Phân lập và sàng lọc vi sinh vật Enzyme bẻ ngắn mạch Polysaccharide từ bùn thải rong nâu trong quá trình sản xuất Fucoidan

LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Thị Thanh Vân -
Trưởng phòng hóa phân tích và triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang và TS. Phạm Thu Thủy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện
Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp
đỡ tôi để tôi có đủ điều kiện thực hiện đồ án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang,
Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và
sau Đại học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và
hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm đồ án.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã
quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên để tôi hoàn thành đồ án này.


Nguyễn Thị Khánh Vy





MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC SƠ ĐỒ
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 4
1.1. Đặc điểm chung về rong biển 4
1.2. Phân loại rong biển 4
1.3. Giới thiệu đặc điểm và sự phân bố của rong Nâu và rong Mơ (Sargassum) 5
1.4. Một số hợp chất polysaccharide từ rong Nâu 6
1.4.1. Fucoidan 6
1.4.2. Laminaran 9
1.4.3. Acid alginic 10
1.5. Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết từ rong biển 11
1.5.1. Hoạt tính sinh học của Fucoidan 11
1.5.2. Hoạt tính sinh học của Laminaran 14
1.5.3. Hoạt tính sinh học của acid alginic 14
1.6. Tình hình nghiên cứu về enzyme cắt mạch polysaccharide có nguồn gốc rong
biển 15
1.6.1. Tình hình nghiên cứu fucoidanase 15
1.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme thuỷ phân laminaran 17
1.7. Một số ứng dụng của oligosaccharide từ rong biển 19
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21
2.1. Nguyên vật liệu 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật 22
2.2.2. Phương pháp lên men vi sinh vật 23
2.2.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 24
2.2.4. Tủa enzyme bằng muối ammonium sulphate 25
2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme 25
2.2.6. Định lượng protein theo phương pháp Lowry 27
2.2.7 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 28
2.2.7.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Fucoidan 28
2.2.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ 29
2.2.7.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 30

2.2.7.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc 31
2.2.7.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 32
2.2.8. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme 33
2.2.8.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme 33
2.2.8.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 34
2.3. Phương pháp xử lý số liệu 34
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
3.1.Phân lập các chủng vi sinh vật từ bùn thải trong quá trình sản xuất fucoidan 35
3.2. Sàng lọc các chủng vi sinh vật theo định hướng sinh enzyme cắt mạch
polysaccharide 36
3.3. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu để chủng SW21 phát triển và sinh
enzyme fucoidanase hoạt tính cao. 38
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ fucoidan 38
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Nitơ 39
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH 40
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc 41
3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng và tổng hợp
fucoidanase 42
3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện xúc tác của enzyme 44
3.4.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme 44
3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 45
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
4.1. Kết luận 46
4.2. Kiến nghị 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số loài rong Nâu có hàm lượng fucoidan cao 7
Bảng 1.2: Vi sinh vật biển và enzym của chúng 16

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan 21
Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn từ bùn thải rong Nâu 35
Bảng 3.2: Kết quả sàng lọc vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh enzyme bẻ
ngắn mạch polysaccharite 36
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ fucoidan lên sự sinh tổng hợp fucoidanase của
chủng SW21 38
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự phát triển và sinh tổng hợp
fucoidanase của chủng SW21 39

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus. 8

Hình 1.2: Cấu trúc laminaran 9

Hình 1.3: Cấu trúc acid alginic 10

Hình 1.4: Sản phẩm MODIFILAN và FUCGASTRO 20

Hình 2.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase 23

Hình 2.2: Đường chuẩn fucose 26

Hình 2.3: Đường chuẩn lowry 27

Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển và khả năng sinh enzyme fucoidanase
của chủng SW21 40

Hình 3.2: Ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc lên khả năng sinh enzyme của chủng
SW21 41

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng và tổng hợp
fucoidanase 42

Hình 3.4: pH tối ưu của fucoidanase chiết từ chủng SW21 44

Hình 3.5: Nhiệt độ tối ưu để enzyme fucoidanase từ chủng SW21 hoạt động 45


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Quy trình nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi khuẩn 24
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ fucoidan thích hợp 28
Sơ đồ 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nguồn nitơ thích hợp 29
Sơ đồ 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy thích hợp 30
Sơ đồ 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ nuôi cấy lắc thích hợp 31
Sơ đồ 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thích hợp 32
Sơ đồ 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của
enzyme 33
Sơ đồ 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính
enzyme 34

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid
Ex Extract
FDA Food and Drug Administration
Fuc Fucose
Gal Galactose
HCMV Human cytomegalo virus
HGF Human Hepatocyte Growth Factor
HIV Human immunodeficiency virus

Man Mannose
OD Optical Density
PM Polymannuronic acid
RNA Ribonucleic acid
Xyl Xylose









