá

33
6
Danh mục các hình
Hình 2.1. Tỷ lệ phần trăm và tổng lượng tiêu thụ TBBPA (2002), HBCDD (2001) và
DecaBDE (2001) tại Mỹ, EU và châu Á 8
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của PBDEs (n + m = 1 -ỉ-10) 9
Hình 3.1. Mầu cá rô phi thu thập tại sông Tô Lịch

20
Hình 3.2. Hệ chiết pha rắn SPE với cột 44% sulfiưic acid impregnated silicagel 21
Hình 3.3. Quy trình phân tích PBDEs toong mẫu cá
22
Hình 3.4. Sắc đồ (SIM) của PBDEs trên thiết bị GCMS-QP2010 24
Hình 4.1. Hiệu suất thu hồi chất phân tích sử dụng 2 loại dung môi chiết là n-hexane và
acetonitrile 28
Hình 4.2. Hiệu suất thu hồi sử dụng 2 loại dung môi chiết là n-hexan và hỗn hợp
n-hexan : etyl axetat (3:2) 29
Hình 4.3. Hiệu suất thu hồi các chất phân tích sau khi rừa axit (n = 3 ) 30
Hình 4.4. Hiệu suất thu hồi (n = 3) các PBDEs qua cột silicagel 44% H2SO4 31
Hình 4.5. Hiệu suất thu hồi (n = 3) các PBDEs trên nền mẫu cá (thêm chuẩn 5 ng/g)

32
7
1. Mở đầu
Công ước Stockholm ra đời ngày 22 tháng 5 năm 2001 tại thành phố Stockholm, Thụy
Điển và chính thức có hiệu lực kể từ ngày 14 tháng 5 năm 2004. Ngày 22 tháng 7 năm
2002, Việt Nam đã trở thành quốc gia thứ 14 trên thế giới phê chuẩn Công ước này. Công
ước Stockholm là một hiệp ước toàn cầu có mục tiêu chung là bảo vệ cuộc sống và môi
trường thiên nhiên, đặc biệt cho người nghèo và các nước nghèo, bằng cách cấm sản xuất
và sử dụng một số các hóa chất độc hại, đặc biệt là 12 chấưnhóm chất: aldrin, chlordane,
dieldrin, endrin, heptachlor, hexachlorobenzenne (HCB), mirex, toxaphene,
dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), polychlorinated biphenyl (PCB), dioxin và furan.
Công ước cũng yêu cầu xử lý triệt để những địa điểm tàng trữ thuốc BVTV và hoá chất
độc hại có chứa POP. Tại phiên họp ngày 8 tháng 5 năm 2009 tại Geneva, 9 loại
chất/nhóm chất mới đã được hơn 160 Chính phủ các nước thống nhất đưa bổ sung vào
danh sách các hóa chất độc hại theo Công ước Stockholm, nâng tổng số chấưnhóm chất
POP lên thành 21. Các đồng loại thuộc nhóm các hợp chất polybtominited diphenyl ete,
viết tắt là PBDEs, bao gồm: hexabromodiphenyl ether và heptabromodiphenyl ether,

tetrabromodiphenyl ether và pentabromodiphenyl ether, nằm trong số 9 nhóm chất/hợp
chất mới này
Các kết quả khảo sát thực tế cho thấy tình trạng ô nhiễm môi trường do các hợp chất POP
gây ra là đáng báo động ở Việt Nam. Tuy nhiên số liệu quan trắc các hợp chất PBDEs
còn rất hạn chế; nguyên nhân là do đây là các hợp chất độc mới được quan tâm trên thế
giới và do điều kiện phân tích ở Việt Nam chưa sẵn sàng cho việc phân tích các hợp chất
này. Nghiên cứu gần đây được thực hiện tại trung tâm CETASD sử dụng phương pháp
chiết thẩm thấu qua gel (GPC) và thiết bị phân tích GC-MS cho thấy dư lượng các hợp
chất PBDEs có thể được tìm thấy trong cá biển (0,58 - 2,4 ng/g lipid) và trong trầm tích
cửa biển (0,05 - 0,15 ng/g trọng lượng ướt) [1]. Giống như nhiều phương pháp đã được
phát triển tại các phòng thí nghiệm trên thế giới, phương pháp phân tích được sử dụng
trong nghiên cứu này còn tương đối phức tạp, đòi hỏi nhiều thời gian và thiết bị tách chiết
đắt tiền (thiết bị GPC) và không thông dụng ở Việt Nam.
Với mục đích nghiên cứu đề suất một quy trình phân tích hiệu quả hơn, phù hợp với điều
kiện của các phòng thí nghiệm ở Việt Nam trong việc phân tích các hợp chất PBDEs,
chúng tôi đã tiến hành lựa chọn, khảo sát, tối ưu hóa quy trình phân tích 11 đồng loại
PBDEs trong mẫu cá sử dụng hệ chiết pha rắn SPE và thiết bị phân tích GC-MS với độ
chính xác và độ tin cậy cao. Kỹ thuật chiết SPE giúp rút ngắn thời gian làm sạch mẫu, tiết
kiệm chi phí. Phương pháp sau đó đã được áp dụng để phân tích và đánh giá sơ bộ hàm
lượng các hợp chất PBDEs trong một số mẫu cá thu thập tại sông Tô Lịch và ao hồ cạnh
khu xử lý chất thài điện tử.
8
2. Tổng quan
2.1. Thông tín chung về các hợp chất PBDEs
Các hợp chất chống cháy được ứng dụng chủ yếu trong các sản phẩm nhựa sử dụng trong
các thiết bị điện dân dụng nhu vô tuyến, máy tính, linh kiện ôtô, bảng mạch điện, dây cáp,
các sản phẩm polyme, sơn, vải, với mục đích làm tăng tính chống cháy của của các vật
liệu. Có nhiều loại chất chống cháy khác nhau: các chất vô cơ, các este hữu cơ của phốt
phát có chứa hoặc không chứa các hợp chất halogen, các hợp chất hữu cơ cơ clo hoặc cơ
brôm [2-4]. Các chất chống cháy được chia thành hai loại, tùy thuộc vào mục đích sử

dụng khác nhau: chất chống cháy ngăn phản ứng gây cháy và chất chống cháy phụ gia.
Chất chống cháy ngăn phản ứng gây cháy được gắn vào các polyme bằng liên kết cộng
hóa trị nên hầu như không thể bị đào thải ra môi trường trừ trường hợp các sàn phẩm
chứa chúng bị phân hủy hoặc bị đốt. Tuy nhiên các chất chống cháy phụ gia thường được
trộn hoặc hòa tan vào các vật liệu nên chủng dễ dàng tách ra từ các sản phẩm thương mại,
vật liệu.
z 39 500 ton l 24 900 ton z 137 400 ton
100%
80%
5 60%
<4,
r
< t . 40%
p 20%
0% -
Mỹ Châu Âu Châu Á
Hình 2.1. Tỷ lệ phần trăm và tổng lượng tiêu thụ TBBPA (2002), HBCDD (2001) và DecaBDE
(2001) tại Mỹ, EƯ và châu Á
Chất chống cháy cơ brôm (BFRs) là những hợp chất đa dạng về cấu trúc hóa học, bao
gồm các vòng thơm, các cyclic aliphatic, các dẫn xuất của phenol, các dẫn xuất của
anhydric phthalic và aliphatic. Các hợp chất BFRs thông dụng nhất là tetrabrombisphenol
A (TBBPA), polybrominated diphenylethers (PBDEs), hexabromocyclododecane
(HBCD) và polybrominated biphenyls (PBBs) [3-5]. Vào giữa thập niên 90 sản lượng
BFRs hàng năm trên thế giới là 150.000 tấn, chiếm khoảng 30% sản lượng các chất
chống cháy. Khoảng 1/3 sản lượng BFRs là PBDEs, 1/3 khác là TBBPA, số còn lại là
những hợp chất cơ brôm khác nhau. Nhu cầu các hợp chất BFRs trên thị trường châu Âu,
châu Mỹ và châu Á nãm 1999 được thống kê và biểu diễn trên hình 2.1 [6]. Tổng sản
lượng của 5 loại BFRs chủ yếu là trên 200.000 tấn (trong đó TBBA chiếm hơn 70%) và
châu Á là điểm tiêu thụ lớn nhất (56,2%). Các hợp chất PBDEs được sử dụng như một
loại phụ da chống cháy cho các sản phẩm polystyren, acrylonitrile butadiene styren, bọt

