ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TÌM HIỂU VỀ CHITOSAN

Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN
1. Lịch sử phát triển [16]
Danh từ chitin theo tiếng Hi Lạp nghĩa là lớp áo vỏ ngoài hay sự bao bọc,
được đề nghị bởi Odier vào năm 1832 khi tác giả tách được một polysaccharide từ
cánh cứng của bọ da. Tuy nhiên, polysaccharide này được phát hiện bởi Braconnot
(một giáo sư về lịch sử tự nhiên, giám đốc vườn Bách thảo và là thành viên của
Viện Hàn lâm Khoa học Nancy, Pháp) vào năm 1811 với tên gọi là “Fungi”.
Chitin rất phổ biến trong tự nhiên, nó được phát hiện ở trong động vật lẫn thực vật,
tham gia vào thành phần cấu tạo thành tế bào nấm (chiếm 3 - 5% trọng lượng
tươi), cấu tạo bộ khung xương của vỏ tôm, sam, cua, côn trùng, … Chitosan được
tổng hợp ngoài nguồn nguyên liệu chính từ chitin trong tự nhiên còn được tổng
hợp bằng cách nuôi cấy vi sinh vật.
Tới năm 1859, Rouget lần đầu tiên phát hiện ra chitosan (dẫn xuất của
chitin) khi ông đun sôi chitin trong KOH đậm đặc.
Năm 1878, Ledderhose đã viết nên phương trình phản ứng thuỷ phân giữa
glucosamine với acetic acid hình thành chitin.
Năm 1894, Gilson đã xác định sự hiện diện của glusosamine.
Năm 1989, Van Wisseling lần đầu tiên viết một cách tổng quan về chitin.
Năm 1906, Von Furth và Russo đã chỉ ra rằng chitosan hình thành muối
tinh thể với acid và bị kết tủa từ dung dịch acid bởi những tác nhân kết tủa là
kiềm.
Quá trình nghiên cứu về chitin, chitosan thực sự bắt đầu có hệ thống vào
năm đầu của thế kỉ XX. Vào năm 1950, chitosan được mô tả một cách rõ ràng như
một polymer của glucosamine và cấu trúc của chitin cũng được nghiên cứu, những
cuốn sách đầu tiên về chitin được xuất bản trong thập kỉ 50. Và cho đến nay,
chitin, chitosan là tên gọi quen thuộc với hầu hết các nhà hoá, sinh, … Hội nghị
khoa học đầu tiên ở vùng Châu Á Thái Bình Dương đã được tổ chức tại trường
Đại học Kebangsaan vào năm 1994 rất quan tâm đến tiềm năng sản xuất và ứng
dụng của chitin và chitosan của các nước Đông Nam Á.
Động lực chính cho sự phát triển và ứng dụng chitosan là nó được điều chế

dễ dàng từ nguồn nguyên liệu loại bỏ, phong phú trong tự nhiên, hạn chế được ô
nhiễm môi trường, không độc đối với con người và có khả năng tự phân huỷ sinh
học. Đặc tính quan trọng nhất của chitosan là khả năng tạo màng tốt, có độ mỏng
cao có thể lên đến 25µm mà vẫn có khả năng lấy ra được nên nó được ứng dụng
khá tốt trong màng bao thực phẩm.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 1
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
2. Chitin [2, 21, 22, 23, 27]
Chitin là một polysaccharide xuất hiện nhiều thứ hai trong thiên nhiên chỉ
sau cellulose, sản phẩm thương mại thường ở dạng rắn. Chitin có mặt trong vỏ các
loại giáp xác (tôm, cua…), nhuyễn thể (sò, ốc…), bộ cánh cứng của côn trùng,
màng tế bào nấm thuộc họ Zygemycetes, có trong sinh khối nấm mốc và một vài
loại tảo.
Hàm lượng chitin có trong một số loài thuỷ sản được xác định bởi Đỗ Đình
Răng và Phạm Đình Cường (2000). Hàm lượng đó được trình bày ở bảng sau:
Bảng 1: Hàm lượng chitin của một số loài thuỷ sản
Nguyên liệu Hàm lượng chitin (%)
Vỏ hến 0,48
Vỏ ốc 1,24
Vỏ cua đồng 23,80
Vỏ tôm đồng 30,00
Vỏ tôm biển 33,10
Chitin có tên khoa học là: poly [-β(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-D-
glycopyranose].
Công thức cấu tạo của chitin:
Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, khi thay C(2) – nhóm hydroxyl của
cellulose bằng C(2)–acetamido ta sẽ chitin.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 2

Hình 1: Cấu trúc của chitin
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
 Cấu trúc mạng tinh thể của chitin:
Chitin tồn tại ở 3 dạng polymorphic. Hướng sắp xếp của các mạch thay đổi
hình thành 3 dạng cấu trúc , , .
 - chitin:
- chitin:
- chitin:
Dạng  - chitin là bền nhất và phổ biến nhất. Từ , - chitin có thể chuyển
hóa về dạng  - chitin.
a. fomic
- chitin  - chitin
Dd HCl 6M nguội

