Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và bước đầu chuyển gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi khuẩn agrobacterium tu mefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TR ỜNGĐẠIHỌCS PHẠM HA NỘI 2
HOÀNG THỊ THỦY
NGHIÊN CỨU XÂY DỤNG HỆ THốNG TÁI SINH VÀ B
Ớc
ĐẦU CHUYỂN GEN CHỈ THỊ VÀO CÂY KHOAI
TÂY THÔNG QUA VI KHUAN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VÃN THẠC sĩ SINH HỌC
HÀ NỘI, 2010
LỜI CẢM ƠN
Đê hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu s
ắc tới PGS. TS. Lê
Huy Hàm, Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi đi
ều kiện thuận lợi cho tôi
được học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm trọng điêm Công ngh
ệ Te bào thực vật,
Viện Di truyền Nông nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Thị Lý Thu là người thầy đă tận tình hư
ớng
dẫn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự đào tạo và giúp đỡ nhiệt tình c
ủa các giáo viên Bộ
môn sinh - Trường đại học sư phạm Hà Nội 2, những người thầy đã d
ạy tôi trong suốt quá
trình học tập để tôi hoàn thành chương trình các môn học cao học.
Đông thời tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thê cán bộ khoa h
ọc
của Phòng Thí nghiệm trọng điêm Công nghệ Te bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình tôi đ

ã luôn luôn bên tôi, quan tâm
và tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự đ
ộng viên,
khích lệ của các đồng nghiệp và bạn bè đã dành cho tôi.
Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với nhừng sự giúp đ
ỡ quý
báu đó.
Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 20 ỉ 0
Học viên
Hoàng Thị Thủy
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình
nào khác.
Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2010 Tác giả
Hoàng Thị Thủy
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
i
LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC
iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
ix
MỞ ĐẦU
1
Chưo’ng 1
4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1. Một số đặc điếm sinh học của cây khoai tây
4
1.1.1. Hệ thống phân loại cây khoai tây
4
1.1.2. Đặc điêm hình thái
4
1.2. Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
5
1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
6
1.2.2. Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật
7
1.2.3. Tái sinh cây khoai tây
8
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cay in vitro
8
1.3. Cơ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật
11
1.3.1. Các phương pháp chuyến gen vào thực vật
11
1.3.2. Hệ thống vector chuyển gen

21
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nưóc
23
1.4.1. Các nghiên cứu sản xuất, nhân giong khoai tây
23
1.4.2. Một số thành tựu về cây trồng biến đối gen
25
Chu’O’ng 2
29
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
29
2.1. Vật liệu nghiên cứu
29
V
2.1.1 Vật liệu thực vật
29
2.2.2 Vật liệu di truyền
29
2.2. Nội dung nghiên cứu
30
2.2.1. Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi
30
2.2.2. Nghiên cứu tải sinh chồi
30
2.3. Phương pháp nghiên cứu
31
2.3.1. Phương pháp thiết kế thí nghiệm
31
2.3.2. Phương pháp chuân bị mâu thực vật
32

2.3.3 Phương pháp chuân bị dịch vi khuân
32
2.3.4. Phương pháp chuyên gen
33
2.3.5. Môi trường nuôi cấy
34
2.3.6. Phương pháp đánh giá biêu hiện gen gus tạm thời
35
2.4. Bố trí thí nghiệm
35
2.4.1. Nghiên cứu xây dựng hệ thong tái sinh
35
2.4.2. Nghiên cửu chuyến gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium
tumefaciens
37
2.5. Các chỉ tiêu đánh giá
39
2.6. Xử lý số liệu
39
2.7. Thiết bị nghiên cứu
39
2.8. Địa điểm và thời gian nghỉên cứu
39
KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
40
3.1. Xây dựng quy trình tạo callus và táisinh cây ở khoai tây
40
3.1.1. Anh hưởng của các nên khoáng tới kha năng tạo callus từ các dạng
mô khác nhau ở cây khoai tây
40

3.1.2. Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus ở khoai tây
42
3.1.3. Anh hưởng của các loại xytokinỉn tới khả năng tạo callus ở khoai tây 46
3.1.4. Anh hưởng của xaccarozo' tới khả năng tạo callus ở khoai tây
49
3.1.5. Anh hưởng của Casein hydrolysate (CH) tới khả năng tạo callus
52
3.1.6. Nghiên cứu tái sinh chồi
55
vi
3.2. Nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium tumefaciens
56
3.2.1. Lựa chọn chủng vi khuân A. tumefaciens thích hợp cho chuyên gen ở
giong khoai tây Atlantic 56

3.2.2. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyến gen vào cây khoai tây thông
qua vi khuân A. tumefaciens 59

3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuân (OD
600nm
) lên tỉ lệ biêu
hiện tạm thời của gen gus 61

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ
biêu hiện tạm thời của gen gus 62

3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỷ lệ biếu hiện tạm thời của gen
gus ở cây khoai tây Atlantic 63

KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Phụ lụcl: Thành phần môi trường MS (Murashige and Skoogs, 1972) 73

