Nghiên cứu khả năng ứng dụng Lectin và các chất có hoạt tính sinh học khác từ nguồn động vật trong chuẩn đoán một số bệnh ung thư và nhiễm trùng ở ngườ i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
ĐỂ TÀI:
NGHIÊN c ú u KHẢ NĂNG ÚNG DỤNG LECTIN VÀ CÁC
CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC KHÁC TỪNGUổN ĐỘNG
VẬT TRONG CHẨN ĐOÁN MỘT s ố BỆNH UNG THƯ VÀ
NHIỄM TRỪNG Ở NGƯỜI
Mã sỏ: QT- 98- 10
Chù trì (lề tài: nùi Hiương Thuận
Các rán hộ tliam iỊÍo: - Nguyễn Hạnh Phúc.
- Cung Thị Tý
BÁO CÁO TÓM TÁT
1.Tên đề tài:
Nghiên cứu khả năng ứng dụng lectin và các chất có hoạt tính sinh học khác
từ nguồn động vật trong chẩn đoán một số bệnh ung thư và nhiễm trùng ở người.
Mã số: QT- 98- 10
2 .CK1Í trì đề tài: PTS. Bùi Phương Thuận.
3.Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
-Tách và tinh chế lectin, cũng như một số chất có hoạt tính sinh học khác
(proteinaz, chất ức chế proteinaz ) rừ động vật.
-Sử dụng chế phẩm thu được vào nghiên cứu ứng dụng trong miễn dịch học,
nhằm tiến tới cliỊẩn trị một số bệnh hiểm nghèo ở người.
4.Kết quả đạt được:
-Đã thu thập mẫu sam Tưc.hypìeus tridentatus từ vùng biển Sầm sơn (Thanh
hoá).
Từ huyết thanh sam đã tinh chế được lectin nhờ kỹ thuật sắc ký ái lực trên cột ỊgG-
sepharose 4B. Chê phẩm đã được kiểm tra độ tinh sạch và đã xác định khối lượng
phân tử của các bãng polypeptit bàng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamit có
SDS trong điều kiện có chất khử. Các kết quả nhận được cho thấy chế phẩm lectin
đã được giải phóng khỏi nhiều protein tạp và đạt độ tinh sạch cao, về cấu tạo được
gồm ba phần dưới đơn vị tương ứng khối lượng 27, 68 và 72 kDa.

-Đã sử dụng lectin sam làm kháng nguyên gắn bản trong các thử nghiệm
trên cơ sở kỹ thuật ELLA (xét nghiêm miễn dịch liên kết enzym-lectin) trên các
mẫu huyết thanh người. Chế phẩm lectin sam (cũng như lectin ở dạng thô) biểu thị
tính đạc hiệu tương tác vói globulin miễn dịch (kháng thể) lớp IgG và không nhận
biết IgA.
Đã tiến hành các thứ nghiệm về khả năng tiên lượng bệnh của lectin sam dựa
trên tính đặc hiệu tương tác này. Các xét nghiệm được tiến hành theo nguyên tắc:
sự thay đổi về hàm lượng và thành phẩn cua IgG huyết thanh trong các trạng thái
sinh lý khác nhau có thể được coi là dấu hiệu cận lâm sàng và được sử dụng để
chẩn đoán biểu hiện của bệnh.
i
Đã cộng tác với các cơ sở y tê (các Bệnh viện và Viện Nghiên cứu Trung
ương) để thu thập và xử lý các mẫu huyết thanh người khoẻ mạnh bìiứi thường
(mẫu đối chứng) và các mẫu huyết thanh của bệnh nhân một số bệnh thuộc loại
nan y (mẫu bệnh phẩm), dùng cho các xét nghiệm miễn dịch học.
Việc sử dụng chế phẩm lectin sam trong xét nghiệm huyết thanh để nghiên
cứu ung thư cho thấy: hàm lượng IgG ỏf người bị bệnh ung thư gan và ung thư máu
không có biến động khác thường, còn ở người bị ung thư vú có giảm đi. Khi sử
đụng lectin sam thô đã phát hiện có sự giảm nhẹ hàm lượng IgG ở huyết thanh
bệnh nhân ung thư máu.
Trong xét nghiệm huyết thanh để nghiên cứu các bệnh do nhiễm virut trên
cơ sở sử dụng chế phẩm lectin sam, kết quả cho thấy hàm lượng IgG ở các bệnh
Iihân bị viêm não giảm 18%, còn ở bệnh nhân bị sởi tãng 27%. Triển vọng có thể
sử dụng lectin sam tliay thế cho kháng nguyên virut sởi dể gắn bản trong kỹ thuật
xét nghiệm thường quy của các phòng thí nghiệm hoá siiih và miễn địch.
Trong nghiên cứu các bệnh tự miễn, việc sử dụng lectin sam thô cho phép
phát hiện sự tăng mạnh hàm lượng IgG so với bình thường ở người bệnh lupus ban
đỏ (30%) và người bệnh viêm thận (26-28%). Kết quả thu được phù hợp với chẩn
đoán của bệnh viện dựa trên các xét nghiệm hoá sinh phức tạp và tốn kém hơn,
Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy khả năng sử dụng lectin sam trong tinh