polyurethan, lớp phủ sợi vải, lớp cách điện của dây điện và dây cáp, phích cám điện [3].
9
Hình 2.2. Công thức cấu tạo của PBDEs (n + m = 1 - 10)
Xét trên phương diện cấu trúc hóa học (hình 2.2), PBDEs cũng gồm có 209 đồng đẳng,
tương tự như hợp chất PCBs, và từng đồng đẳng riêng biệt của các hợp chất PBDEs này
cũng được đánh số tương tự như PCBs. Sản phẩm PBDEs thương mại chủ yếu chứa các
cấu tử được thế bởi nhiều nguyên tử brôm như penta-, octa-, hoặc decabrommodiphenyl
ether (PeBDE, OcBDE hoặc DeBDE). Ví dụ, sản phẩm thương mại của hỗn hợp PBDEs
thường chứa ít hơn 10 đồng đẳng. Tuy nhiên, PCBs kỹ thuật bán trên thị trường thường là
hỗn hợp của khoảng 80 đồng đẳng.
Các hợp chất PBDEs có nhiều tính chất tương tự như PCBs và PCDDs, ví dụ chúng đều
là những chất gây ô nhiễm môi trường, bền vững trong môi trường và có khả năng tích tụ
sinh học. Khả năng hòa tan trong nước và áp suất bay hơi của của các hợp chất PBDEs
rất thấp [3], do đó khi được giải phóng ra môi trường các hợp chất này dường như sẽ
nhanh chóng hấp phụ vào trầm tích và đất. Do có tính ưa mỡ cao và khó bị phân hủy, các
hợp chất PBDEs cũng co khả năng tích lũy sinh học dễ dàng. So sánh với PCBs, các hợp
chất BFRs dễ bị phân hủy trong môi trường hơn do liên kết cacbon-brôm yếu hơn liên kết
cacbon-clo. Một vài hợp chất có khả năng tham gia phản ứng quang hóa dưới tác dụng
của bức xạ u v [3]. Ví dụ, dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, hợp chất DeBDE dễ dàng
phân hủy thành các đồng đẳng cơ brôm có phân tử lượng nhỏ hơn và dễ dàng tham ra quá
trình tích lũy sinh học hơn. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có số liệu nghiên cứu nào
khẳng định rõ phần tỷ lệ nào của tetra- đến hexa-BDEs được tìm thấy trong môi trường là
sản phẩm phân hủy của các đồng đẳng DeBDE và của hỗn hợp thương mại PeBDE.
Các họp chất BFRs không chỉ thâm nhập vào môi trường từ các nguồn thải trong quá
trình sản xuất mà còn từ các sản phẩm hàng hóa trong quá trình sử dụng. Khi bị gia nhiệt
các hợp chất PBDEs có thể chuyển hóa thành các dioxin và íiiram cơ brôm. Các hợp chất.
PFRs đã được tìm thấy trong rất nhiều loại mẫu khác nhau: trong không khí, trầm tích,
bùn cống, mô cá, trứng chim, cá voi, cá heo, mỡ hải cẩu, sò và trầm tích, huyết thanh
người, sữa và các mô tế bào. Tỷ lệ thành phần các đồng đẳng trong các mẫu môi trường
không giống hoàn toàn như tỷ lệ thành phần của chúng trong các sản phẩm kỹ thuật. Điều

này chứng tỏ đã có sự biến đổi về tỷ lệ thành phần trong môi trường, có thể là do quá
trình thay thế các nguyên tử brôm bởi phản ứng quang hóa. Do sự tích lũy sinh học, nồng
độ của các hợp chất này cao hơn đáng kể trong các đối tượng sinh học bậc cao hơn trong
chuỗi thức ăn. Ví dụ, các nhà khoa học đã ghi nhận nồng độ của các hợp chất PBDEs
trong sữa người tăng liên tục trong khoảng thời gian nghiên cún từ 1972 đến 1997 ở
10
Thụy Điển; ngược lại hàm lượng các hợp chất cơ halogen khác như DDTs, PCBs, và
PCNs lại giảm [12,13].
Mặc dù ảnh hưởng của hợp chất BFRs đến sức khỏe và môi trường chưa được xác định
rõ ràng, tuy nhiên, vào năm 1973, thông tin về mức độ tiếp xúc trực tiếp của các loại
động vật sống ở cánh đồng và mức độ tiếp xúc của con người với hợp chất này thông qua
chuỗi thức ăn đã gây được sự chú ý đáng kể ở Michigan [7]. Độ độc cấp tính của phần
lớn các hợp chất BFRs là tương đối thấp, nhưng một vài BFRs lại cho thấy nó có độ độc
tương tự các hợp chất PCBs, PCDDs và ũiran [8,9]. Ví dụ, số liệu đã công bố cho thấy
các đồng đẳng có số nguyên tử brôm nhỏ hơn (tetra đến hexa) có thể là những hợp chất
gây ung thư, chất gây rối loạn nội tiết tố và/hoặc là những chất độc ảnh hường đến sự
phát triển hệ thần kinh [2,3,9]. So với các hợp chất PBDEs có số nguyên tử brôm nhỏ hơn,
hợp chất DeBPE, sản phẩm thương mại chính, được cho là đồng đẳng kém hoạt động hom
vì DeBPE thường được tìm thấy ở hàm lượng nhỏ hơn trong các mẫu sinh học và hấp phụ
kém hom trên thành dạ dày [10,11]. Nghiên cứu trên thức ăn sử dụng TeBDE đánh dấu
đồng vị phóng xạ cho thấy hợp chất này hấp phụ hoàn toàn trong thức ăn, sau đó được
vận chuyển và lưu dữ trong một thời gian dài trong các mô mỡ [10]. Sự duy trì tính
phóng xạ ở các mô mỡ chứng tỏ TeBDE đã không bị chuyển hóa đáng kể thành các hợp
chất ưa nước.Tuy nhiên một vài nghiên cứu khác chỉ ra rằng PBDEs có thể bị chuyển hóa
thành các hợp chất chứa nhóm hydroxyl, và như vậy các hợp chất polybrominated
phenoxyphenol có thể cạnh tranh với các thyroxin trong cơ chế tạo liên kết protein
transthyretin vận chuyển thyroxin [4].
2.2. Hàm lượng các hợp chất cơ brôm
PBDEs đã được tìm thấy trong không khí ở những vùng quê và các khu lân cận, trong
trầm tích và sinh vật. Việc tìm ra PBDEs trong tinh dịch của cá voi cho thấy các hợp chất

