Nghiên cứu phức hợp các hạt nano-kháng thể nhằm phát hiện vi khuẩn vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ




VŨ THỊ HUYỀN






NGHIÊN CỨU PHỨC HỢP CÁC HẠT NANO-KHÁNG THỂ
NHẰM PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC
PHẨM LISTERIA MONOCYTOGENES




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC





Hà Nội – 2012

2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ


VŨ THỊ HUYỀN


NGHIÊN CỨU PHỨC HỢP CÁC HẠT NANO-KHÁNG THỂ
NHẰM PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC
PHẨM LISTERIA MONOCYTOGENES


Chuyên ngành: Công nghệ nano sinh học
Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm


LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HIÊN





Hà Nội – 2012

5
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Vi khuẩn Listeria monocytogenes 3
1.2. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes 5
1.2.1. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng phương pháp nuôi cấy 6
1.2.2. Phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes bằng các thuật miễn dịch 7
1.2.2.1. Phương pháp ELISA 8
1.2.2.2. Phương pháp Western blot 9
1.2.2.3. Phương pháp Dot blot 10
1.2.3. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng kỹ thuật lai phân tử ADN 11
1.2.3.1. Phát hiện L. monocytogenes bằng phương pháp lai hóa ADN trên giá thể
11
1.2.3.2. Phát hiện L. monocytogenes bằng phương pháp PCR 11
1.2.4. Phát hiện L. monocytogenes bằng cảm biến sinh học 12
1.3. Hạt nano 14
1.3.1. Đặc điểm chung 14
1.3.2. Hạt nano từ 14
1.3.2. Hạt nano vàng 20
1.3.4. Chấm lượng tử 23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 27
2.1.1. Vật liệu 27
2.1.2. Hóa chất 27
2.1.3. Các dung dịch 28
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 29

6
2.2. Phương pháp thí nghiệm 30
2.2.1. Phương pháp chức năng hóa bề mặt chấm lượng tử 30
2.2.1.1. Phương pháp carboxyl hóa bề mặt chấm lượng tử 31
2.2.1.2. Phương pháp amin hóa bề mặt chấm lượng tử 32
2.2.2. Phương pháp tạo phức hợp hạt từ và chấm lượng tử với protein 33
2.2.2.1. Phức hợp hạt từ Dynabead – protein 33
2.2.2.2. Phức hợp hạt từ chitosan–protein 34
2.2.2.3. Phức hợp chấm lượng tử–protein 35
2.2.3. Phương pháp phân tích kết quả tạo phức 37
2.2.3.1. Phương pháp quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier (FTIR) 37
2.2.3.2. Kính hiển vi điện tử quét (SEM) 39
2.2.3.3. Kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) 40
2.2.3.4. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide 41
2.2.4. Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes 45
2.2.4.1. Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes trong
dung dịch 45
2.2.4.2. Hạt từ Dynabeads liên kết đặc hiệu với vi khuẩn L. monocytogenes trên
màng nitrocellulose 46
2.2.5. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes trên màng nitrocellulose bằng phức
hợp hạt nano–kháng thể 47
2.2.5.1. Phát hiện bằng phức hợp chấm lượng tử–kháng thể 47
2.2.5.2. Phát hiện bằng phức hợp kháng thể đơn dòng gắn hạt vàng 47
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48
3.1. Tạo phức hợp hạt từ Dynabeads–protein 48
3.2. Tạo phức hợp hạt từ chitosan–protein 53
3.3. Tạo phức hợp chấm lượng tử–protein 58
3.3.1. Biến đổi bề mặt chấm lượng tử 58
3.3.2. Phức hợp chấm lượng tử-protein 64

7
3.4. Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu với vi
khuẩn L. monocytogenes 68
3.4.1. Liên kết trong dung dịch 68
3.4.2. Liên kết trên màng nitrocellulose 70
3.4.3. So sánh phức hợp hạt từ Dynabeads protein và phức hợp hạt từ chitosan
protein 72
3.5. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng kháng thể đơn dòng gắn chấm
lượng tử hoặc gắn hạt vàng 73
KẾT LUẬN 75
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77





8
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Thuật ngữ
ADN Deoxyribonucleic acid
AET 2-aminoethanethiol
BS3 bis[sulfosuccinimidyl] suberate
BSA albumin huyết thanh bò
–COOH Nhóm carboxyl
EDC 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide
ELISA

Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
FESEM Kính hiển vi điện tử quét phân giải cao
FTIR
Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier
(Fourier transform infrared spectroscopy)
HDA Hexadecylamine
HQ Huỳnh quang
Kháng thể Kháng thể đơn dòng kháng L. monocytogenes
L. monocytogenes Listeria monocytogenes
MES 2–(N–morpholino) ethanesulfonic acid
MPA Mercaptopropionic acid
–NH2 Nhóm amino
PCR Polymerase Chain Reaction
QD Chấm lượng tử (Quantum dots)
QD–COOH Chấm lượng tử có nhóm carboxyl
QD–NH
2
Chấm lượng tử có nhóm amin
TMAH Tetramethylammonium hydroxide trong methanol
TOP Trioctylphosphine
TOPO Trioctylphosphine oxide



9
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1.
Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Hình 1.2.
Khuẩn lạc L. monocytogenes sau 24h nuôi cấy ở 35
o
C trên môi
trường BBL

CHROMagar

Listeria
Hình 1.3.
Cấu trúc kháng thể
Hình 1.4.
Cơ chế phản ứng của phương pháp ELISA thông thường
Hình 1.5.
Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng phương pháp
Western blot
Hình 1.6. Phát hiện vi khuẩn L.monocytogenes bằng phương pháp Dot blot

Hình 1.7.
Cảm biến sinh học
Hình 1.8.
Hình ảnh đơn giản về vật liệu thuận từ
Hình 1.9.
Hình dạng điển hình của các tiểu cầu có chứa hạt nano
Hình 1.10.
Sơ đồ phân tách tế bào đơn giản nhất
Hình 1.11.
Nguyên lí dẫn truyền thuốc dùng hạt nano từ tính
Hình 1.12.

Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích thước tăng dần từ trái
qua phải
Hình 1.13.
Mô hình chấm lượng tử cấu trúc lõi vỏ CdS/ZnSe
Hình 1.14.
Huỳnh quang của chấm lượng tử khi kích thước lõi giảm dần
Hình 1.15.
Chấm lượng tử gắn các phân tử sinh học
Hình 1.16.
Hình ảnh chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu của các tế bào ung
thư
Hình 1.17.
Hình minh họa ứng dụng của chấm lượng tử nano composit
trong dẫn truyền thuốc
Hình 2.1.
Các liên kết mang bản chất hóa học
Hình 2.2.
Hệ giao thoa kế Michelson
Hinh 2.3.
Sơ đồ cấu tạo kính hiển vi điện tử quét SEM
Hình 2.4.
Mô hình cấu trúc của phân tử protein trước và sau khi được biến
tính bởi SDS
Hình 3.1.
Hình ảnh SEM của hạt từ Dynabeads
®
My One Carboxylic Acid
Hình 3.2.
Cơ chế gắn protein lên hạt từ Dynabeads sử dụng chất nối EDC
Hình 3.3.

Phổ FTIR của hạt từ Dynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo
phức với BSA
Hình 3.4.
Điện di dịch tan sau phản ứng tạo phức hợp hạt từ Dynabeads
với lượng protein BSA khác nhau. 2, 4, 6: BSA trước phản ứng.
3,5,7: BSA trong dịch tan sau phản ứng
Hình 3.5.
Ảnh SEM của hạt từ Dynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo

10

phức hợp với protein BSA
Hình 3.6.
Ảnh FESEM của hạt từ Dynabeads trước (a) và sau (b) khi tạo
phức hợp với protein BSA
Hình 3.7.
Sự hình thành của chitosan và chitosan biến tính trong nước
Hình 3.8.
Mô hình hạt nano từ bọc chitosan biến tính sử dụng chất nối để
tạo phức hợp với protein
Hình 3.9.
Cơ chế gắn protein lên hạt từ chitosan sử dụng chất nối BS3
Hình 3.10.
Phổ FTIR của hạt từ chitosan (a) và hạt từ chitosan gắn BSA sử
dụng chất nối EDC (b)
Hình 3.11.
Phổ FTIR của hạt từ chitosan gắn BSA khi sử dụng chất nối
BS3(a) và khi không sử dụng chất gắn hay chất nối (b)
Hình 3.12. Ảnh FESEM của hạt từ chitosan gắn BSA với các tỉ lệ khối
lượng khác nhau. Hạt từ chitosan:BSA (w/w): (b) 50:1; (c) 25:1;

(d) 25:2. (e) 25:4. (a) Hạt từ chitosan
Hình 1.13.
Mô hình cấu trúc của các phân tử TOP (A), TOPO(B), HDA (C).

