Định danh các chủng vi khuẩn thuộc chi Proteus phân lập từ động vật biển bằng phương pháp hóa sinh và sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG




PHẠM THỊ SƯƠNG



ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN THUỘC CHI
PROTEUS PHÂN LẬP TỪ ĐỘNG VẬT BIỂN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC


GVHD: TS. NGUYỄN VĂN DUY




NHA TRANG – THÁNG 07 NĂM 2013
i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự chỉ bảo, giúp

đỡ của nhiều thầy cô, các anh chị và bạn bè.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Phạm Thu Thủy
và TS. Nguyễn Văn Duy đã tận tình hướng dẫn tận tình, truyền đạt những kinh
nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô bộ môn công nghệ
sinh học, cùng các thầy cô trường Đại học Nha Trang nhất là các thầy cô trong
Viện công nghệ sinh học và môi trường đã chỉ dạy và truyền đạt kiến thức trong
suốt 4 năm học, giúp tôi có một nền tảng kiến thức để bước vào đời.
Cảm ơn chị Minh Nhật, anh Nguyên, chị Xuân, chị Nhi, các bạn trong phòng
thí nghiệm đã giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận này
Nha Trang, tháng 07 năm 2013
Sinh viên thực hiện



Phạm Thị Sương



ii

MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU viii

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1

1.1. Tổng quan về chi vi khuẩn Proteus 1

1.1.1. Đặc điểm phân loại học của Proteus 1

1.1.2. Đặc điểm sinh học của Proteus 1

1.1.3. Đặc tính sinh lý và sinh hóa của Proteus 3

1.1.4. Tình hình nghiên cứu về chi Proteus trên thế giới và ở Việt Nam .
6

1.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn 7

1.2.1. Tổng quan chung về các phương pháp định danh vi khuẩn 7

1.2.1.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống 7

1.2.1.2. Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống 9

1.2.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn Proteus 12

1.2.2.1. Định danh bằng test hóa sinh 12

1.2.2.2. Định danh bằng sinh học phân tử 13

CHƯƠNG 2. Vật liệu và phương pháp 16

2.1.

Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1.

Chủng vi khuẩn 16

2.1.2.

Hóa chất, môi trường, thuốc thử 16

2.1.2.1. Hóa chất 16

2.1.2.2. Môi trường 17

2.1.2.3. Thuốc thử 18

2.2.

Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng 18

2.3.

Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1.

Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn 19

2.3.2.

Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn 20

2.3.3.

Định danh vi khuẩn bằng thử nghiệm sinh hóa 23

2.3.3.1. Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 20E 23

iii

2.3.3.2. Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 50CH 24

2.3.4.

Kĩ thuật tách chiết DNA tổng số 26

2.3.5.

Kĩ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA và rpoB 27

2.3.6.

Kĩ thuật điện di gel Agarose 29

2.3.7.

Giải trình tự và phân tích trình tự gen 30

2.3.8.

Phân tích quan hệ phát sinh loài 31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1.

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu 32

3.2.

Định danh các chủng vi khuẩn Proteus bằng thử nghiệm sinh hóa 35

3.3.

Kết quả tách chiết DNA tổng số 40

3.4.

Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA 40

3.5.

Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen rpoB 42

3.6.

Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và đoạn gen rpoB 42

3.7.

Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA và đoạn gen rpoB 49

3.8.

Xây dựng cây phát sinh loài 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC


iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt

Viết đầy đủ
1.

DNA Deoxyribonucleic Acid
2.

dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate
3.

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
4.

LDC Lysine Decarboxylase
5.

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid
6.

rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid
7.

RNA Ribonucleic Acid
8.

PCR Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction)
9.

TBE
Tris Boric acid EDTA
10.

Tm Melting temperature
11.

TSA Tryptone Soya Agar
12.

TSB Tryptone Soya Broth



v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:

Tế bào vi khuẩn Proteus vulgaris dưới kính hiển vi điện tử 2

Hình 1.2:

Sự lan tỏa (swarming) của Proteus mirabilis trên môi trường thạch 3

Hình 1.4:

Tế bào lan của Proteus mirabilis kết thành bè và di chuyển trên một bề
mặt 5

Hình 1.5:

Minh họa 4 giai đoạn trong một chu kỳ lan toả của tế bào Proteus
mirabilis 6

Hình 2.1:

Sơ đồ cách tiếp cận tổng quát của đề tài 21

Hình 3.1:

Hình ảnh khuẩn lạc của 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 33

Hình 3.2:

Hình ảnh nhuộm Gram tế bào của 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 34

Hình 3.3:

Kết quả điện di DNA tổng số của các chủng cần định danh 41

Hình 3.4:

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA 41

Hình 3.5:

Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen rpoB 42

Hình 3.6:

Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng thí
nghiệm và các chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi Proteus. 56

Hình 3.7:

Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen rpoB của 5 chủng thí
nghiệm và 4 chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi Proteus. 57




vi

DANH MỤC BẢNG
.
Bảng 1.1:

Một số phản ứng sinh hóa của Proteus 4

Bảng 2.1 Danh sách các chủng vi khuẩn Proteus sử dụng cho nghiên cứu 16

Bảng 2.2:

Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 20E 23

Bảng 2.3:

Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 50CH 24

Bảng 3.1:

Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn bằng bộ Kit API
50 CH và API 20E 36

Bảng 3.2:

Đặc điểm sinh hóa khác biệt của 5 chủng nghiên cứu với các loài của chi
Proteus 39

Bảng 3.3:

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.7A (1024
nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 50

Bảng 3.4:Kết quả so sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng B3.7A (893 nucleotide)
với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 50

Bảng 3.5:

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.10B (1062

nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
51

Bảng 3.6: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng B3.10B (837
nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
51

Bảng 3.7:

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng CT1.1 (1409
nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 52

Bảng 3.8:

So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng CT1.1 (876 nucleotide) với
các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 52

Bảng 3.9:

So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng G1 (1388 nucleotide)
với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 53

Bảng 3.10:

So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng G1 (834 nucleotide) với các
trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 53



vii

Bảng 3.11:

So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng N1.4 (835 nucleotide)
với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 54

Bảng 3.12:

So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng N1.4 (881nucleotide) với các
trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 54

Bảng 3.13:

So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng nghiên cứu với các
chủng chuẩn của các loài trong chi Proteus 55

Bảng 3.14:

So sánh trình tự đoạn gen rpoB của 5 chủng nghiên cứu với các chủng
chuẩn của các loài trong chi Proteus 56

Bảng 3.15:

Đánh giá chung về định danh 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 58

viii
LỜI NÓI ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài:
Vi khuẩn Proteus thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae hiện nay
có 4 loài chính bên cạnh đó vẫn còn 3 Proteus genomospecies (4, 5 và 6) vẫn chưa

được đặt tên loài [17]. Tế bào vi khuẩn Proteus là tế bào Gram âm, có dạng hình
que ngắn đến dạng hình sợi dài, kỵ khí tùy ý, di động mạnh, có lông roi xung
quanh. Vi khuẩn Proteus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy trong xác
phân hủy của động vật, trong nước thải, trong phân người và động vật… Chúng
được tìm thấy như là hệ vi sinh vật bình thường của đường ruột. Vi khuẩn Proteus
được xác định là tác nhân gây bệnh cơ hội, gây ra các bệnh lý nhiễm trùng đường
tiết niệu, nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng huyết, viêm màng não ở trẻ sơ sinh,
viêm tủy xương [17], [20], [26]. Trên thế giới, các nghiên cứu về vi khuẩn
Proteus chủ yếu tập trung vào các chủng có nguồn gốc từ các bệnh nhân nhiễm
trùng đường tiết niệu ở người, ở Việt Nam các nghiên cứu về chi Proteus còn hạn
chế, đặc biệt các chủng phân lập từ động vật biển và khả năng sinh bacteriocin của
các chủng vi khuẩn Proteus này.
Việc định danh Proteus bằng cách sử dụng các phương pháp riêng lẻ như
phương pháp giải trình tự 16S rDNA hoặc sử dụng Kit API 50CHE trong một số
trường hợp không thể định danh đến loài, mặt khác tất cả các hệ thống được sử
dụng để xác định vi khuẩn, cho dù kiểu hình hoặc kiểu gen đều có những hạn chế,
bởi vì không có phương pháp thử nghiệm duy nhất nào cho kết quả chính xác
100%, nhưng yêu cầu tiên quyết là các chủng vi sinh vật probiotic phải được định
danh chính xác đến chi (genus) và loài (species) (FAO, 2002). Do vậy đề tài “Định
danh các chủng vi khuẩn thuộc chi Proteus phân lập từ động vật biển bằng
phương háp hóa sinh và sinh học phân tử” là rất cần thiết, tạo tiền đề cho các
nghiên cứu sâu hơn nhằm ứng dụng các chủng này trong thực tiễn sản xuất.
Mục tiêu của đề tài:
- Định danh 5 chủng vi khuẩn thuộc chi Proteus phân lập từ động vật biển.


ix

- Xây dựng cây phát sinh loài và nghiên cứu mối quan hệ của các loài Proteus
phân lập từ động vật biển.