này có thể phân bố đến cả những vùng nước sâu trong lòng đại dương [28]. Một vài
nghiên cứu đã chỉ ra khuynh hướng tăng lên của nồng độ BFRs trong môi trường. Ví dụ,
với cá voi SE Baffin, hàm lượng BDE-47 tăng 6,5 lần từ năm 1982 đến 1997 [43]. Tương
tự, lượng PBDEs trong sữa người cũng tăng; tại Thuỵ Điển tăng 60 lần từ năm 1972 đến
1997 [12]. Hợp chất được tìm thấy với hàm lượng lớn nhất trong sinh quyển là BDE-4
(2,2,4,4_tetrabromđiphenylete), mặc dù nó không phải là đồng đẳng chính được trong các
sản phẩm [4].
Hàm lượng PFRs trong đất và trầm tích rất đa dạng theo vị trí. Nghiên cứu mới đây về
những mẫu core trầm tích theo thời gian (1907-1999) được lấy ở nhiều địa điểm khác
nhau ờ Châu Âu cho thấy phần lớn những đồng đẳng của PBDEs đều bắt đầu xuất hiện
vào nửa đầu thập niên 60 của thế kỷ trước. BDE-209 xuất hiện sau đấy khoảng 1 thập kỷ
[44].
11
Một vải nghiên cứu về nồng độ và sự phân bố của BFRs trong không khí cũng đã được
thực hiện [44, 45]. PBBEs đã được phát hiện với mật độ tập trung vào khoảng l-8pg/m3.
Ở Thuỵ Điển, Sibria (Nga) nồng độ PBDEs là khoảng 1-8 pg/m3 và ở phía Tây Bắc
Toritorri Canada nồng độ PBDEs vào khoảng 1-7 pg/m3 [45], nồng độ khoảng 7-53pg/m3
đã được phát hiện ở khu công nghiệp Nhật Bản, Đài Loan [45]. Trong một nghiên cứu
gần đây lượng PBDEs được phân bố ở vùng Great Lakes (USA) [45]. Nồng độ tổng
cộng của PBDEs vào khoảng 4.4-12pg/m3 và chất đồng đẳng BDE-47, 99, 100, 153 và
154 đã được tìm thấy ở tất cả các mẫu. Nghiên cứu tương tự cũng chỉ ra ràng mức độ tập
trung của PBDEs trong những văn phòng có máy vi tính thông thường có thể chứa BDE-
209 lên tới 80 pg/m3 và BDE-47 cũng đã được phát hiện.
PBDEs đã được nghiên cứu rộng rãi ở khu sinh vật ở Thuỵ Điển [31]. Trong một vài
nghiên cứu gần đây PBDEs (như BDE-46, 99, 100) trong cá được tìm thấy từ 19-
4600ng/g trọng lượng lipit, trong khi BDE-209 chỉ có trong một vài mẫu dưới dạng vết
[31]. Lượng BDE-47, 99, 100 ở cá là cao hơn so với trong trầm tích ( 4,6-36 lần). Nồng
độ PBDEs cao được tìm thấy trong cá chó, cá trình (17000-1 lOOOOng/g trọng lượng lipit).
Lượng PBDEs trong hải cẩu trong hai nghiên cứu gần đây ở Canada dao động từ 2,4-4,9
ng/g và 1,2-3,4 ng/g trọng lượng lipit đối với hải cẩu đực và cái [20]. Tại cùng thời gian

đó, nồng độ PBDEs tìm thấy trong cá ở Canada là từ 135-545 ng/g.
Lượng BFRs ở người là tương đối thấp. Tuy nhiên, lượng PBDEs ở sữa người ở Thụy
Điển được tìm thấy dao động từ 72-4010 pg/g với đồng đẳng chính là PBDE-47, chiếm
khoảng 60-70% tổng số PBDEs. Các đồng đẳng đáng kể khác là PBDE-99, 100, 153 và
154 [12, 13]. Một nghiên cứu ờ Đức cho biết lượng PBDEs ở sữa người được phát hiện
dao động từ 0,6-1 lng/g chất béo [15]. Nghiên cứu ở Nhật Bản cho biết PBDEs đo được
trong huyết tương người trưởng thành là dưới 1 ng/g [58]. Đồng đẳng chính được tìm
thấy trong mô mỡ người là BDE-47, 99 và 153 và tổng PBDE là 1 ng/g trọng lượng lipit
[9,14,17].
2.3. Chuẩn bị mẫu
Việc xử lý mẫu đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phân tích các hợp chất
PBDEs trong mẫu môi trường vì tính chất phức tạp của nền mẫu và do các hợp chất này
thường chỉ tồn tại ở hàm lượng rất thấp, lượng vết. về cơ bản, qui trình xử lý mẫu bao
gồm các bước: chiết các hợp chất PBDEs từ mẫu, dung dịch chiết sau đó được làm sạch,
rửa giải theo từng phân đoạn và làm giàu trước khi đi đến bước cuối cùng là đo trên máy.
ứng với mỗi nền mẫu (mẫu trầm tích, mẫu lỏng, ) người ta sử dụng các quy trình tách
chiết mẫu khác nhau. Trọng lượng mẫu phân tích thường dao động trong khoảng từ 0,5
đến 50 g.
12
Sau khi được chiết khỏi nền mẫu, dịch chiết thường được làm sạch và các hợp chất cần
phân tích thường được rửa rải theo nhiều phân đoạn khác nhau vì phần lớn các phương
pháp chiết là không chọn lọc hoàn toàn và hiệu quả tách của các kỹ thuật phân tích là
không hoàn toàn hoàn hảo. Các dịch chiết chắc chắn sẽ chứa các cấu tử gần giống với
PBDEs và các cấu tử này thậm chí còn tồn tại ở hàm lượng cao hơn nhiều so với PBDEs.
Quá trình rửa rải theo nhiều phân đoạn là giống nhau cho các loại dịch chiết khác nhau.
2.3.1. Chiết
PBDEs được nghiên cứu ở trong nhiều loại mẫu mô khác nhau, trong cá, trứng chim, cá
heo, mỡ hải cẩu và mỡ cá voi. Thông thường, đầu tiên các mẫu này được đồng nhất, ví dụ
với Na2S 0 4 khan. Các phương pháp chiết đối với loại mẫu này được tổng kết ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Chiết, hấp thụ vả phân tích các mẫu sinh học

Mẩu, chất
phân tích
Xử lý
ban đầu
Quy trình Làm sạch
Phân
tích
Tài
liệu
Mô cá, PBDEs Đồng
Chiết với n-hexan/axeton 1. Cô đặc GC-ECD
[18]
nhất mẫu Chiết với n-hexan sử
dụng bộ chiết polytron
2. Xử lý với H2SO4 đặc
3. Cột 80 X 5mm, lg
ílorisil, giải hấp với 30ml
hay GC-
EI-MS
Cá voi, cá heo,
hexan
hải cẩu, cá, Đồng Chiết soxhlet với n- 1. Xử lý với H
2
SO
4
đặc
GC-NIC- [19]
PBBS, PBDEs nhất mẫu hexan/aceton, 3:1
2. Cột silic, giải hấp với iso
octan và dietylete/octan

MS
Động vật có Đồng
Chiết với CH2CI2 trong l.GPC
GC-MS [20]
vú, PBDEs nhất với
Na2S 04
khan
cột
Cá voi, PBDEs Đồng Chiết với n-hexan/
1. Cột silic đa lớp (H
2
SO
4
-
GC-EI-
[21]
nhất với CH2CI2 (1/1)
silic/silic đã hoạt hóa/KOH-
MS
Na2S0 4
silic), giải hấp với hexan
khan
Cá, thỏ, chuột,
Đồng Chiết trong cột thủy tinh
1. Xử lý với H
2
SO
4
đặc
GC-NCI- [22,

hải cẩu, trứng
nhất mẫu
với 300ml axeton/n-
2. GPC: biobeads S-X3
MS
23,
chim Uria, mô
hexan, 70/30, và 300ml
3. Cột silic
29]
cơ, lớp mỡ
n-hexan/dietylete,
4. Cột than hoạt tính
cứng ở quanh
90/100.
thân bò cừu,
mỡ cá voi,
PBDEs.
13
Mẩu, chất
phâo tích
Xử lý
ban đầu
Quy trình
Làm sạch
Phân
tích
Tài
liêu
Hải cẩu, cá Đồng Chiết ừong cột thủy tinh

1. Cô đặc
GC-EI- [25]
chích, nhất với với 300ml aceton/n-
2. GPC: cột 2x300x7,8 mm
MS
PBDEs.MeO-
Na2S 0 4
hexan, 70/30, và 300ml
i.d. PL-gel, CH2Cl2/hexan
PBDEs khan n-hexan/dietylete, 90/10.
( 1/ 1) như là giải hấp, cất
phân đoạn 17,5-52,5 ml
3. Cô đặc
4. Cột ílorisil, lOmm i.d. 8g
ílorisil, giải hấp với 75ml
CH2C12/ hexan (1/1)
Hải cẩu, Đồng Chiết với 35ml
1. Chiết với lOml H3PO4
GC-ECD
[26,
toxaphene,
nhất với hexan/aceton (5/2) và sau 0,1M với l%NaCl
27]
chlodanes,
Na2SC>4
đó với 25ml hexan
2. Cột sel silic, rửa với
PBDEs khan hexan, giải hấp với
PBDEs
hexan/dietylete (3/1)

