NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ CẢU MỘT SỐ CHỦNG Microcystis PHÂN LẬP Ở HỒ HOÀN KIẾM, HÀ NỘI

đại học quốc gia hà nội
VIệN VI SINH VậT Và CÔNG NGHệ sinh học
o0o



BO CO TI C BIT CP HQG
đề tài nghiên cứu khoa học 2007-2008



NGHIấN CU C IM SINH HC V KH NNG PHN GII
C T CU MT S CHNG Microcystis PHN LP H
HON KIM, H NI



Mó s: QG.07.24



Chủ trì đề tài : Nguyễn Thị Hoài Hà



Hà nội - 2008

BÁO CÁO TÓM TẮT

1. Tên đề tài
Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một
số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội
2. Các thành viên tham gia đề tài
Chủ trì đề tài
- Họ và tên: Nguyễn Thị Hoài Hà
Các thành viên:
Lƣu Thị Thùy Giang
Nguyễn Quang Huy
Lê Trung Thủy
Phạm Thị Bích Đào
Trần Thị Điệp
3. Tóm tắt tổng quan của đề tài
Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo
theo đó là sự ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận. Hồ Hoàn Kiếm
một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm. Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn
tới sự phát triển thƣờng xuyên và không bình thƣờng của vi khuẩn lam, làm biến đổi
cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc
hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở
hồ Hoàn Kiếm đã đƣợc cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trƣờng cho khu
hệ động thực vật sống trong hồ.
Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa
Kutzing là loài bị bắt gặp thƣờng xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố
thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vòng có tên gọi là
microcystin Microcystin là chất ức chế đối với enzyme protein phosphatases
(nhóm PP1 và PP2A) [30]. Độc tố cũng gây ảnh hƣởng xấu lên hai loại protein
serine và threonin phosphatases. Đã có một số bài báo chứng minh hiện tƣợng nƣớc

nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con ngƣời.
Microcystin thƣờng tích luỹ trong nội quan tế bào hoặc dƣới dạng tự do trong nƣớc.
Đã có không ít các công trình nghiên cứu hiện tƣợng nở hoa nƣớc và giảm thiểu tác
hại của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác
nhau. Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đặc
điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis
phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội.
4. Mục tiêu của đề tài
* Phân lập, định tên, nuôi cấy và lƣu giữ đƣợc các chủng vi khuẩn lam
Microcystis trong Bảo tang Vi tảo của Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi
trƣờng - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN.
* Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn.
5. Tóm tắt nội dung nghiên cứu của đề tài
- Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hoá của nƣớc hồ Hoàn Kiếm tại
thời điểm thu mẫu.
- Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp
của các chủng Microcystis.
- Phân loại đến loài các chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc.
- Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc
ký lỏng cao áp (HPLC).
- Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây
độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nƣớc).
6. Kết quả chính của đề tài
- Hồ Hoàn Kiếm đang ở tình trạng ô nhiễm, hàm lƣợng COD, BOD vƣợt
tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 4942- 1995 (loại B) 20 lần. Với giá trị NH
4
+
từ 0,129-
0,699 (mg/l), NO
2

-
từ 0.012- 0,05 (mg/l), NO
3
-
từ 0,047- 0,129 (mg/l), PO
4
3-
từ
0,08- 0.64 (mg/l) chứng tỏ hồ có hàm lƣợng dinh dƣỡng N, P khá cao.
- Đã phân lập thuần khiết và nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam thuộc chi
Microcystis theo phƣơng pháp của Shirai có cải tiến. Môi trƣờng thạch agarose B12
với tỷ lệ 0,4% là môi trƣờng thích hợp nhất cho việc phân lập Microcystis.
- Các chủng Microcystis đều sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng Bold 3N với số
lƣợng tế bào đạt từ 32,94 – 68,6 ×10
6
tế bào/ml

sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Đặc
biệt chủng LT2 số lƣợng tế bào đạt cao nhất là 68,6 ×10
6
tế bào/ml sau ngày thứ 19.
Trên môi trƣờng J, các chủng Microcystis sinh trƣởng số lƣợng tế bào của các
chủng đạt từ 40,42 – 76,46 ×10
6
tế bào/ml

sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Trong đó
chủng LT2 vẫn phát triển với số lƣợng tế bào đạt cao nhất 76,46 × 10
6
tế bào/ml

sau
ngày thứ 19. Trên môi trƣờng B12, số lƣợng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78 ×10
6
tế
bào/ml

sau 12 đến 15 ngày nuôi cấy. Ở môi trƣờng này chủng LT8 phát triển với
mật độ tế bào đạt cao nhất 54,78 ×10
6
tế bào/ml