Nội dung:
- Nuôi cấy, kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 5 chủng
nghiên cứu.
- Xác định khả năng trao đổi chất bằng Kit API 50CH và Kit API 20E.
- Tách chiết DNA của 5 chủng nghiên cứu.
- Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA và rpoB bằng kĩ thuật PCR.
- Giải trình tự, phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh loài.
Phạm vi nghiên cứu:
- 5 chủng cần nghiên cứu (B3.7A, B3.10B, CT1.1, G1, N1.4) thuộc chi
Proteus.
Ý nghĩa đề tài:
- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp định danh và phát hiện thêm các loài
(thuộc chi Proteus) mới có ý nghĩa trong tiến hóa và đa dạng sinh học.


1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi vi khuẩn Proteus
1.1.1. Đặc điểm phân loại học của Proteus
Về phân loại học Proteus được xếp vào:
Giới:

Bacteria
Ngành:

Proteobacteria
Lớp:

Grammaproteobacteria

Bộ:

Enterobacteriales
Họ:

Enterobacteriaceae
Chi:

Proteus
Loài:

Proteus mirabilis


Proteus vulgaris

Proteus hauseri

Proteus penneri

Chi Proteus ban đầu chỉ có 4 loài: Proteus vulgaris, Proteus rettgeri, Proteus
morgani và Proteus mirailis. Sau này Proteus morgani và Proteus rettgeri đã được
định danh lại, chúng lần lượt thuộc chi Morgagena và Providencia [20]. Dựa trên kĩ
thuật lai DNA-DNA, các chủng thuộc loài Proteus vulgaris đã được sắp xếp vào 3
nhóm sinh học (biogroup) khác nhau. Năm 1982, nhóm sinh học 1 đã được định
danh lại là Proteus penneri [9]. Năm 2000 các chủng thuộc nhóm sinh học 3 lại
được phân vào 4 genomospecies (3, 4, 5 và 6) [20]. Trong đó Proteus
genomospecies 3 được định danh lại là Proteus hauseri còn lại Proteus
genomospecies 4, 5, 6 vẫn chưa được đặt tên loài do thiếu những bằng chứng về đặc
điểm kiểu hình khác biệt. Việc hệ thống các loài của chi Proteus là phức tạp và có

thể còn nhiều thay đổi.
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Proteus
Proteus thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, bao gồm các trực
khuẩn Gram âm, di động mạnh, có lông roi xung quanh. Tế bào vi khuẩn Proteus có


2

nhiều hình dạng thay đổi trên các môi trường nuôi khác nhau, từ dạng trực khuẩn
đến dạng hình sợi dài.

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Proteus vulgaris dưới kính hiển vi điện tử
Proteus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy trong xác phân hủy
của động vật, trong nước thải, trong phân người và động vật. Proteus mirabilis và
Proteus vulgaris đã được phân lập từ đường ruột của động vật có vú, chim, bò sát.
Chúng phân bố rộng rãi trong môi trường đất, nước, nước thải và phân. Các loài
khác của Proteus phân bố ít rộng rãi hơn như Proteus penneri không tìm thấy trong
ruột gia súc mà chúng có trong vết thương, mẫu nước tiểu, sỏi bàng quan… [17],
[20].
Proteus sinh trưởng tối ưu ở 37
o
C, chúng dễ dàng mọc trên các môi trường
nuôi cấy thông thường [17]. Trên môi trường thạch dinh dưỡng, vi khuẩn Proteus
phát triển thành khuẩn lạc có dạng một vòng tròn đồng tâm, các vòng tròn lan dần ra
từng đợt, mỗi đợt là một gợn sóng và có mùi hôi.
Trên môi trường có Natri Deoxycholate, Proteus mọc thành khuẩn lạc trơn,
tròn, riêng biệt không gợn sóng, có một điểm đen ở trung tâm, xung quanh màu
trắng nhạt. Các tế bào Proteus phát triển trên môi trường lỏng dưới dạng hình que
ngắn 1,5 – 2 µm với 6 – 10 lông roi quanh bề mặt. Trên môi trường rắn, các tế bào
của Proteus kéo dài 60 - 80 µm với hàng trăm đến hàng ngàn lông roi mới [17].

