Nghiên cứu ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong vi nhân giống cây hồng môn (Anthurium andraeanum) từ mô lá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƢỜNG




NGUYỄN TIẾN GIA

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA
SINH TRƯỞNG THỰC VẬT TRONG VI NHÂN GIỐNG
CÂY HỒNG MÔN (Anthurium andraeanum) TỪ MÔ LÁ


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chun Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC


GVHD: ThS. PHẠM NGỌC MINH QUỲNH



Nha Trang, tháng 07 năm 2013

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CỤM TỪ VIẾT TẮT ……………………

i
DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………
ii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ………………………………………………
iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ……………………………………………………
v
LỜI MỞ ĐẦU ………………………………………………………………
1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………
3
1.1 Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ……………
3
1.1.1. Khái niệm về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật …
3
1.1.2. Cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật …
4
1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào ……………………………………….
4
1.1.2.2. Sự phân hóa, phản phân hóa của tế bào ………………………
4
1.1.3. Ƣu và nhƣợc điểm của nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy
mô tế bào ở thực vật …………………………………………………………
5
1.1.3.1. Ưu điểm …………………………………………………………
5
1.1.3.2. Nhược điểm ……………………………………………………
6
1.1.4. Các kỹ thuật thƣờng dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật …
6

1.1.4.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ………………………………………
6

1.1.4.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời ………………………………
7
1.1.4.3. Nuôi cấy mô sẹo ………………………………………………
8
1.1.4.4. Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ……………………………………
9
1.1.4.5. Nuôi cấy tế bào đơn ……………………………………………
9
1.1.4.6. Nuôi cấy protoplast ……………………………………………
10
1.1.5. Các giai đoạn nhân giống in vitro …………………………………
10
1.1.5.1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị ………………………… ………………
10
1.1.5.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu cấy…………………………………
11
1.1.5.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh ……………………………………….
11
1.1.5.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh ………………………………
12
1.1.5.5. Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiện …
12
1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô thực vật …………
13
1.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy ………………………………………………
13
1.2.1.1 Khoáng đa lượng ………………………………………………

13
1.2.1.2. Khoáng vi lượng ………………………………………………
15
1.2.1.3. Nguồn cacbon hữu cơ …………………………………………
15
1.2.1.4. Các vitamin ……………………………………………………
16
1.2.1.5. Các amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác …………
16
1.2.1.6. Các chất bổ sung ………………………………………………
17
1.2.1.7. pH môi trường …………………………………………………
18

1.2.2. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật …………………………
18
1.2.2.1. Cơ sở lý thuyết của việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng ……
18
1.2.2.2. Nhóm auxin ……………………………………………………
19
1.2.2.3. Nhóm cytokinine ………………………………………………
20
1.2.2.4. Nhóm gibberelline ………………………………………………
21
1.2.2.5. Abscisic acid ……….……………………………………………
22
1.2.2.6. Nhóm ethylene ………………………………………………….
23
1.2.3. Vật liệu nuôi cấy …………………………………………………….
23

1.2.4. Điều kiện vô trùng ………………………………………………….
24
1.2.5. Điều kiện nuôi cấy …………………………………………………
25
1.2.5.1. Nhiệt độ …………………………………………………………
25
1.2.5.2. Ánh sáng ………………………………………………………
26
1.3. Giới thiệu về cây Hồng môn (Anthurim andreanum) ………………….
26
1.3.1. Nguồn gốc và phân loại ……………………………………………
26
1.3.2. Đặc điểm thực vật học ……………………………………………
27
1.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh thái …………………………………………
29
1.3.4. Tình hình nghiên cứu cây hồng môn ……………………………
29
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………
33
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu …………
33
2.2. Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………………
33

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ………………………………………………
33
2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy ………………………………………………
33
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy …………………………………………………