Dd LiSCN bão hòa
- chitin  - chitin
Dạng ,  đều bền trong NaOH 1,25M; HCl 1,25M.
 - chitin có nhiều ở phần cứng vỏ động vật.
, - chitin có nhiều ở vùng mềm và dai của động vật.
Trong tự nhiên, dạng liên kết của chitin thường là phức với protein và
polysaccharide. Liên kết protein- chitin được gọi là “Coralent”.
Chitin thường không tồn tại trong thiên nhiên như một chất riêng biệt mà
xuất hiện dưới dạng phức chất với nhiều chất khác như protein, polysaccharide (kể
cả cellulose). Chitin tinh khiết chỉ có trong vỏ gai (extracellular spine) của những
loài khúc tảo và trong phòng thí nghiệm sau quá trình xử lý để lọai các thành phần
khác. Thực tế ta chỉ khảo sát được chitin dưới dạng hợp chất có chứa chitin. Ngay
cả khi dùng chitin đã được làm sạch người ta vẫn không xem nó là một đơn chất vì
các mạch polime sẽ chứa một phần 2-amino-2-deoxy-D-glycopyranose và một
lượng đáng kể 2-acetamido-2-deoxy-D-glycopyranose.
Việc nghiên cứu thành phần của chitin được tiến hành dựa trên sự thuỷ

phân bằng chlohydric.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 3
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Chitin không tan trong nước, acid loãng hoặc base loãng nhưng tan trong
acid vô cơ đậm đặc như HCl, H
2
SO
4
, H
3
PO
4
(78-79%). Trong HCl đậm đặc, quá
trình thuỷ phân chitin xảy ra bắt đầu từ nối glucose và tiếp đó là sự loại bỏ các
nhóm acetyl.
Chitin không hòa tan trong hầu hết các dung môi thông thường nên khả năng
ứng dụng bị hạn chế. Do đó người ta thực hiện quá trình deacetyl hóa chitin để tạo
ra sản phẩm chitosan nhằm cải thiện độ hòa tan, tăng khả năng ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực.
3. Chitosan [6, 8, 10, 16, 22, 23, 27]
Chitosan có tên khoa học: poly[β-(1-4)-2-amido-2-deoxy-D-
glycopyranose].
 Công thức phân tử: (C
6
H
11
NO
4
)

n
với n nằm trong khoảng 700 ÷ 4500.
 Trọng lượng phân tử trung bình: 10000 – 50000 dalton.
Hình 2: Cấu trúc của Chitosan
 Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, được tạo thành bằng cách loại
các nhóm acetyl từ phân tử chitin (quá trình deacetyl).
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 4
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Trên mỗi mắc xích của phân tử chitosan có 3 loại nhóm chức, các nhóm
chức này có khả năng kết hợp với chất khác để tạo ra các dẫn xuất có lợi khác
nhau của chitosan. Bản chất điện ly được thể hiện khi các nhóm amin của chitosan
bị proton hoá trong dung dịch acid. Trong dung dịch acid loãng không có chất điện
ly, độ nhớt cũng tăng theo nồng độ của chitosan và kích thước của mạch phụ thuộc
vào sức căng ionic của chất trung gian và mức độ ion hoá. Tính mềm dẻo của
mạch tăng theo mức độ deacetyl hoá vì khi đó giảm liên kết hydrogen trong phân
tử chitosan.
Chitosan có tác dụng kháng vi khuẩn khá tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây
bệnh như E. coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng
diệt nấm nhất là nấm Candida albicans. Ngoài các tính năng trên của chitosan, các
dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, sinh học
và bảo vệ môi trường.
Chitosan có khả năng hấp thu đáng kể một lượng lớn nước. Có 2 chỉ số
quan trọng nhất của chitosan là mức độ deacetyl hoá (DD) và trọng lượng phân tử
trung bình. Độ deacetyl hoá (DD) là độ chuyển hoá chitin thành chitosan. Thông
thường các chitosan có độ deacetyl hoá 85 – 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan có
độ deacetyl hoá khoảng 45 - 55% tan tốt trong nước nên được gọi là chitin tan.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 5
Tách nhóm acetyl

Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Trọng lượng phân tử trung bình của chitosan là một đại lượng có ý nghĩa thống kê,
nó được xác định thông qua độ nhớt của dung dịch chitosan, có giá trị biến đổi từ
10000 - 500000 tuỳ theo mỗi loại chitosan khác nhau. Hai chỉ số này ảnh hưởng
trực tiếp đến các tính chất hoá lý, hoạt tính sinh học và ứng dụng của chitosan.
Chitosan thương phẩm đã khử 80 - 85% nhóm acetyl (DD = 80 - 85%).
Bảng 2: Một vài thông số kỹ thuật của chitin và chitosan thương phẩm
(được sản xuất tại công ty Kate International, 14/1909, Kaf villa, Chullickal,
Kochi- 682005, Kerala, India)
Thông số kỹ thuật Chitin Chitosan
Kích thước 2 - 5 mm 2 mm
Độ ẩm < 10% < 10%
Tro < 2% < 0,5%
Protein < 3%
Mùi không trắng không mùi
Màu trắng trắng
Không tan 0,5%
Độ nhớt
50 - 100 với DD > 85%
100 - 200 với DD >
80%
> 200 với DD < 80%
4. Mức độ khác nhau của chitin và chitosan [16]
Trong thực tế, không có sản phẩm nào chiếm 100% chitin hoặc chứa 100%
chitosan, do đó để đánh giá mức độ khác biệt của chitin và chitosan người ta dùng
khái niệm độ acetyl hoá (DA) hoặc độ deacetyl hoá (DD). Thực chất đây là sự
khác nhau do hàm lượng nhóm –NHCOCH
3
và nhóm NH
2