3


Hình 1.2: Sự lan tỏa (swarming) của Proteus mirabilis trên môi trường thạch
1.1.3. Đặc tính sinh lý và sinh hóa của Proteus
Proteus thuộc nhóm kị khí tùy tiện, chúng có khả năng lên men một số loại
đường nhất định mà dựa vào đó người ta có thể phân biệt Proteus với các loài vi
khuẩn khác. Các loài thuộc chi Proteus có thể phân biệt với các chi Morganella và
Providencia dựa vào các phản ứng hóa sinh sau: có khả năng sản sinh H
2
S và lipase,
khả năng thủy phân gelatin, không có khả năng sinh acid từ việc lên men manose. Ở
cấp độ loài, có thể phân biệt Proteus mirabilis với Proteus vulgaris bằng khả năng
sản xuất indol từ Tryptophan, khoảng 95,7% Proteus mirabilis cho kết quả âm tính
trong khi đó Proteus vulgaris lại cho kết quả 88,9% dương tính với thử nghiệm
indol (IND) [17] [20].
Hầu hết các chủng Proteus đều có khả năng sản sinh enzyme urease mạnh,
nhanh chóng thủy phân urea thành ammoniac và carbon monoxide (CO). Các đặc
điểm sinh hóa đặc trưng của Proteus được trình bày trong Bảng 1.1 [17].
Tế bào của vi khuẩn Proteus rất đăc biệt, có thể tồn tại dưới hai dạng hình
thái và sinh lý riêng biệt, được gọi là tế bào bơi (swimmer) và các tế bào lan
(swarmer). Trong môi trường lỏng P. mirabilis được tìm thấy trong trạng thái tế bào
bơi (swimmer), hình que ngắn, có chiều dài từ 1,5 - 2 µm với 6 đến 10 lông roi phân
bố đều trên bề mặt tế bào. Trên môi trường rắn, Proteus có khả năng chuyển đổi
sang trạng thái tế bào lan. Các tế bào vi khuẩn kéo dài đáng kể để tạo thành sợi dài

4

hơn rất nhiều lần so với tế bào bơi ban đầu, chiều dài tế bào lan khoảng 10 µm đến
80 µm với rất nhiều lông roi xung quanh (khoảng 10
3
- 10
4
lông roi).
Bảng 1.1: Một số phản ứng sinh hóa của Proteus
Phản ứng sinh hóa
Kết
quả
Phản ứng sinh hóa
Kết
quả
Arginine dihydrolase
Lysine decarboxylase
Ornithine deaminase
Phenylalanine deaminase
Sinh acid khi len men D-
Glucose
Sinh acid khi lên men
melibiose
Chuyển hóa nitrate từ nitrite

Sản sinh lipase
-
-
+

+

+

-
+
+
Sản sinh ONPG
Sinh acid khi len men mannose
Sinh acid khi len men inositol
Sinh acid khi len men D-
mannitol
Sinh acid khi len men D-arabitol

Sinh acid khi len men adonjtol
Sinh acid khi len men erythritol
Thủy phân gelatin
Sản sinh H
2
S
-
-
-

-
-
-
-
+
+

Các tế bào dàn song song để tạo thành bè có khả năng di chuyển nhanh trên
bề mặt với một số lượng lớn các tế bào lan. Tự tế bào lan không thể di chuyển được
trên bề mặt thạch mà các tế bào lan cần kết bè với nhau (Hình 1.4) [17].

(a) (b)
Hình 1.3: Tế bào bơi (swimmer) và tế bào lan (swarmer) của vi khuẩn Proteus
mirabilis


5

Khi đưa tế bào bơi từ môi trường lỏng vào môi trường rắn (chẳng hạn như
môi trường thạch dinh dưỡng) tế bào bơi sẽ thay đổi về mặt hình thái và sinh lý. Sau
khi tiếp xúc với bề mặt môi trường, các tế bào sẽ nhanh chóng biệt hóa tạo thành các
tế bào có hình thái và sinh hóa đặc trưng gọi là tế bào lan. Ngoài chiều dài và số
lượng lông roi nhiều gấp bội lần so với tế bào bơi thì số lượng nhiễm sắc thể trong
mỗi tế bào cũng tỉ lệ thuận với gia tăng chiểu dài. Đồng thời về mặt sinh lý, có sự
gia tăng đáng kể trong tổng hợp protein và enzym urease được sản xuất với số lượng
cao hơn so với ở trạng thái tế bào bơi từ 30 đến 80 lần. Các polysaccharid được tiết
ra với số lượng lớn từ các tế bào và điều này tạo điều kiện cho việc tăng cường độ
bám dính và di chuyển của các tế bào.