chế và định lượng IgG, phục vụ cho nghiên cứu và liệu pháp miễn dịch, dùng để
chẩn đoán và tiến tới chữa trị một sô bệnh hiểm nghèo ở người.
- Đã hoàn thành và gửi 1 bài báo để đãng trên tạp chí Di truyền học và ứng
dụng. Bài đã được nhận và sẽ được công bố trong số 4/1999.
-Đã hướng dẫn ba sinh viên làm iuận án tốt nghiệp. Hai trong số đó (Hoàng
Nhật Sơn và Trần Quỳnh Hoa) đã bảo vệ đạt loại giỏi (9 điểm). Sinh viên thứ ba
(Nguyễn Trọng Tuệ) đã có báo cáo đoạt giải ba tại Hội nghị Khoa học Sinh viên
của Khoa năm 1999, đã hoàn thành luận án và sẽ bảo vệ vào năm 2000.
S.Tình hình sử dụng kinh phí của dề tài:
Kinh phí được cấp 8 000 000 đ
Kiiih phí đã chi 8 000 000 đ
Trong đó:
Công tác phí
300 000 đ
Thuê hợp đổng
1 800 000 đ
Chi phí hoạt động chuyên môn
5 400 000 đ
Đánh máy, chụp tài liệu 180 000 đ
Quản lý phí cơ sở
320 000 đ
Tổng cộng
8 000 000 đ
Co' quan quiỉn lý (lề tài
III
OUTLINE REPORT
Ỉ.Name of subject:
Study on the possible application of animal lectins and other biologically
active substances in the diagnoses of some human cancers and infection diseases.
Code registered: QT- 98- 10.

2.Subject manager: Dr. Bui Phuong Thuan.
3.()bjective and subject matters of study:
-Isolating and purifying the lectins and other biologically active substances
(proteases, proteinase inhibitors ) from animals.
-Using these substances in research for the diagnoses and treatment of some
serious human diseases.
4.Results achieved:
-The lectin from Vietnam horseshoe crab ('Tơchypìeus h identatiis)
hemolymph was purified by the affinity chromarography on IgG-sepharose
column.
-The lectin purified (as raw lectin in native hemolymph) was shown to
interact specifically with immunoglobulins (antibodies) of class IgG, while was not
bound to those of class IgA. For this specificity, the lectin was used as antigen ill
the Enzyme- Linked Lectinosoi bent Assay (ELLA) ill Older to screening IgG ill
human serum. The change ill the content and composition of these antibodies in
different physiological conditions can be used as clinical index for diagnosis of
đi seases.
For the cancer study, the use of purified lectin in the assays showed rhat the
IgG content in the liver cancer and leukemie serum was not changed, while that of
breast cancer serum diminished. The assays with raw lectin showed some IgG
reduction in the leukemie serum.
For Ihe study on virulent diseases, the use of purified lectin revealed the 18%
reduction of IgG content ill the cases of encephalitis and the 27% increase of that
ill the cases of measles.
The study on autoimmune diseases with raw lectin showed that the content of
IgG increased on 30% in the cases of Systemic Lupus Erythematosus and 26-28%
in the cases of kidney inflamation.
The obtained results showed the possibility to use Tơchypìeus ti identatu.s
lectin in the purification and the quantity determine of IgG for the reseach and
immuno-therapy purposes, in which it will serve as a tool in diagnosis and

treatment of diseases.
Subject Manager
Bill Phitong Thuan
V
MỤC LỤC
Trang
Mở đầu í
Nguyên liệu và phương pháp '2.
Kết quả và thảo luận ổ
Kết luận 2Ẵ
Tài liệu tham khảo
Phụ lục 30
vi
MỞ ĐẦU
Việc nghiên cứu cấu trúc, chức năng và vai trò của các chất liên kết đường ớ
màng đã được đẩy mạnh trong những Iiãm gổĩi đây nhờ sử dụng lectin [4J. Lectin là
những protein hoặc glycoprotein có hoạt tính sinh học, được phân bô phổ biến
trong sinh giới. Tuy không có nguồn gốc miễn dịch, nhưng lectin lại có khả năng
liên kết đặc hiệu với các loại đường và hợp chất chứa đường luôn có trên bề mặt (ê
bào, do vậy có thể gây ngưng kết nhiều loại tế bào [3], Cho đến nay, chức năng
sinh học của lectin còn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn, và đang được tiếp tục
nghiên cứu. Người ta đã thu được nhiều bằng chứng cho thấy lectin có vai trò hảo
vệ, bảo đảm tính chống chịu các bệnh truyền nhiễm ở nhiều loại thực vật, làm chất
dự trữ hoặc có vai trò vân chuyến các chất dự trữ, làm cầu nối giữa vi khuẩn cố
định nitơ với thực vật [5], hoặc đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiền miễn
dịch, bảo vệ cơ thể ở động vật [8], Lectin có lliể lliam gia điều chỉnh nhiều chức
nâng nhận biết tế bào trong quan hệ tương tác sinh lý giữa các tế bào trong cùng
một cơ thể, cũng như giữa các tê bào vật chú và vật ký sinh ở động vật và thực vật
[3], Những ứng dụng của lectin (long nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học vn V học
ngày càng phong phú [5]. Đề tài:” Nghiên cứu khá nâng ứng dụng lectin và các