Phụ lục 2: Thành phần môi trường N6 (Chu và cộng sự, 1975) 74

Phụ lục 3: Môi trưírng nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu 76

vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIỂT TẮT
• • 7
& cs
và cộng sự
2,4D
Dichlorophenoxy acetic acid
AS
Acetosyringone
BAP
6- Benzyl amino purin
bar
Gen mã hóa tông hợp phosphinothricin acetyl transferase
ĐHST
Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật
GA
Gibberellic Acid
gus
Gen mã hóa tông hợp Ị3-glucuronidase
IAA
p- Indole- Acetic Acid

Kinetin
6- furfuryl amino purin
LB
Luria Bertani Medium
MS
Murahige and Skoogs, (1962)
NAA
Napthalene acetic acid
N6
Chu & cs, 1975
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Anh hưởng của các nên khoảng tới khả năng tạo callus từ mô lá cây
khoai tây 40

Bảng 3.2. Anh hưởng của các nên khoảng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân 41
cây khoai tây 41

Bảng 3.3. Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lả cây khoai tây 43

Bảng 3.4. Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây
45

Bảng 3.6. Anh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây 48

Bảng 3.8. Anh hưởng của xaccarozo’ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây 51

Bảng 3.10. Anh hưởng của casein hydrolysate tới khả nàng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây 54

Bảng 3.12. Lựa chọn chủng vi khuân thích hợp cho chuyên gen ở giông khoai tây
Atlantic
56

Bảng 3.13. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyên gen vào mầu lả 59
cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuân A. tumefaciens 59
Bảng 3.14. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyên gen vào đoạn thân 60
cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuân A. tumefaciens 60
Bảng 3.15. Anh hưởng của mật độ vi khuân tới tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus
ở cây khoai tây chuyên gen 61

Bảng 3.17. Nghiên cứu ảnh hư
ởng của thời gian lây nhiễm tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của
gen gus ở mâu khoai tây sau khi chuyên gen 64
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.Cẩu trúc Ti-plasmid 18

Hình 1.2. Cấu trúc đoạn T-DNA
18
Hình 1.3. Quá trình chuyên T-DNA vào tê bào thực vật
19
Hình 1.4. Sơ đô cảu trúc vector nhị thê
21
Hình 1.5. Sơ đo cấu trúc vector liên hợp
23
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIAl301
29
Hình 2.2. Cẩu trúc vectorp6d35S-GUS 30

Hình 3.1. Anh hưởng của các nên khoảng tới khảnăng tạo callus từ mô lả
41
cây khoai tây (1 .Môi trường: N6; 2. Môi trường: MS)
41
Hình 3.2. Anh hưởng của các nên khoáng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
khoai tây (3. Mỏi trường: N6; 4. Môi trường: MS)
42
Hình 3.3. Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lả cây khoai tây 44

CT1(1); CT9(2); CT(7) 44

Hình 3.4. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây
CT1(1); CT9(2); CT(6) 46

Hình 3.5. Anh hưởng của xytokinin tới khả năng tạo callus t
ừ mô lá cây khoai tây 48 Hình
3.6. Anh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ đoạn thân
cây khoai tây 49

Hình 3.7. Anh hưởng của xaccarozcr tới khả năng tạo callus từ mâu lả cây khoai tây
51

Hình 3.8. Anh hưởng của xaccarozơ tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai
tây 52

Hình 3.9. Anh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ mâu lả cây
khoai tây 53

Hình 3.10. Anh hưởng của casein hydrolysate tới khả năng tạo callus từ đo
ạn thân cây khoai

tây
54
X
Hinh3.ll. Tái sinh chồi từ mâu callus tạo thành từ đoạn thân cây khoai tây
Attlantic
56

Hình 3.12. Biếu hiện tạm thời của gen gus trên mẫu lả khoai tây Atlantic sau khi lây
nhiêm với các chủng vi khuân A. tumefaciens khác nhau 58

Hình 3.13. Biêu hiện tạm thời của gen gus trên đoạn thân khoai tây Atlantic sau khi
lây nhiêm với các chủng vi khuân A. tumefaciens khác nhau 58

Hình 3.14. Lựa chọn vector chuyến gen thích hợp vào mẫu lả khoai tây
Atỉantic(AA39: p6d35S-GUS; AA43: pCAMBIA1301) 60

Hình 3.15. Lựa chọn vector chuyên gen thích hợp vào đoạn thân khoai tây Atlantic
(AA39: pCAMBỈA 1301; AA43: p6d35S-GUS) 60

Hình 3.16. Anh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus
lên mâu lá khoai tây 63

Hình 3.17. Anh hưởng của hàm lượng AS lên tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus ở
thân khoai tây 63

Hình 3.18. Anh hưởng của thời gian lây nhiêm lên tỷ lệ biêu hiện tạm th
ời của gen gus ở
đoạn thân khoai tây 65