trong chitin và
chitosan. Nếu sản phẩm có độ DA lớn hơn 50% (DD nhỏ hơn 50%) là sản phẩm
chitin còn nếu ngược lại là chitosan.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 6
Chitosan
Hình 3: Chitosan thương phẩm
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Chương 2. TÍNH CHẤT CỦA CHITOSAN [6, 11, 22, 23, 27]
Những tính chất chung của chitosan thương phẩm:
+ Kích thước hạt: 1 - 3 mm
+ Trọng lượng riêng biểu kiến: 0,15 – 0,05
+ Độ ẩm: 10%
+ Phần hòa tan trong kiềm và tro: 5%
+ Màu dung dịch: trắng hơi
vàng
+ Trọng lượng phân tử: 1,6.10
5
– 3.10
5
g/mol
+ Hàm lượng amin: 7 - 10%
1. Tính chất vật lý
Chitosan thương phẩm có dạng
vảy rắn, màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị.
Nhiệt độ nóng chảy: 309 - 311
o
C.
 Cấu trúc vật lý:
Cấu trúc của chitosan thay đổi tùy thuộc cấu trúc của chitin nguyên liệu và

phương pháp điều chế. Sự khác nhau trong cách sắp xếp các mạch polime trong
chitin sẽ dẫn đến sự khác nhau tương ứng trong chitosan. Song người ta cho rằng
trạng thái bền vững nhất của chitosan tinh chế là một trong những cấu trúc tinh thể
đúng của chitosan. Kết quả phân tích những sản phẩm thu được bằng cách nấu
chảy chitin trong KOH ở 180
o
C và bằng cách xử lý với dung dịch NaOH đậm đặc
cho thấy là như nhau.
 Tính tan:
Chitosan là một base tạo được các muối với acid do đó hình thành các
polyelectrolyte mà tính tan phụ thuộc vào bản chất của những amino liên quan.
Thường thì acid được cho vào chitosan đang ngâm nước để tạo thành muối và sự
hòa tan tự xảy ra đồng thời. Ví dụ để có dung dịch 1% thì dùng 1,0g chitosan
trong 50ml nước và cho tiếp thêm 50ml dd acid 2%.
Tính tan của chitosan trong các dung môi khác nhau như sau:
+ Trong acid vô cơ:
Chitosan tan được trong HCl, HBr, HI, HNO
3
và HClO
4
lõang nhưng cũng
có thể tạo tủa tách riêng được trong dung dịch HCl hoặc HBr khi tăng nồng độ
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 7
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
acid. Chitosan cũng hòa tan được trong H
2
SO
4
ở nhiệt độ phòng. Trong acid

H
2
SO
4
đậm đặc, sự hòa tan xảy ra song song với sự sulphat hóa và thủy phân
chitin.
+ Trong các acid hữu cơ:
Chitosan hình thành muối tan được trong nước với một nhóm acid hữu cơ.
Những muối monocarboxylic acid lên đến hecxanoic dễ dàng hòa tan trong nước
khi hình thành với maloic acid đến nonane dioic acid đều hòa tan được trong
nước. Những nghiên cứu về muối của chitosan và các acid aromatic carboxylic
cũng cho thấy khả năng tan được trong nước như chitosan benzoate, chitosan o-
amino benzoate (chitosan anthranilate), chitosan p- amino benzoate và cũng có
một số muối không tan hoặc ít tan trong nước như chitosan phenylacetate … Còn
muối của chitosan và acid formic, acid acetic tan rất tốt trong nước.
+ Trong những dung môi hữu cơ:
Chitosan hòa tan một cách dễ dàng trong hỗn hợp DMF - N
2
O
4
với tỷ lệ
N
2
O
4
: chitosan = 3 : 1 cho những dung dịch có độ nhớt thấp và không xảy ra một
biến đổi hóa học nào của chitosan. Đây là dung môi hữu cơ được nghiên cứu đến.
 Tính tương hợp với các dung môi:
Dung dịch chitosan trong dung dịch acid acetic có thể tạo một thể thống
nhất với các dung môi phân cực mà không gây ra sự tạo tủa chitosan. Dung dịch