Hình 1.4: Tế bào lan của Proteus mirabilis kết thành bè và di chuyển trên một
bề mặt

Quá trình lan tỏa của Proteus mirabilis diễn ra theo chu kỳ, mỗi chu kỳ bao
gồm 4 giai đoạn chính
:
+ Giai đoạn 1: Giai đoạn đa bội (là giai đoạn biệt hóa tế bào swimmer thành

thế bào swarmer).
+ Giai đoạn 2: Giai đoạn chuẩn bị trước khi chuyển động.
+ Giai đoạn 3: Giai đoạn lan tỏa (các tế bào lan tương tác với nhau và phối
hợp chuyển động theo hướng từ vị trí ban đầu trong khoảng vài giờ).
+ Giai đoạn 4: Là giai đoạn củng cố, các tế bào ngừng di chuyển và biệt hóa
trở lại hình thái ban đầu của tế bào bơi (swimmer).


6

Quá trình tiếp tục lặp lại tạo nên các vòng tròn đồng tâm trên bề mặt thạch
cho đến khi bao phủ kín đĩa thạch.
1.1.4. Tình hình nghiên cứu về chi Proteus trên thế giới và ở Việt Nam
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Proteus, đặc biệt là các loài
Proteus mirabilis và Proteus vulgaris về khả năng gây ra bệnh lý nhiễm trùng
đường tiết niệu. Proteus không phải là nguyên nhân quan trọng của bệnh lí nhiễm
trùng đường tiết niệu mà chúng chỉ gây bệnh khi chức năng bình thường của đường
tiết niệu bị xáo trộn hoặc có thể lây truyền giữa những người sử dụng ống thông tiểu
kéo dài. Ngoài ra, Proteus còn là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng vết thương và
nhiễm trùng huyết, viêm não màng não ở trẻ sơ sinh, viêm mủ màng phổi, viêm tủy
xương… Ở bò, Proteus mirabilis và Proteus vulgaris gây viêm nội mạc tử cung, sẩy
thai, viêm dạ dày, viêm khớp… [17].

Hình 1.5: Minh họa 4 giai đoạn trong một chu kỳ lan toả của tế bào Proteus
mirabilis
Ở lợn, Proteus gây hội chứng mất sữa sau khi sinh, lây nhiễm đường tiết
niệu, tiêu chảy. Ở chó, mèo, chúng gây viêm bàng quang, đôi khi Proteus được coi


7

như là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm. Ở nhiều loài cá, Proteus penneri gây bệnh
xuất huyết [17].
Trong y học, Proteus mirabilis được sử dụng làm kháng nguyên trong phản ứng
huyết thanh chẩn đoán bệnh sốt mò do cấu trúc kháng nguyên oxk của vi khuẩn
Proteus mirabilis tương tự với kháng nguyên của ấu trùng mò Rickettsia orientalis [3].
Trên thế giới đã có một vài nghiên cứu về khả năng sản sinh bacteriocin của
Proteus [5], [14]. Ở Việt Nam, khả năng sản sinh bacteriocin của chúng đã được bắt
đầu nghiên cứu [24].
Người ta có thể định danh vi khuẩn Proteus bằng sử dụng các kĩ thuật như
xác định đặc điểm hình thái, sinh lý đặc trưng, sử dụng bộ Kit API 20E, sử dụng kĩ
thuật lai DNA-DNA, kĩ thuật giải và phân tích trình tự gen 16S rDNA. Một số
nghiên cứu mới đây sử dụng gen rpoB như chỉ thị phân tử để hổ trợ cho định danh
vi khẩn Proteus đã cho kết quả khả quan với khả năng phân tách tốt hơn nhiều so
với việc sử dụng gen 16S rDNA [8], [13], [17].
1.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn
1.2.1. Tổng quan chung về các phương pháp định danh vi khuẩn
Định danh vi khuẩn là công việc xếp loại vi khuẩn theo hệ thống đơn vị phân
loại sinh vật với danh pháp theo thứ tự giới (kingdom), ngành (phylum), lớp (class),
bộ (order), họ (family), chi (genus), loài (species), dưới loài (subspecies).
Có rất nhiều phương pháp để định danh vi khuẩn trong đó có phương pháp
định danh chính như sau:
- Định danh bằng phương pháp truyền thống
- Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống
1.2.1.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống
Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987 khi Ferdinad
Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dáng tế bào. Mặc dù phương pháp này tỏ ra
tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức… nhưng vẫn được sử
dụng để định danh vi khuẩn vì các ưu điểm lớn của nó như: đây là phương pháp tiêu
chuẩn vì nó được xây dựng và phát triển trong thời gian dài được nhiều nước công