3. Cột nhôm oxit, giải hấp
với hexan
Mỡ cá heo Làm khô, Chiết soxhlet với n-
1. Cột nhôm ôxit
GC-NCI- [28]
đồng
hexan, 4 giờ
2. Cột silic
MS
nhất với
hỗn hợp
Na2S 0 4
Mỡ cá voi Đồng
nhất với
hỗn hợp
Na2S 04
trộn với
AlOx
SFE với C02, ở 40°c và
281bar, tốc độ quay
2ml/phút đưa vào cột
C18, giải hấp với 2ml
CH2C12
GC-EI-
MS
[30]
Mô vú người,
Đồng
Hexan/ CH2C12
1. GPC

GC-NCI- [14]
mô mỡ,
nhất
2. Cột ílorisil
MS
PBDEs
Mô người, Đồng
SFE với CƠ2, ờ 40 °c và
GC-EI-
[17,
PBDEs, PCBs, nhất với 300 atm, tốc độ quay 2
MS,
22]
thuốc trừ sâu hỗn hợp
Na2S0 4
trộn với
AIOx 1
ml/phút, đưa vào cột PX-
21 /c 18, giải hấp với 10
ml hexan/ CH2CI2
TOFMS
14
Phương pháp chiết lỏng được áp dụng đối với những mẫu đã đồng nhất từ cá và trứng
chim. Các hỗn hợp dung môi chủ yếu được dùng cho quá trình tách chiêt là hexan/axeton,
hexan/đietylete, hexan/điclometan, hexan và điclometan [14, 31, 32, 33, 34]. Dịch chiết
có thể được làm sạch thêm bằng đệm NaCl hoặc NaH2S04. Các lipít chủ yếu sẽ bị phá
hủy bởi axit suníìiric đặc. Mấu mô cá đồng nhất có thể được chiết cùng với hexan và sau
đó là axeton [35].
Phương pháp chiết soxhlet đã được áp dụng cho các mẫu mô người và cá. Dung môi chiết
được sử dụng cho loại mẫu này thường giống hệ dung môi sử dụng cho đối tượng mẫu

trầm tích như toluen, hexan và hỗn hợp hexan/axeton. Thời gian chiết khoảng từ 4-24
giờ [16, 19, 28]. Hiệu suất thu hồi của PBDEs trong cá và động vật có vú dưới biển đạt
hơn hơn 70% [19].
Phương pháp chiết pha rắn (SFE) đã được sử dụng trong quá trình chiết PBDEs của mỡ
cá voi, sử dụng bẫy pha rắn C18. Mầu đã đồng hóa được trộn với ôxít nhôm như là một
tác nhân giữ mỡ. Thời gian chiết là 20 phút ở 40 °c và 281 bar. Các chất phân tích được
bẫy bằng cách bị hấp phụ vào pha rắn C18, sau đó được giải hấp sử dụng hexan và
diclometan. Thời gian chiết được giải hạn trong 20 phút để giảm hàm lượng lipít bị chiết
ra khỏi mẫu vào dung môi. Hiệu suất thu hồi của các chất chuẩn đồng vị đánh dấu l3C
dao động trong khoảng 83-153% [35].
Bàng 2.2. Chiết, hấp thụ và phân tích các mẫu lỏng
Mấu
phân tích
Xử lý ban đầu Quy trình Làm sạch
Phân
tích
Tài
liệu
Sữa Trộn lOml sữa với lOml Nhồi hỗn hợp 1. 5 g nhôm ôxit giải hấp GC-EI- [ 12]
người,
axit fomic và 5g Iipit
vào cột, rửa với với hexan, cất phân đoạn
MS
PBDEs
5000
40 ml
20-30 mi
Me0H/H20 , 2. Cột silic, 0,6 g, giải hấp
30/70, 40 mi
với 5 ml hexan/CH2Cl2,

Me0H/H20 , 1/1 75/25 sau đó rửa với 4 ml
và 60 ml
hexan và 5 ml hexan/
MeOH/CHCl3/he
CH2C12, 75/25
xan, 1/ 1/ 1, giải
3. GPC, 9 g biobeads S-X3,
hấp với 90 ml
giải hấp với hexan/ CH2CI2,
ACN cất phân đoạn 28-38ml
Xử lý với H2SO4 đặc
Sữa
Xử lý bằng xit fomic/2- Chiết với 2 lần
l.Cô đặc tới 30jil
Cột mao
[13]
người,
propanol (4/1) trong bể hexan/aceton, 1/1 2. Dần xuất hóa bàng
quản
PBDEs
ultrasonic, pha loãng với diazoImetan, làm bay hơi
kép-GC-
nước/propanol, 19/1 phần hóa chất dư ECD
15
Mẩu
phân tích
Xử lý ban đầu
Quy trình
Làm sạch
Phân

tích
Tài
liêu
Huyết Xử lý với HC1 và 2-
Chiết 2 lần với
1. Rửa bời KOH 0,5M
GC-NCI- [38]
thanh,
propanol MTBE/aceton,
trong EtOH 50%
MS
PBDEs
1/1 2. GPC, hexan/CH2Cl2) 7/3,
giải hấp
3. Cột gel silic, 0,5 g, giải
hấp với CH2CI2
4. HPLC, cột NO2, giải hấp
bằng hexan
Máu cá,
Làm biến chất bỏri HC1 và
Chiết với 1. Phân đoạn bởi KOH
GC-ECD [38]
PCBs,
2-propanol
hexan/MTBE trong EtOH 50%
và GC-
PBDEs,
2. GPC, hexan/CH2Cl2, 7/3, MS
DDT,
giải hấp

HCB, và
3. Cột gel silic, 0,5 g, giải
các sản
hấp với CH2CI2
phẩm
4. HPLC, cột NO2, giải hấp
chuyển
bang hexan
hóa
Máu lỏng
PBDEs được phân tích chủ yếu trong các mẫu lỏng, bao gồm nước thải, huyết thanh và
sữa người. Các phương pháp chiết mẫu lỏng được tóm tắt ở bảng 2.2.
Phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) hai lần với hỗn hợp hexan và axeton đã được sử
dụng để xác định PBDEs trong mẫu sữa người. Phần chiết sau đó được xử lý với axit
suníuric đặc để loại bỏ lipít và PBDEs được tách ra khỏi phân đoạn các hợp chất PCBs sử
dụng cột silica [13].
PBDEs cũng đã được chiết từ sữa người cùng với một hỗn hợp chất gien poliphilic và
axit íòcmic. Những mẫu sữa kết hợp chặt chẽ với chất gien khi lắc mạnh mẫu này với
hỗn hợp chất gian poliphilic và axit íocmic trong 2,5 giờ. Hỗn hợp này được chuyển
sang một ống thuỷ tinh và sau đó các tạp chất được loại bỏ khỏi hỗn hợp bằng các hỗn
hợp nước và metanol, metanol/ điclometan/ hexan. Hiệu suất thu hồi của PBDEs dao
động trong khoảng 86- 102% [12].
LLE cũng được sử dụng để xác định PBDEs trong những mẫu huyết thanh. Axit
hyđrôcloric và 2-propanoI được thêm vào mẫu thử sau đó PBDEs được chiết ra bởi
hexan/MTBE, và pha hữu cơ được rửa bàng KCI 1% [38]. LLE cũng được áp dụng cho
16
những mẫu nước sông và nước biển với việc sử dụng hexan làm dung dịch chiết sau khi
đã thêm vào 1 lượng nhỏ aceton [35].
2.3.2. Làm sạch dịch chiết
Dịch chiết, đặc biệt là dich chiết thu được bằng phương pháp chiết soxhlet hoặc các

