Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ nấm linh chi đa niên, nấm đa niên góp phần phòng chống và điều trị một số bệnh ung thư, tim mạch và tiết niệu

Bộ giáo dục và đào tạo
đại học quốc gia hà nội






báo cáo tổng kết đề tài kh&cn cấp nhà nớc

Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học
từ nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên
góp phần phòng chống và điều trị
một số bệnh ung th, tim mạch và tiết niệu


Chủ trì đề tài: GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt

7053
26/12/2008


hà nội - 2008





1
Báo cáo tóm tắt

1. Tên đề tài: " Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ nấm
Linh chi đa niên, nấm đa niên góp phần phòng chống và điều trị
một số bệnh ung th, tim mạch và tiết niệu"

Mã số: KHDA

2. Chủ trì đề tài: GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt.

3. Danh sách những ngời thực hiện chính

STT Họ và tên Chức vụ Cơ quan
1 GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt Chủ trì đề tài
TTCNSH -
ĐHQGHN
2 GS. TS. Lê Đình Lơng Chủ trì đề tài nhánh nt
3 TS. Đàm Bạch Dơng Cán bộ NC nt

4 CN. Hoàng Văn Vinh Cán bộ NC nt
5 CN. Vũ Thị Kim Ngân Cán bộ NC nt
6 Ths. Trần Thị Lan Cán bộ NC nt
7 TS. Ngô Anh Cán bộ NC ĐH. Huế
8 PGS. TS. Lê Xuân Thám Cán bộ NC
TT Sinh học
phóng xạ
9 Ths. Tạ Bích Thuận Cán bộ NC ĐH KHTN
10 Ths. Đoàn Văn Vệ Cán bộ NC nt
11 CN. Trịnh Tam Bảo Cán bộ NC nt

4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
4.1. Mục tiêu
- Xác định tên khoa học của nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên có khả
năng dùng làm dợc liệu.
- Xác định một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của nấm Linh
chi đa niên và nấm đa niên dự kiến sử dụng trong liệu pháp nấm góp phần
tăng cờng khả năng miễn dịch và phòng chống ung th, điều trị bênh tim
mạch, tiết niệu bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.

2
4.2. Nội dung
- Tiến hành thu mẫu nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên tại một số vùng
sinh thái chính của Việt Nam và biên giới Trung Quốc, Lào, Campuchia. Định
loại các loài nấm thu đợc bằng các đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của
một số loài quan trọng.
- Phân lập thuần khiết giống gốc nấm để bảo tồn quỹ gen. Xác định khả
năng thu nhận sinh khối nấm để cung cấp nguyên liệu nấm ổn định.
- Tách chiết, sàng lọc, nghiên cứu một số các hợp chất tự nhiên và một số
chất có hoạt tính sinh học chính ở một số chủng nấm quý hiếm. Xác định cấu

trúc của một vài chất quan trọng.
- Nghiên cứu khảo nghiệm tác dụng của nấm đa niên trong liệu pháp
nấm góp phần tăng cờng khả năng miễn dịch và phòng chống ung th, điều trị
bệnh tim mạch và tiết niệu.
5. Các kết quả đạt đợc
- Nghiên cứu xác định loài nấm đa niên của Việt Nam thuộc các họ
Ganodermataceae (2 chi, 13 loài); Hymenochaetaceae (3 chi, 24 loài);
Coriolaceae ( 7 chi, 15 loài). Các đặc điểm hình thái và hiển vi của một số loài
quan trọng đã đợc mô tả.
- Xác định đợc quy trình tách chiết ADN từ nấm Linh chi đơn niên. Đã
nghiên cứu sử dụng enzyme giới hạn cắt gen Mn SOD để phân loại và nhận dạng
nấm linh chi đơn niên và nấm linh chi đa niên Gau.
- Đã nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thể của 5 chủng nấm đa
niên Toh, E1, H1, Gs và C1. Sự hình thành bảo tử vô tính cũng nh quả thể của
các chủng trên đã đợc mô tả.
- Các nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của các chủng E1, Toh, H1,
C1, N1 đã đợc nghiên cứu bằng các phơng pháp sắc kí cho thấy chúng rất giàu
các chất có hoạt tính sinh học.
- Tất các các dịch chiết của 5 chủng nấm đa niên cũng nh hỗn hợp của
chúng không gây độc đối với các dòng tế bào đẫ thử nghiệm. Sau khi đợc xử lí
với dịch chiết nớc và cồn đã quan sát thấy sự ức chế quá trình tăng sinh của tế
bào ung th phụ thuộc vào nồng độ. Việc ứng dụng dịch chiết nấm cho các bệnh
nhân tự nguyện bớc đầu đã cho kết quả khả quan.

3
- Góp phần đào tạo 2 nghiên cứu sinh và 1 cử nhân khoa học tài năng theo
hớng nghiên cứu của đề tài.
- Đã có 02 báo cáo tại Hội nghị quốc tế, 03 báo cáo tại Hội nghị quốc gia
và 07 bài báo đăng trên các Tạp chí chuyên ngành.