acid acetic- chitosan có tính tương hợp tốt với rượu như metanol, propanol,
butanol, ethylen glycol, diethylene glycol, aceton, glycol formamide. Những dung
dịch acid của chitosan đều hòa lẫn được với các lọai nhựa tan trong nước không
ion, hồ, dextrin, glucose, saccharose, các glycol, sorbitol và các lọai dầu mỡ, các
parafin, hydrocloric, nitric, formic, citric, và acid lactic nhưng không hòa tan trong
acid sulfuric và các sulphate.
 Bản chất điện ly cao phân tử của chitosan trong dung dịch acid:
Trong dung dịch acid, những nhóm amin của chitosan bị proton hóa và thể
hiện bản chất của chất điện ly cao phân tử. Trong dung dịch lõang không có mặt
chất điện ly, chỉ số độ nhớt tăng theo sự tăng nồng độ dung dịch chitosan. Đây là
đặc trưng của những dung dịch chất điện ly cao phân tử và là kết quả của sự tăng
kích thước sợi khi pha lõang dung dịch do lực đẩy tĩnh điện giữa các đọan mạch.
Lực đẩy này có thể bị khử mất bằng cách thêm một chất điện ly trọng lượng phân
tử thấp có tác dụng che những phần mang điện trên mặt polymer. Và đồng thời,
chỉ số độ nhớt cũng giảm theo nồng độ chitosan cho trước.
 Cấu tạo và kích thước phân tử của những mạch chitosan trong dung
dịch acid:
Mạch sẽ mềm dẻo khi tăng sức căng ionic của dung dịch vì lực đẩy tĩnh
điện giữa các mạch giảm. Độ dài bền vững phụ thuộc vào sức căng ionic của chất
trung gian và mức độ ion hóa.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 8
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Tính mềm dẻo của mạch tăng theo mức độ deacetyl hóa vì khi đó giảm sự
tạo liên kết hydrogen trong phân tử giữa nhóm C(6)-OH và C(2)-NHCOCH
3
. Tính
ổn định của mạch sẽ giảm khi tăng sự deacetyl hóa và tăng theo sự tăng nhiệt độ.
Trong dung dịch chitosan tồn tại những glycan β-(1- 4) và có cấu tạo xoắn ngẫu
nhiên.

Bảng 3: Kích thước phân tử chitosan trong dung dịch acid
Dung dịch acid Độ dài (A
o
)
CH
3
COOH 0,33M – NaCl 0,3M 30 - 230
CH
3
COOH 0,167M – NaCl 0,46M 73
CH
3
COOH 0,2M – NaCl 0,1M – Ure 4M 122
2. Tính chất hóa học
Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, nhóm -NH
2
trong các
mắt xích D- glucozamin, do đó nó có thể tham gia các phản ứng hóa học đặc trưng
cho từng nhóm chức, tạo ra các dẫn xuất thế.
Mặt khác chitosan là một polime mà các monome được nối với nhau bởi
các liên kết -(1-4)-glucoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá
học như: axit, bazơ, tác nhân oxy - hóa và các enzim thuỷ phân.
Hình 4: Cấu trúc của Chitosan
 Tính acid bazơ:
Chitosan là một bazơ.
Hằng số K
b
của nhóm amin thu được từ phương trình:
-NH
2

+ H
2
O
⇔
-NH
3
+
+ OH
-
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 9
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
K
b
=
[ ] [ ]
[ ]
2
3
.
NH
OHNH
−
−
−+
Và pK
b
= -logK
b
Trong khi đó hằng số acid liên hợp thu được từ cân bằng :

-NH
3
+
+ H
2
O
⇔
-NH
2
+ H
3
O
+
K
a
=
[ ] [ ]
[ ]
+
++
−
−
3
32
.
NH
OHNH
Và pK
a
= -logK

a
pK
a
của chitosan phụ thuộc vào mật độ điện tích của polime và mức độ
deacetyl hóa. Giá trị pK
a
có thể thay đổi từ 6,0 đến 6,8.
 Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp:
Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử
oxi và nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả
năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp
như: Hg
2+
, Cd
2+
, Zn
2+
, Cu
2+
,Ni
2+
,Co
2+
, Tuỳ nhóm chức trên mạch polime mà
thành phần và cấu trúc của phức khác nhau.
Hình 5: Phức Ni(II) chitosan
Sự tạo phức giữa chitosan và ion kim loại xảy ra chủ yếu nhờ những nhóm
amin đóng vai trò ligant. Do đó mức độ deacetyl hóa chitosan và nồng độ của
những nhóm amin linh động có ảnh hưởng lớn đến mức độ tạo phức. Kết quả thực
nghiệm cho thấy mức độ hấp phụ những ion chuyển tiếp ở pH7 bởi các dung dịch

chitosan có mức độ deacetyl hóa khác nhau sẽ khác nhau như sau:
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 10
Trong đó là mạng polime.

Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Bảng 4: Mức độ hấp thu kim loại của chitosan
Chất nền Mức độ hấp phụ của ion kim loại x 10
3
mol.g
-1
Ni (II) Cu (II) Zn (II) Cd (II)
Chitosan
[0.55]
3,5 5,3 5,5 6,5
Chitosan
[0.03]
2,3 4,8 3,2 4,9
Kết quả cho thấy dung dịch chitosan có mức độ deacetyl hóa cao ([0,55])
thì mức độ hấp phụ các ion kim loại sẽ cao và mức độ này tùy thuộc vào từng loại
kim loại.
 Phản ứng thủy phân trong môi trường acid:
Trong môi trường acid chitosan bị thủy phân nhưng mức độ thủy phân phụ
thuộc vào loại acid, nồng độ acid và một số các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gian
phản ứng. Những kết quả cho thấy :
−Trong môi trường H
2
SO
4
, sự thủy phân chitosan kèm theo quá trình N-