1
MỞ ĐẦU
Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong Nâu là một trong
số các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất. Rong Nâu
chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Đó là
các chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose,…); 17 acid amin; các acid
béo không no; các chất khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các
polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự
do nguy hiểm; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu; alginat là chất giải độc
thiên nhiên; polyuronan có hoạt tính kháng u não [48]; laminaran có tác dụng rất
tích cực trong việc hỗ trợ điều trị bệnh có liên quan đến mạch máu tim, chất kháng
ung thư, chất bảo vệ phóng xạ, kháng đông lạnh, chất kích thích hạt giống nảy
mầm, tăng trưởng cây trồng [3] và fucoidan có khả năng kích thích hệ miễn dịch,
chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư.
Trong rong Nâu, hàm lượng polysaccharid chiếm khoảng từ 40-80% khối
lượng rong khô, là những chất có giá trị nhất và có ứng dụng hết sức rộng rãi nhờ

các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng. Theo các nhà khoa học Nga,
polysaccharide tồn tại trong rong Nâu được chia làm 2 nhóm chính: nhóm tan trong
kiềm là acid alginic, đã được nghiên cứu từ những năm 30 của thế kỷ trước và được
sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm và
mỹ phẩm; nhóm tan trong nước bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan là
những chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá mới được nghiên cứu sử dụng trong
khoảng vài thập kỷ trở lại đây. Đặc biệt là fucoidan được tìm thấy trong vách tế bào
rong Nâu là chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá: Hoạt tính chống đông máu và
chống đông tụ, hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch, hoạt tính kháng virus, trị
bệnh dạ dày, bệnh về da [5]. Ngoài ra fucoidan còn được sử dụng để điều trị các
bệnh dị ứng, lão hóa, viêm khớp, suyễn, đái tháo đường, tăng nhãn áp, huyết áp cao,
cholesterol cao, bệnh tim, viêm gan C, HIV, bệnh gan, loét dạ dày, đột quỵ, tuyến
giáp, thiên đầu thống.
Nước ta có bờ biển dài hơn 3.200 km trải dài từ Bắc xuống Nam, bao bọc
toàn bộ phía Đông và phía Nam với diện tích mặt nước biển hơn 1.000.000 km
2
,
2
được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong Nâu rất đa dạng và phong
phú, trong đó rong Mơ (Sargassum) đã phát hiện được trên 60 loài với sản lượng
khai thác ước tính đạt trên 10.000 tấn khô/năm. Mặc dù vậy cho đến nay các nghiên
cứu trong nước về chế biến rong Nâu mới chỉ quan tâm đến việc tách chiết các
thành phần đơn lẻ alginat, iodine, manitol, kích thích tố sinh trưởng cây trồng và
gần đây là laminaran nhưng đều ở một trình độ chưa cao, hiệu quả kinh tế còn thấp.
Thấy được tiềm năng này Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã
triển khai nghiên cứu và sản xuất thành công fucoidan là một hướng nghiên cứu
thiết yếu cho khoa học và có giá trị thực tiễn.
Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của các polysaccharide rong
Nâu lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng chúng để làm dược liệu thì việc xác
định cấu trúc hóa học của chúng là điều kiện tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của

các nhà khoa học trên thế giới. Các phương pháp sử dụng lý hóa trước khi phân tích
được sử dụng hiện tại (thủy phân đề-sulfat hóa, đề actyl hóa) thường đòi hỏi điều
kiện acid hoặc kiềm mạnh ở nhiệt độ cao, do đó có thể làm thay đổi cấu trúc của
polysaccharide và làm mất hoạt tính sinh học quý của chúng [7][8][9][10]. Do đó
enzyme là công cụ hữu hiệu nhất để thực hiện các phân tích này. Nguồn phân lập vi
sinh vật bẻ ngắn mạch polysaccharide là những nơi có sự hiện diện của nguồn cơ
chất như rong biển, hoặc môi trường xung quanh rong biển sinh sống như nước
biển, bùn biển [37].
Hiện nay Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã chiết xuất
thành công fucoidan và đã đưa vào sản xuất ở quy mô pilot. Rong Nâu được dùng
để chiết xuất fucoidan, phần còn lại là các polysaccharide khác như alginate,
lamninaran và một lượng nhỏ fucoidan nằm trong bả thải, thải xuống hầm cống. Bã
thải để lâu ngày, bị hệ vi sinh vật trong hầm phân hủy. Đây chính là nguồn phân lập
vi sinh vật bẻ ngắn mạch polysaccharide rất tốt vì nơi nào có sự hiện diện của cơ
chất thì nơi đó có khả năng tồn tại các vi sinh vật tiêu thụ nó.
Xuất phát từ những lý do nêu trên tôi quyết định chọn đề tài : “Phân lập và sàng
lọc vi sinh vật sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharide từ bùn thải của pilot sản
xuất Fucoidan”
3
Nội dung luận văn bao gồm:
 Phân lập vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharide rong
Nâu
 Sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh enzyme hoạt tính cao
 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để vi khuẩn sinh enzyme hoạt tính cao
 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