6. Tình hình kinh phí
- Kinh phí đợc cấp: 600 triệu đồng.
- Kinh phí đã sử dụng: 600 triệu đồng.

Trung tâm Công nghệ Sinh học
Giám đốc





TS. Dơng Văn Hợp

Chủ nhiệm Đề tài






GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt

Cơ quan chủ trì đề tài
Đại học Quốc gia Hà Nội

4
Summary

1. The title project:
Study of perennial Ganoderma, polypores mushroom, their main
bioactive compounds for health protection and pufification recombinant Taq
polymerase for biotechnological research.
Code number: KHDA
2. Prject Coordinator: Prof. Dr. Sc. Trinh tam kiet
3. Project members:
- Prof. Dr. Sc. Trinh Tam Kiet - Center of Biotechnology, VNU
- Prof. Dr. Le Dinh Luong - Center of Biotechnology, VNU
- Dr. Dam Bach Duong - Center of Biotechnology, VNU
- BA. Hoang Van Vinh - Center of Biotechnology, VNU
- BA. Nguyen Thi Kim Ngan - Center of Biotechnology, VNU
- BA. Trinh Thi Tam Bao - Center of Biotechnology, VNU
- BA. Nguyen Xuan Hung - Center of Biotechnology, VNU
- MSC. Tran Thi Lan - Center of Biotechnology, VNU
- MSC. Doan Van Ve – College of Science, VNU
- MSC. Ta Bich Thuan - College of Science, VNU
- Dr. Le Xuan Tham – Center of Radio biotechnology.
4. The objectives and research contents
4.1. The objectives
- Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores

mushroom base on morphological and molecular characteristica.
- Research on main bioactive compounds for health protection
(stimulation immune system and antitumor).
4.2. The research contents
- Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores
mushroom base on morphological and molecular characteristica and maintaining
the strains on culture collection.
- Research on main bioactive compounds and method to exstract the main
bioactive compounds from some important specices.
- Study using the abouv exstractions to stimulation immune system and
antitumor traitement.





5
5. Main results
- There are about 52 specices of the perennial Ganoderma, polypores
mushroom had been found (Ganodermataceae – 2 genus, 13 species,
Hymenochaetaceae – 3 genus, 24 species, Coriolaceae – 7 genus, 15 species).
- The morphological and micropic characteristica of some importan
species are discribed and maintaining the strains on culture collection.
- Finding the method to extraction DNA of anual Linzi and identification
Ganoderma using PCR – RFLP analysis of Mn SOD gene.
- The growing and fruiting of the perenial linzhi and polypores strains
Toh, E1, H1, Gs and C were studied on Agar medium and Substrat.
- The main bioaactive compounds of the strains E1,Toh, H1, N1, C1 were
identificative by chromatography methods: MS, HPLC, TLC.
- All extracts and their mixtures do not exhibit cytotoxic effect against the

tested cell lines. Upon treatement with ethanolic and aqueous extracts, a
concentration-dependent inbibition of cell proliferation was abserved. The
exstractions were using to treatement of the free willing patients and give the
good results.
- Six papers have been published and three presentations on National
congress and two in Japan and Germany.
- Two graduate students is being under the research direction of the
project.

Center of Biotechnology, VNU
Director



Dr. Duong Van Hop
Prject Coordinator




Prof. Dr. Sc. Trinh Tam Kiet

Project implementing organization

Vietnam National University, Hanoi

6
I. Mở đầu
Số lợng các loài nấm đã đợc định danh là 80060 loài (Từ điển nấm,
Kirk et al, 2001). Trong đó, số lợng loài nấm lớn (Marcro fungi) có quả thể
nhìn thấy bằng mắt thờng khoảng 14 nghìn loài và có thể lên tới 22 nghìn loài
(Hawkworth, 2001) trong đó, khoảng 50% các loài có thể ăn đợc bởi các mức
độ khác nhau, hơn 2000 loài an toàn (cả các hợp chất trong tế bào và các hợp
chất trao đổi thứ cấp đều có tính sinh kháng nguyên yếu và không gây phản ứng
phụ ) và khoảng 700 loài đợc cho rằng có các đặc tính dợc liệu. Các số liệu
hiện có cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có
trọng lợng phân tử lớn nh: Polysaccharide, Pol accharide- Protein, và đặc biệt
giàu các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp có trọng lợng phân tử nhỏ hơn.ít nhất
có 651 loài và 7 dới loài thuộc 182 chi của các Nấm có đảm đa bào
(Heterobasidiomycetes) và Nấm có đảm đơn bào (Holobasidiomycetes) chứa các
Polysaccharide có tác dụng dợc liệu (Reshetnikov et al., 2001). Chúng hầu hết
là các Glucan với nhiều loài liên kết Glycoside khác nhau nh -1->3, -1->6 và
- 1->3) nhng một số thực sự là Hecteroglucan. Một số polysaccharide liên kết
với các gốc protein nh phức hợp PSP (Krestin) chiết xuất từ nấm Vân chi
(Ttrametes versicolor). Các chất này có tác dụng chủ yếu chống ung th, nhng
nằm trong vách tế bào nấm, thờng che lấp bởi thành phần chính của nấm là
kitin. Bên cạnh đó, từ nấm lớn hàng trăm các chất có hoạt tính sinh học có trọng
lợng phân tử nhỏ hơn cũng đa đợc tách chiết, sàng lọc, nghiên cứu cấu trúc
cũng nh hoạt tính sinh học của chúng. Trớc hết phải kể đến các Terpenoit nh
ganoderic axit, lucideric axit, ganoderiol, ganodermodiol từ các loài Ganoderma
cũng nh
các lanostal, sterol, phenol từ hàng loạt các loài nấm lớn khác.