chất có hoạt lính sinh học khác từ nguồn dộng vật trong chẩn đoán một số bệnh
ung thư và nhiễm trùng ở người” là nhằm góp phần vào việc điều tra và khai thác
nguồn tài nguyên động (hực vật ở Việt nam. Trong số đó lectin tách từ sam biển
Tưvhypìeus tridentatus Lecỉdì có thể nhận biết đặc hiệu axit sialic (là thành phần
đường quan trọng và phổ biến cùa màng tê bào) và gamma globulin (kháng thể lớp
IgCi, một thành phẩn quan trọng cúa hệ thống miễn dịch clịcli thể ớ người và động
vật bậc cao) [I. 8], Đay là những tính chất quý giá và CÒI) ít được nghiên cứu. Mục
tiêu của đề thi là tinh chế lectin sam và nghiên cứu ứng dụng khả năng liên kết đặc
hiệu của nó với IgG trong biểu hiện lam sàng của một số bệnh hiếm nghèo ờ người,
nhằm phát hiện và tiến lới chẩn trị các bệnh này.
NGUYÊN LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú ti
1 .Nguyên liệu:
-Sam 0Tachypìeus tridentưtus) được đánh bắt ở vùng biển Sầm sơn- Thanh
hoá. Máu sam sau khi lấy được để đông ở nhiệt độ phòng, ly tâm ở 3 000
vòng/phút trong 20 phút, loại tế bào máu, thu huyết thanh, cho chất chống khuẩn
và bảo quản ở 4nc.
-Hồng cầu người thuộc nlióin A, B, o do Viện huyết học và truyền máu trung
ương cung cấp.
-Huyết thanh người bình thường (khoẻ mạnh, không mắc bệnh ung thư hoặc
truyền nhiễm ), huyết thanh người bệnh lupus ban đỏ, bệnh suy thận, ung thư máu
ác tính do Phòng Miễn dịch, Bệnh viện Bạch mai cung cấp.
-Huyết thanh người bệnh ung thư vú và ung thư máu do Bộ môn Hoá sinh,
Viện Quân y 108 cung cấp.
2/rhiết bị và hoá chất:
Đã sử dụng các loại máy móc plụic vụ nghiên cứu của các hãng Mỹ,
Pháp đảm bảo độ chính xác cao như quang phổ, ly tãm, điện di, máy đọc
ELISA Tất cả các hoá chất sử dụng đều ở dạng tinh khiết hoá học của các hãng
Sigma, BioRad (Mỹ), Pharmacia (Thuỵ điển)
3.Phương pháp nghiên cứu
ĩ.ỉ.X á c định hoạt độ lectin

Hoạt độ của lectin được xác định bằng kỹ thuật miễn dịch qua khá năng gây
Iigung kêt hổng cầu Iheo phương pháp của Roche và Monsigny [8]. Dịch lectin
được pha loãng gấp đôi liên liếp bằng đệm tris 0,05 M pH 8,3 có chứa NaCI 0,15
M (TBS) trong các giêng của bản thử hằng chất dẻo đáy nhọn (Microíitei system
của Anh). Tiếp theo cho vào mỗi giếng hổng cầu 2% đã được rửa sạch nhiều lẩn
bằng dung dịch muối sinh lý (NaCI 0,9 %). Kết quả phản ứng ngưng kếí được ghi
nhộn sau 60- 90
pluìt ở nhiệt độ phòng. Hoại độ Iigiíng kết (hiệu giá, viết lát là HAA) là giá trị
nghịch đảo của độ pha loãng ỈỚI1 nhất mà dịch lectin vẫn còn khả năng gây ngưng
2
kết hồng cầu. Hoạt động riêng của chế phẩm lectin là số đơn vị ngưng kết HAA có
trong 1 mg protein.
3.2. Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein của huyết thanh sam và của chế phẩm lectin được xác
định theo phương pháp Lowry, dùng huyết thanh bò làm chuẩn, hoặc đo ở bước
sóng 280 nm trên máy quang phổ, như đã mô tả trước đây [8].
3.3.Tinh chê lectin sam bằng cột sắc ký ái lực ìgG-Sepharose 4B
Cột sắc ký ái lực dùng IgG tách từ huyết thanh người làm phối tử gắn lên
sepharose 4B đã hoạt hoá được chuẩn bị theo phương pháp chuẩn của hãng
Pharmacia (Thuỵ điển) [8].
Huyết thanh sam được ly tẳm loại tế bào máu và plia loãng bằng đệm tri.s
chuẩn (TBS). Dung dịch này được cho chảy qua cột sắc ký đã cân bằng trước trong
TBS với tốc độ 10 ml/giờ. Quá trình được lặp lại nhiều lần. Rửa lại cột bằng TBS
cho đến khi hết protein không gắn với ígG trên cột. Phản hấp phu lectin bằng đệm
có pH thấp, tốc độ rửa chiết 20 inl/giờ, thu phân đoạn I ml. Xác định hoạt độ và
hàm lượng protein của các phân đoạn. Thu chê phẩm, thẩm tích loại muối và bảo
quản ở 0nc.
3.4. Phương pháp điện di theo Laemmli:
Đã tiến hành điện di trên gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) có sử dung
chất khử (còn gọi là điện di biến tính) để xác định độ tinh sạch và khối lượng phân