4
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm chung về rong biển
Rong biển hay tảo biển là thực vật thủy sinh, chúng có thể là đơn bào, đa
bào, sống thành quần thể, sống ở biển hoặc vùng nước lợ ven biển. Rong biển có
kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài
hàng chục mét, hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay
hình thù rất đặc biệt.
Rong biển Việt Nam rất phong phú và đa dạng, theo các kết quả nghiên cứu
thì hiện nay nước ta có khoảng 794 loài, phân bố ở miền Bắc 310 loài, miền Nam
484 loài, 156 loài tìm thấy ở cả hai miền. Nguồn rong biển mọc tự nhiên chủ yếu là
rong Nâu, trữ lượng khoảng 10000 tấn khô/năm, miền Trung và miền Nam là nơi có
trữ lượng rong Nâu lớn và chất lượng cao. Sản lượng hàng năm đại dương cung cấp
cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong. Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon
tổng hợp hàng năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó có 20% do rong
biển tổng hợp nên.
Rong biển cung cấp đầy đủ các khoáng chất đặc biệt là các nguyên tố vi
lượng, các acid amin cần thiết cho cơ thể, các loại vitamin, các carbohydrat đặc
trưng và các chất có hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể đồng thời có khả năng
phòng và trị bệnh. Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức
năng và ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới.
1.2. Phân loại rong biển
Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà
rong biển được chia làm 9 ngành sau đây:
1) Ngành rong Lục (Chlorophyta)
2) Ngành rong Nâu (Phaeophyta)
3) Ngành rong Đỏ (Rhodophyta)
4) Ngành rong Trần (Englenophyta)

5) Ngành rong Giáp (Pyrophyta)
6) Ngành rong Khuê (Bacillareonphyta)
5
7) Ngành rong Kim (Chrysophyta)
8) Ngành rong Vàng (Xantophyta)
9) Ngành rong Lam (Cynophyta)
Trong đó, ba ngành rong có giá trị kinh tế cao là rong Đỏ, rong Nâu và rong
Lục. Rong Đỏ và rong Nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và
được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp và đời sống. Đối với rong Lục thì
loại tảo clorella được xếp vào loại tảo kì diệu, có tốc độ sinh khối cực nhanh, đang
được nghiên cứu phục vụ cho đời sống con người [4].
1.3. Giới thiệu đặc điểm và sự phân bố của rong Nâu và rong Mơ (Sargassum)
Rong Nâu là tên gọi chung của các loài rong thuộc ngành Pheophyta, ngành
này chỉ có một lớp Phaeophycea, gồm 265 chi và khoảng 1500 – 2000 loài, phần
lớn sống ở biển, chỉ có một số loài sống ở nước ngọt.
Rong Nâu có cấu tạo nhiều tế bào dạng mảng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn
giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn thành
dạng cây có gốc, rễ, thân, lá. Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa và ở gốc các lóng.
Rong Nâu sống bám vào các vật thể khác nhờ bàn bám, do đó rong Nâu
thường sống ở các vùng biển đá hoặc nơi có các vật bám khác như chân đập, cầu
cảng, san hô… Rong Nâu tại các vùng ôn đới, hàn đới có kích thước cá thể lớn, số
lượng cá thể nhiều, số loài ít. Còn ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới, rong Nâu có kích
thước cá thể nhỏ, số lượng loài phong phú.
Rong Nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam,
Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil,
Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó, bộ Fucales, đối
tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai
giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới.
Sản lượng rong Nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên
667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc

khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000
6
tấn với 3 chi Laminaria, Udaria, Cladosiphon; Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile
khoảng 27.000 tấn.
Rong Mơ Sargassum là một giống Tảo lớn thuộc họ rong Mơ Sargassaceae
của ngành rong Nâu sống trôi nổi trong nước.Ở Việt Nam, các loài rong Mơ thuộc
chi Sargassum, họ Sargassaceae, bộ Fucales, ngành rong Nâu là nguồn lợi rong
biển tự nhiên lớn nhất, chúng phân bố khá phổ biến ở ven biển và hải đảo phía Nam
Việt Nam (từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên).
Đây là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn, dài 6-8m, sản lượng 12kg
rong tươi/m
2
, hình dạng rất giống thực vật bậc cao. Chúng có khả năng phân bố
rộng, mọc trên các bờ biển đá, san hô chết…thích hợp từ khoảng phía trên mực triều
thấp cho đến vài ba mét sâu. Sản lượng trung bình từ 2000-4000g/m
2
, có nơi đến
7000g/m
2
như ở Hòn Chồng, Nha Trang [4].
1.4. Một số hợp chất polysaccharide từ rong Nâu
1.4.1. Fucoidan
Fucoidan là một polysaccharide sulphate được Kylin mô tả đầu tiên vào năm
1913 từ loài rong Nâu Laminaria digitata và ông điều chế được chúng vào năm
1915 với tên gọi là Fucoidin [11]. Sau gần 100 năm kể từ khi Kyllin phát hiện ra,
fucoidan được mô tả là một polysaccharide sulphat hóa dị hợp, trong đó fucose
chiếm từ 18,6% đến 60% [24][25], sulphat chiếm từ 17,7% đến 32,9% [24][41],
ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose,
xylose, rhamnose và acid uronic. Các liên kết glycosit là liên kết (1-3), (1-2) hoặc
(1-4) và các liên kết này có thế là liên kết mạch thẳng hoặc mạch nhánh. Vị trí