34
2.3. Nội dung nghiên cứu …………………………………………………….
34
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………………………………….
35
2.4.1. Bố trí thí nghiệm ……………………………………………………
35
2.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian
đến hiệu quả khử mẫu …………………………………………………………
36
2.4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D, sự kết hợp giữa 2,4-D với
BA và đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ……………………………………
37
2.4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và Ki đến quá trình tái sinh chồi
từ mô sẹo ………………………………………………………………………
38
2.4.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Ki và NAA đến khả năng nhân
nhanh cụm chồi ………………………………………………………………
39
2.4.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng
ra rễ và chất lượng rễ ………………………………………………………….
40
2.4.2. Phƣơng pháp tiến hành …………………………………………….
41
2.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu …………………………………………
41
2.4.2.2. Phương pháp xử lý khử trùng mẫu ……………………………
41
2.4.2.1. Phương pháp cấy mẫu …………………………………………
42

2.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi và phƣơng pháp xác định …………………
42

2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ………………………………………….
44
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………….
45
3.1. Nghiên cứu quy trình khử trùng mẫu ………………………………….
45
3.2. Nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo mô sẹo …………………………….
49
3.3. Nghiên cứu quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo ………………………….
55
3.4. Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi ………………………………
59
3.5. Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh ………………………………………
66
3.6. Đề xuất quy trình vi nhân giống Hồng môn …………………………
71
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………….
74
4.1. Kết luận …………………………………………………………………
74
4.2. Kiến nghị …………………………………………………………………
74
TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………
75
PHỤ LỤC

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CỤM TỪ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid.
NAA : 1-naphthaleneacetic acid.
BA : 6-benzyladenin.
Ki : Kinetin (N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine ).
MS : Murashige và Skoog, 1962.
ĐC : Đối chứng.
NT : Nghiệm thức.
TB : Trung bình.
CS : Cộng sự.
NXB : Nhà xuất bản.










ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng
Trang
1
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen :
nước cất là 1:2.
36
2
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen :
nước cất là 1:1.
36
3
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của 2,4-D trong quá trình cảm ứng tạo mô
sẹo.
37
4
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình
cảm ứng tạo mô sẹo.
37
5
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của Ki lên khả năng tái sinh chồi từ mô
sẹo.
38
6
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô
sẹo.
38
7
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng nhân nhanh
chồi.
39

8
Bảng 2.8. Ảnh hưởng của BA và Ki lên khả năng nhân nhanh
chồi.
39
9
Bảng 2.9. Ảnh hưởng của BA, Ki và NAA lên khả năng nhân
nhanh chồi.
40
10
Bảng 2.10. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng
ra rễ và chất lượng rễ.
40
11
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen :
46
iii

nước cất là 1:2.
12
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen :
nước cất là 1:1
47
13
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D trong quá trình cảm ứng tạo mô
sẹo.
50
14
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình
cảm ứng tạo mô sẹo sau 10 tuần nuôi cấy.
51

15
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Ki lên khả năng tái sinh chồi của từ mô
sẹo.
55
16
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi của từ
mô sẹo.
57
17
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng nhân nhanh.
60
18
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của BA và Ki lên khả năng nhân nhanh
chồi.
62
19
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của BA, Ki và NAA lên khả năng nhân
nhanh chồi.
64
20
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng
ra rễ của Hồng môn sau 4 tuần.
67






iv

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

STT
Tên bảng
Trang
1
Biểu đồ 3.1. Hiệu quả khử trùng với tỷ lệ javen: nước và thời gian
khác nhau.
47
2
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ tạo mô sẹo dưới tác động của 2,4-D và BA.
51
3
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của BA và Ki đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô
sẹo.
59
4
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến hệ số
nhân chồi.
66
5
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến tỷ lệ ra rễ ở
cây Hồng môn.
67
6
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến chiều dài và
số rễ trung bình ở cây Hồng môn.
68

v

DANH MỤC HÌNH
STT
Tên bảng
Trang
1
Hình 1.1. Cây Hồng môn Anthurium andraeanum.
27
2
Hình 1.2. Cấu tạo của hoa Hồng môn.
27
3
Hình 1.3. Các sắc thái của hoa Hồng môn.
28
4
Hình 2.1. Mẫu lá 2 tuần tuổi.
41
5
Hình 3.1. Tình trạng lá sau khi khử trùng.
49
6
Hình 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình

cảm ứng tạo mô sẹo sau 10 tuần nuôi cấy.
53
7
Hình 3.3. Quá trình hình thành mô sẹo trên mẫu lá.
54
8
Hình 3.4. Hình thái cụm chồi khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung
Ki.
56
9
Hình 3.5. Ảnh hưởng của BA khả năng tái sinh chồi của từ mô sẹo.
58
10
Hình 3.6. Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA trong quá trình tái
sinh chồi.
61
11
Hình 3.7. Ảnh hưởng của BA kết hợp với Ki trong quá trình tái
sinh chồi.
63
12
Hình 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến chất lượng
chồi
65
13
Hình 3.9. Ảnh hưởng NAA đến quá trình ra rễ cây Hồng môn.
70

1

LỜI MỞ ĐẦU
Hồng môn (Anthurium andreanum) là một loại cây thân cỏ lâu năm thuộc họ
Ráy (Araceae), có nguồn gốc từ các nước nhiệt đới vùng Trung và Nam Mỹ. Đây là
loài hoa đẹp, đa dạng về màu sắc và khá bền nên Hồng môn được trồng để lấy hoa,
làm cảnh, trang trí phòng làm việc, trong nhà hoặc trang trí trong nhiều dịp như:
đám cưới, sinh nhật, ngày Tết, lễ hội,…và là một mặt hàng có giá trị kinh tế cao
trên thị trường thế giới. Ngành sản xuất hoa Hồng môn đã đem lại một nguồn thu
nhập lớn tại một số nước như: Hà Lan, Nhật Bản, Mỹ…Trong thời gian gần đây,
cây Hồng môn đã du nhập vào Việt Nam và được trồng sản xuất tại một số nơi như
Đà Lạt, Di Linh, Bảo Lộc và Hà Nội; và trở thành mặt hàng tiêu thụ nhanh trên thị
trường .
Khả năng nhân giống của Hồng môn trong tự nhiên rất thấp, chỉ đạt 1-3 cây
con/cây mẹ trong một năm, nên khi sản xuất với quy mô lớn sẽ gặp khó khăn về
nguồn giống. Tại một số nước có nền công nghiệp trồng Hồng môn phát triển,
nguồn giống Hồng môn được chủ động hoàn toàn thông qua việc sản xuất cây giống
bằng phương pháp nuôi cấy mô. Nhờ có phương pháp nuôi cấy mô đã ra một số
lượng lớn cây giống đồng nhất, chất lượng, sạch bệnh và chủ động nguồn giống
phục vụ sản xuất quanh năm.
Quá trình nhân giống in vitro bị ảnh hưởng rất nhiều yếu tố như thành phần
môi trường, nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng, yếu tố vật lý, nguồn vật liệu ban
đầu…Một số nghiên cứu trước đây cho thấy, việc nhân giống Hông môn thành công
cao nhất từ mẫu lá non của cây phải trải qua nhiều giai đoạn khác nhau: mô sẹo, tái
sinh chồi và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Quá trình phát triển hình thái qua các
giai đoạn nhân giống chịu sự tác động của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật.
Mỗi giai đoạn phụ thuộc vào loại chất điều hoà sinh trưởng và nồng độ khác nhau.
Chính vì vậy, để tìm hiểu mức độ tác động của chúng đến các giai đoạn nhân
giống của cây Hồng môn, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu ảnh hƣởng các chất
2

điều hòa sinh trƣởng thực vật trong vi nhân giống cây Hồng môn (Anthurium

andraeanum) từ mô lá”, trên cơ sở kết quả nghiên cứu này xây dựng quy trình
nhân giống in vitro và áp dụng trong điều kiện thực tế.