sau ngày thứ 15.
- Có 7 loại axít béo không no dạng C15, C17 và C19 trong tế bào 2 chủng
Microcystis LT2 và LT8. trong đó thành phần axit palmitic (C
16
H
32
O
2
) chiếm lƣợng
lớn nhất với 1,302 μg/mg trọng lƣợng khô ở chủng LT2, chủng LT8 là 0,9683
μg/mg trọng lƣợng khô. Kết quả cho thấy có sự sai khác nhau về lƣợng của 7 loại
axit béo có ở trong tế bào 2 chủng LT2 và LT8.
- Dựa vào phƣơng pháp phân loại truyền thống theo phân loại hình thái học
và phƣơng pháp phân loại hiện đại dựa trên phân tích trình tự rADN 16S, 2 chủng
vi khuẩn LT 2, LT8 đƣợc xác định là Microcystis aeruginosa, 2 chủng vi khuẩn
nƣớc N4 và N7 đƣợc xác định thuộc các loài Sphingomonas mali và Sphingomonas
asaccharolytica
- Dựa vào kết quả phân tích trên HPLC, hàm lƣợng độc tố MC – RR đạt lớn

nhất là 512,8 ng/mg trọng lƣợng khô, độc tố MC – YR là 236,8 ng/mg và thấp nhất
là độc tố MC – LR: 114,25 ng/mg.
- Hai chủng vi khuẩn Sphingomonas tuyển chọn đƣợc có khả phân giải
microcystin khá nhanh. Ở nồng độ microcystin 3 µg/l thời gian bán phân giải là
1,34 giờ và với nồng độ 20µg/l, thời gian là 3,43 giờ.
- Nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của các chủng vi khuẩn
Sphingomonas mali N4 và Sphingomonas asaccharolytica N7 là 30°C. Sau 7 ngày
sự phân giải gần nhƣ hoàn toàn là 100%.
7. Các công trình công bố và sản phẩm đào tạo
 Công trình công bố
- Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà
2008. Đánh giá sự biến động số lượng theo mùa và theo tầng nước của vi khuẩn
lam Microcystis aeruginosa ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội, Tạp chí Khoa học Đại học
Quốc gia Hà Nội. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 125 – 128.
- Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà
2008. Tìm hiểu khả năng phân giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis trong hồ
Hoàn kiếm bằng vi khuẩn. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội. Khoa học
Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 119 – 122.
 Đào tạo 4 Cử nhân
- Bƣớc đầu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân
giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội. 2007. Khoá
luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Đặng Thị Kim Anh.
- Bƣớc đầu đánh giá khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam
Microcystis aeruginosa bằng vi khuẩn Sphingomonas. 2008. Khoá luận tốt nghiệp
hệ đại học chính quy của Nguyễn Thị Hoài.
- Khảo sát sự biến động theo mùa của vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa ở
hồ Hoàn Kiếm và khả năng ức chế sinh trƣởng của chúng bằng dịch chiết vỏ chuối,
vỏ quýt. 2009. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Lê Thị Trang.
- Phân lập, nghiên cứu một số đặc tính của tảo độc Microcystis tách chiết độc
tố và thăm dò biện pháp xử lý.2009. Đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hữu Hiếu

 Đào tạo 1 Thạc sỹ
Phân giải tế bào Microcystis và sự phân huỷ độc tố microcystin bằng vi
khuẩn nƣớc 2007 - 2009.
Những đóng góp của đề tài:
- Là công trình đầu tiên tách và lƣu giữ đƣợc chủng vi khuẩn lam
Microcystis.
- Phân lập đƣợc 2 chủng vi khuẩn thuộc chi mới Sphingomonas có khả năng
phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam Microcystis.
- Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết độc tố microcystin.
8. Tình hình sử dụng kinh phí của đề tài
- Kinh phí đƣợc cấp: 100 000 000 đồng
- Kinh phí thực hiện: 100 000 000 đồng

Hà Nội , ngày 18 tháng 10 năm 2008
Chủ trì đề tài Thủ trƣởng đơn vị
(ký tên, đóng dấu)


TS. Nguyễn Thị Hoài Hà
ABSTRACT OF PROJECT

1. Title of the project: “Study on biological characteristis and capacity of
biodegradation toxin of some Microcystis isolated from Hoan Kiem Lake, Hanoi”
2. Coodinator: Nguyen Thi Hoai Ha
Member: Luu Thuy Giang
Nguyen Quang Huy
Le Trung Thuy
Pham Thi Bich Dao
Tran Thi Diep
3. Introduce