Hình 3.14.
Phản ứng trao đổi ligand biến đổi bề mặt chấm lượng tử
Hình 3.15.
Ảnh huỳnh quang của chấm lưởng tử dưới đèn UV trước (a) và
sau (b) khi biến đổi bề mặt với MPA
Hình 3.16.
Ảnh huỳnh quang của chấm lưởng tử dưới đèn UV trước (a) và
sau (b) khi biến đổi bề mặt với AET
Hình 3.17.
Phổ FTIR của chấm lượng tử trước khi biến đổi bề mặt
Hình 3.18.
Hình ảnh phổ FTIR của chấm lượng tử đã biến đổi bề mặt với
MPA (a) và AET (b)
Hình 3.19.
Sơ đồ phản ứng NHS_ester với chấm lượng tử
Hình 3.20.
Sơ đồ phản ứng gắn protein lên QD–NH2 bằng BS3
Hình 3.21.
Ảnh FESEM của QD–NH2 trước (a) và sau (b) khi tạo phức hợp
với kháng thể đơn dòng
Hình 3.22.
Ảnh FESEM của QD–COOH trước (a) và sau (b) khi tạo phức
hợp với kháng thể đơn dòng
Hình 3.23.
Ảnh điện di dịch nổi sau phản ứng 100µg QD–NH2 với lượng
BSA khác nhau sử dụng chất nối BS3

Hình 3.24.

Kết quả điện di dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên chấm
lượng tử. 1: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên

QD–COOH. 2: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên QD–
NH
2
. 3: Kháng thể đơn dòng C86030M khi chưa phản ứng với
chấm lượng tử (3 vạch với khối lượng phân tử 30kDa, 50 kDa và
160 kDa, tương ứng với chuỗi nhẹ, chuỗi nặng của kháng thể và

11

kháng thể hoàn chỉnh. 4:

Thang protein.
Hình 3.25.
Ảnh nhuộm Gram. (a) Vi khuẩn L. monocytogenes. (b) Phức hợp
hạt từ Dynabeads–BSA. (c) Phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng
thể đơn dòng sau khi bắt vi khuẩn L. monocytogenes trong dung
dịch. (d) Đối chứng: Phức hợp hạt từ Dynabeads–BSA sau khi ủ
vi khuẩn L. monocytogenes trong dung dịch
Hình 3.26.
Cấu trúc hóa học của màng Nitrocellulose
Hình 3.27.
Hình minh họa phương pháp li giải tế bào trên màng
nitrocellulose
Hình 3.28.
Hình ảnh quan sát màng nitrocellulose bằng kính hiển vi quang

học. (a) Đối chứng: Màng không có dịch li giải vi khuẩn sau khi
nhỏ và rửa hạt từ không có kháng thể. Màng có dịch li giải vi
khuẩn L. monocytogenes (b) và E. coli (c) sau khi nhỏ và rửa
phức hợp hạt từ Dynabeads–kháng thể đơn dòng kháng L.
monocytogenes.
Hình 3.29.
Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes sau khi li giải trên màng
Nitrocellulose dùng phức hợp chấm lượng tử–kháng thể (a) hoặc
kháng thể phức hợp hạt vàng–kháng thể (b).
Hình 3.30.
Sơ đồ biểu diễn việc sử dụng một cặp phức hợp hạt nano –kháng
thể để phát hiện vi khuẩn


12

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1.
So sánh các phương pháp ELISA trong việc phát hiện vi khuẩn

L. monocytogenes
Bảng 2.1.
Bảng các hóa chất sử dụng trong luận văn
Bảng 2.2.
Các dung dịch sử dụng trong luận văn
Bảng 2.3.
Bảng các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong luận văn
Bảng 2.4.
Các mẫu phân tích FTIR

Bảng 2.5.
Các mẫu đo FESEM
Bảng 2.6.
Thành phần của một gel polyacrylamide
Bảng 2.7.
Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng hạt từ Dynabead với BSA
Bảng 2.8.
Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng chấm lượng tử có nhóm
amin (QD–NH2) với BSA
Bảng 2.9.
Các mẫu điện di dịch tan sau phản ứng chấm lượng tử với kháng
thể đơn dòng kháng L. monocytogenes
Bảng 2.10.
Các mẫu nhuộm Gram
Bảng 3.1.
So sánh hạt từ Dynabeads và hạt từ chitosan