nhóm sulphat có thể ở ba vị trí đó là C
2
, C
3
và C
4
. Những năm sau này fucoidan
không chỉ được tìm thấy ở các loài rong Nâu mà còn được tìm thấy ở một số loài
động vật thân mềm biển như Dưa chuột biển, Cầu gai biển tuy nhiên đáng kể nhất
vẫn là fucoidan chứa trong rong Nâu với hàm lượng lên tới 6,5% trọng lượng khô,
chủ yếu thuộc Bộ Laminariles và Bộ Fucales của lớp Phaeophyceae. Một số loài
rong chứa fucoidan được chỉ ra trên (bảng 1.1).

7
Bảng 1.1: Một số loài rong Nâu có hàm lượng fucoidan cao
TT Bộ Loài
1 Order Ectocarpales Adenocystis utricularis
2 Order Chordariales Cladosiphon okamuranus (Okinawamozuku)
Ascophyllum nodosum
Fucus distichus L
Fucus evanescens C.Ag.
Fucus vesiculosus
Hizikia fusiformic (Hijiki)
Pelvetia wrightii
Pelvetia canaliculata (Dene and Thur)
Sargassum fulvellum
Sargassum stenophyllum
Sargassum kjellmanianum
Sargassum ringgoldiamum
Sargassum fusiforme

Sargassum siliquastrum
Sargassum thunbergii (Umitoranoo)
3 Order Fucales
Undaria pinnatifida (Wakame)
Kjellmaniella crassifolia
Ecklonia kurome
Chorda filum
Laminaria japonica
Laminaria cichorioides miyabe
Laminaria saccharina (L.) Lam
Laminaria religiosa
Lessonia flavicans
4 Order Laminariles
Nemacystus decipiens (Itomozuku)
8
Đặc biệt fucoidan không được tìm thấy ở động thực vật trên cạn. Fucoidan từ
các nguồn chiết khác nhau thì có cấu trúc khác nhau. Hơn thế nữa, cùng một nguồn
fucoidan nhưng phương pháp tách chiết khác nhau sẽ thu được fucoidan có thành
phần khác nhau. Vì vậy, đối với từng loại nguyên liệu khác nhau để chiết được
fucoidan có hiệu suất cao sẽ có phương pháp chiết đặc biệt để chiết chúng. Do đó,
cho đến nay mới chỉ có duy nhất một loại fucoidan được bán trên thị trường đó là
fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus.


Hình 1.1: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus.

9
1.4.2. Laminaran
Laminaran là một polysaccharide tạo thành từ glucose, có tên thường gọi là
laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là: 1,3 -  - D – glucan [30].

Laminaran có hàm lượng từ 1 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào
từng loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của từng loại rong. Thường vào
mùa hè hàm lượng laminaran giảm vì phải tiêu hao cho quá trình sinh trưởng và
phát triển của cây rong [4].
Laminaran thường được chiết xuất từ rong Nâu (Pheophyceae), và đặc biệt là
Fucales hoặc Laminariales.
Laminaran được hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các
liên kết -13 và một ít liên kết -16, gốc đường cuối mạch của một số phân tử
có thể có các gốc manitol (M-series) hay vẫn là glucose (G-series).
Các gốc laminaran từ các loài rong khác nhau thì khác nhau rõ rệt về tỉ lệ của
các liên kết -13 và -16 cũng như cách thức nối của các liên kết này trong
chuỗi glucan [32].