8

nhận, quá trình phân lập trải qua nhiều bước chọn lọc, khẳng định nên kết quả có độ
tin cậy cao.
Phương pháp truyền thống định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu
phân loại như đặc điểm hình thái, sinh lý, nhuộm, hình thái tế bào khuẩn lạc, khả
năng di động
Định danh bằng phương pháp Bacteriophage: dựa trên cơ sở khoa học là mỗi
loại vi khuẩn là vật chủ của một loại virus gọi là Bacteriophage, mỗi phage có thể
nhân lên đặc hiệu ở mỗi loài vi khuẩn nhất định và gây bệnh cho vi khuẩn đó. Bằng
phương pháp dùng phage đã biết trước cho tiếp xúc với vi khuẩn đang cần xác định,
nếu đặc hiệu thì tế bào vi khuẩn sẽ bị phage gây bệnh và phá hủy. Tuy nhiên
phương pháp này thực tế không được sử dụng để định danh vi khuẩn vì nó bộc lộ
một số nhược điểm khó giải quyết như các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với
phage bị ảnh hưởng bởi ngoại cảnh hoặc các vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác
nhau đối với các bacteriophage khác nhau. Điều quan trọng nữa là bacteriophage rất
dễ biến đổi đặc tính nên dẫn đến làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.
Phân loại vi khuẩn theo kiểu huyết thanh: Nguyên tắc của phương pháp là
dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật. Ưu điểm của
phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để phân biệt nhiều chi vi
khuẩn khác nhau thậm chí nhiều trường hợp có thể đặc trưng cho loài. Hạn chế của
phương pháp này là yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa
các phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính
ổn định giữa các lần lặp lại.
Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn: nguyên tắc phân loại dựa vào các
kiểu bacteriocin. Bản chất của bacteriocin là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi
khuẩn để chống lại các vi khuẩn khác. Vì vậy loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin
nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó.

Như vậy ta có nhiều phương pháp truyền thống khác nhau để phân loại và
định danh vi khuẩn. Tuy nhiên, mỗi cách lại có nhược điểm nhất định và không có


9

tính vạn năng để áp dụng cho tất cả các vi khuẩn. Vì vậy để có kết quả chính xác
hơn cần phải kết hợp các phương pháp để định danh.
1.2.1.2. Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp truyền thống, nhiều phương
pháp nhanh và tự động đã được phát triển và thương mại hóa như phương pháp
miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot) và các kỹ thuật sinh học
phân tử như PCR, multiplex – PCR, Realtime PCR… Các phương pháp này gọi
chung là các phương pháp hiện đại. Đặc điểm chung của các phương pháp này là
cho kết quả nhanh hơn phương pháp truyền thống và có thể áp dụng cho tất cả các
vi sinh vật kể cả các vi sinh vật khó có khả năng nuôi cấy như các xoắn khuẩn (tác
nhân gây bệnh giang mai), các tác nhân gây bệnh đường sinh dục, vi khuẩn lao,
Helicobacter (Hp)…
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Hiện nay
kĩ thuật này đã được cải tiến rất nhiều so với bản gốc của chúng và được sử dụng
rộng rãi nhất trong việc định danh phát hiện các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh
PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA từ mạch khuôn từ một trình tự
đích ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của trình tự khuôn thành hàng triệu
bản sao khác nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc
hiệu cho đoạn DNA này.
Nguyên tắc chung của phương pháp PCR: phản ứng PCR là một chuỗi các
quy trình kế tiếp nhau dựa trên sự hoạt động của enzyme Taq polymerase hoạt động
tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn và mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích sẽ
tăng theo mỗi chu kỳ của phản ứng.

Một chu kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn chính:
• Giai đọan biến tính: phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn
nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thường là 94-95
o
C làm phá vỡ các
liên kết hydrogen để tách hai sợi DNA ra.


10

• Giai đoạn bắt cặp: nhiệt độ được hạ thấp xuống khoảng 40-70
o
C (thấp
hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn
DNA sợi đơn.
• Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được tăng lên 72
o
C, enzyme DNA
polymerase hoạt động, nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Các thành phần của phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và ảnh
hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR
+ Khuôn DNA
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch
chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1 µg xuống còn 100
ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao.Một ưu điểm lớn của
phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo
quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô,
hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết…
+ Enzyme

Nồng độ Taq polymerase thích hợp cho phản ứng là từ 1 – 2,5 đơn vị (u) cho
100 µl dung dịch phản ứng. Thông thường có thể sử dụng 0,5 u/25 µl. Nếu nồng độ
Taq polymerase quá cao, có thể dẫn tới các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm
sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp, sẽ không đủ lượng enzyme
để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn
+ Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA ngắn cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây
chuyền tổng hợp DNA. Mồi là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại
của một thí nghiệm PCR.Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp
PCR và phải tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:
• Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung
giữa mồi xuôi và mồi ngược cũng như không có cấu trúc kẹp tóc do có
sự bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một mồi.