1

MỞ ĐÀU
1. Đặt vấn đề
Trên thế giới, cây khoai tây được coi là cây lương thực có tầm quan trọng đ
ứng
hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô. Ớ một số nước, khoai tây đư
ợc xem là thực phẩm
chính hàng ngày mặc dù giá thành thấp nhưng có giá trị dinh dưỡng cao.
Việt Nam, có thời kỳ coi khoai tây là nhóm cây lương th
ực có tầm quan trọng thứ
ba sau lúa và ngô. Cây con được nhân giống in vitro thường được dùng đ
ế sản xuất khoai
tây giống phục vụ cho việc tạo củ in vitro [10]. Hiện nay, nhiều cơ quan như Vi
ện Khoa
học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Cây lương thực và Cây thực phâm, Trường Đ
ại
học Nông nghiệp Hà Nội, Công ty Giống cây trồng Trung ương đã đầu tư cho vi
ệc nghiên
cứu, sản xuất các giống khoai tây sạch bệnh, tuy nhiên cho đến nay, chúng ta vẫn ch
ưa có
hệ thống sản xuất, xác nhận giống và cung ứng giống khoai tây hoàn chỉnh [53].
Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chúng ta đã chứng kiến các bư
ớc phát triên
vượt bậc của công nghệ sinh học. Từ những nghiên cứu cơ bản trong những năm 70-80 c
ủa
thế kỷ trước, con người đã bước đầu tạo ra được các giống cây trồng chuyên gen có các đ
ặc
tính hoàn toàn khác biệt như chông ch
ịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, chịu hạn, mặn,
chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dường, tăng cư
ờng hoạt

ch
ất sinh học và ứng dụng trong sản xuất. Một trong những phát triên hứa hẹn sáng sủa
nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyến gen đ
ế sản xuất các chất có
hoạt tính sinh học như: vitamin, các h
ợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công
nghiệp, trong y tể như: kháng nguyên, kháng thê, interferon, vaccine [35].
Hiện nay người ta đã thành công trong việc chuyên gen tông hợp vaccine
ở thực vật
như lúa, thuốc lá, khoai tây, cà r
ốt, rau diếp, chuối, cà chua [20], [32], [33], [34], [41],
[45], [47], Các nghiên cứu đă cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine u
ống sản xuất
thông qua h
ệ thống thực vật chuyến gen là rất lớn, nó không những sẽ góp phần giảm rất
đáng kê giá thành vaccine mà còn m
ở ra những triến vọng mới trong việc ứng dụng công
nghệ sinh học thực vật cho mọi mặt của đời sống. Cây
2
khoai tây là một trong những đối tư
ợng thực vật có vai trò quan trọng trong thành công của
lĩnh vực này.
Việt Nam có khả năng phát triên mạnh cây khoai tây, nhất là ở vùng đ
ồng bằng Bắc
Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc trung Bộ và Tây Nguyên, ư
ớc tính, ít nhất có khoảng 200.000
ha đất có thế trồng được khoai tây. Tuy nhiên trong những năm gần đây, di
ện tích trồng
khoai tây chỉ dao động trong khoảng 30.000-35.000 ha với năng su
ất bình quân khoảng từ

10-11 tấn/ha. Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến năng su
ất thấp và diện tích
trồng giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt. Củ giống trồng phổ biến là loại củ gi
ống
chất lượng thấp (tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao, già sinh lý và độ thuần chủng thấp) [53].
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đă tiến hành đề tài:“ Nghiên c
ứu xây
dựng hệ thống tái sinh và bước đ
ầu chuyến gen chỉ thị vào cây khoai tây thông qua vi
khuân Agrobacterium tumefaciens“.
2. Mục đích nghiên cửu
- Xây dựng được quy trình tạo callus và tái sinh cây t
ừ các dạng mẫu mô khác
nhau của cây khoai tây.
- Bước đâu nghiên c
ứu chuyên gen ở cây khoai tây thông qua vi khuân
Agrobacterium turnefacỉens.
3. Nội dung nghiên cứu
• Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình tạo callus
và tái sinh
cây như: nền khoáng, chất ĐHST, xaccarozơ, casein hydrolysate
• Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đ
ến quá trình biến nạp gen vào cây
khoai tây thông qua A. tumefacines như: Chủng vi khuân Agrobcicterium thích h
ợp cho
biến nạp gen, mật độ vi khuân, thời gian lây nhiễm, AS
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
*Ý nghĩa khoa học
Ket quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về khả năng tái sinh, kh
ả

năng tiếp nhận gen từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số giống khoai tây.
3
* Ỷ nghĩa thực tiên
Là cơ sở đê áp dụng chuyên gen quan tâm vào cây khoai tây nhăm tạo ra các giống
khoai tây biến đôi gen.
5. Phưong pháp nghiên cứu
■ Phương pháp nuôi cấy mô tế bào
(theo quy trình của Yee shirley và cộng sự, 2001)
■ Phương pháp chuyển gen (theo quy trình của De Block, 1988)
■ Phương pháp đánh giá biếu hiện gen gus tạm
thời (theo Jefferson và cộng sự 1987).
6. Giả thuyết khoa học
- Xây dựng được quy trình tạo callus và tái sinh cây từ các dạng mẫu mô khác nhau
của cây khoai tây.
- Bước đâu nghiên cứu chuyên gen ở cây khoai tây thông qua vi khuân
Agrobacterium tumefaciens.
4
Chưong 1
TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây
1.1.1. Hệ thống phân loại cây khoai tây
Khoai tây - Solanum tuberosum L., thuộc họ Cà - Solanaceae
Giới ựegnum):
ae
Plant
Bộ
(ordo):
ales
Solan
Họ