1
MỞ ĐẦU
Ngộ độc thực phẩm đã và đang là vấn đề được cộng đồng trên toàn thế giới
quan tâm. Nguyên nhân chính gây ra các ca ngộ độc thực phẩm là do các vi
khuẩn như Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes Trong đó, số
ca tử vong do vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra đứng thứ hai (chỉ sau vi
khuẩn Salmonella) trong tổng số các ca tử vong do nhiễm khuẩn từ thực phẩm.
Listeria monocytogenes là vi khuẩn gram dương, có thể tồn tại trong điều
kiện khắc nghiệt như pH thấp, nồng độ muối cao [41] và nhiệt độ thấp (-0,1
o
C)

[62]. Do đó chúng có thể gây ra ngộ độc cho con người từ những thực phẩm
đông lạnh. Mặc dù hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm nhưng khi đi vào
cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội gây bệnh. Một tỉ lệ lớn
dân số, ước tính khoảng 3-10%, có mang vi khuẩn Listeria monocytogenes trong
đường tiêu hóa của họ mà không thấy bất cứ dấu hiệu gì của bệnh tật [53]. Tỉ lệ
tử vong do vi khuẩn này là rất cao, 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm
bệnh [66, 54]. Mỗi năm tại Úc có 40-44 ca tử vong [61]; từ năm 1993-1997,
mỗi năm Hoa Kỳ có 100 ca tử vong [10]. Ở Việt Nam cũng đã có nhiều ca
nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes bị tử vong do không được phát hiện và
điều trị kịp thời. Cho đến nay, đã có nhiều phương pháp phát hiện vi khuẩn này
như nuôi cấy trong môi trường chọn lọc [29], PCR [33], Western blot [3],
ELISA [11], nhận biết đặc trưng loài [16] … nhưng hầu hết các phương pháp
này đều đòi hỏi nhiều thời gian và công sức.
Hiện nay, công nghệ nano phát triển rất nhanh tạo ra những vật liệu nano
tiên tiến (vật liệu có kích thước nano mét) mang lại nhiều ứng dụng to lớn trong
lĩnh vực dược phẩm và y sinh. Trong các loại vật liệu nano, các hạt nano như hạt
nano từ, hạt nano vàng và chấm lượng tử (quantum dots) là những loại vật liệu
nano được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi nhất. Hạt từ với tính chất từ đặc
trưng cho phép điều khiển bằng một từ trường ngoài, do đó có nhiều ứng dụng
trong phân tách, chọn lọc và làm giàu tế bào [27]. Đặc biệt là hạt nano từ ít gây
độc cho cơ thể nên được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong dẫn truyền thuốc và
trị liệu gen [37,38, 39]. Hạt nano vàng gắn với các phân tử sinh học là một sản
phẩm với rất nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học, trong chẩn đoán và điều
trị các tế bào ung thư, đặc biệt trong công nghệ chế tạo các loại kit chẩn đoán
nhanh các loại bệnh truyền nhiễm [9]. Chấm lượng tử với khả năng phát huỳnh

2
quang và độ bền màu với ánh sáng đã vượt qua các chất màu hữu cơ và trở
thành một trong số các vật liệu sáng giá của công nghệ nano. Chấm lượng tử
được sử dụng trong đánh dấu tế bào và các phần tử sinh học, dẫn truyền và phân

phối thuốc và trong các công cụ chẩn đoán mới [68].
Với sự nguy hại của Listeria monocytogenes như đã nêu ở trên thì việc tìm
ra phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Listeria monocytogenes nói riêng và
các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm nói chung là rất cần thiết. Ứng dụng các
hạt nano trong việc phát hiện các vi khuẩn có thể cải tiến độ nhạy và hiệu quả
của các phương pháp chẩn đoán phân tử truyền thống. Giải pháp sử dụng các hạt
nano hứa hẹn nhiều ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học và các kít chẩn
đoán. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu phức hợp các
hạt nano–kháng thể nhằm phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm
Listeria monocytogenes”.
Ở Việt Nam, phức hợp hạt nano với kháng thể thường được tạo ra bằng
cách sử dụng các bộ kit của nước ngoài rất đắt tiền. Một số nhóm nghiên cứu tạo
phức hợp hạt nano với kháng thể dựa vào lực hút tĩnh điện giữa hai phần tử
mang điện tích trái dấu. Tuy nhiên, phức hợp tạo thành kém bền khi pH của
dung dịch đệm thay đổi. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu và
xây dựng quy trình tạo các phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt từ và chấm
lượng tử bằng phương pháp hóa học sử dụng các chất nối. Phức hợp tạo thành
bằng phương pháp này có độ bền cao. Để có thể gắn các phần tử sinh học lên
các hạt nano, các hạt này cần được chức năng hóa các bằng các chất hoạt động
bề mặt [40], polymer [45] hoặc các hợp chất hóa học có nhóm chức amin,
carboxyl [42].
Các nội dung của luận văn là:
1. Chức năng hóa bề mặt chấm lượng tử.
2. Nghiên cứu và xây dựng quy trình tạo phức hợp hạt nano với kháng thể
đơn dòng bằng phương pháp hóa học sử dụng chất nối.
3. Phân tích các phức hợp hạt nano–kháng thể đơn dòng tạo thành.
4. Chứng minh các phức hợp hạt nano–kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu
với vi khuẩn Listeria monocytogenes.