tử của các băng polypeptit của chê phẩm trên cơ sở kỹ thuật đã mô tả trước đây [8].
Đúc gel với nồng độ 12 %, cho dung dịch mẫu đã xử lý vào các giếng, điện di
bản gel với dòng điện ban đầu là 12 mA, sau đó tăng lên 16 111A/ bản gel. Điện di
cho đến khi chất màu đánh dấu mẫu chạy tới đáy bán gel. Nhuộm bản gel, sau đó
rửa và tẩy màu phần nền.
3.5.Xác dinh kháng thé IgG trong huyết thanh ngĩiòi theo kỹ thuật ELLA:
Dã sử dụng xét nghiệm miễn dịch liên kểt enzym-lectin (ELLA: Enzyme-
Linked Lectinosorbent Assay) để phát hiện sự biếu hiện kháng thể ỊgG trong huyết
thanh người [2,7]. Đây là kỹ thuật dùng enzym để đánh dấu kháng nguyên hoặc
kháng thể, với mục đích làm tăng độ nhạy của phản ứng. Kỹ thuật này cho phép
xác định một lượng kháng thể có trong huyết thanh (như globulin miễn dịch của
3
các lớp IgG, IgA, IgE ) bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu gắn với enzym . Kỹ
thuật được tiến hành qua các bước sau:
- Gắn kháng nguyên: Sử dụng chế phẩm lectin sam làm kháng nguyên gắn lên n
pha rắn là thành giếng trong bản chất dẻo (polystyren):
+Pha kháng nguyên với nồng độ 10 j-ig/ml trong đệm cacbonat pH 9,6.
+Nhỏ vào mỗi giếng của bản chất dẻo 50 f.il kháng nguyên.
+ủ bản qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc ở 37°c trong 2 giờ.
+Rửa bản 3-4 lần bằng dung dịch Tween 20 (0,05%) để loại bỏ kháng nguyên
không gắn.
-Phủ bản (blocking):(nhằm bão hoà các vị trí kết hợp kháng nguyên còn tự
do)
+Nhỏ 50 f.il dung dịch blocking cho mỗi giếng của bản chấr dẻo.
+ủ bản 2 giờ ở 37°c.
+Rỉra bản 3-4 lán bằng dung dịch Tween 20.
-Gắn kháng thể (IgG của liuyếl (hanh người bình thường hoặc bệnh lý):
+Pha loãng huyết (hanh với nồng độ 1/100 trong dung dịch blocking.
+Nhỏ 50 f.t1 huyết thanh đã pha loãng vào mỗi giếng của bản nhựa đã gắn
lectin.

+ủ bản 2 giờ ở 37°c
+Rửa bản 5 lần bằng dung dịch Tween 20.
-Gắn cộng hợp:
+Nhỏ vàơ mỗi giếng của bản nhựa 50 |.il cộng hợp kháng IgG người gắn
enzym (PO) pha loãng 1/2 000 trong dung dịch blocking.
+ủ I giờ ở 370C .
+Rửa 3-5 lần như trên.
-Gắn cơ chất:
+Nhỏ vào mỗi giếng 50 |.il cơ chất OPD.
+Để trong tối 10-15 phút ở nhiệt độ phòng cho phản ứng xảy ra hoàn toàn.
-Ngừng phản ứng:
+N1-IỎ 25 |il dung địch axit H2S04 2M vào mỗi giếng
+Đọc kết quả phản ứng màu trên máy đọc ELỈSA ở bước sóng 492 nm.
4
KỂT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
l.Tinh chê lectin sam
Lectin sam đưực tinh chế từ huyết thanh sam theo quy trình đã được mô tả
trong phần phương pháp nghiên cứu. Hoạt độ ngưng kết hồng cầu và hàm lượng
protein của các phân đoạn thu được đã được xác định. Kết quả tinh chế lectin được
tóm tắt ở bảng 1 và biểu diễn trên hình I.
Bảng 1: Kết quả tinh chê lectin từ huyết thanh sam
Các bước
tinh chê
Protein
Hoạt độ
Hoạt độ riêng
(đ.v.n.k/mg protein)
Độ tinh
sạch (lần)
mg

protein
% h.đ.t.s ¥
(đ.v.n.k)**
%
Dịch lên
cột (6 ml) 245
100 61 200 100 250 1
Chế phẩm
lectin (B2)
3,8
1,5
4 000 6,4
1 052 4
* h.đ.t.s: hoại độ tổng số.
** đ.v.n. k: đơn vị ngưng kết.
Bảng 1 cho thấy huyết thanh sam sau khi qua cột sắc ký ái lực IgG- sepharose
4B đã cho một đỉnh chế phẩm, Hoạt tính thu hồi của chế phẩm là 6,4 % so với hoại
tính ban đầu. Hoạt độ riêng và dộ tinh sạch của chế phẩm đã được tăng lên gấp 4
lẩn so với dịch huyết thanh sam cho qua cột.
5
Hình 1: Sắc ký dồ tinh chế lectin tù huyết (hanh sam trên cột sắc ký ái
lực Ig(ỉ-Sepharose 4IỊ
Tốc độ chíív 10 ml/ giò, thu phân đoạn 2 ml
Đổ thị trên hình 1 cho thấy đỉnh có hoạt tính lectin B2 (chế phẩm lectin) đã
được tách ra khỏi đỉnh protein không có hoạt tính Az. Điều này chứng tỏ chê phẩm
lectin đã được giải phóng khỏi nhiều protein tạp và đạt đô tinh khiết cao.
Độ tinh sạch của chế phẩm đã được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel
polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) trong điều kiện có chất khử (điện di biến tính)
như đã mô tả trong phẩn phương pháp nghiên cứu. Kết quả được trình bày trên hình
6