Hoạt tính chống ung th, điều hòa hệ miễn dịch, antioxydan, chống viêm
nhiễm, chống virus, vi khuẩn, nấm; làm giảm lợng choresterol, mỡ, đờng

trong máu cũng đợc nghiên cứu tích cực tại nhiều nớc có nền công nghiệp
phát triển [8, 10, 14, 15, 16, 17].

Những nghiên cứu về thành phần loài nấm lớn của Việt Nam đã đợc
Trịnh Tam Kiệt và các tác giả khác tiến hành [1, 2, 4, 11, 18, 19] và thống kê
toàn bộ vao năm 2001 [2], bao gồm khoảng 1200 loài trong tổng số 2250 loài
nấm đợc định tên khoa học . Trong đó có một số loài đợc ghi nhận là có tác

7
dụng dợc liệu nhng cha chỉ ra các đặc điểm sinh học cũng nh tác dụng dợc
học của chúng. Một số chủng nấm dợc liệu khác nh Linh chi, Vân chi, Nấm
đầu khỉ, Nấm lỗ cũng đợc nhập nội và nuôi trồng thử nghiệm ở một số cơ sở
nghiên cứu và nuôi trồng nấm của Việt Nam. Một số sản phẩm nấm nh linh chi
khô nguyên cái hoặc cắt lát, bột nấm, chè linh chi cũng đợc sản xuất thử
nghiệm và cung ứng cho ngời tiêu dùng. Tuy nhiên, những nghiên cứu kỹ lỡng
hơn về thành phần loài, sự phân bố, trữ lợng, khả năng đa vào nuôi trồng các
loài nấm dợc liệu mọc tự nhiên của Việt Nam cũng nh xác định chất lợng và
tác dụng dợc lí còn cha đợc làm sáng tỏ.
Trong khuôn khổ dự án hợp tác với CHLB Đức: Nghiên cứu các chất có
hoạt tính sinh học ở Việt Nam. Các chất có hoạt tính sinh học chính của gần 100
loài nấm lớn đã đợc nghiên cứu, hơn 50 chất đã đợc xác định tới cấu trúc phân
tử, trong đó có khoảng 30 chất có cấu trúc mới cho khoa học đã đợc mô tả [14]
. Một số chất có hoạt tính cao, kìm hãm sự hoạt động của tế bào ung th, tăng
khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng các vi sinh vật gây bệnh, chống viêm có
khả năng ứng dụng lớn trong dợc phẩm, mỹ phẩm [12]. Đặc biệt gần đây Cổ
linh chi (thc ra chính xác hơn là nấm linh chi đa niên và nấm đa niên) đã đợc
đặc biệt lu ý.
Vì vậy việc nghiên cứu tích cực thành phần loài , định loại và mô tả các
đặc điểm sinh học của chúng trong thiên nhiên cũng nh phân lập thuân khiết dể
bảo tồn nguồn gen, bớc đầu định loại chúng bằng sinh học phân tử, nghiên cứu

trong môi trờng nuôi cấy, xác định các nhóm chất chất có hoạt tính sinh học
chính của một số loài nấm quan trọng, khảo nghiệm việc sử dụng quả thể của
các loài này trong liệu pháp nấm đa niên.
II. phơng pháp nghiên cứu
- Thu thập, xử lý, phân lập và bảo quản nấm theo Trịnh Tam Kiệt (1981),
Ryvarden & Gilberson (1986).
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các loài Ganoderma theo Lê
ỡnh Lơng và cộng sự (2004-2005).
- Nghiên cứu hoá các hp chất tự nhiên theo U. Graefer và cộng sự (1991).



8
III. Kết quả nghiên cứu

3.1. Thu mẫu nấm tại một số vùng sinh thái chính của Việt Nam bao gồm:
Lào Cai Sapa, Lai Châu, Sơn La, Yên Bái, Tam Đảo, Ba Vì, Cúc Phơng,
Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng,
KonTum, Đắc Lắc, Đắc Nông. Tổng số mẫu thu đợc khoảng 500 mẫu.
+ Các mẫu vật trên đã đợc xử lý, sấy khô và bảo quản tại Bảo tàng Nấm
Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.

3.2. Nghiên cứu thành phần loài, định loại và mô tả các loài quan trọng của
Việt Nam
+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái quả thể, sợi, bào tử dới kính hiển vi
quang học và kính hiển vi điện tử quét của khoảng 15 chủng.
+ Bớc đầu định loại và mô tả các loài thờng gặp. Các số liệu nghiên cứu
cho thấy tập đoàn nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên chủ yếu của Việt Nam khá
phong phú:

* Thnh phn loi nm a niờn ó ghi nhn c ti Vit Nam
(Theo Ainsworth & Bisby: Dictionary of the Fungi 1995 v Trnh Tam
Kit v cỏc tỏc gi khỏc: Checklist of plant species of Vietnam, Fungi p.51
393, 2001).
Ngành Basidiomycota
Lp Basidiomycetes
Di lp Holobasidiomycetidae
B Ganodermatales
H Ganodermataceae ( Donk) Donk, 1948
Chi Ganoderma Karst., 1881
Di chi Elfvingia (12 species)
1. Ganoderma annulare (Fr.) Gilbn.
2. G. applanatum (Pers.) Pat
3. G. australe (Fr.) Pat.