Hoan Kiem Lake is a famous place because of its historical and cultural
value. This is the habitat of valuable and rare species with endemicity and is also
diversifying about the component of microalgae species. In recent years, the
socioeconomic developmental process caused a lot of influences on the lake
ecosystem especially on water quality. Mesotrophic situation of this lake resulted in
the bloom water reducing specific microalgae species and concurrently increasing
the species component and density of toxic algae. Among toxic cyanobacterial
genera, Microcystis accounts for highest population (approximately 80% of total
cyanobacterial strains that cause the bloom water). Microcystis aeruginosa Krutzing
is the most popular species. This is a species which produces hepatotoxin, a type of
liver toxin, composed from cyclic peptides called microcystin.
They have effect on both animals and plants in waters. microcystin usually
accumulates in cells or releases to surrounding waters. Thus the research on toxic
cyanobacteria Microcystis in Hoan Kiem lake, Hanoi and finding effective methods
to diminish their negative effects are essential. In this report, we describe the
isolation, selection and classification location as well as biological characters of
some Microcystis strains from Hoan Kiem lake, as a basic for the next researches.
4.The airm of project
- Isolation, identification, inoculation and maitainance of Microcystis strains
(blue-green, Cyanobacteria) at Microalgal Technology and Enviromental Biology
Lab, Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National of University,
Hanoi.
- Capacity of toxin degradation by aquatic bacteria.
5. Brief summary:
- Biophysical and biochemical analysis of freshwater in Hoankiem lake at
sampling time.
- Isolation, screening, study on characteristics of Microcystis isolated.
- Identification of Microcystis isolated.
- Determination microcystin of same Microcystis strains by HPLC.
- Capacity of toxin degradation by fresh bacteria

6. Results obtained
- Hoankiem lake is in pollution condition in the aspect of chemical
evacuation such as COD and BOD concentration is over the corresponding ones in
Vietnamese standard system, TCVN 4942-1995 (type B) 20 times. Concentration of
ammonium cation 0,129- 0,699 (mg/l), nitrite 0.012- 0,05 (mg/l), nitrate 0,047-
0,129 (mg/l), and phosphate 0,08- 0.64 (mg/l) that demonstrate concentration of
nitrogen and phosphorus are relatively high.
- Based on modified Shirai method, 10 pure strains of Microcystis were
isolated and cultured. B12 medium (0.4% agarose) was selected as the most suitable
for Microcystis isolation.
- All of Microcystis strains were grown well on the Bold 3N medium that the
numbers of cell from 68,6 ×10
6
cells/ml after 15-19 days of culture. Especially, the
maximal cell number of LT2 strain increased to 68,6 ×10
6
cells/ml after 19
th
culture.
For J medium, the cell density was from 40,42 – 76,46 ×10
6
cells/ml after 15-19
days of culture in which LT2 was the best growth strain with the numbers of cell
76,46 ×10
6
cells/ml after 19
th
culture.
- Analytical results of unsaturated fatty acid in Microcystis LT2 and LT8
strains showed different 7 types of C15, C17 and C19 in which Palmitic acid

occupied as major part with 1,302 μg/mg and 0,9683 μg/mg (in dry weight) in LT2
and LT8, respectively. The results indicated the diference in the concentration
between 7 types of fatty acid.
- Based on morphological and molecular taxonomy (for example
comparision the sequence of 16S rDNA), LT2 and LT8 cyanobacterial strains were
identified as M. aeruginosa; aquatic N4 and N7 bacterial strains were type of
Sphingomonas mali và Sphingomonas asaccharolytica.
- HPLC analysis showed the maximal concentration of MC-RR of 512,8
ng/mg in dry weight, 236,8 ng/mg of MC-YR and the lowest 114,25 ng/mg MC-
LR.
- Sphingomonas strain was demonstrated to degrade microcystin in relatively
good level. Time for degradation of a half of 3 µg/l and 20µg/l microcystin was
1,34 h and 3,43 h; respectively.
- The suitable temperature for microcystin degradation by Sphingomonas
mali N4, Sphingomonas asaccharolytica N7 strains was at 30°C. The degradation
was completely after 7 day.




7. Publications and training activity
Publications
- Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha.
Investigate water quality and the composition of algae in some lakes in Hanoi.
2008. Vietnam National University, Hanoi. Journal Natural Science. Vol 24, No 18,
pp 125 – 128.
- Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha.
Study on toxin lysis in blue green algae by some strains bacteria isolated in Hoan
Kiem lake. 2008. Vietnam National University, Hanoi. Journal Natural Science. Vol
24, No 18, pp 119 – 122.