ựamilia):
aceae
Solan
Chi
{genus):
um
Solan
Loài
(species):
s.

tuberosum
1.1.2. Đặc điêm hình thái
a) Bộ rễ
R
ễ khoai tây thuộc loại rễ chùm (trồng từ củ), có rễ cọc (khi trồng bằng hạt), từ rễ
cọc phát triển nhiều rễ phụ khác. Phần lớn rễ tập trung ở độ sâu 30-40 cm, nhưng c
ũng có
những rễ ăn sâu tới l,5-2m. Ngoài ra rễ còn phát triến ở trên củ nhưng ngắn, ít ph
ân nhánh
và cũng có chức năng giống các rễ khác.
Rễ khoai tây phát triển mạnh ở thời kỳ ra hoa (ở dưới mặt đất lúc này đ
ã hình thành
củ và củ bắt đầu lớn lên).
b) Thân
Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo dích dắc, có 3-4 c
ạnh, cao trung bình
từ 40-70 cm đến 1-1,2 m. Phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc mà chi
ều cao
cây có thê khác nhau. Thân thường có màu xanh hoặc xanh nhạt

5
hay đậm, đôi khi có màu ph
ớt hồng hoặc tím tuỳ thuộc vào từng giống. Trên thân có lớp
lông tơ mềm (khi cây còn non) cứng dần và rụng theo thời gian sinh trưởng.
c) Lá
Lá khoai tây tương tự như lá cà chua nhưng khác một số điêm- thu
ộc lá phức tạp,
bản lá to, có 3-7 đôi mọc đối xứng qua trục và 1 lá lẻ trên cùng thường lớn hơn đư
ợc gọi là
lá chét đỉnh. Lá khoai tây dài khoảng 10-15 cm, mặt lá phăng hoặc gợn sóng, lá bản t
o hơn
lá cà chua. Màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều ki
ện
chăm sóc mà có thê màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt
d) Hoa
Hoa khoai tây thường mọc tập trung trên 1 chùm hoa. Nó thuộc loại hoa lư
ờng tính
và có cấu tạo 5:5:5; cuống ngắn. Màu sắc hoa thư
ờng trắng, cũng có the là phớt hồng,
hồng, tím hoặc màu đở phụ thuộc vào từng loại và giống
e) Quả
Qu
ả thuộc loại quả mọng. Hình dạng quả tròn hoặc trái xoan. Khi chín, quả màu
trắng bạc hoặc phớt hồng, mùi vị dễ chịu. Quả có từ 2-3 ngăn, trong đó có chứa nhi
ều hạt
(30-300 hạt).
f) Hạt
Hạt khoai tây có dạng hình dẹt, màu cà phê sáng hoặc màu đen.Khốilượng
1000 hạt khoảng 0,5 g. Thời gian ngủ nghỉ hạt lâu.
g) Củ

Củ là bộ phận làm thực phâm cho con ngư
ời. Củ khoai tây còn có tên gọi là thân củ
hay thân ngầm bởi củ được hình thành là do thân phát triển dưới mặt đất, trong đi
ều kiện
bóng tối. Hình dạng củ khoai tây có thể tròn, elip, tròn dài. đôi khi hình vuông. Màu s
ắc củ
tu
ỳ thuộc vào từng giống, có thê là màu trắng, trắng nhạt, vàng, vàng nhạt trên củ có
nhiều mắt củ, nhưng phân bố không đều. số lư
ợng mắt củ nhiều hay ít tuỳ thuộc vào từng
giống. Trên mắt củ có mi mắt và mắt. Mi mắt dài hay ngắn, mắt nông hay sâu là do đ
ặc tính
di truyền của giống. Trên mỗi mắt thường có 2-3 mầm ngủ và thường tập trung nhiều t
rên
đỉnh củ [7].
1.2. Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
6
1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
1.2.1.1. Tỉnh toàn năng của tế bào
Cơ sở nền tảng của nuôi cấy mô, tế bào thực vật là học thuyết về tính toàn năng c
ủa
tế bào do nhà thực vật học người Đức Habcrland đưa ra vào năm 1902. Ke thừa quan đi
ếm
của ông, các nhà sinh học hiện đại cho rằng tất cả các tế bào cấu tạo nên cơ thê th
ực vật
đều chứa toàn bộ thông tin di truyền đủ đê mã hoá hình thành một c
ơ thê, các nhà nghiên
cứu cho rằng mỗi tế bào thực vật khi tách ra khỏi cơ thê nếu được nuôi trong đi
ều kiện
thích hợp thì có thế phát triển thành một cơ thế hoàn chỉnh. Từ đó đ