3

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật.
1.1.1. Khái niệm về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy thực vật in vitro) là phạm trù khái
niệm cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật
trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [8].
Quá trình hình thành cơ quan in vitro chịu sự tác động trực tiếp từ 3 nhân tố:
môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy
mô, con người đã nhân giống các loại thực vật nhanh hơn gấp nhiều lần so với trong
tự nhiên, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ
và rút ngắn thời gian đưa một giống mới phục vụ sản xuất với quy mô lớn.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất

quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loại thực vật, giúp mở ra những hướng nghiên
cứu mới về sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý
phân tử - đột biến và nhiều vấn đề sinh học khác…
1.1.2. Cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật.
1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào.
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về
tính toàn năng của tế bào.
Gottlibeb Haberlandt (1902) – nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn
năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời”. Theo ông:
“Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di
4

truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào
đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”.
Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn
chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy
mô thương mại bằng cách nuôi cấy mô trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái
sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn.
1.1.2.2. Sự phân hóa, phản phân hóa của tế bào.
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau.
Sự phản phân hóa là quá trình ngược lại với quá trình phân hóa, tức là tế bào
đã phân hóa thành mô chức năng không hòa toàn mất đi khả năng phân chia mà
trong một điều kiện thích hợp nhất định chúng có thể quay về dạng phôi sinh và tái
phân chia.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực chất là kết quả của
các quá trình phân hóa và phản phân hóa. Các quá trình có thể tóm tắt như sau:

Sơ đồ 1. Quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào.
5

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức
chế gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen
nhất định được hoạt hóa (mà vốn trước đây bị ức chế) cho ta tính trạng mới, một số
khác bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa
trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào, làm cho quá trình sinh trưởng phát triển
của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác trong khối mô bình thường tế bào
luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, sự ức chế
của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen sẽ được hoạt hóa và quá trình
phân hóa sẽ xảy ra theo một chương trình định sẵn [11].
1.1.3. Ƣu và nhƣợc điểm của nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế
bào ở thực vật [7], [8].
1.1.3.1. Ưu điểm.
Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một
quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương
mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công
nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có
thể tạo thành hàng triệu cây.
Tiết kiệm không gian: các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây
tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và
trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu
để loại trừ virus, vi khuẩn, nấm khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch
bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15-25% so với giống được thực
hiện bằng phương pháp nhân giống thông thường.
Chủ động trong việc lưu trữ, bảo quản nguồn gen quý hiếm mà các kỹ thuật
trong tự nhiên khó áp dụng.

6

Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa
dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác
nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực
vật quốc tế.
Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian
nào, không phụ thuộc mùa vụ, chủ động trong sản xuất vì được thực hiện trong
phòng thí nghiệm [3].
1.1.3.2. Nhược điểm.
Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không
phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều
cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu
cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến
nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành
thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống
như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai
khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con
không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn
đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng
hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý
khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền
[3].
1.1.4. Các kỹ thuật thƣờng dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.1.4.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Trong nuôi cấy in vitro, một phương pháp thường được sử dụng để tạo
những giống hoàn toàn sạch virus là phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Hiểu
7

một cách đúng nghĩa thì nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sử dụng phần mô phân sinh
ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, tức là các đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,1 –
0,15mm tính từ chóp sinh trưởng. Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện dưới
kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường không
cao [3], [9].
Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về
mặt di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống và
tính ổn định tăng, nếu độ lớn giảm thì tỷ lệ sống và tính ổn định giảm.
Trên thực tế người ta thường nuôi cả đỉnh chồi non với kích thước khoảng
vài mm. Đó có thể là đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách. Mỗi đỉnh sinh trưởng
nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát
triển thành cây hoàn chỉnh.
1.1.4.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời.
Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả
khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện
thuận lợi. Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã
cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo
nhiều hơn.
Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác
nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường
và các muối của các nguyên tố đa lượng ( N, P, K, Ca) và vi lượng ( Mg, Fe, Mn,
Co, Zn, ). Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B
1
, B
6
, B
3
, ) và các
chất điều hoà sinh trưởng.