3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) (Hình 1.1) là vi khuẩn gram
dương thuộc chi Listeria. Vi khuẩn này có hình que, không bào tử, yếm khí,
kích thước khoảng 0,5µm1,5µm. Vi khuẩn L. monocytogenes có kháng
nguyên thân O và kháng nguyên lông H, được chia thành 7 loại huyết thanh (từ
I đến VII).

Hình 1.1. Vi khuẩn Listeria monocytogenes
Vi khuẩn L. monocytogenes được tìm thấy ở rất nhiều nơi trong tự nhiên
như đất, nước, thảm thực vật mục nát, trong các động vật hoang dã, các loại sản
phẩm chế biến từ sữa, thịt cá tươi sống và các sản phẩm của thịt cá, rau xanh
Một số loại thực phẩm như ngô, sô cô la, xà lách, tôm và gạo đã được báo cáo
có nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes [55]. Vi khuẩn này có sức đề kháng cao
nên chúng tồn tại khá lâu ngoài môi trường. Con đường lây lan chủ yếu là qua
đường tiêu hóa, ít gặp qua đường hô hấp. Ở trẻ sơ sinh, bệnh truyền qua rau thai
hoặc lây lúc trẻ lọt qua đường sinh dục của người mẹ.
L. monocytogenes có bảy yếu tố độc lực: (1) Protein bề mặt internalin, có
hai dạng InlA và InlB đóng vai trò thậm nhập vào tế bào. InlA thâm nhập vào
các tế bào không thực bào như tế bào biểu mô, còn InlB thâm nhập vào các tế

4
bào gan [20]; (2) Protein bề mặt p104 có khả năng bám dính vào tế bào ruột
[49]; (3) Listeriolysin O là một hemolysins (ngoại độc tố có khả năng ly giải tế
bào hồng cầu) có vai trò gây ra bệnh listeriosis [31]; (4) Protein ActA; (5)
Metalloprotease; (6) Clp proteases và ATPases; (7) Protein P60 là enzyme
hydrolase xúc tác trong phản ứng trong giai đoạn cuối cùng của sự phân chia tế
bào. Các yếu tố độc lực này tham gia vào quá trình lây nhiễm theo những cách
riêng và có thể gây ảnh hưởng tới dẫn truyền tín hiệu của tế bào chủ với mục
đích tăng cường khả năng lây nhiễm. Như vậy, với tất cả các đặc điểm này L.