11

• Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt
quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC
lặp đi lặp lại nhiều lần.
• Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại,
không trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
• Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên trình tự nhỏ hơn 1 kb.
+ Nồng độ các dNTP
Nồng độ dNTP (deoxynucleotide triphotphate) thường được sử dụng là 20 –
200 µM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh’’. Bên cạnh đó, sự cân
bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Mất cân bằng
trong thành phần các dNTP làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.
+ Nồng độ Mg

2+

Nồng độ Mg
2+

cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR.
Mg
2+

rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, là cofactor cho enzyme Taq
polymerase. Nếu nồng độ Mg
2+

quá thấp thì Taq polymerase sẽ hoạt động kém và
hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg
2+

cao làm tăng hiện tượng bắt cặp
giả và cho ra những sản phẩm không đặc hiệu. Chính vì vậy phải có nồng độ tối ưu
cho từng phản ứng. Thông thường, Mg
2+

được sử dụng ở nồng độ từ 1,5 – 4 mM.
+ Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lượng bản mẫu
ban đầu. Ví dụ nếu số lượng bản mẫu là 10
5
bản sao thì cần 25-30 chu kỳ, nếu
số lượng bản mẫu là 10
2

-10
3
thì số chu kỳ thường cần khoảng 35-40 chu kỳ…
Trong thực tế, không vượt quá mức 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR vì phản
ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng lên
theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm
hẳn vì các nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản
ứng, sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng
hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.


12

1.2.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn Proteus
1.2.2.1. Định danh bằng test hóa sinh
Yêu cầu đầu tiên cũng là quan trọng đối với test sinh hóa là phải thu được các
khuẩn lạc đơn, thuần khiết để việc định danh được chính xác hơn. Việc định danh
này được thực hiện dựa vào các đặc điểm kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng trao
đổi chất của vi sinh vật. Các cách để tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa
dùng cho mục đích định danh là cách truyền thống, sử dụng bộ Kit và dùng các thiết
bị tự động.
Các thử nghiệm sinh hóa của hàng trăm loài vi sinh vật tại nhiều phòng thí
nghiệm khác nhau trên thế giới được tổng hợp thành những bản định danh vi sinh
vật. Bảng sinh hóa bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất để phân loài vi
sinh vật được biểu thị bằng một trị số là tỉ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết
quả dương tính theo thống kê ở một loài sinh vật.như vậy, trị số 100 có nghĩa là
100% trường hợp của loài này đã thử đều cho các thử nghiệm dương tính, ngược lại
số 0 có nghĩa là có 0% trường hợp thử nghiệm cho kết quả dương tính. Trong thực
tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị quy ước bằng các ký hiệu
như (+): dương tính, (-): âm tính; (+/-) khoảng trên 70% là dương tính và (-/+)

khoảng 70% là âm tính.
Hiện nay đối với việc test sinh hóa bằng Kit thì việc kiểm tra kết quả sau khi
test sẽ đơn giản hơn vì sẽ không cần phải dò bảng kết quả mà ta chỉ việc nhập các
kết quả vào máy và máy sẽ tự động phân tích các dữ liệu có sẵn trong máy và xuất
ra cho chúng ta kết quả chính xác của loài đó dựa trên kết quả thí nghiệm và dữ liệu
từ máy đó. Muốn kết quả chính xác hơn và mang tính cập nhật thì tốt nhất là tra trên
dữ liệu online như trên trang web hoặc trên ABIS
online www.tgw1916.net/intro.html .
Ngày nay các thử nghiệm sinh hóa truyền thống để định danh vi sinh vật đã
có thực hiện ở dạng đĩa giấy, que giấy, ngoài ra còn có các bộ Kit cho phép thực
hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hóa để đinh danh vi sinh vật một cách dễ dàng và
thuận tiện. Các bộ Kit này được sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưu điểm là tiết