Training activity
Master thesis completed in 2009
- Lysis of Microcystis and degradation of microcystin by aquatic bacteria.
2007-2009. Tran Thi Diep‟s official undergraduate thesis.
Bacheler thesis completed
- Isolation and screening of Microcystis toxin-degrading bacterial strains in
Hoankiem lake, Hanoi, 2007. Dang Thi Kim Anh‟s official undergraduate thesis.
- Investigation of Microcystis aeruginosa microcystin degradation by
Sphingomonas. 2008. Nguyen Thi Hoai ‟s official undergraduate thesis.
- Study on the seasonal fluctuation of cyanobacterial Microcystis aeruginosa
in Hoankiem lake and growth restriction by banana skin and mandarin peel
extracted solution, 2009. Le Thi Trang‟s official undergraduate thesis.
- Isolation and study on Microcystis toxic cyanobacterial characteristics:
toxin extraction and treatment investigation, 2009. Nguyen Huu Hieu‟s official
undergraduate thesis.

8. Contributions of project:
- Here is the first report that described isolation, maintaince and preservation
of Microcystis strain.
- Two Sphingomonas bacterial strains were isolated and proved as potent
microcystin-degrading agent.
- Establishment of toxin microcystin extraction procedure.
9. Research grant
- Supplied expenditute: 100 000 000 Vnd
- Used expenditute: 100 000 000 Vnd
The project is supported by Vietnam, National University, Hanoi
Hanoi, 18
th
October 2008
Project Coodinator Institute of Microbiology and Biotechnology

Nguyen Thi Hoai Ha
Vietnam, National University, Hanoi
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM 3
1.2. VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC 3
1.2.1. Vi khuẩn lam Microcystis 6
1.2.2. Độc tố microcystin của Microcystis 6
1.2.3. Cơ chế gây độc của microcystin 8
1.3. SỰ PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƢỚC
Sphingomonas 9
1.3.1. Vi khuẩn Sphingomonas 9
1.3.2. Cơ chế phân giải độc tố microcystin của Sphingomonas 10
1.4. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘC TỐ TỚI NGƢỜI VÀ GIA SÚC 11
1.5. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LAM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT
NAM 13
1.5.1. Trên thế giới 13
1.5.2. Ở Việt Nam 14
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 16
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16
2.1.3. Máy móc, dụng cụ 17
2.1.4. Hóa chất 17
2.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lam và vi khuẩn 18

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.2.1. Phƣơng pháp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm và đánh giá
chất lƣợng nƣớc 18
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis 18
2.2.2.1. Làm giàu mẫu 18
2.2.2.2. Phƣơng pháp tách và thuần khiết trên thạch đĩa 18
2.2.3. Phân loại vi khuẩn lam Microcystis 19
2.2.3.1. Bằng phƣơng pháp hình thái 19
2.2.3.2 . Phƣơng pháp tách ADN 19
2.2.3.3. Hóa phân loại phân tích thành phần acid béo 20
2.2.4. Xác định mật độ tế bào 21
2.2.5. Phƣơng pháp tách chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis 22
2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng trên máy quang phổ 22
2.2.7. Các phƣơng pháp sắc ký 22
2.2.7.1. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) 23
2.2.7.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 23
2.2.8. Phƣơng pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas 24
2.2.9. Phƣơng pháp xác định khả năng phân giải microcystin 24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU THỦY LÝ, THỦY HÓA NƢỚC HỒ HOÀN
KIẾM 26
3.1.1. Nhiệt độ 26
3.1.2. pH 26
3.1.3. Các chất lơ lửng SS 26
3.1.4. Hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc (DO- Dissolve oxygen) 27
3.1.5. Nhu cầu oxy hóa học (COD- Chemical oxygen demand) 27
3.1.6. Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD- Biochemical oxygen demand) 27
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM THUỘC CHI Microcystis
PHÂN LẬP ĐƢỢC 27
3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy 27

3.2.2. Phân lập các khuẩn lạc của Microc ystis 29
3.2.3. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis LT1, LT2, LT3, LT4,
LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trên các môi trƣờng khác nhau 32
3.2.4. Thành phần acid béo trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 35
3.2.5. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S 36
3.3. TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ MICROCYSTIN 38
3.3.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) 38
3.3.2. Xác định hàm lƣợng microcystin trên máy quang phổ 38
3.3.3. Hàm lƣợng microcystin trên sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 39
3.4. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN NƢỚC CÓ KHẢ
NĂNG PHÂN GIẢI MICROCYSTIN 44
3.4.1. Phân lập các chủng vi khuẩn nƣớc 44
3.4.2. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S 2 chủng N4 và N7 47
3.5. KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA 2 CHỦNG
Sphingomonas N4 VÀ N7 49
3.5.1. Hiệu quả phân giải microcystin của 2 chủng N4 và N7 49
3.5.2. Xác định điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của
chủng Sphingomonas N4 và N7 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
PHỤ LỤC 1 62
PHỤ LỤC 2 65
PHỤ LỤC 3 66
PHỤ LỤC 4 77
PHỤ LỤC 5 78
PHỤ LỤC 6 1

DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG
Danh mục hình
Hình 1.1. Hồ Hoàn Kiếm Hà Nội 3

Hình 1.2. Microcystis flos-aquae [62] 6
Hình 1.3. Microcystis aeruginosa [63] 6
Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [54] 7
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [54] 7
Hình 1.6. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [54] 8
Hình 1.7. Hình dạng tế bào của Sphingomonas [57] 9
Hình 1.8. Con đƣờng phân giải mycrocystin nhờ Sphingomonas [20] 11
Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu 16
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng C 28
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng Bold 3N 28
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng B12 28
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng J 28
Hình 3.5. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT1 29
Hình 3.6. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT2 29
Hình 3.7. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT3 30
Hình 3.8. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT4 30
Hình 3.9. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT5 30
Hình 3.10. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT6 30
Hình 3.11. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT7 31
Hình 3.12. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT8 31
Hình 3.13. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT9 31
Hình 3.14. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT10 31
Hình 3.15. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể Bold
3N 33
Hình 3.16. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể Bold 3N
33
Hình 3.17. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể J 34
Hình 3.18. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể J 34
Hình 3.19. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong môi trƣờng dịch thể B12 35
Hình 3.20. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể B12 35

Hình 3.21. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của 2 chủng LT2,
LT8 và các loài có quan hệ họ hàng gần 37
Hình 3.22. Kết quả chạy TLC trƣớc khi nhuộm nihyđrin 38
Hình 3.23. Kết quả chạy TLC sau khi nhuộm nihyđrin 38
Hình 3.24. Đồ thị đƣờng chuẩn microcystin 39
Hình 3.25a. Sắc ký đồ microcystin RR chuẩn 40
Hình 3.25b. Sắc ký đồ microcystin YR chuẩn 40
Hình 3.25c . Sắc ký đồ microcystin LR chuẩn 41
Hình 3.25d. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT2 41
Hình 3.25e. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT8 42
Hình 3.26. Nuôi cấy làm giàu các chủng vi khuẩn nƣớc trên môi trƣờng NA và M7
45
Hình 3.27. Cấy pha khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng NA 45
Hình 3.28. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N4 và
các loài có quan hệ họ hàng gần 48
Hình 3.29. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N7 với
các loài có quan hệ họ hàng gần 49
Hình 3.30. Thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau của 2
chủng N4, N7. 50
Hình 3.31. Khả năng phân giải microcystin của vi khuẩn Sphingomonas N4 ở các
nhiệt độ khác nhau 52
Hình 3.32. Khả năng phân giải của vi khuẩn Sphingomonas N7 ở nhiệt độ khác
nhau 53
Danh mục bảng
Bảng 1.1. Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16] 4
Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng Bold3N
32
Bảng 3.2. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng J 33
Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng của các chủng Microcystis trên môi trƣờng B12 34
Bảng 3.4. Thành phần acid béo có trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 36

Bảng 3.5. Hàm lƣợng microcystin của 2 chủng LT2 và LT8 43
Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái của 2 chủng vi khuẩn nƣớc N4 và N7 46
Bảng 3.7. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng N4 và N7 46
Bảng 3.8. Hằng số tốc độ phân giải (K) và thời gian bán phân giải microcystin ở các
nồng độ khác nhau 50
Bảng 3.9. Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N4 ở
các nhiệt độ khác nhau 52
Bảng 3.10. Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N7 ở
các nhiệt độ khác nhau 52
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT


Các chữ viết tắt
Tên đầy đủ
Adda
3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-
dienoic acid
MC-LR
Leucine and arginine in the positions of X and Z of
microcystin
MC-RR
Arginine and arginine in the positions of X and Z of
microcystin
MC-YR
Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of
microcystin
PCR
Phản ứng trùng hợp (Polymerase chain reaction)
WHO
Tổ chức y tế thế giới (World Health Organisation)

TLC
Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)
HPLC
Sắc ký lỏng cao áp (High permormance liquid
chromatography)
bp
Cặp bazơ (Base pair)
tb
Tế bào