9
4. G. cf. brownii (Murr.) Gilbn.
5. G. gibbosum (Blume & Nees, Fr.) Pat.
6. G. lobatum (Schw.) Atk.
7. G. oroflavum (Lloyd) Humph.
8. G. philippii (Bres & Henn.) Bres.
9. G. tornatum (Pers.) Bres.
10.G. cf. triangulum Zhao & Xu
11. G. cf. ungulatum Zhao & Zhang
12. Ganoderma sp.1
13.Ganoderma sp.2
Chi Tomophagus Murr., 1905
1. Tomophagus collossus Murr.
Bộ Hymenochaetales
Họ Hymenochaetaceae Imazeki & Toki, 1954

Chi Phellinus Quell., 1886 (22 species)
1. Phellinus adamantinus (Berk.) Ryv.
2. Ph. bambusinus (Pat.) Pat.
3. Ph. cf. conchatus (Pers.: Fr.) Pat.
4. Ph. contignus (Pers.: Fr) Pat.
5. Ph. extensus (Lev.) Pat.
6. Ph. fastuosus (Lev.) Ryv.
7. Ph. gilvus (Schw.: Fr.) Pat.
8. Ph. hartigii (Allesch. et Schnabl.) Pat.
9. Ph. igniarius (L.: Fr.) Quel.
10. Ph. lamaensis (Murr.) Pat.
11. Ph. linteus (Berk. et Curt.) Teng
12. Ph. nilgheriensis (Mont.) Cunn.

10
13. Ph. noxinus (Corner) Cunn.
14. Ph. pachyphloeus (Pat.) Pat.
15. Ph. pectinatus (Klotzsch) Quel.
16. Ph. pini (Brot.: Fr.) Ames
17. Ph. pullus (Berl. et Mont.) Ryv.
18. Ph. rimosus (Berk.) Pilat
19. Ph. robustus (Karst.) Bourd. et Galz.
20. Ph. senex (Nees et Mont.) Imaz.
21. Ph. setulosus (Lloyd) Imaz.
22. Ph. torulosus (Pers.) Bourd. et Galz.
Chi Phylloporia Murrill, 1904
1. Phylloporia ribis ( Schumach.:Fr.) Ryvarden
Chi Inonotus P. Karst., 1879
1. Inonotus sp.
Bộ Poriales

Họ Coriolaceae (Imazeki) Singer, 1961
Chi Nigrofomes Murrill, 1904 (1 species)
1. Nigrofomes melanoporus (Mont.)Murrr.
Chi Lariciofomes Kotl. & Pouzar, 1957 (1 species)
1. Lariciofomes officinalis (Vill.: Fr.) Kotl. & Pouz.
Chi Fomitopsis P.Karst., 1881(4 species)
1. Fomitopsis pinicola (Sw.:Fr.)P.Karst.
–Ungulina marginata(Pers.:Fr.)Pat.
2. Fomitopsis rhodophaeus (Lev.)Imaz.
3. Fomitopsis dochimus (Berk.& Br.) Ryv.
4. Fomitopsis carneus Blume &Nees)Imaz.
Chi Pereniporia Murrill, 1942 (4 species)

11
1. Pereniporia medulla-panis (Jacq.:Fr.)Donk
2. P.martius (Berk.)Ryv.
3. P. cf. Latisima (Berk.)Ryv.
4. Pereniporia sp.
Chi Pyrofomes Kotl. & Pouzar, 1964 (1 species)
1. Pyrofomes albomarginatus (Lev.) Ryv.
Chi Rigidoporus Murrill, 1905 (3 species)
1. Rigidoporus lineatus (Pers.) Ryv.
2. R. microporus(Fr.) Overeem.
3. R. vinctus(Berk.) Ryv.
Chi Wolfiporia Ryvarden &Gilb., 1984(1 species)
1. Wolfiporia cocos (Schw.)Ryv.&Gilb
Qua bn danh lc cỏc loi nm a niờn ó gp trờn, chỳng ta thy các loi
nm thuc chi Phellinus chim u h rừ rt, khong 50% s loi ó c ghi
nhn, sau ú n cỏc i din ca h Ganodermataceae v Poriaceae v
i s

lng loi gn tng ng nh nhau, khong trờn di 10 loi.
Cng tng t nh vy, khi xem xột v a dng b ta thy u th rừ rt
thuc v Hymenochaetales, sau ú mi ti Ganodermatales v Poriales.
V a dng chi, ta thy ni bt u th tuyt i trong cỏc nm a niờn ca
Vit Nam thuc v Phellinus, sau ú ti Ganoderma thuc d
i chi Elfvingia
úng vai trũ quan trng. Cỏc chi Fomitopsis v Pereniporia úng vai trũ trung
bỡnh. Mt s chi ch cú mt loi c ghi nhn nh Nigrofomes, Laricifomes,
Tomophagus, Wolfiporia,

Nhằm bảo tồn nguồn gen nấm, các quả thể tơi đã đợc phân lập sơ bộ tại
hiện trờng và phân lập thuần khiết tại phòng thí nghiệm. Các chủng giống gốc
Nấm đợc lu trữ tại Bảo tàng Giống Gốc Nấm, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc
Gia Hà Nội (30 chủng).