phương pháp chiết lỏng, thường rất bẩn để có thể phân tích ngay cho đối tượng chất phân
tích là PBDEs. Để xác định các hợp chất cơ brôm ở lượng vết, dịch chiết cần phải trải
qua qui trình làm sạch gồm nhiều bước. Một qui trình làm sạch riêng biệt là không cần
thiết. Thay vào đó, khi cần thiết, các bước làm sạch có thể được thực hiện trong quá trình
chiết. Ví dụ, mẫu thử có thể được trộn với bột đồng để loại bỏ lưu huỳnh khỏi mẫu (mẫu
trầm tích), hoặc nhôm oxit được dùng để tách lipít khỏi mẫu (mẫu sinh học). Hơn nữa,
dịch chiết có thể tiếp tục được làm sạch hoặc phân tách bàng việc sử dụng bẫy pha rắn
[17, 39, 35].
Loại bỏ lỉpit từ sản phẩm chiết của mẫu sinh học
Sản phẩm chiết của các mẫu thử sinh học thường chứa hàm lượng lipit cao và các lipit
này cần bị loại bỏ trước khi mẫu được bơm trên thiết bị GC để phân tích các PBDEs. Vì
nồng độ các chất cần phân tích thường liên quan đến hàm lượng lipit có trong mẫu, nên
cần xác định hàm lượng lipit trong mẫu đi đôi với việc phân tích các hợp chất này.
Axit suníìiric thường được dùng để loại bỏ lipít trong mẫu; tuy nhiên phương pháp này
cũng có thể phá huỷ một vài hợp chất cần phân tích. Nhôm oxit sẽ ít gây ảnh hưởng đến
các hợp chất cần phân tích hơn; hơn nữa chúng cũng được sử dụng để làm sach dịch chiết
mẫu trầm tích, sắc ký thẩm thấu qua gien (GPC) cũng là một phương pháp được lựa trọn
nhàm loại bỏ lipít ra khỏi mẫu [5, 22, 25], tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém và
thường được áp dụng để phân tích một số lượng mẫu đáng kể. Cột ílorisil có thể được
cùng sử dụng để loại bỏ một cách có lựa chọn hơn các hợp chất lipít [14].
Phân đoạn mẫu
Cột silica và cột ílorisil thường được sử dụng cùng với cột ôxít nhôm để tách dịch chiết
thành các phân đoạn tương ứng với các hợp chất phân tích khác nhau, sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) cũng có thể được sử dụng để làm sạch mẫu và tách các phân đoạn dịch
chiết.
Các bước làm sạch tương đối đơn giản đã từng được sử dụng trong một vài phương pháp
phân tích các hợp chất PBDEs. Khi xác định các hợp chất PBDEs trong mẫu sữa người,
các đồng đẳng chính của PCBs trong dịch chiết LLE đã được tách ra bàng cách sử dụng
cột silica [13]. Với phương pháp tương tự, toxaphene và chlorđan đã được tách ra khỏi
dich chiết là mẫu mỡ hải cẩu khi phân tích PBDEs. Dịch chiết lỏng sau khi được sử lý

với axit suníuric trong hexan được làm sạch trên côt silicagelusau khi PCBs đươc rửa giải
-"'A h QC 3 U Ố C GIA HA NO'
17 ?JNG TAM Th'ÕNG TIN THƯ yiẺN
L. OOO&OOOCUOé
khỏi cột bằng hexan, hợp chất phân tích được rửa giải khỏi cột bằng hỗn hợp hexan/ete
dietyl [26, 27]. Với dịch chiết soxhlet từ các động vật cỏ vú, sau khi được xử lý bởi axit
sunfuric DeBDE cũng được giải hấp từ cột silicagel bằng iso octan, và các hợp chất
PBDEs khác được giải hấp bàng đietyl ete/iso octan [28]. Tương tự, cột nhôm đã được sử
dụng cho các dịch chiết soxhlet khi xác định PBDEs trong các mẫu trầm tích. Hỗn hợp
dịch chiết aceton/hexan được đưa qua cột nhôm và các PBDEs sau đó được rửa giải khỏi
cột bằng hexan [16].
Quá trình làm sạch gồm ba bước đã được ứng dụng để phân đoạn PBDEs trong mẫu sữa
sau khi được chiết bởi axeton nitrin. Đầu tiên dịch chiết được làm sạch trên cột ôxit nhôm,
dung dịch rửa giải hexan ở phân đoạn 2 sau đó được làm sạch tiếp trên cột silicagel và
hợp chất cần phân tích được rửa giải bởi hỗ hợp điclometan/hexan sau khi cột đã được
làm sạch bởi hexan [12].
Dịch chiết LLE của mẫu huyết thanh được làm sạch bởi quá trình tách phân đoạn với
dung dịch KOH etanol. Phân đoạn trung tính được sử lí bằng H2SO4 đặc và được dẫn qua
cột silica gel/ axit sunfuric cùng với hexan [38].
2.4. Phương pháp phân tích
Phần lớn các phương pháp phân tích sử dụng cho việc xác định các hợp chất BFRs trong
mẫu môi trường là cho các cấu tử có trọng lượng phân tử thấp (nhỏ hơn 800). Do các hợp
chất này là hỗn hợp của nhiều đồng đẳng nên phương pháp sắc ký khí thường được sử
dụng để phân tích; điều này hạn chế việc phân tích các đồng đẳng có khối lượng phân tử
lớn. Vấn đề khó khăn thường gặp phải khi phân tích các mẫu môi trường là nhiều hợp
chất khác trong nền mẫu sẽ cùng bị rửa rải với chất phân tích gây ảnh hưởng đến quá
trình định lượng. Ví dụ rất nhiều các chất có mặt trong các mẫu trầm tích như: các chất
vô cơ như nguyên tố lưu huỳnh và các hydrocacbon tồn tại với hàm lượng cao hay hàm
lượng cao của chất béo trong các mẫu sinh, học sẽ gây ảnh hưởng đến việc phân tích các
hợp chất BFRs. Sự tồn tại của các hợp chất này trong mẫu đòi hỏi phải sử dụng những

thiết bị đo có độ chọn lọc cao như khối phổ sử dụng chương trình chọn lọc ion (MS/SIM).
hoặc quá trình làm sạch mẫu phức tạp, hoặc thậm chí cả hai điều kiện này. Nhìn chung,
cần cỏ một quá trình xử lý mẫu gồm nhiều bước cho các đối tượng mẫu này.
GC là kỹ thuật phân tích thông thường để xác định các PBDEs trong các mẫu môi
trường. Cột nhồi đã được sử dụng trong một vài nghiên cứu ban đầu [33]. Nhưng ngày
nay việc phân tích các hợp chất này được thực hiện hiệu quả hơn nhiều khi sử dụng cột
mao quản [40].
Phương pháp GC sử dụng để phân tích PBDEs trong các mẫu môi trường là tương tự như
phương pháp được phát triển cho việc phân tích PCBs. Tuy nhiên cần lưu ý là các PBDEs
18
chứa nhiều nguyên tử brôm hom cũng kém bền hơn so với PCBs tương ứng và do đó dễ bị
phân hủy ở nhiệt độ cao [41].
PBDEs chủ yếu được phân tích sử dụng cột OV-1, DB-5, Ưltra-2, SPSil-8 và SE-54 [12,
13, 29, 36 , 41]. Chiều dài của cột có thể từ 15-60 m. Những cột ngắn thường dùng để
xác định DeBDE.
MS và ECD đều có thể được sử dụng để phân tích các hợp chất PBDEs. Kỹ thuật ion hoá
va chạm điện tử (EI) và ion hoá hóa học âm (NCI) thường được ứng dụng với MS để
phân tích các hợp chất này. Sự kết hợp giữa MS và NCI sẽ làm tăng độ nhạy phát hiện,
đặc biệt với những hợp chất chứa nhiều hơn bốn nguyên tử brôm. Độ nhạy của kỹ thuật
NCI có thể cao hơn gấp 10 lần so với ECD [41]. Metan thường được sử dụng là khí phản
ứng. Tuy nhiên kết quả thực nghiêm khi phân tích một vài hợp chất cho thấy bằng việc sử
dụng amôni thay cho metan độ nhạy có thể tăng lên đến 80% [41]. So sánh kỹ thuật EI và
NCI trong sắc ký khối phổ GC-MS các nhà khoa học nhận thấy hai kỹ thuật này cho
những kết quả tương đương về khả năng đáp ứng, độ nhạy và giá trị định lượng [42]. Tuy
nhiên, phương pháp EI mang lại tính chọn lọc cao hơn do các hợp chất PBDEs được phân
tích dựa trên các ion phân tử hoặc các mảnh ion có khối lượng lớn. Hơn nữa, sẽ dễ dàng
hom cho việc lựa chọn các chất nội chuẩn khi sử dụng kỹ thuật GC-EI-MS.
3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.1. Nội dung nghiên cừu
Đề tài đã thực hiện các phần nghiên cứu sau nhằm đạt được các mục tiêu đã đề ra:

1/ Dựa trên các quy trình tham khảo đã được công bố tiến hành khảo sát và tối ưu hóa
quy trình phân tích các hợp chất PBDEs trong mẫu cá sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và
phương pháp phân tích GC-MS.
2/ Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích đối với đối tượng nghiên cứu là các mẫu cá lấy
tại sông Tô Lịch, thành phố Hà Nội.
3/ Đánh giá sơ bộ sự tích lũy của các các hợp chất PBDEs trong các mẫu cá tại các địa
điểm đã chọn.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
3.2.1.1. Hóa chất
* n-hexan loại tinh khiết phân tích (Trung Quốc), được cất lại trên cột cất cao 0,8 m,
lấy phân đoạn sôi ở 60 °c và được kiểm tra lại trên thiết bị GC-MS để đảm bảo
không chứa các hợp chất PBDEs.
* Axeton, ethyl axetat, axeton nitrin, axit sunfuric loại tinh khiết phân tích (Merck).
* Nước cất 2 lần, axeton và n-hexan (Trung Quốc) để rửa dụng cụ
* Muối khan Na2S 0 4 ,NaCl (Merk) (hoạt hóa ở 600 °c trong 4 giờ).
19
* Chuẩn đơn lẻ của 11 hợp chất PBDEs (BDE-28, 47, 49, 66, 85, 99, 100, 119, 138,
153, 154) nồng độ 2 ng/mL pha trong xyclohexan (Cambridge Isotope Laboratory
Inc., Mỹ).
* Chất đồng hành (Sr): PCB 209 nồng độ 100 ng/mL (Dr. Ehrenstorger, Đức).
* Chất nội chuẩn (IS): Perylene-di2 nồng độ 10 ng/|iL pha trong cyclohexane (Dr.
Ehrenstorger, Đức).
Các dung dịch làm việc được chuẩn bị bàng cách pha loãng dung dịch gốc bằng n-hexan.
Dung dịch gốc được bảo quản trong điều kiện thiếu ánh sáng ờ nhiệt độ dưới 4 °c không
quá 6 tháng trong tủ lạnh, dung dịch làm việc được bảo quản tương tự với thời gian
không quá 2 tháng.
3.2.1.2. Dụng cụ
* Chai đồng hóa 100 mL, các vial thủy tinh màu hổ phách 1,5 mL, 4 mL, 15 mL.
* Cốc thủy tinh và ống đong loại 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL.

* Bình tam giác loại 250 mL, 500 mL, phễu chiết 500 mL, bình cầu 250 mL.
* Pipet paster, micro pipet, phễu thủy tinh
* Dao, thớt, panh.
* Cột 44%H2S 04-Silica/LC-SI 12ml Tube.
* Khí mang He (độ tinh khiết 99,9999%).
Các dụng cụ bằng thủy tinh trước khi sử dụng đều được làm sạch bàng cách: rửa xà phòng,
siêu âm 30 phút, rửa bằng nước cất 2 lần, để ráo tự nhiên, sấy khô trong tủ sấy ở 105 °c, tráng
lại bàng acetone và n-hexan sạch trước khi sử dụng.
3.2.1.3. Thiết bị
* Máy say sinh tố (Philip, Nhật).
* Thiết bị đồng hóa mẫu chuyên dụng (Kika Labortechnike, Đức).
* Cân phân tích có độ chính xác 10'4g (Precisa, Thụy Điển).
* Máy ly tâm
* Bộ chưng cất phân đoạn có cột cất 0,8 m (Sigma-Aldrich, Mỹ).
* Thiết bị cất quay chân không (Buchi, Nhật Bản).
* Máy siêu âm (Cole Parmer, Mỹ), tủ sấy (Lenton, Anh), tủ hốt (Lapconco, Mỹ).
* Thiết bị đuổi dung môi thổi khí N2 (Eyela, Nhật Bản).
* Thiết bị phân tích sắc ký khí - khối phổ GCMS - QP 2010 với cột mao quản DB-1
(30 m X 0,25 mm X 0,25 |im) (Shimadzu, Nhật Bản).
3.2.2. Phạm vi nghiên cứu
20
Mầu cá đã được thu thập tại các địa điểm nghi ngờ có sự tồn tại của các hợp chất PĐDEs.
Địa điểm lấy mẫu là sông Tô Lịch, sông Nhuệ, nơi hàm lượng cao của các hợp chất PCBs
đã được ghi nhận.
• Thời điểm lấy mẫu: các mẫu cá được lấy vào tháng 06 năm 2009 tại đầu sông Tô Lịch
và đầu sông Nhuệ
• Số lượng mẫu: 8 cá thể cá rô phi, cá diếc, cá trôi, cá trê đã được thu thập tại đầu sông
Tô Lịch và sông Nhuệ (bảng 3.1.). Các cá thể cùng loại đã được đồng thể hóa để tạo
thành 4 mẫu cá riêng biệt (mẫu cá rô phi, mẫu cá diếc, mẫu cá trôi, mẫu cá trê.
Bảng 3. 1. Thông tin vê các mâu cá

STT
rp A /
Tên cá Đia điểm
Khối lượng (g)
Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm)
1 Rô phi
Sông Tô Lịch
58,81
14,0 6,0
2
Rô phi
Sông Tô Lịch
63,34
13,5 6,0
3 Rô phi Sông Tô Lịch 59,20 13,7
6,9
3 Diếc 1 Sông Nhuệ 43,95 13,5
5,0
4 Diếc 2
Sông Nhuệ
38,74 13,2
4,5
5 Trôi 1
Sông Nhuệ
67,47 19,0
4,5
6 Trôi 2 Sông Nhuệ
63,07
18,0
4,6