1
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo
theo đó là sự ô nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận. Hồ Hoàn Kiếm
một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm. Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn
tới sự phát triển thƣờng xuyên và không bình thƣờng của vi khuẩn lam, làm biến đổi
cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc
hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở
hồ Hoàn Kiếm đã đƣợc cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trƣờng cho khu
hệ động thực vật sống trong hồ [1, 2, 5, 9].
Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa
Kutzing là loài bị bắt gặp thƣờng xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố
thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vòng có tên gọi là
microcystin (MC) [14, 15, 19, 23, 29]. Microcystin là chất ức chế đối với enzyme
protein phosphatases (nhóm PP1 và PP2A) [30]. Độc tố cũng gây ảnh hƣởng xấu
lên hai loại protein serine và threonin phosphatases [15, 16, 17, 18, 22]. Đã có một
số bài báo chứng minh hiện tƣợng nƣớc nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh
vật thủy sinh, động vật và con ngƣời [16,17, 19, 20, 21]. Microcystin thƣờng tích
luỹ trong nội quan tế bào hoặc dƣới dạng tự do trong nƣớc [16, 18, 35, 36, 42]. Đã

có không ít các công trình nghiên cứu hiện tƣợng nở hoa nƣớc và giảm thiểu tác hại
của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác
nhau. Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc
điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng
Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội”.
Mục tiêu của đề tài
* Phân lập, định tên, nuôi cấy và lƣu giữ đƣợc các chủng vi khuẩn lam
Microcystis trong Bảo tàng Vi tảo của Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi
trƣờng - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN.
* Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn.


2
Nội dung của đề tài
- Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hoá của nƣớc hồ Hoàn Kiếm tại
thời điểm thu mẫu.
- Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp
của các chủng Microcystis.
- Phân loại đến loài các chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc.
- Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc
ký lỏng cao áp (HPLC).
- Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây
độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nƣớc).

3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM
Hồ Hoàn Kiếm nằm ở trung tâm thủ đô Hà Nội, xƣa là một đoạn của dòng
sông hồng và còn có tên gọi khác là sông Nhị. Diện tích hồ ƣớc tính khoảng 12
hecta, chiều dài Nam - Bắc là 700m. Chiều rộng Đông – Tây là 200m.

Hình 1.1. Hồ Hoàn Kiếm Hà Nội
Trong vài thập kỷ gần đây song
song với quá trình phát triển kinh tế
xã hội của Hà Nội,do không có biện
pháp ngăn chặn những tác động gây ô
nhiễm làm biến đổi hệ sinh thái hồ,
ảnh hƣởng tới chất lƣợng nƣớc hồ,
hàm lƣợng N và P tăng lên đã dẫn tới
sự phát triển bùng nổ của vi khuẩn
lam. Hồ Hoàn Kiếm trở thành một
trong những hồ phú dƣỡng ở Hà Nội.
Trong hồ có sự phát triển mạnh mẽ của một số vi khuẩn lam thuộc chi
Microcystis, tạo thành những váng lớn nổi bồng bềnh che kín mặt một góc hồ. Kết
thúc sự nở hoa, vi khuẩn lam chết hàng loạt gây mùi hôi lan xung quanh khu vực hồ
[6].
1.2. VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC
Vi khuẩn lam là nhóm cơ thể cổ xƣa nhất và mang nhiều tên gọi khác nhau
trong quá trình nghiên cứu: thực vật phân cắt (Schizophyceae), tảo nhầy
(Myxophyceae), tảo lam (Cyanophyta), vi khuẩn lam (Cyanobacteria). Từ năm
1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh.
Trong phân loại hiện đại, sinh vật chƣa có cấu trúc nhân hoàn hảo (Procaryota) gồm
vi khuẩn lam và vi khuẩn, căn cứ vào đặc điểm cả hai đều không có nhân điển hình,
chỉ có chất nhân và nhiễm sắc thể. Vi khuẩn lam và vi khuẩn còn có những nét
giống nhau nhƣ: màng tế bào đều cấu tạo từ murein, một loại glucozaminopeptit;

4
trong tế bào chất có nhiều riboxom; nhiều loài vi khuẩn và vi khuẩn lam đều có khả
năng đồng hoá đƣợc N
2
tự do; cả hai đều có thể hình thành các pha cyanophase và