12
3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử
Bên cạnh việc sử dụng các phơng pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu,
nghiên cứu các đặc điểm hiển vi quang học cũng nh điện tử, việc thăm dò định
loại linh chi đa niên cũng bớc đầu đợc tiến hành. Các kết quả ban đầu thu
nhận đợc cho thấy :
+ ở các loài Linh chi đơn niên : Xỏc lp c quy trỡnh tỏch chit ADN
t nm Linh chi n niờn. Cú th túm tt nh sau: 0,1 g mu nm vi 1 ml
dch chit (Tris 100 mM pH 8, EDTA 50 mM, SDS 1%) 65
o
C trong 30 phỳt;
thờm 200 àl kali axetat 5M, ỏ 20 phỳt; ly tõm thu dch ni; kt ta ADN bng

mt th tớch isopropanol; ra kt ta hai ln bng etanol 70%; lm khụ v hũa
tan ADN trong 30àl nc MiliQ.
+ ở các loài Linh chi đa niên : phng phỏp tỏch chit ADN ỏp dng
cho nm Linh chi n niờn khụng phự hp vi nm Linh chi a niờn: sn phm
tỏch chit ch cú ARN, khụng thu c ADN.
Để khắc phục khó khăn trên, nhằm phân loại và nhận dạng 2 loài trong chi
Ganoderma bằng kỹ thuật PCR- RFLP đối với đoạn gen Mn SOD đã đợc nhân
bản dựa trên những nghiên cứu trớc đây của chúng tôi.
- ADN đợc tách chiết từ các mẫu theo Nguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình
Lơng, có cải tiến [IX].
- PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của G.lucidum và G.australe là
FGau1 và RGau2. Trình tự của cặp mồi này do Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn
Xuân Hùng, Lê Đình Lơng thiết kế [XI] có trình tự nh sau:
FGau1: 5- GAA GCA CCA CCA GAC CTA CGT C- 3
RGau2: 5- AGA CGT CGA CGC CGA TGA TGG- 3
- Cắt sản phẩm PCR bằng 11 enzym giới hạn với đệm phù hợp, ở 37
o
C trong 5
giờ [XII].
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và cắt enzym giới hạn trên gel polyacrylamid
6% và nhuộm bạc[XII].


a. Nhận dạng G.australe:
Với tất cả các enzym sử dụng, Gau luôn tạo ra số lợng và kích thớc các
đoạn cắt giới hạn khác so với 3 mẫu thuộc G.lucidum do đó G.australe có thể

13
đợc phân biệt rất rõ bởi tất cả các ezyme sử dụng(Bảng 1). Trong đó, có hiệu
quả nhất là enzym ScaI, FspI, PstI vì 3 enzym này chỉ cắt đặc hiệu đối với nó.

ScaI chỉ cắt Gau , tạo ra 2 băng đều có kích thớc khoảng 375bp; FspI tạo ra 2
băng có kích thớc 600 và 150 bp; còn PstI tạo ra 2 băng có kích thớc 650 và
100bp. Tiếp theo có thể dùng AvaI, AvaII và PvuI và chúng đều tạo ra các đoạn
ADN ở Gau khác xa so với Gl1, Gl2 và HQ.

b.Nhận dạng G.lucidum và các dới loài của nó:

G.lucidum có thể đợc nhận dạng dựa trên kiểu cắt đặc trng bởi các enzym
PvuI, AvaI, AvaII, MnlI, HhaI, AluI, SacI, EcoRI nh thể hiện trong bảng 1.
Gl2 có thể đợc phân biệt với Gl1 và HQ bởi sự khác biệt trong kích
thớc các đoạn cắt đợc tạo ra, đặc biệt sự khác biệt này khá rõ ở HhaI, MnlI,
PvuI và AvaI. Gl2 rất có thể là dị hợp tử đối với locus Mn SOD nên cho hai băng
sản phẩm PCR có kích thớc khoảng 700 và 720 bp, do đó khi cắt bởi các ezyme
giới hạn tạo ra nhiều băng có tổng kích thớc khoảng 1200bp.
HQ có quan hệ gẫn gũi nhất với Gl1 do số lợng và kích thớc các đoạn
cắt giới hạn của chúng rất giống nhau đối với đa số enzym. Nh vậy có thể xếp
HQ vào một dới loài của G.lucidum rất gần với Gl1. Tuy nhiên, HQ cũng có thể
đợc phân biệt với Gl1 bởi kiểu cắt của enzym AvaII. Gl1 chỉ cho 2 băng : 440
và 220 bp, còn HQ cho 4 băng: 440, 320, 220 và 115 bp. Điều này có thể đợc
giải thích do HQ cũng là dị hợp tử đối với locus này, trong đó 1 alen có 1 điểm
cắt (tạo 2 băng 440 và 220 bp giống với Gl1) còn 1 alen có 2 điểm cắt cho AvaII
(tạo 3 băng 320, 220 và 115 bp). AvaII cắt đoạn ADN của Gl2 cũng tơng tự nh
của HQ.