7 Trê 1 Sông Nhuệ 85,79
21,0
3,5
8
Trê 2 Sông Nhuệ
67,35 19,5 3,0
Hình 3.1. Mau cá rô phi thu thập tại sông Tô Lịch
3.2.3. Chuẩn bị mẫu
3.2.3.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu cá được đánh bắt tại địa điểm lấy mẫu. Mầu cá đều còn tươi, được gói trong
giấy nhôm và bảo quản lạnh trong suốt quá trinh vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm.
21
Sau khi đưa mẫu về phòng thí nghiệm, tién hành đo kích thước (chiều dài, chiều rộng) và
đo khối lượng của từng mẫu. Tiến hành tách rời phần thịt và gan và đem cân, lấy phần
thịt xay nhuyễn bằng máy say sinh tố. Mau sau đó được bảo quản trong tủ lạnh sâu ở -20
°c đến khi đem phân tích.
3.2.3.2. Tách chiết và làm giàu sơ bộ
Quá trình tách chiết và làm giàu sơ bộ được thực hiện dựa theo các tài liệu đã công bố [1, 3,
16]: Cân chính xác 2 g mẫu cá (ướt) đã được xay nhuyễn cho vào cốc đồng hóa 100 mL,
thêm 50 ml acetonitrile và 100 ppb các chất đồng hành PCB 209 vào rồi tiến hành đồng
hóa trong 5 phút, tiếp tục ly tâm 5 phút. Sau đó gạn dịch chiết vào bình cầu 250 ml.Thêm
20 ml acetonitrile vào phần xác cá còn lại, lắc đều, ly tâm 5 phút và gạn tiếp phần dịch
chiết vào bình càu 250 ml trên, cô cất quay chân không để làm giàu về khoảng 5 mL.
3.2.3.3. Làm sạch và làm giàu dịch chiết
Dịch chiết từ nền mẫu sinh học thường chứa nhiều tạp chất như Iipid, acid béo, amin, rượu
Do đó làm sạch dịch chiết là vô cùng quan ữọng, kỷ thuật chiết pha rắn đã được sử dụng để
loại bỏ các tạp chất này cũng như để làm sạch dịch chiết. Trong nghiên cứu này, quy trinh làm
sạch mẫu sẽ được tối ưu hóa, bao gồm: lựa chọn dung môi chiết, rửa xít, tối ưu thể tích tách
chiết mẫu qua cột SPE.
Hình 3.2. Hệ chiêt pha rắn SPE với cột 44% sulíuric acid impregnated silicagel

22
Cân 2 g mẫu thịt cá vào chai thủy tinh 100 mL
+ 50 ml acetonitrile
■+ 50 nl PCB 209 20 ppm
Đông hóa 5 phút. Ly tâm 5 phút. Gạn. Cô cât quay chân không vê 5
+ Chuyên vào phễu chiết 500 mL chứa 250
mL nước và 10 g NaCI
Chiêt với 250ml H2O
+ 50 mL n-hexane:ethyl acetat (3:2)
Lắc chiết lần 1 trong 10 phút
Lắc chiết lấn 2 ừong 10
4

_____
„
________
*
__________
,
__
Cô cất quay chân không về 1
+ 50 mL n-hexane:ethyl acetat
+ Làm khan bằng 10 g Na2S 0 4
ĩ
+ 10 mL n-hexane để chuyển dung
Cô cât quay chân không vê 1
+ 10 mL n-hexane, chuyển dung môi
Cỏ cât quay chân không vê 1 ml
Rửa axỉt lân 1
+ lml axit H2SO4 98%

+ lml axit H2SO4 98%
Rửa axit lân 2
vê 500|iL
Qua cột 44%
+ Hoạt hóa cột 44%H2S 0 4 bằng
20ml n-hexane
-I2SO4. Rửa giải
bằng 12 mL n-hexane
Thêm 100 |il hỗn hợp nội chuẩn 5 ppm
Cô băng N2 vê 200|iL
+ Đinh mức vế 1 mL
Bơm lên GC-MS
Hình 3.3. Quy trình phân tích PBDEs trong mẫu cá
- Làm sạch mẫu bằng bước rửa axit: Mẩu sau khi đã được chuyển về dung môi n-hexan, được
làm giầu về 2-3ml sẽ được chuyển vào lọ 15ml, cho lml axit H2SO4 98% lắc đều và để yên 5
phút cho 2 phân lớp axit và dung môi được phân lớp rõ ràng. Thu lấy phần lớp dung môi cho
vào một vial.Phần lóp axit tiếp tục thêm 3ml n-hexane lắc chiết lần 2. Thu lấy phần dung môi
vào vial đựng dung môi chiết lần 1.
23
- Làm sạch bàng cột chiết pha rắn 44% H2SO4: Sau khi làm giàu mẫu về 500 pj.l. Hoạt hóa cột
bằng 20ml hexane. Chuyển toàn bộ mẫu vào trong cột và rửa giải bằng 12 ml hexane với tốc
độ 1-2 giọưgiây
Qui trình phân tích PBDEs trong mẫu cá được mô tả tổng quát tại hình 3.3.
3.2.4. Phương pháp phân tích
3.2.4.1. Điều kiện phân tích trên GC-MS
Việc phân tích định tính và định lượng các hợp chất PBDEs được tiến hành trên thiết bị
GCMS - QP 2010 của Shimadzu, Nhật Bản. Các thông số dưới đây và các thông số trong
bảng 3.3 và 3.4 trình bày điều kiện phân tích mẫu trên thiết bị GC-MS. Hình 3.4 biểu
diễn sắc đồ (SIM) thu được cùa hỗn hợp chuẩn PBDEs đo trên thiết bị GCMS-QP2010.
* Điều kiện làm việc của thiết bị sắc ký:

- Cột tách: cột mao quản DB-1MS
(30 m X 0,32 mm X 0,25 |im).
- Khí mang He (độ tinh khiết 99,9999%).
- Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 270°c
- Nhiệt độ lò cột: 60°c.
- Kiểu bơm mẫu: splitless, tỉ lệ chia 5:1.
- Tốc độ dòng: 5 ml/phút
* Điều kiện làm việc của thiết bị khối
phổ:
- Nguồn ion hóa: EI (lon hóa trên cơ sở bắn
phá điện tử).
- Nhiệt độ nguồn ion hóa: 230 °c.
- Nhiệt độ interface: 290 °c.
- Thời gian cắt dung môi: 8 phút.
- Hiệu thế detector: 1,35 kv.
- Chế độ phân tích lựa chọn mảnh (SIM).
Bàng 3.3. Chucmg trình nhiệt độ của thiết bị sắc ký
Tốc độ
(°c/phút)
Nhiệt độ cuối
(°C)
Thòi gian giữ
(phút)
-
60
2
10 200
2
20 300
25

Tổng thời gian: 48 phút
Bàng 3.4. Thời gian lưu và chế độ quan sát ion chọn lọc đối với các PBDE
Đồng loại PBDE
lon mảnh đặc
trưng (m/z)
Iod mí
sánh 1
mh so
m/z)
Thời gian
liru (phút)
PBDE28
408
406
248
19.47
PBDE49
326 486
328
20.96
24
Đồng loại PBDE
lon mảnh đặc
trung (m/z)
lon mì
sánh (
ính so
m/z)
Thời gian
liru (phút)

PBDE 47
326
486 328 21.21
PBDE 66 326 486 328 21.41
PBDE 100
408
564 406
22.23
PBDE 119
408 564
406 22.31
PBDE 99 408 564 406
22.49
PBDE 85 408
564
406 22.92
PBDE 154
484
486 644
23.21
PBDE 153
484
486 644
23.58
PBDE 138
484
486 644
24.10
PCB 209
498 500 496

23.03
Perylene-dio
264
260 265
22.88
3.2.4.2. Phân tích định tính và định lượng bằng GC-MS
* Phân tích định tính: Dựa vào thòi gian lưu của chất phân tích, kết họp phổ khối đặc trung và
cường độ vạch phổ của chất chuẩn hoặc chất phân tích với thư viện phổ. Để xác định thời
gian lưu và mảnh khối phổ đặc trưng của từng chất phân tích PBDE, chất đổng
hành và chất nội chuẩn nghiên cứu, chúng tôi tiến hành quét phổ nồng độ 2 ng/ml
các chất phân tích ở chế độ SCAN trên thiết bị GCMS - QP 2010.
* Phân tích định lượng: Sử dụng phương pháp nội chuẩn
Phương pháp nội chuẩn dựa trên việc so sánh cường độ tín hiệu của chất cần phân tích
với tín hiệu của chất có tính chất tương tự đối với thiết bị như chất cần phân tích. Chất đó
được gọi là chất nội chuẩn. Chất nội chuẩn được đưa vào mẫu cần phân tích với nồng độ
25
đã biết. Khi tính toán, phần mềm của thiết bị sẽ dựa vào tỉ lệ tín hiệu của chất cần phân
tích với chất nội chuẩn để tính ra nồng độ. Phương pháp này có độ chính xác cao hơn vỉ
nó loại bỏ được các yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu phân tích (yếu tố nền). Ngoài ra, ta
cũng không cần chú ý đến thể tích mẫu bơm lẽn máy một cách chính xác.
3.2.5. Phương pháp đánh giá
a) Hiệu quả quy trình phân tích sẽ được đánh giá dựa trên độ thu hồi và độ lặp lại của các
chất cần phân tích trên các loại mẫu trắng và mẫu thật.
b) Giới hạn phát hiện của thiết bị (LOD) và giới hạn đinh lượng của thiết bị (LOQ).
LOD - là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà thiết bị phân tích còn cho tín hiệu
phân tích có ý nghĩa so với đường nền.
LOQ - là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng
được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng so với đường nền.
LOD và LOQ được xác định bằng sai số của các lần bơm lặp lại dung dịch có nồng
độ nhỏ nhất của chất phân tích mà thiết bị còn cho tín hiệu lớn hơn giá trị 3 S/N