bacteriophase. Vi khuẩn lam khác với các ngành tảo và thực vật bậc cao ở cấu trúc
rất cổ xƣa, tế bào không có cấu trúc nhân điển hình và không có các giai đoạn phân
chia nhân. Vi khuẩn lam phân bố khắp nơi trên trái đất, đa số sống trong nƣớc ngọt,
một số phân bố trong thuỷ vực nƣớc mặn giàu chất hữu cơ hoặc trong nƣớc lợ [7].
Độc tố vi khuẩn lam phổ biến nhất là độc tố gan (hepatotoxin) và độc tố thần
kinh (neurotoxin). Một số loài vi khuẩn lam có chứa cả hai loại độc tố trên. Các
quần thể nở hoa trong thuỷ vực nƣớc ngọt chủ yếu thuộc về chi Microcystis thƣờng
gây độc [8, 9], nhƣng cũng có các chủng thuộc chi này không gây độc [29]. Có ý
kiến cho rằng độc tính không phải là tính trạng đặc hiệu ở những loài nhất định nào
đó, nhƣ với microcystin (hepatotoxin) thì độc tính của một chủng phụ thuộc vào
điều kiện là chủng đó có mang gen mã hóa cho microcystin hay không [38, 39]. Thí
nghiệm nuôi cấy vi khuẩn lam cũng chỉ ra rằng sản sinh microcystin là tính trạng
không đổi của một số chủng nhất định, hiếm khi bị tác động bởi các yếu tố môi
trƣờng [16, 49]. Trong khi các điều kiện dẫn tới sự nở hoa của vi khuẩn lam đã
đƣợc sáng tỏ, thì các yếu tố dẫn tới sự bùng nổ của các chủng gây độc so với các
chủng không độc vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ [15, 20, 22, 34].
Bảng 1.1. Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16]
Loài
Loại độc tố
Nơi phát sinh
Anabaena spp. (flos-
aquae, lemmermannii,
circinalis)
Microcystins
Anh
Anabaena circinalis
Microcystins
Pháp
Anabaena flos-aquae
Microcystins

Nauy
Microcystis aeruginosa
Microcystins
Worldwide
M. viridis
Microcystins
Nhật Bản
M. botrys
Microcystins
Đan Mạch
Planktothrix agardhii
Microcystins
Trung Quốc
P. agardhii
Microcystins
Nauy
Oscillatoria limosa
Microcystins
Thuỵ Sỹ

5
Loài
Loại độc tố
Nơi phát sinh
Nostoc sp.
Microcystins
Anh
Anabaenopsis millerii
Microcystins
Bỉ

Haphalosiphon
hibernicus (soil isolate)
Microcystins
Mỹ
Nodularia spumigena
Nodularins
Úc
Aphanizomenon
Ovalisporum
Cylindrospermopsin
Isaen
Cylindrospermopsis
raciborskii
Cylindrospermopsin
Úc
Umezakia natans
Cylindrospermopsin
Nhật
Anabaena flos-aquae
Anatoxin-a
Canada
Anabaena blooms
Anatoxin-a
Đức
Anabaena sp.
Anatoxin-a
Nhật
Aphanizomenon sp.
Anatoxin-a
Phần Lan

Aphanizomenon blooms
Anatoxin-a
Đức
Cylindrospermum sp.
Anatoxin-a
Phần Lan
Microcystis sp.
Anatoxin-a
Nhật Bản
Planktothrix sp.
Anatoxin-a
Anh
Planktothrix Formosa
Homoanatoxin-a
Nauy
Anabaena flos-aquae
Anatoxin-a(S)
Canada
A. lemmermannii
Anatoxin-a(S)
Đan Mạch
Anabaena circinalis
Sacidoxins
Úc
Aphanizomenon flos-
aquae
Sacidoxins
Mỹ
Cylindrospermopsis
raciborskii

Sacidoxins
Braxin
Lyngbya wollei
Sacidoxins
Mỹ

Sự nghiên cứu vi khuẩn lam gây độc ở nhiều nƣớc trên thế giới cho thấy có
khoảng 60% các mẫu vi khuẩn lam đƣợc điều tra mang độc tố (bảng 1.1). Tuy
nhiên, độc tố của hiện tƣợng nở hoa nƣớc có thể thay đổi theo thời gian và không
gian. Nếu chứng minh đƣợc quần thể vi khuẩn lam trong một hồ nào đó có mang
độc tính nhƣng mật độ của chúng thấp thì không nhất thiết phải báo động cho cộng

6
đồng về những tác hại của chúng đối với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng [16, 22,
43, 48, 50].
1.2.1. Vi khuẩn lam Microcystis
Trong số các loài vi khuẩn lam đƣợc xác định gây độc cho con ngƣời thì
Microcystis aeruginosa đƣợc xem là thƣờng gặp nhất, là một trong những loài vi
khuẩn lam tham gia đáng kể hình thành hiện tƣợng nở hoa của nƣớc. Với đặc điểm
là tập đoàn bao gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ cỡ từ 2- 3 µm và mỗi tế bào đều
chứa một không bào khí. Chính sự tập hợp của hàng nghìn không bào khí định vị
trong vô số các tế bào này giúp chúng nổi trên mặt nƣớc và thu nhận đƣợc nguồn
ánh sáng mặt trời, thông qua quá trình quang hợp tổng hợp sắc tố diệp lục tạo nên
váng xanh trên mặt nƣớc [25].