ến nay, rất nhiều các
công trình nghiên cứu đã tạo ra được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối
mô
hay từ một phần của cơ quan. Điều đó khẳng định tính toàn năng của tể bào thực vật là c
ơ
sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật [2], [5], [18].
1.2.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan khác
nhau, có chức năng khác nhau và đư
ợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên mọi tế bào đều bắt nguồn từ một tế bào hợp tử ban đầu. Te bào hợp tử đ
ầu tiên lúc
đầu phân chia thành khối tế bào chưa chuyên hoá. Các tế bào chưa chuyên hoá này ti
ếp tục
phân chia và biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc trưng cho các mô, cơ quan có ch
ức
năng khác nhau. Đó là hiện tư
ợng phân hoá tế bào. Tuy nhiên, các tế bào chuyên hoá thành
các tế bào chuyên biệt lại không mất hoàn toàn sự biến đổi của mình. Trong những đi
ều
kiện thích hợp nhất định chúng có thế trở thành dạng tế bào chưa chuyên hoá. Hiện tư
ợng
này gọi là hiện tượng phản phân hoá tế bào [2], [5].
Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt đ
ộng
của các gen. Trong một giai đoạn phát triên nhất định của cây, một số gen nào đó đang
ở
trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá đê cho ra m
ột tính trạng biếu hiện mới.

Ngư
ợc lại một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt đ
ộng. Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra
theo một chương trình đã đư
ợc lập sẵn trong cấu trúc hệ gen của tê bào, giúp cho sự sinh
trưởng, phát triên của cơ thê thực vật được hài hoà.
7
Sự hoạt hoá mô, cơ quan của cơ thê. Khi tách riêng từng tê bào, hoặc làm giảm kích thư
ớc
khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [5].
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là kỹ thuật đi
ều khiên sự phát sinh hình thái
của tế bào thực vật một cách có định hư
ớng dựa và sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
thực vật. Đe điều khiến được phát sinh hình thái của tế bào, người ta bô sung vào môi

trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật chính là auxin
và xytokinin.
Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trư
ờng nuôi cấy
khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ, hoặc callus) c
ủa mô
nuôi cấy khác nhau. Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ nồng đ
ộ auxin/xytokinin thấp thì mô
nuôi cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo callus
[5],
[18].
1.2.2. Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật
Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và phát sinh cây hoàn chỉnh đ
ạt hiệu xuất cao là

tiền đề quan trọng cho thí nghiệm chuyển gen. Đ
ối với mồi loài thực vật, nhất thiết phải
nghiên cứu tối ưu hoá kỹ thuật nuôi cấy thích hợp. Sau đây là các hư
ớng tái sinh cây từ mô
thực vật có thế được sử dụng đế biến nạp gen :
Nuôi cấy callus: Callus là khối tế bào mô mềm có mức đ
ộ cấu trúc di truyền thấp,
chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao. Callus
thu
được bằng nuôi cay in vitro tò các cơ quan của thực vật như thân, lá, r
ễ, hoa trong môi
trường dinh dưỡng có chứa chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin và đi
ều kiện nuôi
cấy thích hợp. Callus có thế được duy trì liên tục trên môi trư
ờng nuôi cấy bằng cách cấy
chuyến định kỳ. Callus khi cấy chuyến lên môi trư
ờng thích hợp có thế phát sinh chồi trực
tiếp hoặc tạo phôi soma và nảy mầm thành cây hoàn chỉnh. Đây là h
ệ thống nuôi cấy có thể
được sử dụng để biến nạp gen đ
ạt hiệu quả cao. Cây chuyên gen phát triển từ một tê bào
callus không bị thê khảm [2],
Nuôi cấy tế bào huyền phù: Là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn ho
ặc cụm nhỏ tế bào
trong môi trường long. Các tế bào này cũng được tạo ra từ callus có ngu
ồn gốc từ thân, lá,
rễ, hoa phôi Tuy nhiên trở ngại của phương pháp này c
ần thời gian nuôi cấy dài và ảnh
hưởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây [52].
8

Nuôi c
ấy tế bào trần: Te bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại
khối nguyên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh đư
ợc gọi là tế bào trần
(protoplast). Các tế bào trần sau khi được nuôi cấy trên môi trư
ờng thích hợp thì tái tạo
thành tế bào, phát triên thành khối callus và tái sinh thành cây hoàn ch
ỉnh, ứng dụng có ý
nghĩa nhất ở phương pháp này là tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp protoplast
và
úng dụng đê biến nạp gen [11].
Ngoài ra, hệ thống tái sinh cây thông qua tạo đa chồi từ mảnh lá hoặc đo
ạn thân
không có chồi bên, cũng có thể được sử dụng để chuyển gen.
1.2.3. Tái sinh cây khoai tây
Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được xem là mấu chốt quyết định đ
ến sự
thành công trong quy trình tạo cây chuyên gen. Nhiêu nhà nghiên cứu thực nghiệm đ
ã thu
được tế bào sống sót trên môi trường chọn lọc nhưng lại không tái sinh đư
ợc cây hoàn
chỉnh. Do vậy hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh được cây hoàn chỉnh
là công
việc quan trọng đầu tiên khi tiến hành biến nạp gen. Một trong yếu tố ảnh hưởng đ
ến nuôi
cấy và tái sinh cây như: Nguồn mẫu vật nuôi cấy, môi trường và đi
ều kiện nuôi cấy, tỷ lệ
thích hợp của chất điều hoà sinh trưởng và các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc.
Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu tái sinh thành công cây khoai tây
in