Hình 1.2: Cấu trúc laminaran
10
1.4.3. Acid alginic
Alginic là thành phần rất quan trọng trong rong Nâu, nó chính là thành phần
làm cho rong Nâu có ý nghĩa về mặt kinh tế. Hàm lượng alginic trong các loài rong
Nâu khoảng 2 – 4% so với rong tươi và 13 – 15% so với rong khô, hàm lượng này
phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường mà rong sinh sống. Hàm lượng
alginic của rong biến đổi theo thời gian sinh trưởng trong năm. Hàm lượng tăng dần
vào đầu tháng 1, tăng cao vào các tháng 3, 4 cũng là thời gian rong phát triển hình
thành các phao bơi và thỏi sinh sản, sau đó hàm lượng giảm dần khi rong già và tàn
lụi [4].
Acid alginic là một polysaccharide mạch thẳng được tạo thành từ hai monome
là acid -D-manuronic (ký hiệu là M) và acid -L-gluronic (ký hiệu là G) được nối
với nhau qua liên kết glycozit (1-4).Trong phân tử acid alginic các gốc acid này có
thể liên kết với nhau tạo thành các kiểu block: G-block, M-block, MG-block. Sự sắp
xếp các block-M và block-G trong mạch polyme không theo quy luật mà phụ thuộc
vào từng loài rong và chu trình sinh trưởng của chúng [31].

Hình 1.3: Cấu trúc acid alginic

11
Acid alginic không tan trong nước nhưng có khả năng hấp thụ một lượng
nước rất lớn, trương nở và tạo thành dạng bột nhão. Ngược lại, alginat natri, các
muối K
+
, NH
4
+
, (CH
2
OH)
3
NH
+
của acid alginic lại tan nhiều trong nước và tạo
thành dung dịch có độ nhớt cao. Alginate là một sản phẩm tự nhiên nên nó có thể bị
tiêu hóa bởi một số loại vi sinh vật hoặc các enzyme thủy phân được phân lập từ
đất, biển và các loài nhuyễn thể [1].
1.5. Một số hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết từ rong biển
1.5.1. Hoạt tính sinh học của Fucoidan
 Hoạt tính chống đông máu và chống đông tụ (Anticoagulant và
Antithrombotic)
Fucoidan có các hoạt tính sinh học hết sức đa dạng, tuy nhiên hoạt tính
chống đông tụ của nó được nghiên cứu sâu nhất.Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng
hoạt tính chống đông tụ của fucoidan có thể có mối quan hệ với vị trí của nhóm
sulphat, trọng lượng phân tử và thành phần đường. Fucoidan có chứa nhóm sulphat
cao hơn thường có hoạt tính chống đông tụ cao hơn so với fucoidan không có nhóm

sulphat (E. kurome, H. fusiforme, etc.) [16].

Hoạt tính kháng u

Năm 1937, Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã chiết các hợp chất
trong rong Nâu theo 31 phân đoạn từ trung tính đến acid, đem thử hoạt tính kháng
ung thư và họ cho rằng hai phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình khoảng
13500 Da và 19000 Da có hoạt tính kháng ung thư. Các fucoidan này tương tác trực
tiếp với tế bào ung thư và tiêu diệt những tế bào ung thư này [47].
Theo các nhà khoa học, fucoidan có tác dụng chữa ung thư theo các cơ chế sau:
1) Fucoidan thúc đẩy các tế bào ung thư tự phá hủy. Điều này có nghĩa là
DNA trong tế bào ung thư bị bẻ gãy bởi các enzym trong tế bào làm cho các tế bào
ung thư không có khả năng sinh sản, không hình thành khối u [14].
2) Fucoidan tăng cường hệ miễn dịch nên fucoidan phục hồi lại các tế bào,
tăng cường bảo vệ tế bào bình thường, cảnh giác tế bào lạ [26].

12
 Hoạt tính kháng virus
Trong những năm gần đây người ta đã chứng minh được rằng polysaccharide
sulphat (bao gồm fucoidan) biểu hiện hoạt tính kháng vi rút cả invivo và invitro.
Fucoidan của Laminaria japonica có các chức năng kháng loại vi rút RNA và DNA.
Vai trò của Sulphat thì cần thiết cho hoạt tính kháng virut. Hơn nữa, fucoidan còn
có các hoạt tính ức chế chống lại sự sao chép vỏ ngoài một số vi rút quan trọng như
HIV và HCMV [33].
 Hoạt tính kháng khuẩn
Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương
và vi khuẩn Gram âm, fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại viêm màng não
một biến chứng của viêm do vi rút và vi khuẩn gây ra. Fucoidan cũng được xem là
một hợp chất điều trị HIV. Fucoidan tăng khả năng sản xuất các dạng interferon
kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau cần thiết để đề phòng nhiễm trùng và bệnh tật

[21].
 Tăng cường tính miễn dịch
Fucoidan kích thích sự sản xuất tế bào miễn dịch giúp cho cơ thể có khả
năng chống lại vi khuẩn, vi rút, kí sinh trùng và ngay cả tế bào ung thư. Các tế bào
diệt tự nhiên là các tế bào làm nhiệm vụ đầu tiên bảo vệ hệ miễn dịch cho cơ thể
con người. Fucoidan chứa các đường đặc biệt làm sản sinh các tế bào diệt tự nhiên
chống tất cả các bệnh. Khi những người sức khỏe yếu sử dụng fucoidan làm tăng số
tế bào diệt tự nhiên giúp cơ thể có khả năng tự bảo vệ [12].

 Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu
Các nhà nghiên cứu đã công bố rằng các polysaccharide tìm thấy trong rong
biển tác động dương tính lên phản ứng insulin và đường huyết trong các động vật
thí nghiệm. Việc đưa thêm các polysacharide này dẫn đến giảm một cách đột ngột
cân bằng hấp thụ đường. Điều này giả thiết rằng các hợp chất polysaccharide giống
fucoidan làm chậm việc truyền glucose vào máu từ ruột, nhờ vậy giúp giữ mức
đường máu ổn định và ngăn chặn phản ứng insulin quá mức [28].
13
 Bảo vệ dạ dày
Fucoidan với liều lượng thích hợp có tác dụng cải thiện hoạt động của dạ
dày. Fucoidan ngăn chặn sự gắn của một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày
Helicobacteria pylori lên tế bào.
Theo một số nghiên cứu của người Nhật ở Tokyo, việc bổ sung fucoidan
thích hợp có tác dụng cải thiện hoạt động của đường dẫn dạ dày-ruột non. Hơn nữa
các nhà khoa học mới đây đã công bố rằng fucoidan ngăn chặn sự gắn của
Helicobacteria pylori (một loại vi khuẩn gây loét dạ dày) lên tế bào tạo thành lớp
lót dạ dày. Họ đã phỏng đoán rằng hợp chất fucoidan này có thể bao phủ bề mặt vi
khuẩn làm cho chúng khó bám vào các tế bào dạ dày [28].
 Trị bệnh về da
Fucoidan thúc đẩy việc sản xuất một protein gọi là integrin làm tăng sự săn
chắc và phục hồi da cũng như thúc đẩy sự co collagen [35].Các chất trong rong biển

có tác dụng giữ ẩm cho da, làm mềm da nên được dùng làm mặt nạ làm mềm da,
giúp da phục hồi, tươi sáng [28].
 Trị bệnh khớp
Fucoidan đẩy mạnh về việc tạo ra fibronectin, một glycoprotein với phân tử
lượng lớn có vai trò trong việc giữ cho khớp được bôi trơn và linh động. Fucoidan
cũng có tác dụng tái tạo sụn cho các khớp đau [28].
Trong năm 1995, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng fucoidan giúp đẩy
mạnh việc tạo ra fibronectin, một glycoprotein có phân tử lượng lớn có vai trò quan
trọng trong việc giữ các khớp được bôi trơn và linh động. Nghiên cứu phát hiện ra
sự có mặt của fucoidan đã góp phần cho việc sản xuất bình thường chất này, việc bổ
sung fucoidan có thể có tác dụng hữu ích trong việc tái tạo sụn cho các khớp đau.
 Trị bệnh gan
Fucoidan làm tăng đáng kể việc sản xuất HGF là một cytokin rất đặc biệt, nó
không chỉ kích thích việc tái tạo tế bào gan mà đồng thời còn tăng cường việc sản
xuất các tế bào da, tế bào cơ tim, sụn [22].
14
Đến nay sản phẩm fucoidan đã có mặt trên thế giới và được dùng làm thuốc
hỗ trợ sức khoẻ và điều trị nhiều loại bệnh. Ở nước ta chưa có sản phẩm fucoidan
trên thị trường. Do vậy việc nghiên cứu fucoidan trong rong Nâu Việt Nam là việc
làm rất cần thiết và có ý nghĩa khoa học cũng như thực tiễn cao.
1.5.2. Hoạt tính sinh học của Laminaran
Laminaran là thực phẩm chức năng có giá trị dược lý được FDA chấp thuận
trong việc chống đông máu, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu và kích
thích miễn dịch bẩm sinh [43].Gần đây các nhà khoa học nghiên cứu và phát hiện
thấy chất laminaran trong rong biển có thể hỗ trợ, không để tế bào miễn dịch ‘’tử
vong’’, từ đó có tác dụng bảo vệ hệ thống miễn dịch không bị tổn thương dưới tác
động của tia bức xạ. Khả năng chống tia bức xạ của chất chiết từ rong biển thiên
nhiên này đem lại niềm hy vọng cho những người đang dung tia phóng xạ chữa trị
các khối u gây ung thư trong cơ thể [49]. Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng
sức đề kháng với nhiễm trùng [44] và thúc đẩy sữa chữa vết thương [42].