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi
cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acid
amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh
trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các
chất này [3].
8

1.1.4.3. Nuôi cấy mô sẹo.
Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là
nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế
bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi
soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…
Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô và các cơ
quan phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hoà
sinh trưởng thực vật…). Sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không
hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường mới theo chu kỳ. Màu
sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên
các bộ phận khác nhau và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…
Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa
trước lần phân chia đầu tiên. Nhìn chung quá trình tạo mô sẹo in vitro trải qua 3 quá
trình:
- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao
gồm các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn song
tử diệp dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin thậm chí không cần auxin ngoại
sinh như ở các loài cây cỏ hay dây leo.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được
ưu tiên áp dụng ở đơn tử diệp, vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô khó phản
phân hoá so với song tử diệp.
Nồng độ và loại chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong môi trường nuôi

cấy là những yếu tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo. Thường
mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin, hàm lượng hormone nội sinh
và chiều di chuyển của các hormone này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát
9

sinh mô sẹo, có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp
với cytokinin tuỳ từng loại cây.
Ngoài ra, quá trình tạo mô sẹo còn phụ thuộc vào nguồn mẫu cấy, cách đặt
mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy [3].
1.1.4.4. Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.
Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn dựa trên cơ sở đơn tính đực, người ta nuôi cấy
các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phân
đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn
này phát triển thành cây đơn bội.
Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn khác
nhau. Vì vậy mỗi chồi hoa phải kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát triển
giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy.
Các phương pháp nuôi cấy bao phấn và hạt phấn:
- Nuôi cấy bao phấn trên môi trường đặc: mô sẹo và cây đơn bội xuất hiện
trên bề mặt bao phấn.
- Nuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng và lắc: hạt phấn giải phóng vào
môi trường, mô sẹo và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn.
- Nuôi cấy hạt phấn tách rời trong môi trường lỏng và lắc hoặc trong môi
trường bán lỏng: mô sẹo và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn.
1.1.4.5. Nuôi cấy tế bào đơn.
Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể
được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy
tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX.
10

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý
enzyme. Mỗi lọai cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy
khác nhau.
Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu
ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và
phân hoá của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.
1.1.4.6. Nuôi cấy protoplast.
Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông
là người đầu tiên dùng enzyme để thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ
tế bào rễ cà chua. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành
tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng
trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai
protoplast có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung
hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene [3].
1.1.5. Các giai đoạn nhân giống in vitro.
1.1.5.1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị.
Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là tạo ra nguồn nguyên liệu vô trùng để
đưa vào môi trường nuôi cấy. Khâu này có thể coi như một bước thuần hóa vật liệu
nuôi cấy, vì cây giống sẽ được đưa ra khỏi môi trường sống tự nhiên để thích ứng
với môi trường mới.
Khi chọn cây giống cần lưu ý một số điểm như sau: cây mẹ để lấy mẫu thường
là cây có đặc tính ưu việt, khỏe, sạch bệnh, chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi,
đoạn thân có chồi ngủ, nụ hoa, lá v.v…mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả
năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn
định.
11

Khi đã có nguồn nguyên liệu ta tiến hành xử lí mẫu cấy trong những điều kiện
vô trùng để đảm bảo nguồn mẫu sạch cho quy trình nhân giống. Trong nuôi cấy mô

người ta thường sử dụng một số loại hóa chất như: HgCl
2
0,1%, cồn 70
0
, H
2
O
2
,
Ca(OCl)
2
,… để khử trùng mẫu cấy. Tùy thuộc vào từng loại vật liệu nuôi cấy mà lựa
chọn hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp.
1.1.5.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy.
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu đã được khử
trùng và nuôi cấy trên môi trường thích hợp.
Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm
hoặc bình tam giác. Các mẫu nuôi cấy thành công sẽ được lưu giữ trong phòng ở
những điều kiện phù hợp. Sau một thời gian nhất định, mẫu cấy có thể tạo mô sẹo
hoặc tái sinh chồi.
Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu
cầu sau:
- Tỷ lệ nhiễm thấp.
- Tỷ lệ sống cao.
- Tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả bước này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu. Quan trọng nhất vẫn
là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ…
Thời gian nuôi cấy ở giai đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần.
1.1.5.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh.
Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với

các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy giai đoạn
nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống.
12