Sulphate hóa, cho sự phân hóa ngẫu nhiên các mạch phân tử.
−Trong môi trường HF, chitosan cũng bị thủy phân nhưng kém hơn chitin,
tạo thành hỗn hợp các oligome sau 19h ở 20
o
C.
−Trong các môi trường acid khác như HCl, H
3
PO
4
,… sự thủy phân cũng xảy
ra ở những mức khác nhau.
Sự thủy phân chitosan trong môi trường acid được ứng dụng để điều chế
Chitosan vi tinh thể.
 Phản ứng deamin hóa:
Dưới tác dụng của acid nitric, nhóm amin của chitosan sẽ bị khử. Vận tốc
của quá trình có thể tính như sau:
W = Kcf.[H
2
NO
2
+
].[-NH
2
]
Trong đó Kcf là hằng số tốc độ cơ bản.
 Phản ứng nitro hóa:
Cho chitosan tác dụng với HNO
3
trong hỗn hợp của các loại: glacial acetic
acid : acetic anhydric : acid nitric nguyên chất với tỷ lệ: 1 : 1 : 1,3 trong 5,5h ở

nhiệt độ  5
o
C, sau đó trung hòa bằng dung dịch kiềm loãng. Sản phẩm thu được là
muối acid của chitosan nitrat.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 11
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
O
O
O
2
NO
CH
2
ONO
2
O
3
N NH
3
NH
2
CH
2
ONO
2
O
O
O
2

NO
OH
-
 Phản ứng sulphate hóa:
Cho chitosan tác dụng với hỗn hợp H
2
SO
4
95% và ClSO
3
H 98% ở nhiệt độ
từ 0 - 4
o
C, tỉ lệ 1 : 2 trong 1h, cho sản phẩm ở dạng Zwitter ionic (là liên kết tĩnh
điện giữa C(6)OSO
3
-
và NH
3
+
C(2) trong phân tử) làm tăng tính cứng của chuỗi.
Sản phẩm có dạng:
O
HO
O
H O
O
O
3
SOCH

2
O
O
CH
2
OSO
3
NH
3
NH
3
 Phản ứng N-acyl hóa:
Ta có thể acyl hóa chitosan bằng các carboxylic acid, chẳng hạn như formyl
hóa chitosan bằng cách đun chitosan trong HCHO 100% ở 90
o
C.
Trong những trường hợp khác người ta thường cho chitosan phản ứng với
các carboxylic anhydric trong môi trường là hệ dung môi đồng tướng: CH
3
COOH
10% vol – Methanol; hoặc hệ: acid acetic : H
2
O : Methanol tỉ lệ 1 : 9 : 40.
Chitosan phản ứng với RCOOH tạo:
O
O
CH
2
OH
NH

O
HO
C
R
O
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 12
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Ngoài ra chitosan còn có thể tạo các bazo shiff, do tác dụng với các
andehyde mạch thẳng hay vòng tạo các dẫn xuất N-alkylidene chitosan và N-
arylidene chitosan gel.
3. Phương pháp khảo sát phản ứng định tính chitosan
Để kiểm tra một chất có phải là chitosan hay không, người ta có thể sử
dụng phản ứng với kali bicromat như sau:
+ Cho 1ml dung dịch kali bicromat 5% vào 10ml dung dịch chitosan 0,5%
trong dung dịch acid acetic 1%.
+ Nếu có xuất hiện kết tủa màu vàng là có chitosan.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 13
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Chương 3. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT CHITOSAN
I. Phương pháp sản xuất [16, 26]
Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin. Chitin có thể được sản xuất
từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như từ tôm, cua, côn trùng có bộ cánh
cứng, các loài giáp xác, nhuyễn thể (sò, ốc…), từ nấm… Đặc biệt trong vỏ tôm
cua, hàm lượng chitin cao, từ 10 - 15% nguyên liệu khô. Trong đó chitin liên kết
với protein, các chất vô cơ mà chủ yếu là CaCO
3
và các chất béo. Do đó cần phải
loại các hợp chất này ra khỏi chitin.