Laminaran với những đặc tính của một alpha – amylase gây ra kích hoạt các
enzyme có mặt trong quá trình tăng trưởng ở thực vật và sự kích thích của hoạt
động phân giải protein của các tế bào được xử lý. Nên hiện nay laminaran được
nghiên cứu để sử dụng như là một chất thúc đẩy hạt giống nảy mầm và tăng tốc độ
tăng trưởng cây trồng.
1.5.3. Hoạt tính sinh học của acid alginic
Alginat có hoạt tính tẩy xạ, khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng
đường tiêu hóa, có thể dung alginate Na để đưa ra ngoài cơ thể. Alginat có khả năng
này vì tạo được kết tủa bền với strontium do đó ngăn được sự hấp thụ strontium vào
máu và được thải ra ngoài. Việc dùng alginate Na làm chất tẩy phóng xạ không ảnh
hưởng đến quá trình trao đổi Ca và khả năng phát triển bình thường của cơ thể [50].
Ngoài ra aginat Na còn có khả năng chống đông tụ máu.

15
1.6. Tình hình nghiên cứu về enzyme cắt mạch polysaccharide có nguồn gốc
rong biển
1.6.1. Tình hình nghiên cứu fucoidanase

Những năm trước đây, mặc dù hầu như chưa biết gì về sinh tổng hợp fucan
sunphat hóa, nhưng người ta đã có những hiểu biết về cách phân lập cách phân lập
các loại enzyme có khả năng thủy phân các polysaccharide này từ một số loài vi
sinh vật biển.
Vi sinh vật biển là những nguồn chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh học
nhiều triển vọng, bao gồm các enzyme quý hiếm. Một số vi sinh vật biển có khả
năng bẻ ngắn các polysaccharide không tan trong nước như chitin và agar cũng như
các polysaccharide thành tế bào của rong biển và các sinh vật khác. Khi bị phân hủy
rong sẽ trở thành đối tượng tấn công của các vi sinh vật mà có hệ enzyme có khả
năng bẻ ngắn mạch polysaccharide thành tế bào rong về mono- và oligosaccharide.
Các saccharide này được sử dụng như nguồn dinh dưỡng của các vi sinh vật. Vì vậy
những năm gần đây các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu nghiên cứu về vi sinh vật

biển sinh enzyme phân cắt Fucoidan. Một số kết quả đã được công bố tuy nhiên các
kết quả này vẫn chỉ ở mức quy mô phòng thí nghiệm, chưa được đưa ra thị trường.
Dưới đây là một số kết quả tổng hợp trên thế giới. (bảng 1.2).








16
Bảng 1.2: Vi sinh vật biển và enzym của chúng [28].

Enzym ST
T

Họ Giống Loài Chủng Nguồn PL
Loại pH
otp
T
otp
(
o
C)
Fucoidanase 6,0 40
1

Vibrionacace Vibrio n.s N-5 Cát biển
fucosulfatase 7,5

n.s n.s n.s Nước biển ven bờ
Endosulfated
fucan-degesting
6,5-8 30-35
KMN
3296
Focus evenescens
Thủy phân liên kết
O-glycosidic
n.s <50
KMN
3297
Apostichopus japonicus n.s n.s <50
Pseudoalteromonas P.citrea
KMN
3298
Corda filum n.s n.s <40
2

Alteromonadaceae
Saccharophagus S.degradans 2-40 Spartina alterniflora n.s. n.s. n.s.
Mariniflexile
fucanivorans
n.s. SW 5 Cây xử lý nước n.s. 7.5 20-25 °C
Gramella n.s.
KMM
6054
Strongylocentrotus
intermedius
n.s. n.s. n.s.

n.s. Acrosiphonia sonderi n.s n.s. n.s.
3

Flavobacteriaceae
Maribacter M. algae
KMM
621
S. intermedius n.s. n.s. n.s.
4

Melanconiaceae Hyphomycete
Dendryphiella
arenaria
TM 94 Cát biển
Exo-and endotype
hydrolysis
6.0 50 °C
5

Sphingomonaceae Sphingomonas
Sphingomonas
sp.
PF-1 Nước biển
Fucoidanase
(endotyp)
n.s. n.s.
17
Hiện nay có 2 loại enzyme tác động lên fucoidan là fucoidanase (EC3.2.1.44)
và α-L-fucoisidase (EC.3.2.1.51). Nếu như hoạt tính của α-L-fucoisidase được mô
tả dễ dàng như là sự giải phóng L-fucose khỏi đoạn cuối của một phân tử