13

kiệm thời gian, công sức, tuy nhiên cũng có nhược điểm như mỗi bộ Kit chỉ định
danh được một số loại vi sinh vật nhất định, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn.
Trong đề tài này chúng tôi chọn bộ Kit API 50CH và bộ Kit API 20E để định
danh các chủng thuộc chi Proteus. Bộ Kit API 50CH là bộ Kit bao gồm 49 các phản
ứng sinh hóa dùng để test nhanh khả năng lên men chuyển hóa cacbohydrate của các
vi sinh vật với cơ chất là các loại cacbohydrate và dẫn xuất của chúng như
heterosides, polyalcohols, uronic acids. Chúng tôi sử dụng bộ Kit 50CHB/E vì đây
là bộ Kit thiết kế riêng để định danh cho Bacillus và các chi liên quan, các chủng
Gram âm thuộc Enterobacteriaceae và họ Virionaceae. Trong khi ủ, cacbonhydrate
được lên men tạo thành các sản phẩm acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường, và
phàn ứng được phát hiện bởi sự thay đổi màu của chỉ thị Phenol red (được cho sẵn
vào các giếng). Kit API 50CH được khuyến cáo nên sử dụng kèm theo với Kit API
20E để định danh các Enterobacteriaceae và họ Virionaceae vì đây là bộ Kit được
thiết kế riêng để định danh cho các chủng này. Trong bộ Kit API 20E có một số các

phản ứng quan trọng đặt trưng để phát hiện các loài thuộc chi Proteus (chi Proteus
mà chúng ta cần định danh thuộc họ Enterobacteriaceae).
1.2.2.2. Định danh bằng sinh học phân tử
Ngày nay sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân
loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới. Phương pháp hiện đại trong
định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong
một thời gian ngắn. Phân tử 16S rRNA ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm
men thì tình tự D1/D2 26S rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến
để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và
định danh vi sinh vật. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức
năng không đổi, phân tử 16S rRNA còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào,
có tính bảo thủ cao nhưng vẫn có sự khác biệt giữa các loài và đặc trưng cho từng
nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ kích thước vừa
phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự. Các trình tự


14

rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng vì DNA là vật liệu dễ
thu nhận và có tính bền cao hơn so với RNA.
Việc định danh bằng chỉ thị phân tử 16S rRNA là một công cụ mạnh mẽ và
đến nay đã trở thành kỹ thuật phân tử phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để xác
định sự khác biệt các loài vi khuẩn bằng sinh học phân tử [15] tuy nhiên kĩ thuật này
cho khả năng phân tách loài chưa tốt và không có hướng dẫn thống nhất để xác định
thế nào là một loài dựa trên chỉ thị phân tử 16S rDNA, một chủng với mức độ tương
đồng lớn hơn 97% có thể hoặc không thể thuộc cùng một loài vì thế cần có những kĩ
thuật bổ trợ để xác định chính xác được đến mức loài cho vi khuẩn [17]. Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra những vấn đề còn hạn chế của việc sử dụng chỉ thị phân tử 16S
rRNA và chứngng minh khả năng phân tách loài khi sử dụng chỉ thị phân tử rpoB để
bổ trợ cho việc định danh đến loài nhất họ Enterrobacteriace [5], [15], [16]. Đặc biệt

là các mối quan hệ di truyền chặc chẽ giữa 2 loài P. vulgaris và P. penneri không
thể phân biệt rõ ràng bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA [16]
Trong số các gen chính của vi khuẩn, gen rpoB đã được xác định là một
trong số ít các gen có tiềm năng thích hợp cho phân tích phát sinh loài vi khuẩn và
đã được đề xuất như một công cụ phổ biến mạnh mẽ để xác định về di truyền của vi
khuẩn [16]. Gen rpoB là gen mã hóa cho tiểu đơn vị β-RNA polymerase trong hệ
gen của chúng, như chúng ta đã biết RNA polymerase là một nhân tố quan trọng
trong quá trình phiên mã nên có tính bảo thủ và đặc trưng rất cao, mặc khác gen
rpoB lại có mặt trong tất cả các vi khuẩn. Việc sử dụng gen rpoB như chỉ thị phân tử
để phân tích phát sinh loài là đặc biệt quan trọng cho các nghiên cứu tập trung trên
mức chi hoặc thấp hơn vì trình tự rpoB đã được chứng minh có thể mô tả những loài
khác nhau thuộc chi Proteus trên cơ sở phân tử [7], [8], [16], [20]. Gen rpoB là gen
mã hóa protein nên có nhiều lợi thế hơn các gen chỉ thị phân tử mã hóa cho phân tử
RNA (gen rpoB có thể được sử dụng ở cả hai axit amin và nucleotide). Mồi và mẫu
dò cho gen rpoB để phát hiện và phân tích phát sinh loài của một số nhóm vi khuẩn
thuộc họ Enterobacteriaceae đặc biệt là chi Proteus đã được thiết kế riêng ([6], [13],
[16], [26].


15

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kết hợp cả quan sát hình thái,
nhuộm Gram, test sinh hóa, giải trình tự gen 16S rDNA và gen rpoB với các đoạn
mồi đặc hiệu nhờ phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để định danh 5
chủng vi khuẩn Proteus.