monocytogenes có thể gây ra nhiều căn bệnh nguy hiểm cho con người.
Khi xâm nhập vào trong cơ thể, L. monocytogenes gây bệnh bằng cách sinh
sản và phát triển. Nhiệt độ tối ưu để vi khuẩn L. monocytogenes phát triển là từ
30°C đến 37°C. Khác với các vi khuẩn khác, L.monocytogenes có thể tồn tại và
phát triển ở nhiệt độ 4°C. Thậm chí chúng còn có thể tồn tại trong điều kiện
khắc nghiệt như pH thấp, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp (-0,1
o
C) [41, 62].
Với những đặc điểm đó, L.monocytogenes thể gây ra ngộ độc cho con người từ
những thực phẩm đông lạnh. Mặc dù hiện diện với số lượng nhỏ trong thực
phẩm nhưng khi đi vào cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội
gây bệnh. Một tỉ lệ lớn dân số, ước tính khoảng 3-10%, có mang vi khuẩn L.
monocytogenes trong đường tiêu hóa của họ mà không thấy bất cứ dấu hiệu gì
của bệnh tật [53].
Đối tượng mắc bệnh do vi khuẩn L. monocytogenes gây ra thường là những
người có sức đề kháng yếu như phụ nữ mang thai, trẻ em và người già. Khi xâm
nhập vào cơ thể, vi khuẩn L. monocytogenes thường không phát bệnh ngay mà ủ
bệnh sau một thời gian khá lâu, trung bình khoảng 3 tuần, thậm chí đến 2 tháng.
Các triệu chứng của bệnh ban đầu giống như cúm (sốt, khó chịu, đau cơ…) [66].
Nếu độc tố đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính sau khi ăn thực
phẩm bị ô nhiễm khoảng 24 - 72 giờ, với triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau
quặn bụng, nhức đầu
Nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc
thực phẩm, mà chúng còn gây ra những biến chứng nguy hiểm như viêm màng
não, nhiễm trùng huyết, sẩy thai tự nhiên hoặc bệnh listeriosis ở trẻ sơ sinh [66].
Bệnh listeriosis có nguy cơ gây tử vong cao hơn so với các bệnh do các loại vi
khuẩn gây ngộ độc thực phẩm khác gây ra. Tỉ lệ tử vong do vi khuẩn này là rất
cao, 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh [55, 66].

5

Vi khuẩn L. monocytogenes đã gây ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm tại
nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ… Các vụ ngộ độc này
thường dẫn tới tình trạng tử vong. Theo thống kê từ năm 2002 tại Mỹ, hàng năm
tại nước này, số bệnh nhân nhiễm bệnh do vi khuẩn L. monocytogenes khoảng
2500 người, với gần 500 người chết. Tại Anh từ năm 2001-2005 có 1993 người
mắc, với trên 300 ca tử vong. Ở Canada, hàng năm vẫn thường xảy ra các vụ
ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn L. monocytogenes gây ra. Gần đây, tại Trung
Quốc cũng đã báo cáo vài vụ ngộ độc do vi khuẩn này. Ngoài ra, còn các trường
hợp [61]; từ năm 1993-1997, mỗi năm Hoa Kỳ có 100 ca tử vong [10].
Nhằm hạn chế tình trạng nhiễm khuẩn L. monocytogenes, cơ quan y tế các
nước châu Âu, châu Mỹ, nước Úc, Nhật Bản thường xuyên đưa ra những lời
cảnh báo, đồng thời đưa ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt các nguồn
nguyên liệu thực phẩm. Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, vi khuẩn
L. monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học
có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm.
Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực
phẩm với 7000-10000 nạn nhân, trong đó có 100-200 ca tử vong, gây thiệt hại
cho Nhà nước hàng tỉ đồng. Tuy nhiên, với điều kiện phát triển nhanh các loại
thức ăn công nghiệp cũng như việc kinh doanh tràn lan nhiều loại thực phẩm
không rõ nguồn gốc như hiện nay, thì thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn này không
phải là ngoại lệ. Mặt khác, công tác điều tra dịch tễ và sàng lọc tác nhân gây
bệnh chưa được đúng mức (phần lớn các tỉnh, thành chưa có đủ điều kiện xét
nghiệm loại vi khuẩn này), vì vậy biện pháp tuyên truyền để phòng ngừa vẫn là
cách tốt nhất. Gần đây, Việt Nam cũng đã có nhiều ca nhiễm khuẩn Listeria
monocytogenes bị tử vong do không được phát hiện và điều trị kịp thời. Vì vậy,
việc tìm ra phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Listeria monocytogenes nói
riêng và các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm nói chung là rất cần thiết.
1.2. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes
Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện vi
khuẩn L. monocytogenes như phương pháp nuôi cấy [22], phương pháp miễn

dịch [51, 58], phương pháp phân tử [63] cảm biến sinh học [32]…. Sau đây,
chúng tôi trình bày một số phương pháp điển hình trên.