FspI ScaI PstI PCR

_____________ _____________ _____________ _____________
Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Mr Gau HQ Gl1 Gl2

700
600
500
400


300






14






Ava
I AvaIII MnlI PvuI
______________ _____________ _____________ ______________
Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Mr

500
400

300


200
175
150
125
100

75



AluI SacI EcoRI HhaI
______________ _____________ _____________ ______________
Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Gau HQ Gl1 Gl2 Mr




500

400

300

200
175
150
125
100
75

S¶n phÈm PCR (PCR) víi cÆp måi FGau1 vµ RGau2 vµ c¾t enzym giíi h¹n
Chó thÝch: Mr: Thang ADN chuÈn (25/100 ladder – Bioneer)










15


Bảng 1. Các đoạn giới hạn (bp) đợc tạo ra khi cắt đoạn gen Mn SOD của các mẫu
Ganoderma bởi các enzym giới hạn
Gau HQ Gl1 Gl2
TT
Tên
Enzym
Số
Băng

Kích thớc
băng (bp)
Số
băng
Kích thớc
băng (bp)
Số
băng
Kích thớc
băng (bp)
Số
băng
Kích thớc
băng (bp)
0 PCR* 1 750 1 690 1 690 2
(2)

720+700

1 PstI 2 650+100 1
690
(không cắt)
1
690
(không cắt)
2
(2)

720+700
(không cắt)

2 ScaI 1
(1)
375 1
690
(không cắt)
1
690
(không cắt)
2
(2)

720+700
(không cắt)
3 FspI 2 600+150 1
690
(không cắt)
1
690
(không cắt)
2
(2)

720+700
(không cắt)
4. AvaII 2 710+630 4
(2)

450+320+
220+120
2 450+220 4

(2)

470+320+
240+120(2)
5. AvaI
(3)
2 570+130 1 630 1 630 2
(2)
680+660
6. PvuI
(3)
2 400+390+300 3
310+290+
110
3
(4)


310+290+
110

3
(2)

310+300+
110
7 MnlI
(3)
5
250+175+

130+105+
100
2
250+120+
90+70
2
250+120+
90+70
8
(2)

260+140+
132+127+
120+115+
90+85
8 HhaI
(3)
6
250+160+
115+110+
90+80
4
200+150+
110+70
4
200+150+
110+70
8
(2)

200+175+
150+130+
120+115+
90+70
9 AluI 2 560+190 2 500+165 2 500+165 4
(2)

520+510+
180+170
10 SacI 2 560+190 2 500+165 2 500+165 4
(2)

520+510+
180+170
11 EcoRI 2 620+130 2 560+130 2 560+130 3
(2)

590+570+
130

Chú thích: *: Sản phẩm PCR với cặp mồi FGau1 và RGau2
(1): tạo thành 2 băng cùng kích thớc 375 bp
(2): có thể giải thích sự tạo nhiều băng do các mẫu là dị hợp tử đối với locus Mn
SOD.
(3):bảng chỉ liệt kê các đoạn ADN nhìn thấy trên bản gel. Những đoạn còn lại
quá nhỏ ( dới 70bp) không thể thấy đợc trên bản gel do nồng độ gel 6% không phù hợp.
(4):do nồng độ ADN cao nên enzym cha cắt hoàn toàn đã bị mất hoạt tính

16
Từ kết quả trên cho thấy, PCR - RFLP đối với đoạn gen Mn SOD có thể

đợc sử dụng làm dấu chuẩn di truyền để phân biệt và nhận dạng các mẫu thuộc
2 loài G.australe và G.lucidum .

3.4. Nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thể của một số loài quan trọng.
Bờn cnh vic thu hỏi, x lý, lu tr v nh loi cỏc loi nm a niờn
chớnh trong thiờn nhiờn, vic phõn lp thun khit nhm lu tr ngun gen v
nghiờn cu s mc, s hỡnh thnh qu th ca chỳng cng cú ý ngh vụ cựng
quan trng.
Cỏc chng nm sau õy c chn lm i tng nghiờn cu :
1. Tomophagus colossus (Toh)
2. Ganoderma sp. (E1)
3. Phellinus sp. (H1)
4. Pereniporia sp. (P1Gs)
5.
Wolfiporia cocos (C1)
* S mc v s hỡnh thnh qu th ca cỏc chng nm nghiờn cu trờn
mụi trng thch khoai tõy
Cỏc chng nm nghiờn cu c nuụi cy trờn mụi trng thch-khoai
tõy nhit 25C trong t m nh ụn, trong ti. Tc mc v dy ca si
c ỏnh giỏ theo Schwantes (1971). Cỏc s liu c ch ra trong bng sau :
Qua ú, ta thy hu ht cỏc loi nm u mc t
t trờn mụi trng thch,
trong ú tc mc nhanh nht chng C1, Wolfiporia cocos, t ti 400 àm/h,
tip ú l n Tomophagus sp t 260 àm/h, Perenniporia sp 230 àm/h v
chm nht l chng Ganoderma sp, ch t 200 àm. dy ca h si nm nh
sau : Dày nhất là ở Phellinus sp tới 4 đơn vị, sau đó đến Wolfiporia sp 3 đơn vị,
Ganoderma sp 2,5 đơn vị, còn Tomophagus sp va Perenniporia sp chỉ đạt 1 đơn
vị.
Hỡnh thỏi si nm tt c cỏc chng ban u u trng, sau ú chuyn mu
dn, hỡnh thnh nhi

u git nc trờn mt. Hu ht cỏc chng u dng li khi
tin n thnh bỡnh ngoi tr chng H1. Din bin c th ca s mc nh sau :