HìnỀi 2 : Phổ diện đi biên tính (SI)S-PA(ỈE) chế phẩm lectin sam
1 .Huyết thanh sani.
2.Chế phẩm lectin.
3.Protein chuẩn (Sigma): a- lactalbumin: 14,4 kDa; chất úc chê Kunitz
từ đậu tương: 20,1 kl)a; cacbonic anliytlraz: 30 kl)a; ovalbumin: 43 kl)a;
albumin huyết thanh bò: 67 kDa; pliotphorylaz B: 94 kl)a,
Điện di đồ cho thấy: so với huyết thanh sam (cột 1), chế phẩm lectin (cột 2)
đã được giải phóng khỏi lất nhiều protein tạp. Protein lectin chỉ còn chứa ba vạch
lõ nét của ba phẩn dưới đưn vị (d.đ.v) tương ứng với khối lượng phân tứ (Mr)
khoảng 27, 68 và 72 kDa. Kết quá này chứng tỏ độ tinh sạch của chế phắm và phù
hợp với các kết quả chúng tôi đã nghiên cứu trước đây bằng các quy trình tinh sach
khác [8].
7
2.Xác định tính đặc hiệu của lectin sam với kháng thể lớp IgG
Các globulin miễn dịch (viết tắt !à Ig) đóng vai trò kháng thể- bảo vệ cơ thê
chống lại các vật lạ xâm nhập là các kháng nguyên- trong hệ tuần hoàn cùa người
và động vật bậc cao, và được tạo thành Irong đáp ứng miễn dịch dịch thể. Sự kết
hựp đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và khả năng sản xuất được các
kháng thể đặc hiệu đã khiến cho chúng được sử dụng rộng rãi như một chất phản
ứng trong các lĩnh vực áp dụng miễn dịch học vào mục đích chẩn đoán và điều trị
[6, 7, 9]. Các globulin miễn dịch được chia thành 5 lớp là IgG, IgA, IgM, IgD và
IgE. Trong số này, IgG có hàm ỉượng lớn nhất, chiếm khoảng 80% tổng số các Ig
của huyết tương người bình thường, với nồng độ trung bình khoảng 12 mg/ ml. Số
IỚI1 các kháng thể lưu động đều thuộc lớp IgG.
Chúng tôi đã tiến hành xác địnli khả năng liên kết đặc hiệu của lectin sam
hằng cách tiến hành song song hai thí nghiệm vói IgG và ĩgA từ huyết thanh người
bình thường (qua xét nghiệm của bệnh viện đểu là những người không mắc bệnh
ung thư hoặc truyền nhiễm). Hai thí nghiệm này, cũng giống như các Ihí nghiệm
sau đó, đều dùng lectin sam làm kháng nguyên gán bản trong kỹ thuật ELLA. Kỹ
thuật này vể cơ bản giống với kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, nhưng thay vì gắn

kháng thể với thuốc nhuộm huỳnh quang, người ta gắn kháng thể với một enzyin.
Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thuỷ phân cơ chất (hành
một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa
kháng nguyên và kháng thể. Dựa trên cường độ màu mà máy ELISA đọc được ở
bước sóng 492 nm, có thể tính được lượng kháng thể đặc hiệu đã tham gia phản
ứng với kháng nguyên.
Trước khi tiến hành thí nghiệm, chúng tôi đã thãin dò nồng độ lectin thích
hợp cho phán ứng liên kết với các kháng thể có trong huyết thanh, và nhận thấy
nồng độ tối thích của kháng nguyên (lectin sam) là 5 ụg/ ml. Những thăm dò tương
tư cho thấy kháng thể IgG có trong huyết thanh cần được pha loãng 100 lần, và
nống độ kháng thể gắn enzym kháng IgG là 1/20 000. Sau khi đã tìm được những
nồng độ thích hựp của kháng nguyên, kháng thể, chất cộng hợp và cơ chất, chúng
tôi đã tiến hành gắn bản và thực hiện các bước cua xél nghiệm ELLA theo quy
8
trình được mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả thí nghiệm được trình
bày ở bảng 2 và được minh họa bằng ảnh chụp bản thử xét nghiêm trên hình 4.
Bảng2: Độ hấp thụ quang (0 1 )492nm) ciia IgA và IgG (từ huyết thanh
ngưnri bình thường- liT) được lectỉn sam nhận biết
Mẩu huyết
thanh
0 » 492nn. tủa IgA liên
kết lectin sam
OI)492nn, cua IgG
liên kết lectin sam
BT 1 0,035 0,905
BT 2 0,024 0,918
BT3
0,028 0,975
BT 4 0,078 0,943
BT5 0,023 0,933