Có 2 phương pháp để sản xuất chitosan là sử dụng hóa chất và enzym.
Phương pháp dùng hóa chất rất đơn giản, ít chi phí đầu tư nhưng ảnh hưởng không
tốt đến môi trường xung quanh. Ngược lại, phương pháp sử dụng enzym không
làm ô nhiễm môi trường, song phức tạp và đòi hỏi chi phí đầu tư cao. Hiện nay
trên thế giới, chitosan phần lớn được sản xuất bằng hóa chất, phương pháp dùng
enzym mới bước đầu đi vào ứng dụng ở một số nước. Theo thực tế nghiên cứu
điều chế cho thấy ở nước ta chưa thể điều chế chitin- chitosan theo phương pháp
sinh học, do các lý do sau:
+ Hiệu suất thu sản phẩm chitosan rất thấp, mặc dù hoạt tính enzym cao
nhưng chỉ có một phần nhỏ chitin tham gia phản ứng do độ tinh thể của vỏ cao, chỉ
có những nhóm acetyl của chitin nằm bên ngoài mới tiếp xúc được với enzym.
+ Việc sản xuất chitosan bằng enzym sẽ thành công khi và chỉ khi enzym
được phá tinh thể trước khi cho phản ứng deacetyl hóa. Mà thực tế, vấn đề các
phòng thí nghiệm trong nước chưa thực hiện được điều này do thiếu thiết bị máy
móc.
+ Điều chế chitosan theo phương pháp sinh học bằng cách sử dụng enzym
đòi hỏi phải có một nguồn cung cấp enzym thường xuyên và ổn định hay một môi
trường nuôi cấy enzym thích hợp. Điều này trong nước vẫn chưa thực hiện được.
Bên cạnh những bất lợi của phương pháp sinh học thì phương pháp hóa học
lại tỏ ra có nhiều lợi điểm hơn:
+ Quy trình sản xuất đơn giản, thiết bị rẻ tiền.
+ Hoá chất sử dụng rẻ tiền.
+ Chất lượng sản phẩm cao hơn do có thể thực hiện phản ứng ở nhiệt độ
cao hơn.
+ Hiệu suất thu hồi sản phẩm khá cao.
Tuy nhiên phương pháp hoá học cũng có những bất lợi cần quan tâm:
+ Vấn đề xử lý nước thải: phải xử lý nước thải trước khi thải ra môi trường.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 14
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên

+ Vấn đề thu hồi hoá chất.
+ Điều kiện làm việc với hóa chất (NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ăn
mòn thiết bị, làm giảm chất lượng chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức
–NH
2
.
+ Chưa có biện pháp tận thu protein sau khi loại ra khỏi vỏ giáp xác.
Bảng 5: Thành phần hóa học của vỏ các loại giáp xác
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 15
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Hình 6: Hiệu suất thu hồi chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 16
Hình 7: Hàm lượng chitin trong 7 loài giáp xác
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Hình 8: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất Chitosan
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Loại Protein
Tạp chất
Dd NaOH
3.5%
Dd HCl
Loại muối khoáng
(CaCO
3
)
Tạp
chất
Dd NaOH

40%
t=60-120
o
C
Chitin
Nước
Rửa
Deacetyl
hóa
Làm
nguội
Rửa
Nghiề
n
Bột
Chitosa
n
Hòa tan trong HCl
Kết tủa
chậm
Kết tủa nhanh
Vẩy Chitosan
50-60%
Chitosan
kết tủa
mịn
Chitosa
n
dd keo
Sấy

Trang 17
Vỏ tôm,cua
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Hình 9: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chitosan
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 18
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
 Cụ thể người ta tiến hành lần lượt các công đoạn sau:
1. Chuẩn bị:
Làm sạch vỏ giáp xác: Phế liệu vỏ giáp xác được thu thập và đun sôi trong
1h để loại hết các mô. Vỏ tiếp tục được cho vào lò ở 163
O
C trong 1h, sau đó lấy ra,
tách phần mô đã sấy khô còn sót lại trên vỏ, cọ rứa sạch lớp vỏ.
Khử màu: Lớp vỏ cứng bên ngoài của loài giáp xác có chứa chất màu chủ
yếu là cardenoid. Thành phần chính là astarene, astaxanthin, canthaxanthin, lutin
và β - carotene. Chúng không xuất hiện dưới dạng phức chất với các chất vô cơ
cũng như protein, vì vậy khử protein và khử khoáng cũng không loại được
cardenoid. Tuy vậy có thể khử màu bằng chất trích màu như KMnO
4
, NaOCl, SO
2
,
NaHSO
3
… Có thể bổ sung công đoạn ngâm vỏ trong dung dịch chất tẩy trắng
loãng trước khi thực hiện quá trình đun sôi.
Làm nguội vỏ giáp xác: Vỏ sau khi đã làm
sạch được đặt trong lò ở 80
o

C trong 48h để phá vỡ cấu
trúc tinh thể của chitin, nhằm chuyển hầu hết chitin
trong vỏ thành dạng vô định hình. Sau 48h, vỏ được
lấy ra khỏi lò và đổ nhanh vào bể chứa nitơ lỏng
(-196
o
C) để làm nguội. Việc làm nguội nhanh sẽ hạn
chế được sự tái hình thành tinh thể chitin, làm chúng
trở nên vô định hình hơn. Ngoài ra trong quá trình làm
nguội, nhiệt độ của nitơ lỏng còn làm cho vỏ trở nên
rất giòn, dễ vỡ, giúp quá trình nghiền sau đó sẻ dễ
dàng hơn. Sau khoảng thời gian nhất định, lấy vỏ ra
khỏi dung dịch nitơ lỏng, nghiền bằng cối và chày. Có
thể thay dung dịch nitơ lỏng bằng hỗn hợp
methanol- nước đá khô.
2. Loại Protein:
Protein được loại bằng cách nấu với NaOH, nhiệt độ 60-100
o
C. Gần đây
các nghiên cứu mới được thực hiện với một khoảng rộng với các tác nhân như
NaOH, NaHCO
3
, KOH, K
2
CO
3
, Ca(OH)
2
, Na
2