polysaccharide, thì việc xác định hoạt tính của fucoidanase phân giải fucoidan là
không dễ dàng. Fucoidanase có thể bẻ gãy các liên kết glusosit bên trong phân tử
polsaccharide làm giảm nhanh chóng trọng lượng phân tử (endo-fucoidanase) hoặc
ở phía rìa ngoài của phân tử để lấy đi một số phân tử oligosaccharide làm cho trọng
lượng phân tử giảm từ từ (exo-fucoidanase) [18][38].
Một trong những trở ngại trong việc làm sạch fucoidanase là chưa có phép
thử đơn giản nào để có thể nhận biết và định lượng loại enzyme này. Một số
phương pháp đã được sử dụng bao gồm, sự giảm độ nhớt [20], tăng đường khử [45],
kết tủa với albumin [27], sắc ký rây phân tử [13]. Do đó, cho đến nay mới chỉ có 2
enzyme fucoidanase được làm sạch tới trạng thái đồng nhất [15].
1.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme thuỷ phân laminaran
R. Saravanan và cộng sự (2007) đã phân lập và tinh sạch enzyme ngoại bào
(1,3)--D-glucanase từ nấm Trichoderma reesei (3929), một dòng nấm do viện
Công nghệ vi sinh vật Chandigarh, Ấn Độ (Institute of Microbial Technolygy
Chandigarh) cung cấp. Dịch nuôi cấy được tinh sạch qua các bước: tủa bằng
(NH
4
)
2
SO
4
, thẩm tách và thử hoạt tính enzyme dựa trên lượng đường glucose tạo
thành. Trọng lượng phân tử enzyme được xác định bằng phương pháp điện di trên
gel SDS là khoảng 52 đến 62 kDa [34].
Năm 1988, B. Tangarone và cộng sự đã nghiên cứu tinh sạch và xác định đặc
tính của enzyme endo-(1,3)--D-glucanase thu được từ nấm Trichoderma
longibrachiatum. Nhóm tác giả đã nuôi cấy Trichoderma longibrachiatum trong
môi trường chứa nguồn carbon duy nhất là D-glucose, sau đó tiến hành tinh sạch
enzyme từ dịch nuôi cấy. Enzyme thu được có khả năng thủy phân laminaran thành
các phân tử glucose, ditose, tritose, tetratose, pentose và các oligo có trọng lượng

phân tử lớn hơn. Nói chung, loại enzyme này chỉ cắt những phân tử glucan có chứa
liên kết -1,3. Khoảng pH và nhiệt độ tối ưu của enzyme thu được là 4,8 và 55
o
C.
18
Trọng lượng phân tử của enzyme được xác định bằng phương pháp điện di trên gel
SDS 12,5% và kết quả cho thấy trọng lượng phân tử của enzyme là khoảng 70 kDa.
Giá trị K
m
và V
max
đối với cơ chất laminaran lần lượt là 0,16% và 3,170
μmol/phút/mg [6].
Một loại endo-(1,3)--D-glucanase do vi khuẩn Arthrobacter sp. sản sinh ra
đã được Zhongcun Pang và các cộng sự (2004) tinh sạch qua các bước: tủa bằng
(NH
4
)
2
SO
4
, sắc ký trao đổi anion và sắc ký lọc gel. Enzyme tinh sạch được có trọng
lượng phân tử khoảng 32.500 Da (bằng phương pháp điện di trên gel SDS). Enzyme
tinh sạch có pH tối ưu khoảng 6,5 và khoảng pH hoạt động là từ 5 đến 8. Nhiệt độ
tối ưu là 55
o
C. Hằng số Michaelis K
m
đối với laminaran là 0,16 mg/ml [46].
Theo M.S. Pesenseva và các cộng sự, tính đặc hiệu và phương thức cắt mạch

của enzyme laminaranase là công cụ quan trọng để nghiên cứu cấu trúc của
laminaran có nguồn gốc từ những loài rong khác nhau. Ngoài ra, quá trình chuyển
hóa laminaran bằng enzyme còn tạo ra các chất mới có hoạt tính sinh học (13);
(16)--D-glucan. Laminaranase là enzyme cắt liên kết -1,3 của laminaran bằng
hai cơ chế. Exo-laminaranase (EC 3.2.1.58) cắt lần lượt các liên kết từ sau ra trước
của phân tử laminaran, kết quả là tạo thành các sản phẩm thủy phân đơn giản nhất:
các phân tử D-glucose; trong khi đó endo-laminaranase (3.2.1.39) lại thủy phân các
liên kết bên trong mạch laminaran và giải phóng sản phẩm là các oligo-laminaran.
Theo nhóm tác giả này, đã có hai enzyme laminaranase đã xác định được trình tự
amino axit, đó là enzyme từ trứng hải sâm Strongylocentrotus purpuratus và endo-
(13)--D-glucanase từ một loài hai mảnh vỏ Spisula sachalinensis. Hai đối tượng
này thuộc nhóm động vật biển không xương sống, có kích thước và trữ lượng lớn và là
nguồn enzyme laminaranase đầy hứa hẹn.
Ngoài ra, có hai dạng enzyme laminaranase được phân lập từ gan Littorina
kurila (một loài động vật thân mềm). Cả hai loại enzyme này đều đặc hiệu đối với
liên kết -1,3 trong các phân tử glucan. Cả hai enzyme đều có tỷ lệ thủy phân
laminaran và translam (một sản phẩm chuyển hóa của laminaran bằng enzyme) cao
hơn so với các glucan khác (như yeast glucan, lichenan, zymosan, pachiman