BT6 0,021
1,014
BT 7 0,023 0,910
BT 8
0,051
0,936
Trung bìnli 0,035 0,942
Kết quả ở bảng 2 cho thấy có sự chênh lệch rất lớn trong mức độ nhận biết
hai lớp kháng thể IgA và IgG của lectin sam khi được sử dụng làm kháng nguyên
gắn bản. Độ hấp thụ quang trung bình của IgA (biểu hiện khi gắn chất cộng hợp
kháng IgA) là không đáng kể so với độ hấp ỉlụi quang trung bình của IgG (biểu
hiện khi gắn chất cộng hợp kháng ỉgG). Việc xác định hàm lượng các kháng thể
trong huyết thanh (kết quả được trình bày trên bảng 9) cho thấy có mối tương quan
tỉ lệ thuận giữa chúng với giá trị độ hấp thụ quang. Từ đó có thể rút ra kết luận:
-Lectin sam không nhận biết được IgA và không liên kết được với lớp kháng
thê này (hàng 3, 4 hầu như không bắt màu cùa bán thú ớ hình 4).
-Lectin sam kếl hợp đặc hiệu với IgG, và có thể được sử dụng để định lượng
IgG có trong huyết thanh (hàng I, 2 bắl màu lất đâm trên bản thử ở hình 4 chứng
tỏ lượng IgG được lectin giữ laị do lương lác đậc hiệu là lất lớn).
9
Hinh_3: Ảnh chụp kẽt quả xác định lượng IgA và IgG (từ huyết thanh
bình thường và huyết thanh bệnh) của lectin sam bằng kỹ thuật ELLA
1.2. Độ hấp thụ quang cùa Ig(ỉ được lectin sam nhận biết
3.4. Độ hấp thụ quang của IgÀ được lectin sam nhận biết
Kết quả thí nghiệm được minh hoạ bằng biểu đổ trên hình 4.
1
-
0.9 ■
0.8 •
0.7 ■

rị V : "!VI;
0.6 >
•
0.5 ■
■*
0.4 .
/ ' •:
0.3 ■


0.2 ■
0.1 ■
— ™
■
Hình 4 : Biểu đổ so sánh độ hấp thụ quang (OI)4Mmn ) của IgA và Ig(ỉ
(từ huyết thanh người bình thường) được lectin sam nhận biết.
1. Độ hấp thụ quang của IgA.
2. f)ộ hấp tliụ quang của Ig(ĩ.
10
Bảng 3 : Khả năng liên kết vói ỉgG từ huyết thanh người bình thường
(1ỈT) và người bệnh ung thư gan (KG) của lectin sam .
Mẫu huyết
thanh bình
thường
OO492111T1
Mẫu huyết thanh

bệnh ung thư gan
0 I^492nm
BT 1
0,905 KG 1
0,934
BT2
0,918
KG 2
0,942
BT 3
0,975 KG 3
0,954
BT 4
0,943 KG 4 0,883
BT5
0,933 KG 5 0,861
BT6
1,014
KG 6 0,895
BT 7
0,910
KG 7 0,875
BT 8 0,936 KG 8
0,828
Trung bìnli
0,942 Trung bình
0,901
Kết quả trên đây cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về lượng IgG trong
huyết thanh người bị bệnh ung thư gan và người không mắc bệnh này qua khả năng
liên kết được với lectin sam của chímg. Đây mới chỉ ỉà kết quả bước đàu và cần

được nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên lectin sam đã chứng tỏ có khả năng liên kết
đặc hiệu IgG và cho phép phát hiện được loại kháng thể này trong huyết thanh
người bình thường và người mắc bệnh ung thư, khi được sử dụng làm kháng
nguyên trong kỹ thuật ELLA.
32.Bệnh ung thư vú:
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu huyết thanh người bị bênh ung
thư vú song song với 4 mẫu huyết thanh người bình thường không mắc bệnh. Kết
quả được trình bày trên bảng 4 và hình 5.
12
Báng 4: Độ Kấp thụ quang của Ig(ỉ từ huyết thanh người bệnh ung thư
vú đưực lectin sam nhận biết
Mẫu huyết
thanh bình
thường
^^492nm
Mẫu huyết thanh
bệnh ung thư vú
^^492nm
BT 1
0,762
KV 1
0,619
BT 2 0,924
KV 2
0,783
BT 3
1,160
KV 3 0,790
BT 4
0,899

KV 4 0,431
Trung bình
0,936
Trung bình 0,660
Hình 4 : Biểu đồ so sánh (lộ hấp thụ quang tủa ỉg(ỉ (từ huyết thanh
người bình thường và ngưòi bệnh ung tlur vú) liên kết lectin sam
l.f)ộ hấp thụ quang của IgG từ huyết thanh Iiguiri bình thường.
2 .ĐỘ hấp thụ quang của Ig(ỉ từ huyết tlianli nguòi bị bệnh ung thư vú.
Kết quả trên cho thấy cổ sự giám mạnh (30%) hàm lượng IgG trung bình
trong huyết thanh Iigirời mắc bệnh ung thư vú so với người bình thường. Số bệnh
phẩm thử nghiệm còn quá ít, và có lliể tất cả đã ớ trong giai đoạn suy giảm đáp ứng
miễn dịch.
13
Thí nghiệm được tiến hànli với 4 mẫu huyết thanh người bị bệnh ung thư máu.
so sánh với 4 mẫu huyết thanh người bình thường. Kết quả được trình bày trên
bàng 5.
Iiáng 5 : Độ hấp tliụ qiiiing cua Ig(ì từ huyết thanh người bệnh ling thư
máu liên kết lectin sam
Mầu huyết
thanh bình
thường
OD4921U11
Mầu huyết thanh
bệnh ung thư máu
{)^492nni
BTI 0,423
KM1 0,373
BT2
0,458 KM2 0,502
BT3