6
1.2.1. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng phương pháp nuôi cấy
Nuôi cấy là phương pháp truyền thống để phát hiện vi khuẩn
L. monocytogenes. Phương pháp này thường rất nhạy và luôn là “tiêu chuẩn
vàng” cho các phương pháp khác. Phương pháp nuôi cấy dựa trên việc làm giàu
chọn lọc (selective enrichment) và đĩa cấy chọn lọc (selective plating) để phân
lập các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng thuần khiết, từ đó khảo
sát và định loại vi khuẩn. Việc xác định vi khuẩn dựa vào các đặc trưng của vi
khuẩn như hình thái khuẩn lạc, lên men đường và thuộc tính tán huyết [22].
Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi
sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Muốn vậy, ngoài các thao tác
luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường,
dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được
khử trùng thích hợp để được vô trùng trước khi sử dụng. Đối với hầu hết các vi
khuẩn thì điều kiện nhiệt độ để vi khuẩn sinh trưởng và phát triền tốt là 37
o
C
trong 16 giờ, nhưng đối với vi khuẩn L.monocytogenes lại có sự khác biệt,
chúng có thể phát triển ngay khi nhiệt độ xuống tới 4
o
C và thường được nuôi ở
30
o
C đến 35
o
C trong 24 giờ đến 48 giờ.
Hai phương pháp nuôi cấy được sử dụng nhiều nhất để phát hiện vi khuẩn

L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm là FDA BAM (Food and Drug
Administration Bacteriological and Analytical Method – Phương pháp phân tích
vi sinh của Cục quản lý thuốc và thực phẩm) và ISO 11290 (International
Organization of Standards–các tiêu chuẩn của tổ chức quốc tế) [22]. Cả hai
phương pháp này đều yêu cầu ủ 25g mẫu thực phẩm trong dung dịch chọn lọc
(selective broth) để làm chậm sự phát triển của các sinh vật cạnh tranh, trước khi
cấy lên môi trường thạch và sinh hóa chọn lọc (thạch Oxford, PALCAM, MOX
hoặc LPM). Đối với FDA BAM, mẫu được ủ trong 48h ở 30
o
C trong môi trường
tăng sinh chọn lọc như acriflavin, naladixic acid. Đối với phương pháp ISO
11290, quá trình làm giàu vi khuẩn L. monocytogenes trải qua hai giai đoạn: (1)
các mẫu thực phẩm được làm giàu trong 24h trong môi trường Fraser; (2) mẫu
thực phẩm được ủ trong môi trường Fraser pha loãng 2 lần trong 24 giờ, sau đó
mẫu được chia ra làm nhiều phần, mỗi phần lại được ủ tiếp trong môi trường
Fraser không pha loãng để làm giàu vi khuẩn. Dung dịch Fraser chứa các tác
nhân tăng sinh chọn lọc acriflavin và naladixic acid.

7
Năm 2002, các nhà khoa học Anh đã nuôi cấy phân lập vi khuẩn
L.monocytogenes từ mẫu phân sau khi các mẫu được giữ ở 4
o
C với các thời gian
khác nhau [15]. Kết quả báo cáo này cho thấy kỹ thuật nuôi cấy sau khi mẫu
được ủ lạnh (4
o
C) cho kết quả tốt hơn khi mẫu không được ủ lạnh. Báo cáo cũng
đưa ra kết quả là sau khi mẫu vi khuẩn được làm giàu lạnh ở tuần thứ 3 đến tuần
thứ 7 cho kết quả phân lập tốt nhất. Năm 2005, Odumeru cùng cộng sự đã công
bố là sau 24h được cấy và ủ ở 35

o
C trong môi trường BBL

HROMagar


Listeria, vi khuẩn L. monocytogenes phát triển thành những khuẩn lạc tròn riêng
biệt và có màu xanh lơ (Hình 1.2) [48].

Hình 1.2. Khuẩn lạc L. monocytogenes sau 24h nuôi cấy ở 35
o
C
trên môi trường BBL

CHROMagar

Listeria
Phương pháp nuôi cấy vi sinh mất khá nhiều thời gian (khoảng 5 ngày)
[29] và cần các môi trường tăng sinh và phân lập chọn lọc cho từng loại vi
khuẩn nên không phù hợp với nhu cầu phát hiện nhanh vi khuẩn trong các
mẫu thực phẩm hoặc chẩn đoán nhanh nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
cho người bệnh để có phương pháp điều trị kịp thời. Các phương pháp chẩn
đoán phân tử dựa trên kỹ thuật miễn dịch và kỹ thuật lai hóa ADN cho kết
quả nhanh hơn và tiện lợi hơn.
1.2.2. Phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes bằng các thuật miễn dịch
Các kỹ thuật miễn dịch (ELISA, Western blot, Dot blot) dựa trên nguyên lí
tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.