vitro từ các nguyên liệu như thân, lá thông qua con đường nuôi cấy thuỷ canh in vitro ph
ục
vụ sản xuất củ bi khoai tây (Solanum tuberosum L.) và vi ghép in vitro
cây cà chua
(Lycopersicum esculentum) và cây khoai tây(Solanum tuberosum) [10].
ĩ.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cay in vitro
Môi trường nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro.

Ngoài ch
ức năng làm giá thê cho mẫu cấy, môi trư
ờng nuôi cấy còn có nhiệm vụ chính là
cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết đ
ể cho mẫu cấy tồn tại, phân hoá và phát triên. vấn
đề đặt ra ở đây là khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trư
ờng thích hợp cho sự
sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đ
ối
tượng nuôi cấy cụ thế.
9
- Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dường cơ b
ản cần thiết cho sự sinh
trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cay in vitro. Thành ph
ần của môi
trường hoá học thay đôi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi
cây
nhưng nhìn chung thường gồm các nhóm chất sau [2],
+ Nhóm nguyên tố đa lượng: Nguyên tố đa lượng là nguyên tố muối khoáng đư
ợc sử
dụng ở nồng độ trên 30 ppm, bao gồm các nguyên t
ố sau: N, p, K, s, Mg và Ca. Các nguyên

tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đôi chât của tế bào và có chức n
ăng xây
nên thành tế bào.
+ Nhóm các nguyên tố vi lượng: Nguyên tố vi lượng là nguyên tố khoáng đư
ợc sử
dụng ở nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo tuy chỉ cần một lư
ợng
nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành ph
ần không thể thiếu cho sự sinh
trư
ởng và phát triển của mô. Neu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu
Bo mô nuôi cấy phát triển callus rất nhanh, nhưng có hiệu xuất tái sinh thấp. Hàm lư
ợng
của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vilượng phụ thuộc
vào
từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy.
+ Nguồn cacbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng r
ất yếu, vì vậy
buộc phải bô sung nguồn cacbon đế mẫu nuôi cấy có thê tông hợp được các chất hữu c
ơ
giúp tế bào phân chia. Thông thường nguồn cacbon bô sung là đường xaccaroz
ơ và glucozơ
với liều lượng 20-30g/lít. Guatheret (1959) cho thấy đối với phần lớn các mô, đư
ờng
xaccarozơ và glucozơ là nguồn cacbon tốt nhất [13]. Trong trư
ờng hợp cần thiết có thê thay
thế bằng các loại đường khác như: maltoza, lactozo' hay fructozơ.
+ Các vitamin: Mô và tế bào thực vật khi nuôi cay in vitro vẫn có khả năng t
ự tổng
hợp được một so vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh trư

ởng và phát
triên nhanh của chúng. Các vitamin thường được sử dụng như: B] (thiamine) đóng vai tr
ò
quan trọng trong quá trình biên đôi cacbon và tham gia vào thành phần tô hợp enzim xú
c
tác quá trình oxy hóa khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,1-10 mg/1. B
6

(piridoxin) tham gia vào thành phần các enzim khử cacbon và thay đôi v
ị trí nhóm amin
trong các axit amin, nồng độ thường dùng
10
từ 0,1-1 mg/1. B
5
(axit nicotinic) đi vào thành phần các enzim oxy hóa kh
ử dehydrrogenase
xúc tác việc tách hydro khỏi các axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,5-1 mg/1. Myo-
inositol cũng hay đư
ợc sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tông hợp thành tê bào
thực vật [13].
+ Các chất phụ gia hữu cơ: Các chất phụ gia được đưa vào môi trư
ờng nuôi cấy
nhằm kích thích sự sinh trưởng của callus và các cơ quan như: nư
ớc dừa, khoai tây, chuối,
dịch chiết nấm men. Trong thành phần nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đư
ờng,
myo-inositol và các chất hoạt tính auxin, các gluoxit của xytokinin.
+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hoà sinh trư
ởng có vai trò hết sức
quan trọng đến kết quả nuôi cay in vitro, quyết đ