17
- Ở chủng Toh (Tomophagus), phát triển sợi dạng bông màu xám và rất
mềm. Khi hầu hết hệ sợi đã chuyển sang giai đoạn trưởng thành, chúng ta có thể
quan sát thấy sự tào thành bào tử vách dày, hay còn gọi là hậu bào tử
(chlamydospore) với những kiểu hoa văn điển hình. Đặc biệt, trong điều kiện tối
ưu, chủng này có thể hình thành quả thể chín với nhiều lỗ tương đối lớn. Trên
bào t
ầng, ta có thể tìm thấy nhiều bào tử đảm điển hình của loài với kích thước
trong khoảng 15 – 18 µm. Dưới kính hiển vi điển tử quét (SEM), ta quan sát
được những bào tử đã nảy mầm và cấu trúc hoa văn dạng mạng.

Bµo tö cña Tomophagus vµ Pereniporia trong nu«i cÊy thuÇn khiÕt.

- Ở chủng E1 (Ganoderma sp.), hệ sợi đổi màu từ trắng sang vàng sau
một thời gian. Các sợi gắn với nhau rất chặt. Trên bề mặt cấu trúc sợi quan sát
thấy nhiều giọt nước. Trên bề mặt có nhiều nếp nhăn và vết nứt.
- Ở chủng P1 (Pereniporia sp.), hệ sợi ban đầu màu trăng, sau đó chuyển
thành màu x¸m đen. Khi quan s¸t d−íi kÝnh hiÓn vi ta thÊy sîi nÊm với bào tử
vách dày điể
n hình không có hoa văn. Trong điều kiện tối ưu, chủng này có thể
hình thành mÇm m«ng qu¶ thÓ (primordium).
- Ở chủng H1 (Phellinus), hệ sợi ban đầu cũng có màu trắng dạng bông,
sau đó chuyển sang vàng. Đặc biệt, sợi nấm có thể leo men theo thành bình tam
giác (Erlenmeyer flask), đạt tới độ cao 3-5(-7) cm và đôi khi còn chạm nút bông.
Khi quan sát dưới kính hiển vi, hầu hết cấu trúc sợi là sợi nấm dạng lông cứng.
Dưới những điều kiện tối ưu, ch
ủng này có thể hình thành quả thể bất thụ dạng

gò.

18
Đặc biệt ở chủng P1 có hình thành hậu bào tử, đầu tiên màu xám sau
chuyển sang màu đen, gây ấn tượng như nuôi cấy bị nhiễm. Bào tử hữu tính
hình trái xoan điển hình, đạt kích thước …
Trong các chủng nuôi cấy, chỉ có P1 hình thành quả thể dạng gờ nổi, dạng
bán cầu có chia thuỳ ít nhiều, đầu tiên màu trắng sau chuyển sang màu vàng,
kích thước5 -12 cm. Trên quả thể hình thành ống rộng, kích thước 2-3 èng trong
1 mm . Khi quan sát dưới kính hiển vi, các đảm bào tử đ
iển hình được hình
thành, kích thước đạt15 -18 µm. Dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM), thấy rõ
lỗ nảy mầm và trang trí dạng mạng lưới rộng.

Sù h×nh thµnh qu¶ thÓ cña Phellinus
* Sự mọc và sự hình thành của các chủng nấm khi nuôi cấy trên giá
thể mùn cưa
Mùn cưa gỗ bồ đề đã có bổ sung dinh dưỡng được sử dụng để nghiên cứu
sự mọc và sự hình thành quả thể của các chủng n
ấm nói trên.
Trong tối, cả bốn chủng đều mọc tốt trên giá thể, hình thành sợi nấm màu
trắng, đạt tốc độ từ 200 µm – 300 µm.
Khi hệ sợi đã lan kín giá thể, được chuyển ra sáng để nghiên cứu sự mọc
trong điều kiện nhiệt độ phòng.
Qua đó ta thấy :
- Chủng H1 chỉ hình thành mô sẹo mà chưa hình thành quả thể thành thục.

19
- Chng Gs hình thnh qu th phôi thai màu trắng xám, sau đó hình thành
l mu hng tht nhng cha hình thnh qu th thnh thc.

- Chng Toh hình thnh qu th mu vng v nu chm sóc tt s cho qu
th thnh thc với mặt mũ đầu tiên màu vàng sáng sau chuyển thành vàng đạm,
nhẵn bóng tơng tự màu sắc quả thể ngoài tự nhiên. Phía dới hình thành ống
nấm điển hình 2-3 ống trong 1 mm. Trên lớp bào tầng hình thành bào tử nấm
thành thục. Thời gian hình thành quả thể thành thục trong điều kiện thuận lợi 40
- 60 ngày. Trên giá thể mùn ca có bổ sung dinh dỡng, chủng Toh nhanh chóng
mọc kín giá thể mặc dù sợi rất mỏng và hình thành quả thể thành thục sau 4 tuần
kể từ khi nuôi cấy. Khả năng thu nhận sinh khối chủ động của chủng nấm này là
rất khả quan.
- Chng E1 phát trin to thnh qu th th
nh thc, hình thnh ng nm
in hình mu trng v bo t giá điển hình.Thời gian hình thành quả thể thành
thục dài tới 120-140 ngày.