Giai đoạn này sẽ kích thích mô cấy phát sinh nhiều chồi mầm để cung cấp
cho các giai đoạn sau, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu
hóa nhằm đạt mục đích nhân nhanh.
Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ
quan, đặc biệt là chồi như:
- Bổ sung tổ hợp các chất điều hóa sinh trưởng mới (tăng cytokinine giảm
auxin). Tăng tỷ lệ auxin/cytokinine sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ
kích thích phát sinh chồi.
- Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1000 lux.
- Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-30
o
C.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là tạo ra hệ số nhân nhanh cao
nhất nhưng không ảnh hưởng tới sức sống và bản chất di truyền của cây.
1.1.5.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh.
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên,
nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để
kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác, các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra
đất. Giai đoạn này thông thường cần 2 - 8 tuần.
1.1.5.5. Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiện.
Đây là giai đoạn đầu tiên, trong đó cây được chuyển từ điều kiện vô trùng
của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Đối với một số loài có thể chuyển chồi
chưa có rễ ra đất, nhưng đa số chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới
được chuyển ra vườn ươm. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây cần
sự chăm sóc đặc biệt. Vì cây chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn
ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải đáp ứng các yêu

cầu:
13

- Cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương đảm bảo cung cấp độ ẩm và
làm mát.
- Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc mùn cưa, tro, rêu, rễ cây,…. Giai
đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần.
Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải
được chăm sóc và tránh những yếu tố bất lợi sau:
- Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô.
- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn.
- Cháy lá do nắng.
1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô thực vật.
1.2.1. Môi trường nuôi cấy.
1.2.1.1. Khoáng đa lượng.
Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi tùy theo đối tượng
nuôi cấy. Nói chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trường ít nhất là
300 ppm (30 mg/l). Chúng là nguyên liệu để tế bào xây dựng nên các thành phần
cấu trúc của mình [3].
- Nitơ (N):
Thành phần chính của hầu hết các môi trường là nitơ vô cơ dưới dạng nitrat
(NO
3
-
) hoặc amonium (NH
4
+
). Các muối được dùng phổ biến là kali nitrat (KNO
3
),

nitrat amon (NH
4
NO
3
) và canxi nitrat (Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O). Những hợp chất này cung
cấp nitơ vô cơ cho thực vật để tổng hợp các phân tử chất hữu cơ phức tạp.
Mô, tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như
aminonium và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino
acid. Tỉ lệ amonium và nitrate thay đổi tùy theo loài và trạng thái phát triển của mô.
Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, KNO
3
, NaNO
3
hoặc
NH
4
NO
3

. Amonium được cung cấp dưới dạng (NH
4
)
2
SO
4
hoặc NH
4
NO
3
. Tổng
14

nồng độ của NO
3
+
và NH
4
+
trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng
nuôi cấy và mục đích nghiên cứu [8].
- Phospho (P):
Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật . Nó tham gia vào
việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu
trúc của màng.
Trong môi trường nuôi cấy, Photpho được cung cấp dưới dạng mono hay
dihydrogenphosphate potasium hay sodium.
Phospho ở dạng HPO
4
2-

được hấp thụ nhờ hệ thống rễ của thực vật và ngược
lại với nitrat, sunfat, nó không bị khử [3].
- Lưu huỳnh (S):
Lưu huỳnh như SO
4
2-
được hấp thụ ở rễ cây với tốc độ chậm. Giống như
nitrat, lưu huỳnh phải được khử trước khi sử dụng để sinh tổng hợp các hợp chất có
chứa lưu huỳnh như amino axít, protein và enzym. Lưu huỳnh ở dạng chưa khử
được kết hợp trong các sulpholipide và các polysaccharide [3].
- Kali (K):
K
+
là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và
hữu cơ. Ion K
+
được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều
hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K
+
trong môi
trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước [3].
K
+
được cung cấp dưới dạng muối KNO
3
,
KCl. 6H
2
O, KH
2

PO
4
[1]
.

- Canxi (Ca):
Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây
nhưng cách thức không giống như K
+
và Mg
+
vì Ca
2+
không phải là ion linh động.
Calciun có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do đó nó góp phần vào
trong cấu trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế
bào. Sự hoạt động của nhiều enzim khác của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca
2+
vì
calcium là đồng yếu tố với những enzim phân giải ATP [3].