ịnh sự thành công của toàn bộ quá trình
nuôi cấy. Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đ
ặc biệt
là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất điều hoà sinh trưởng đ
ối với
từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì vậy, đê nuôi cay in vitro
thành
công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thê để tìm ra nồng độ cũng như t
ỷ lệ các chất
điều hoà sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thư
ờng sử dụng 3 nhóm
chất là auxin, xytokinin và gibberellin. .
Các chất thuộc nhóm auxin có tác d
ụng kích thích sự dãn tế bào, sự hình thành rễ
bất định và callus. Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng các loại auxin là: I
AA, NAA
và 2,4-D. Các loại auxin thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,1-0,5 mg/1 tu
ỳ từng loài cây,
từng loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy.
Các ch
ất thuộc nhóm xytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và hình
thành chồi. Các chất thuộc nhóm này thường đư
ợc sử dụng là: Kinetin và BAP. Tỉ lệ giữa
auxin và xytokinin quy định sự biệt hoá của mô, tế bào theo hư
ớng tạo chồi, tạo rễ hoặc
hình thành callus. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong môi trư
ờng nuôi cấy nếu tỉ lệ
auxin/xytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hư
ớng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo
hướng tạo chồi, còn nếu tỷ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng t

ạo
callus.
+ Độ pH của môi trường: Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hư
ởng trực tiếp tới quá trình
hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy. Thực tế đă chứng
11
minh pH thấp (pH<4,5) hoặc cao (pH>7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triên c
ủa mô
và tế bào nuôi cấy. Cụ thê, nếu pH của môi trư
ờng giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao
đôi Fe, làm giảm hay ngừng hắn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy. Thông thường độ
pH
dao động trong khoảng từ 5,5-6,5 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
- Môi trường vật lý: Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh hưởng cơ b
ản
và quan trọng nhất trong nuôi cay in vitro.
+ Nhiệt độ: Là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đ
ến sự phân chia tế bào
và các quá trình trao đổi chất trong mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạt đ
ộng
của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của mô nuôi cấy. Nhiệt đ
ộ nuôi
cấy cần được giừ ổn định ở
25±2°c.

+ Ánh sáng: Các nghiên cứu đă cho th
ấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát triển và
phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời gian chiếu sáng, cường đ
ộ
chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Đặc biệt thời gian chiếu sáng phải phù hợp với đ

ặc tính
sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thường biến đ
ộng từ
12-16 giờ/ngày. Ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000-
3000 Lux, tương đương
với khoảng cách 30cm từ đèn chiếu sáng tới mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng t
ự nhiên với
cường độ thấp là phù hợp với nuôi cay in vitro. Nuôi cay callus có th
ế không cần ánh sáng.
Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi cấy. Ánh sáng đở làm t
ăng
chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng. Ánh sáng xanh ức chế sự v
ươn cao, nhưng
lại có ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của callus. Nguồn chiếu sáng bằng đèn Compact
3U có
ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trư
ởng và phát triển của cây khoai tây và cây hoa chuông
[10].
1.3. Co’ sở khoa học của công nghệ chuyển gen vào thực vật
1.3.1. Các phương pháp chuyên gen vào thực vật
1.3.1.1. Phương pháp chuyến gen trực tiếp
■ Chuyến gen nhờ kỹ thuật xung điện (electroporation)
12
Kỹ thuật này áp dụng cho việc chuyên gen vào tê bào trân. Ngư
ời ta chuân bị một
huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tô h
ợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc.
Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao khoảng 200-600 v/cm trong kho
ảng thời gian ngắn
4-5 ph

ần nghìn giây. Ket quả làm cho màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời
có đường kính khoảng 30 [im, mà qua đó các DNA bi
ến nạp ở bên ngoài có thê xâm nhập
vào trong tế bào. Quá trình biến nạp được thực hiện trong các cuvet chuyên dụng hoặc c
ác
“buồng xung điện” có các tấm cực bằng kim loại đặt cách nhau 1 -
4 mm. Sau quá trình
điện xung, tế bào trần được nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trư
ờng chọn lọc
đe tách các tế bào trần đă thu nhận DNA. Sau đó các tế bào trần này được nuôi c
ấy tái sinh
cây và tiếp tục chọn lọc. Các yếu tố chính tác động lên hiệu quả biến nạp bằng xung đi
ện
bao gồm: cường độ điện trường, điện dung, tính chất ion và nồng độ đ
ệm, thời gian tiền xử
lý.
■ Kỹ thuật chuyên gen nhờ silicon carbide
Silicon carbide là nh
ững vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất. Sợi
silicon carbide có đường kính rất nhở khoảng 0,6 |im và dài khoảng 1 0 - 8 0
|Lim.
Khi l
ắc
một huyền phù tế bào đơn cùng plasmit tái tô h
ợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc
với silicon carbide trên máy lac vortex kho
ảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại
lai có thể xâm nhập vào. Sau đó các tế bào này được nuôi cấy tạo callus,
tái sinh cây và
chọn lọc đê tách ra những cây mang gen chuyên [14]. Huyền phù tế bào đơn thường đư