Hình 1.2. Microcystis flos-aquae [62]


Hình 1.3. Microcystis aeruginosa [63]
1.2.2. Độc tố microcystin của Microcystis

Microcystin [16, 40] là những độc tố vi khuẩn lam gặp phổ biến và rộng rãi
nhất. Hợp chất này đƣợc tách ra đầu tiên từ loài vi khuẩn lam Microcystis
aeruginosa do vậy đƣợc gọi là microcystins. Chúng là các heptapeptide mạch vòng
do có chứa 1 amino acid đặc hiệu (ADDA) chuỗi bên [24]. Cho đến nay, đây là
những dạng cấu trúc chỉ gặp ở microcystins và nodularin (một loại pentapeptide
vòng của vi khuẩn lam ở trong nƣớc lợ). Ngƣời ta đã biết khoảng 70 loại độc tố
microcystins khác nhau. Chúng khác nhau ở các nhóm metyl và 2 amino acid. bên
trong chuỗi. Từ đó dẫn đến sự khác nhau về cấu trúc bậc 4, tính độc cũng nhƣ các

7
đặc tính ƣa nƣớc hoặc kỵ nƣớc. Microcystin gắn protein phosphataza 1 và 2 là
những loại protein quan trọng trong tế bào nhân thật bằng 1 liên kết đồng hóa trị
không thuận nghịch. Các kênh gắn acid mật đƣợc tìm thấy trong tế bào gan là con
đƣờng cho phép microcystin đi vào trong tế bào. Đối với động vật có xƣơng sống,
liều lƣợng gây chết của microcystin sẽ làm cho gan bị hoại tử trong thời gian vài
giờ hoặc vài ngày. Có lẽ rằng các cấu trúc kỵ nƣớc có thể đi xuyên qua 1 vài loại tế
bào mà thậm chí không theo kênh acid mật.
Ngoài ra, Fitzgeorge đã cung cấp bằng chứng cho rằng các MC-LR thƣờng
gặp có thể huỷ hoại cấu trúc của mô mũi. Trong khi đó, độc tính gây ra do hấp thụ
qua đƣờng miệng thƣờng ít gây ảnh hƣởng hơn nếu so với tiêm vào dƣới màng
bụng trong các thí nghiệm mà ngƣời ta tiêm sẽ khiến chúng có tác dụng phá huỷ
màng tế bào và làm gia tăng độc tính của anatoxin-a (một loại độc tố thần kinh)
[49].

Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – LR [54]

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – RR [54]

8

Hình 1.6. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố MC – YR [54]
Biến thể xảy ra chủ yếu tại các vị trí 1 và 2. Ví dụ, Microcystin-LR chứa
leucine amino acid (L) và arginine (R) tại các vị trí 1 và 2 tƣơng ứng. Microcystin-
RR có arginine ở cả hai vị trí. Các nghiên cứu cơ chế độc học tế bào đã cho biết
microcystins ảnh hƣởng đến các cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân và điều
này giúp giải thích khả năng kích thích gây ung thƣ của chúng.
1.2.3. Cơ chế gây độc của microcystin
Cơ chế gây độc của microcystin ở mức độ phân tử là ức chế các hepatocyte
protein phosphatases P 1 (PP1) và 2A (PP2A) – hai enzyme điều chỉnh nhiều quá
trình diễn ra trong tế bào động vật và thực vật. Sự kìm hãm này dẫn tới sự siêu
phosphoryl hóa của tế bào cytoskeratin. Trong tế bào gan của ngƣời và động vật,
điều này còn làm tăng sự phá vỡ các vi sợi hình thành nên khung tế bào. Khi các vi
sợi trở lên tách rời màng tế bào sẽ làm xuất hiện các bóng nƣớc trong màng, đồng
thời làm màng tế bào bị co lại, dịch tế bào thoát ra. Đây đƣợc xem là nguyên nhân
gây ra chảy máu gan, phá vỡ cấu trúc của gan thƣờng thấy ở động vật. Sự tiếp xúc
lâu dài với nồng độ microcystin thấp trong nƣớc uống là nhân tố gây ra ung thƣ gan
ở ngƣời [14]. Các nghiên cứu cơ chế động học tế bào đã cho biết microcystin ảnh
hƣởng lớn đến cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân, điều này giúp giải thích
khả năng kích thích gây ung thƣ của chúng. Độc tố này cũng gây ảnh hƣởng xấu
đến hai loại enzyme là serin – photphatase và threonin – photphatase liên quan tới
sự điều hòa phát triển các tế bào nhân thật (Eukaryote), điều khiển sự hoạt động của
tế bào động thực vật trong quá trình phân chia, sinh trƣởng, trao đổi chất, sao chép