Sự hình thành quả thể của Ganoderma

20

Sự hình thành quả thể của Tormorphagus
Cng nh trờn mụi trng thch khoai tõy, s mc v hỡnh thnh qu th
ca cỏc chng nm l nhiu nm trờn giỏ th mựn ca cng b nh hng bởi
nhiu nhõn t mụi trng, ly vớ d nh ỏnh sỏng, ch khớ, nhit , m v
iu kin dinh dng. Trong s ú, ỏnh sỏng v nhit l hai nhõn t ti quan
trng i vi s phõn hoỏ vựng sinh dng v sinh s
n. Quỏ trỡnh to bo t
non, quỏ trỡnh phõn hoỏ m chu nh hng tớch cc ca ỏnh sỏng v nhit
trong khi s mc ca si trong iu kin cú ỏnh sỏng v nhit tng i cao
thỡ li b c ch mt cỏch rừ rt.

3.5. Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của một số loài
quan trọng
Quả thể của 5 chủng nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên đã đợc tách chiết
trong các dung môi hữu cơ. Tỷ lệ các nhóm hoạt chất tách chiết đợc khoảng từ
2.5 4.5% trọng lợng khô của quả thể nấm. Các nhóm chất tự nhiên chủ yếu đã
đợc chỉ ra bằng những nghiên cứu trên sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký
khí và nghiên cứu khối phổ cho thấy các chất chiết của nấm Cổ linh chi và nấm
Đa niên rất giàu các hoạt chất. Ngoài các chất có trọng lợng phân tử lớn nh:
Polysaccharide, Polysaccharide-peptide, Peptaibol thì các chủng nghiên cứu
còn chứa nhiều Steroid (esgosterin), Tepenoid. Đáng kể nhất là 7 colossolacton
mới (đợc gọi chung là colossin) từ Ganoderma colossum; aplanostanoic,
poricoic, tumuloic axit từ Wolfiporia cocos ; Ganoderic acid, aplanic acid,

21
Egosterol tõ Ganoderma sp.; Hispolon, Hispidin, Inotilone tõ Inonotus sp. vµ
Phellinus sp.
Quả thể khô của một vài loài nấm đa niên quan trọng được chiết suất nhằm
mục đích nghiên cứu về những nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học chính. Các
chủng nấm nghiên cứu được tách chiết theo quy trình sau:
- Làm sạch, cắt thành miếng (1 x 1 cm), sấy khô để bảo quản .
- Chiết suất trong nước đun sôi 3 lần và 3 lần trong cồn thực phẩm 90
o
.
- Lọc dịch chiết, đông khô thăng hoa, thẩm tích, sấy đông khô sản phẩm.

Khèi phæ cña dÞch chiÕt cån cña E1.

Khèi phæ cña dÞch chiÕt n−íc cña E1.

22

S¾c kÝ líp máng cña dÞch chiÕt cån E1
Qua đó chúng ta thấy các dịch chiết nước và cồn của các mẫu nấm đa niên
chứa vô cùng nhiều các hợp chất tự nhiên. Để nghiên cứu tiếp các nhóm chất,
chúng ta phải tách chiết, sàng lọc rất kỹ và ứng dụng các phương pháp nghiên
cứu hiện đại mới có thể đi sâu nghiên cứu được cấu trúc phân tử của chúng.



23


CÊu tróc ph©n tö cña Colossolactons (Tomophagus)



CÊu tróc ph©n tö cña Terpenoid (Wolfiporia)

24


Cấu trúc phân tử của các hợp chất tách chiết từ H
1

3.6. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên
lên tế bào nuôi cấy Invitro của ngời và khỉ

* Chun b dch chit lm thớ nghiờm v nh hng i vi cỏc dũng t
bo ca ngi v ng vt.
Chỳng tụi s dng 5 mu cú ngun gc t 5 loi nm l a niờn ca Vit
Nam, kớ hiu l H1, H3, E1, N1, P1. chit sut, chỳng tụi ly 300g qu th
khụ t mi mu. un sụi vi nc 3 ln, mi ln trong 2 gi. Sau ú, ho d
ch
chit ca ba ln li lm mt, tip tc un, cụ c cho ti khi ta cú chng 25 30
ml.
Dch chit sau ú c sy ụng khụ, ri ho tan tr li vi nc. Phn
nguyờn liu cũn li sau khi chit vi nc c em chit vi cn. Sau 24 gi,
chỳng tụi ct quay v tip ú ho tan tr li trong cn.
* nh hng c t bo v kỡm hóm tng sinh t bo ca d
ch chit nc
v cn ca cỏc nm l a niờn i vi t bo ngi.
Hin ti, chỳng tụi iu tra v cỏc nh hng ca dch chit nc v cn
ca mt s nm l lờn s sinh trng ca mt s dũng t bo. Phi k n, ú l