0,569 KM3 0,421
BT4 0,442 KM4
0,581
Trung bình 0,473 Trung bình
0,469
Kết quả cho thấy hầu như không có sự thay đổi về độ hấp thụ quang của IgG
trong huyết thanh người mắc bệnh ung thư máu so với người bình thường, khi sử
dụng chế phẩm lectin sam làm kháng nguyên gắn bản.
Trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng lectin sam ớ dạng thô chưa
tinh chế (huyết thanh sam nguyên) thay thế cho chê phẩm tinh khiết. Thử nghiệm
này dựa trên hiện tượng thực tê là dịch huyết thanh sam luôn có hoạt dộ Iiguìig kết
hổng cầu, cũng như ái lực với IgG, cao hon chế phẩm sau tinh chế [8], Nguyên
nhãn có thể do trong huyết thanh sam có những yếu tố làm bền hoạt tính lectin,
hoặc do các vị trí nhận biết kháng thể của phàn từ lectin đã bị ảnh hưởng trong quá
trình tinh chế (bị mất bớt hoặc bị phong bê), dẫn đến làm giảm khả năng nhận biết
và hoạt tính của nó.
Kết quả được trình bày trên bảng 6 và hình 5.
14
Bảng 6: Ị)ộ hấp thụ quang của IgG từ huyết thanh người bệnh ung thư
máu liên kết lectin sam thô
Mẫu huyết
thanh bình
thường
^1^49211*11
Mảu huyết thanh
ung thư máu
^^492nm
BT 1
0,426
KM 1

0,288
BT2
0,370
KM 2
0,206
BT3
0,544
KM 3
0,965
BT 4
0,720 KM4
0,372
BT 5 0,544 KM 5
0,648
BT 6
0,61 1 KM 6
0,467
BT7
0,714 KM 7
0,451
BT 8
0,535
KM 8
0,142
BT 9
0,393
KM 9
0,502
BT 10
0,452

KM 1 0
0,539
BT 11
0,504
BT 12
0,582
BT 13
0,467
BT 14
0,603
BT 15
0,447
BT 16
0,316
BT 17
0,506
BT 18
0,540
BT 19
0,494
BT 20
0,504
Trung bình
0,514
Trung bình
0,458
15
0.6
0.5
T 0.4

CNT _ _
g 0.3
o 02
0.1
0
Hình 5: Biểu đồ so sánh (íộ hấp thụ quang của IgG (từ huyết thanh
người bình thường và người bệnh ung thư máu) khi sử tlụng lectin sam thô
l.Độ hấp thụ quang cua ĩgG từ huyết thanh bìnli thưiYng.
2.ĐỘ hấp thụ quang của IgG tù huyết thanh bệnh ung thư máu.
Kết quả cho thấy với lectin sam ở dạng thô, đã phát hiện được mức chênh lệch
rõ rệt hơn trong độ hấp thụ quang của IgG lừ huyết thanh người bệnh ung thư máu
so với người thường, với mức giam h ung bình khoảng 10%.
Trên đây mới chỉ là kết quả cùa những thử nghiệm ban đầu về khả năng phát
hiện một số bệnh ung thư của lectin sam, dựa Irên sự thay đổi trong hệ thống niiển
dịch dịch thể, liên quan đến hàm lượng bất thường của lớp kháng thể IgC Các tác
giả nghiên cứu về miễn địch học trong các bệnh của tuyến giáp nhận thấy kháng
thể thuộc hai lớp IgG và IgM tăng cao, còn ở bệnh viêm gan cũng như ung thư gan
thì kháng thể lớp IgA lại tăng gấp 2-3 lần. Hầu như mọi nghiến cứu về miễn dịch
học chống ung thư đều đi đến kết luận rằng các yếu tố miễn dịch tế bào thể hiện
vai trò rõ hơn là các yếu tố miễn dịch dịch thể [7, 9], Do vậy để có thể đi đến
những kết quả có tính khẳng định về biểu hiện cua các loại bệnh ung thư này, cần
phải điều tra với số lượng bệnh nhăn lớn hơn. kết hợp với sự theo dõi lâm sàng
trong từng giai đoạn phát triển của bệnh.
16
Cho đến nay bệnh sởi vẫn là bệnh phổ biến mà thế giới và Việt nam đang
quan tâm, đạc biết đối VƠI sự đáp ứng miễn địch của trẻ em trong bênh này. Muc
đích của các nhà miễn dịch học là xem xét và đánh giá hiệu giá kháng thể IgG
khang SƠI tiong mục tiêu giam sat và tiêm chúng phòng bênh. Hiện nay các phòng
thi nghiệm vân dựa vao smh phâm đê chân đoán bênh, tvong đó sử dung kháng
nguyên virut sỏi để gắn bản với mục đích xác định IgG kháng sởi. Khi đó người ta