ợc
thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy chuyến là giai đoạn tốt nhất đê th
ực hiện
quy trình chuyên gen.
Hiệu quả chuyên gen phụ thuộc vào kích thước sợi silicon carbide, thông sô
vortex,
dụng cụ chứa mẫu, nguyên liệu thực vật và đặc điêm tế bào thực vật, đặc biệt là đ
ộ dày của
thành tế bào.
Ưu điếm của phương pháp này là đơn giản, chi phí thấp và áp dụng đư
ợc cho nhiều
loài thực vật. Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất là hiệu quả chuyến gen thấp và tổn th
ương
gây ra cho tế bào có thể ảnh hưởng tới khả năng tái sinh sau này [46].
■ Chuyên gen bằng sủng băn gen
13
Chuyên gen bằng súng bắn gen là kỹ thuật sử dụng các viên đ
ạn là các phần tử
kim loại nặng (wonfam hay vàng) có kích thước hiến vi (0,5 - 5 |Lim) có t
ỷ trọng cao
đê đạt được gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa l
ớp DNA bọc ngoài tiếp cận
với bộ máy di truyền của tế bào [14], [42].
ưu điêm:
- Có thê áp dụng hầu hết với các loại mô, tế bào.
- Chuyên DNA ngoại lai vào tê bào nhanh.
- Dễ sử dụng, quy trình đơn giản, một số lượng lớn mẫu có thê được xử lý
trong
thời gian ngắn.
- Các vector được thiết kế đơn giản, không đòi hỏi các trình tự DNA cho đoạn T-

DNA như chuyển gen bang Agrobacterỉum.
- Cần một lượng nhỏ DNA plasmid.
- Bi
ểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thế quan sát thấy trong vòng vài ngày sau
biến nạp.
Nhược đỉêm:
- Nhiều bản sao được chuyến vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho vi
ệc phân
tích biểu hiện của gen đã chuyển, dẫn tới sự biêu hiện của các gen không bền vững.
- Tần số biến nạp thấp, thường xuyên nhận được thế khảm.
- Thiết bị đắt tiền, không phải bất cứ phòng thí nghiệm nào cũng có thê mua đư
ợc,
giá thành vật tư đắt.
■ Biến nạp bằng hoả chat PEG (polyethylene glycol)
Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương pháp chuy
ển gen
nhờ PEG thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào trần.
Ớ nồng độ cao, PEG làm DNA c
ần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan nữa mà
kết dính lại trên màng sinh chất. Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng đ
ộ cao của
Ca
2+
hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển nạp vào trong tế bào trần [14].
Ưu điêm:
14
- Hiệu quả chuyên gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công.
- Có thê chuyến gen vào tế bào trần của bất kỳ loài thực vật nào
- Không đòi hởi thiết bị đắt tiền
15

Nhitợc điểm:
- Quá trình biến nạp khó đi
ều khiên, số bản sao của gen trong tế bào biến nạp có thê
lớn.
- Tần số biến nạp thành công biến động giữa các thí nghiệm.
- Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp của các tế bào trần, gây khó khăn cho vi
ệc phân
tích biêu hiện của gen.
- Đòi hởi một hệ thống tái sinh tế bào trần vốn còn gặp khó khăn
ở nhiều loài cây
trồng do phụ thuộc vào các yếu tố ngoài thí nghiệm như: loài, ki
ểu gen trong loài, phản ứng
tổn thương và tái sinh.
■ Phương pháp vi tiêm
Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết b
ị hiển vi và
máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào. Kỹ thuật này có ưu điếm là: lư
ợng
DNA được biến nạp là tuỳ ý và xác định, DNA được đưa vào đúng v
ị trí mong muốn, thậm
trí là nhân tế bào. Có thê áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như h
ạt phấn,
phôi non mà các kỹ thuật khác không thê thực hiện đ- ư
ợc và có thế biến nạp vào các loài
cây trồng, có thê thực hiện nuôi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm. Tuy nhiên ph
ương pháp
này tốn nhiều thời gian và công sức do mỗi lần biến nạp chỉ đưa đư
ợc DNA vào một tế bào
duy nhất và chỉ có the thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao v
ới những thiết bị

tương đối đắt tiền [14].
■ Phương pháp vĩ tiêm
Sử dụng kim tiêm có đường kính lớn hơn đường kính tế bào đê đưa DNA vào t
ế
bào. Các tế bào này bị phá vờ và DNA xâm nhập vào các tế bào bị tổn thương, sau đó đư
ợc
chuyến vào các tế bào bên cạnh. Kỹ thuật này đơn giản nhưng hi
ệu quả chuyển gen thấp
[24]. Chuyển gen bằng vĩ tiêm thường áp dụng cho những đối tư
ợng có bầu nhụy lớn, dễ
thao tác.
■ Phương pháp Agrolistic
Phương pháp Agrolistic kết hợp ưu điểm của hai phương pháp b
ắn gen và chuyến
gen thông qua Agrobacterium. Trong phương pháp này, vector thiết kế có đoạn T-
DNA
mang gen quan tâm được chuyến đồng thời với các gen mă hoá protein