SO
4
, NaHSO
3
, Ca(SO
4
)
2
, NaPO
4
,
Na
2
S. Song NaOH vẫn được dùng thông dụng hơn.
Tùy từng loại vỏ mà điều kiện xử lý có thể thay đổi về nồng độ NaOH,
nhiệt độ hoặc thời gian. Với những loại vật liệu dễ khử protein, có thể dùng
Na
2
CO
3
0.1M ở khoảng 100
o
C trong 4h. Đối với vật liệu khó xử lý, có thể dùng
NaOH 5M ở khoảng 100
o
C trong 4h. Tuy nhiên, hầu hết các quá trình khử thường
dùng NaOH 1N với một khoảng nhiệt độ và thời gian xử lý (từ 65-100
o
C) trong
vòng 0.5-7h.

SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 19
Hình 10: Nghiền vỏ bằng cối và chày
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Tiến hành: Cho hỗn hợp vỏ đã làm nguội vào dd NaOH 3,5% (tỉ lệ 1:10
w/v) ở 65
o
C. Sau 2h lấy phần nổi lên trên, rửa bằng nước cất và sấy khô ở 90
o
C.
Người ta có thể định lượng xác định lượng protein tách ra từ vỏ tôm.
Hình 11: Loại protein bằng cách đun với dung dịch NaOH
3. Loại muối khoáng:
Để khử khoáng có thể dùng các tác nhân acid như HCl, HNO
3
, H
2
SO
4
,
CH
3
COOH, HCOOH,… song người ta thường dùng HCl ở nhiệt độ phòng. Tùy
tính chất nguyên liệu mà thay đổi nồng độ acid và thời gian xử lý cần thiết. Ngoài
ra người ta cũng nghiên cứu quá trình khử EDTA ở pH kiềm. Nguyên liệu được
xử lý bằng EDTA ở pH9 hoặc pH10, sau đó xử lý ở pH3 sẽ cho sản phẩm có
khoảng 15% chất vô cơ chủ yếu là silicat.
Tiến hành: Vỏ tôm đã loại protein được cho vào dd HCl 1N (tỉ lệ 1:15
w/v) ở 25
o

C trong 2h ở nhiệt độ phòng. Sau 2h lấy phần vỏ nổi lên trên, rửa bằng
nước cất, sấy ở 90
o
C. Vỏ tôm sau khi đã sấy khô chứa chủ yếu là chitin.
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 20
Hình 12: Loại muối khoáng bằng
dung dịch HCl
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
4. Phản ứng deacetyl hóa:
Phản ứng chính trong điều chế chitosan là deacetyl hóa bằng dung dịch
kiềm. Dung dịch phản ứng cần được gia nhiệt và khuấy trộn đều trong suốt thời
gian phản ứng.
Tiến hành: Chitin thu được đem phản ứng với dung dịch NaOH 40% (tỉ lệ
1:25 w/v) để trong lò ở 80
o
C trong 96h. Chuẩn độ đến pH 7.0 với dung dịch HCl
1N. Chitosan sẽ kết tủa, ta tiến hành lọc hoặc ly tâm, sau đó sấy thu được chitosan.
5. Tinh sạch chitosan:
Kết tủa sau khi đã sấy khô được nghiền thành bột và hòa tan trong dd acid
acetic 2% với tỉ lệ 1:100 (w/v). Cho dung dịch vào các ống thẩm tích, đặt các ống
vào dung dịch acid acetic có nồng độ tương đương trong 24h. Mục đích của quá
trình nhằm loại bỏ các hợp chất có phân tử lượng nhỏ ( muối CH
3
COONa, muối
calci, các protein có phân tử lượng thấp…). Sau đó lấy dung dịch trong ống ra và
sấy chân không, ta thu được chitosan gần như tinh khiết (Được kiểm nghiệm bằng
phương pháp phân tích HPLC).
Tiến hành thí nghiệm lần lượt với 1g và 10g vỏ tôm ban đầu, sự giảm khối
lượng vỏ tôm khi qua từng công đoạn được thể hiện trong bảng sau:

SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 21
Hình 13: Thực hiện phản ứng deacetyl hóa chitin
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Bảng 6: Sự giảm khối lượng vỏ tôm qua từng công đoạn
Khối lượng
vỏ tôm ban
% so với ban đầu
Sau khi lọai
protein
Sau khi lọai
muối khóang
Sau khi lọai
nhóm acetyl
Sau khi thẩm
tích
1 g 67,53 40,46 33,38 19,85
10 g 69,58 33,55 29,78 15,08
Hình 14: Chitosan thu được từ một số loại vỏ giáp xác
Các yếu tố ảnh hưởng đến mức độ deacetyl hóa:
• Nhiệt độ
• Nồng độ dd NaOH
• Thời gian phản ứng
Tiến hành thí nghiệm khảo sát mức độ deacetyl hóa dung dịch chitosan ở
hai chế độ nhiệt độ 100
0
C và 120
0
C, hai nồng độ dung dịch NaOH 40% và 50%.
Kết quả thu được biểu diễn bằng đồ thị như sau:

SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 22
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 23
Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến
mức độ deacetyl hoá dd Chitin
Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến khối
lượng phân tử trung bình của dd Chitosan
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
Từ đồ thị ta thấy: ở nhiệt độ 120
o
C – dung dịch NaOH 50%, mức độ
deacetyl hóa là cao nhất. Ngược lại, ở nhiệt độ 100
o
C – dung dịch NaOH 40%,
mức độ deacetyl hóa là thấp nhất.
Một thí nghiệm khác được tiến hành để khảo sát khối lượng phân tử trung
bình của dung dịch chitosan khi deacetyl hóa chitin bằng dung dịch NaOH 40% và
50%, nhiệt độ 100
o
C và 120
o
C, kết quả thu được:
Từ đồ thị ta thấy ở nhiệt độ 120
o
C – dung dịch NaOH 50%, khối lượng
phân tử trung bình của dung dịch chitosan giảm nhanh nhất. Ngược lại, ở nhiệt độ
100
o

C – dung dịch NaOH 40%, khối lượng phân tử trung bình của dung dịch
chitosan giảm chậm nhất. Điều này được giải thích là do nhiệt độ cao, nồng độ
NaOH lớn, mức độ deacetyl hóa càng lớn làm khối lượng phân tử trung bình của
dung dịch giảm và ngược lại. Ngoài ra, sự giảm nhanh khối lượng phân tử trung
bình được giải thích là do có sự cắt mạch phân tử chitosan khi phản ứng với dung
dịch NaOH ở nồng độ cao và nhiệt độ cao.
II. Phương pháp đánh giá chất lượng của chitosan [7, 11, 13, 16,
17]
1. Thử độ tinh khiết
 Giới hạn polypeptide và acidamin:
Cân chính xác 1g chitosan nghiền mịn với 50ml nước cất. Đun sôi 10ph,
lấy dịch lọc trong (A). Lấy 5ml dịch lọc A thêm 3 giọt NaOH 10% và 1 giọt
CuSO
4
1% lắc đều. Không có màu xanh tím của phản ứng ure.
Lặp lại thí nghiệm để có dịch lọc A, cho vào A vài giọt dung dịch ninhydrin
0.1%, lắc đều. Dung dịch không có màu xanh tím.
 Độ tro:
Cân chính xác 1g chitosan trong chén sứ (đã được nung đến khối lượng
không đổi). Nung trong lò ở 650
o
C đến khi được tro trắng và khối lượng không
đổi. Cân và xác định độ tro.
2. Xác định pH
Cân 10g chitosan nghiền mịn trong 100ml nước cất đun sôi, để nguội. Lọc
lấy nước trong, đem đi xác định pH bằng máy đo pH.
3. Xác định độ deacetyl hoá của chitosan
Có 4 phương pháp nhằm để xác định độ deacetyl hoá của chitosan đó là
phương pháp dựa vào phản ứng với phosphoric acid, phản ứng ninhydrin, phương
pháp dựa vào hàm lượng % đạm tổng số và phương pháp đo phổ hồng ngoại.

SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 24
Đồ án CNTP GVHD: KS.Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS.Nguyễn Xích Liên
3.1. Phản ứng với phosphoric acid
Nguyên lý: Khi chitosan tác dụng H
3
PO
4
đặc ở nhiệt độ cao, gốc acetyl có
trong chitosan sẽ bị tách ra dưới dạng acetic acid và định lượng bằng NaOH 0,1N
theo phương pháp định phân thể tích. Độ deacetyl hoá được tính theo công thức:
DD (%) = 100 – k.V/m
Trong đó:
k = 2,03: Hệ số liên quan đến phân tử lượng của chitin tính theo lý thuyết.
V: sai biệt về thể tích NaOH 0,1N định lượng mẫu thử và mẫu trắng (ml).
m: Khối lượng mẫu thử đã dùng (g).
3.2. Phương pháp phản ứng với ninhydrin
Nguyên lý: Một trong những tính chất hoá học của nhóm amin có trong
nhóm chitosan là tác dụng với ninhydrin vì thế có thể đo độ deacetyl hoá bằng
cách cho chitosan tạo màu với ninhydrin và định lượng bằng phương pháp đo
quang phổ.
- Đo độ hấp thu ở bước sóng 565 nm bằng máy đo quang phổ UV- VIS
hiệu Seconmam.
- Tiến hành đo độ hấp thu ở hai thời điểm 15 phút và 30 phút sau khi thực
hiện phản ứng.
- Mỗi mẫu làm phản ứng đo 3 lần sau đó tính theo công thức:
DD = (b/a) * 99%
Trong đó:
a: Nồng độ dung dịch chitosan thử khi đo.
b: Nồng độ dung dịch chitosan chuẩn mà ở đó độ hấp thu của nó bằng với

độ hấp thu của dung dịch thử.
3.3. Phương pháp dựa vào hàm lượng nitơ tổng số
Nguyên lý: Khi chitin chuyển hoá thành chitosan, gốc acetyl chuyển thành
gốc amin làm ảnh hưởng đến % nitơ tổng số. Dựa vào sự thay đổi % nitơ tổng số,
ta tính được DD (%).
SVTH: Nguyễn Thị Minh Thư
Trang 25