sử dụng một phương pháp tương tự với ELLA là phương pháp ELISA, thay lectin
bằng kháng nguyên sởi để gắn bản. Việc tinh chế kháng nguyên sởi là rất khó khăn
và tốn kém. Do vậy chúng tôi đã thử nghiệm dùng lectin sam gắn bản để thay thế.
Xét nghiệm ELLA được tiến hành đổng thời với hai loại huyết thanh bệnh sởi và
bệnh viêm não (cũng là một bệnh hiểm nghèo hay gặp ở trẻ em do virut gây ra) có
so sánh với huyết thanh bình thường. Kết quá được trình bày trên bảng 7 và hình 6.
4.Sư dụng lectin sam đê xác định IgCỈ trong huyết thanh người
mắc bệnh do nhiễm virut: bệnh sởi (HTBS) và bệnh viêm não (HTVN)
Bảng 7 : Độ hấp thụ quang của Ig(ỉ (từ huyết thanh người mác hệnh
serf và người niắc bệnh viêm não) liên kết lectin sam.
Mảu huyết
tlianli bình
thường
Mầu liu vết
thanh viêm
não
Ol
Màu huyết
thanh bệnh
sởi
BT 1
0,176
VN 1
0,137
BS 1
0,258
BT 2
0,159
VN 2
0,168

BS 2
0,272
BT3
0,170
VN 3
0,128
BS 3
0,155
BT4
0,214
VN4
0,154
Trung bình
0,180
Trung bình
0,147
Trung bìnli
0,228
1 ' ' I u O' JOC G■ A Hm M
^ i ! ‘, 'T .~ 'N 7 ,JLr" ■'
.
I 0 0 0 W
17
ồ so sánh độ hấp thụ quang cua IgG (từ HTBT, HTVN
và HTIỈS) liên kết lectin sam
p thụ quang của Ig(ĩ từ huyết thanh bình thường,
ấp thụ quang của IgCỈ từ huyết thanh viêm não.
lấp thụ quang của IgG tù huyết thanh bệnh sởi.
thấy có sự chêiứi lệch khá rõ trong độ hấp thụ quang trung
loại mẫu huyết thanh: của bệnh viêm não giảm 18%, còn của

với đối chứng. Điểu này chứng tỏ có sự thay đổi về hàm
thanh khi mắc bệnh sởi và mắc bệnh viêm não, biểu hiện
a kháng thể với lectin sam. Tuy cần được nghiên cứu tiếp
ểin chứng, nhưng qua kết quả ban đàu này, chúng tôi nhận
ng lectin sam trong chắn đoán cả hai bệnh. Phương pháp sử
1 trong kỹ thuật ELLA để phát hiện IgG là đơn giản, cho
xác có thể dùng để thay thế các phương pháp xét nghiệm
khác. Hơn nữa do có khả năng liên kết đạc hiệu với IgG, nên lectin sam có thể
được sử dụng để thay thế kháng nguyên sởi gắn bản. Việc tinh chế lectin sam là dễ
dàng và ít tốn kém hơn nhiều so với tinh chế kháng nguyên sởi.
18
Đáng lưu ý về mặt miễn dịch học là các bênh tư miễn ở người, như luput ban
đỏ, sốt thấp, viêm khớp dạng thấp Khác với các đáp ứng tự miễn có thể được thể
hiện dưới hình thức sinh ra kháng thể (tự kháng thể), bệnh tự miễn là những tổn
thương bệnh lý gây ra do sự tương tác giữa tự kháng thể với các thành phần tổ chức
của cơ thể, các kháng nguyên bản thân. Ở các bệnh này, hiện tượng tăng globulin
miễn dịch trong tuần hoàn chứng tỏ kháng thể được sản xuất gấp bội, trong đó sự
tăng IgG bao giờ cũng theo kiểu đa dòng (đa cloti). Trong bệnh lupus bail đỏ hệ
thống (SLE), yếu tố quan trọng trong chẩn đoán bệnh là tế bào LE được xác định là
một loại globulin miễn dịch kiểu IgG. Theo một số nhà nghiên cứu, yếu tô LE có
thể là một tự kháng thể lưu động trong máu và có tính chất chống lại nhãn tê bào
của bản thân bệnh nhân, và được gọi là “yếu tố kháng nhân- ANF”. Trong huyết
thanh bệnh nhân, thấy có nhũng tự kháng thể kháng hồng cầu, tiểu cầu và cả bạch
cầu. Người ta còn gặp cả những tự kháng thể kháng cơ quan (kháng tuyến giáp,
kháng dạ dày) cũng như yếu tố dạng thấp. Những phát hiện gần đây cho thấy trong
bệnh này có sự rối loạn chức Iiãng điểu hoà miễn dịch của lympho T, cụ thể là
thiếu hoặc giảm các lympho T ức chế. Có thể do đó mà cơ thể đã tạo ra đáp ứng tự
miễn.
Trong trường hợp viêm thận do tự kháng thể chống màng cơ bản cầu thận
(GBM), hoặc do tự kháng thể chống màng cơ bản ống thận (TBM), những tổn

thương ở thận vừa do cơ chê lảng đọng phức hợp miễn dịch (kháng nguyên cố định
tại tổ chức) vừa do cơ chế kháng thể trực tiếp làm tổn thương tế bào đích [7, 9],
Chúng tôi đã tiến hành xét nghiêm ELLA trên các mẫu huyết thanh người
mắc bênh lupus ban đỏ- một bệnh tư miễn khá phổ biến ở Việt nam. Kết quả được
trình bày trên bảng 8.
5.Sủ dụng lectin sam đé xác định IgG trong huyết thanh nguòi
mắc bệnh tụ miễn
19