(signal/noise).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi bơm dung dịch hỗn hợp các hợp chất PBDEs có nồng
độ 2 ng/ml (hay 2 ppb) lên máy. Thể tích bơm mẫu là 2 Ịil, mẫu được bơm Ịặp lại 5 lần.
Từ đó, tính ra được độ lệch chuẩn SD theo công thức:
Từ đó, tính được giới hạn phát hiện (quy cho 2 g mẫu cá): LOD = 3 X S.D. (ng/g)
c) Đường chuân phân tích
PBDEs tồn lưu trong các mẫu sinh học thường ở hàm lượng rất thấp nên chúng tôi tiến
hành dựng đường chuẩn trong khoảng nồng độ từ 2 ppb đến 10 ppb.
d) Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu cá: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu
cá được tính theo công thức sau:
c m|u : hàm lượng chất phân tích trong mẫu thật (ng/g mẫu tươi).
c may : hàm lượng chất phân tích đo được trên thiết bị (ng/mL).
Vguôi : thể tích của mẫu sau các bước xử lí (mL).
mmẫu: khối lượng mẫu tươi.
H (%): hiệu suất thu hồi của chất đồng hành.
Và giới hạn định lượng (quy cho 2 g mẫu cá):
LOQ = 10 X S.D. (ng/g)
mầu
xioo%
Trong đó:
26
!
Một mẫu trắng được tiến hành kèm theo trong mỗi lần thí nghiệm để kiểm tra sự nhiễm
bẩn của hóa chất và dụng cụ ở phòng thí nghiệm.
Hàm lượng tổng PBDEs được tính bàng tổng của 11 đồng loại PBDE (BDE-28, 47, 49,
66, 85,99, 100, 119, 138, 153, 154).
e) Hàm lượng mỡ trong mẫu cá
Các hợp chất PBDEs đều là các chất có Kow lớn, vì vậy chúng có khả năng hòa tan và tích
lũy lâu dài trong mô mỡ của động vật. Hàm lượng tương đối cao của các chất béo trong
thân cá là môi trường tốt cho việc tích lũy các hợp chất PBDEs. Để xác định hàm lượng mỡ

trong thân cá, chúng tôi tiến hành như sau:
- Cân 10 g mẫu vào cốc đồng hóa (rrica), thêm 50 mL acetonitril, đồng hóa 5 phút.
- Chuyển dung dịch sau khi đồng hóa vào phễu chiết, thêm 30 mL hỗn hợp ethyle
acetate:n-hexan (2:3, v/v), 17 g muối NaCl, 250 ml nước cất rồi tiến hành lắc trong 15
phút, chiết lấy lớp hữu cơ bên trên vào bình cầu. Lặp lại quá trình lắc chiết như trên.
- Cô dung dịch trong bình cầu về khoảng 1 ml bẳng phương pháp cất quay chân không,
chuyển dung môi bằng 10 mL n-hexane và cô về 2 ml, chuyển dung dịch này sang cốc 50
ml và tráng bằng 10 ml n-hexan rồi sấy ở nhiệt độ 100 °c ừong khoảng 6 tiếng.
- Cân cốc trước khi có dung dịch (m0) và sau khi sấy (rtii).
- Hàm lượng mỡ được tính theo công thức sau: %mmỡ = — — m° 100%
m ca
f) Sự tích lũy của PBDEs trong cá: Mức độ tích lũy của PBDEs trong cá tại các địa điểm
nghiên cứu đã được đánh giá dựa trên các kết quả phân tích thu được.
3.2.6. Phương pháp xử lý sổ liệu thỉ nghiệm
Kết quà thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê, sử dụng các phần mềm
Excel 2003 và Origin 6.0.
4. Kết quả và thảo luận
4.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Tiến hành bơm lặp lại 5 lần hỗn hợp chất phân tích và chất đồng hành nồng độ 2 ng/ml
lên thiết bị GCMS - QP2010. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1.
- Giới hạn phát hiện (LOD) giao động từ 0,04 ng/g đến 0,16 ng/g
- Giới hạn định lượng (LOQ) giao động từ 0,13 ng/g đến 0,52 ng/g.
27
Bảng 4.1. Giới hạn phát hiện vả giói hạn định lượng của thiết bị (n = 5)
Tên chất N
ồng độ
trên mái
ỵ (ng/mL)
SD RSD
(%)

LOD
(ng/g)
LOQ
(ng/g)
Lần 1 Lần 2
Lần 3 Lần 4
Lần 5
PBDE28
2,03 1,98 2,05
2,00 2,01
0,03 1
0,04
0,13
PBDE 49
2,14
1,94 2,01 2,09
2,12 0,08 4
0,13
0,42
PBDE47 2,05
1,98
2,02 2,09
2,02 0,04 2
0,06
0,19
PBDE 66
2,05
1,94 1,99 1,99
2,04 0,04 2
0,07 0,22

PBDE100
2,08
1,91
2,02
2,05
1,97 0,07 3
0,10
0,33
PBDE 119
1,96 2,03
1,98 2,02 2,08
0,04
2
0,07
0,22
PBDE99
2,06
1,96 1,99
1,94 1,94 0,05
3 0,08 0,26
PBDE 85
2,09 2,16 2,09
2,12 2,08 0,03 2
0,05 0,17
PBDE 154
2,20
1,93 2,09
1,98 2,08 0,10
5 0,16
0,52

PBDE 153
2,17 2,01
2,02
2,00
2,05 0,07 3
0,10
0,34
PBDE 138
2,28 2,08
2,12
2,10 2,07
0,09
4
0,13 0,44
4.2. Khảo sát ioại dung môi chiết mẫu cả
Các hợp chất PBDEs là các hợp chất kém phân cực, đồng thời tương tác mạnh với nền
hữu cơ của mẫu, vì vậy việc tách hoàn toàn chúng ra khỏi nền mẫu sinh học là khá phức
tạp. Việc lựa chọn dung môi chiết mẫu ban đầu thích hợp đóng một vai trò rất quan trọng.
Dựa vào các tài liệu đã tham khảo [1,4, 16, 46] chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu suất thu
hồi các chất phân tích trên nền mẫu thực (mẫu cá) sử dụng 2 loại dung môi khác nhau là
n-hexan và axeton nitrin. Kết quả so sánh khi sử dụng 2 loại dung môi để chiết mẫu được
trình bày ở bảng 4.2. và hình 4.1.:
Bảng 4.2. Hiệu suất thu hồi sử dụng 2 loại dung môi chiết lả n-hexan và axeton nitrin
Tên chất
Nồng độ
thêm chuẩn (ng/g)
Hiệu suất thu hồi (%)
n-hexan
axeton nitrin
PBDE-28

5
3
90
PBDE-49
5
0
67
PBDE-47
5
11 70
PBDE-66
5
0 70
PBDE-100
5
0 68
PBDE-119
5
0 102
PBDE-99
5
0 105
PBDE-85
5
0
85
PBDE-154
5
3
73

PBDE-153
5
0
74
PBDE-138
5
0
68
PCB-209
5
9 68
28