8
Ái lực của kháng thể đối với kháng nguyên là hợp lực của các lực liên kết

yếu như liên kết hydro, liên kết kị nước, lực Van Der Waals, các liên kết tĩnh
điện… Các lực liên kết yếu này chỉ có tác dụng trong một bán kính nhỏ, do đó
sự đặc hiệu trong cấu trúc không gian ba chiều của hai vùng phân tử có vai trò
quyết định đối với ái lực của kháng thể đối với kháng nguyên.
1.2.2.1. Phương pháp ELISA
Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay còn gọi
là kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme là phương pháp dựa trên sự kết hợp đặc hiệu
giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme.
Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản
ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu
chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông
qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát
hiện (Hình 1.4).


Hình 1.4. Cơ chế phản ứng của phương pháp ELISA thông thường
ELISA là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để phát hiện các tác
nhân gây bệnh. ELISA được chia làm ba loại là ELISA trực tiếp (Direct
ELISAs), ELISA kiểu sandwich (Sandwich ELISAs) và ELISA cạnh tranh
(Competitive ELISAs). Cả ba loại ELISA này đều đã được sử dụng để phát hiện
vi khuẩn L. monocytogenes nhưng mỗi loại lại có ưu nhược điểm và ngưỡng
phát hiện khác nhau (Bảng 1.1) [12].
Phương pháp ELISA có thể tăng độ nhạy hơn nữa bằng cách đánh dấu
huỳnh quang cho các kháng thể gọi là kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme có đánh
dấu huỳnh quang (ELFA - enzyme-linked fluorescent assay ). Sewell cùng cộng
sự (2003) đã sử dụng phương pháp này để phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes

9
bằng một thiết bị thương mại VIDAS có chứa kháng thể đơn dòng cộng hợp
huỳnh quang và đã phát hiện được ở nồng độ 10

4
– 10
5
cfu/ml [58]. Hai nhóm
độc lập Gangar [21] và Silbernagel [59] cùng cộng sự của họ cũng đưa ra kết
quả tương tự nhóm Sewell.
Bảng 1.1. So sánh các phương pháp ELISA trong việc phát hiện vi khuẩn
L. monocytogenes
Phươn pháp Ưu điểm Nhược điểm Ngưỡng phát hiện
ELISA
trực tiếp
Đơn giản,
phát hiện
trong vài giờ
Yêu cầu mẫu có số lượng lớn
Mức độ nền có thể cao
10
3
-10
5
cfu/ml [8]
10
3
-10
6
cfu/ml [11]
ELISA
kiểu
sandwich
Cho tín hiệu

mạnh hơn
Phải có kháng thể thứ cấp
Mất nhiều thời gian hơn
ELISA trực tiếp
1cfu/25g sau khi
được làm giàu [14]

ELISA
cạnh tranh
Ít dương tính
giả
Phải có kháng nguyên thuần,
tinh sạch
10
4
-10
5
cfu/ml [58]

1.2.2.2. Phương pháp Western blot
Western blot là phương pháp phổ biến trong chẩn đoán phân tử dùng để
phát hiện và định lượng các loại kháng nguyên. Kháng nguyên ban đầu được
điện di biến tính bằng phương pháp điện di SDS–PAGE, sau đó chuyển kháng
nguyên từ gel lên màng Nitrocellulose hoặc PVDF, block màng bằng protein để
tránh các liên kết không đặc hiệu của kháng thể lên màng. Cuối cùng các kháng
nguyên sẽ được phát hiện bởi các kháng thể đặc hiệu đã được đánh dấu bằng các
chất phát quang [51].
Siragusa cùng cộng sự đã sử dụng phương pháp Western blot chứng minh
độ đặc hiệu của kháng thể đơn dòng trong việc phát hiện vi khuẩn L.
monocytogenes (Hình 1.5) [60]. Nhóm nghiên cứu Vũ Xuân Nghĩa cùng cộng

sự đã sử dụng phương pháp Western blot để phát hiện vi khuẩn L.
monocytogenes. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đã phát hiện được L.
monocytogenes ở nồng độ 10
5
cfu/ml [3].
10


Hình 1.5. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng
phương pháp Western blot [60]
1.2.2.3. Phương pháp Dot blot
Dot blot cũng là phương pháp hay được dùng trong chẩn đoán kháng nguyên
vì đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và khá chính xác. Cơ chế của Dot
blot khá giống với Western blot, nhưng có điểm khác đó là Dot blot không cần
điện di protein và chuyển sang màng mà ta sử dụng kháng nguyên tinh sạch.
Màng được phủ bằng protein, cuối cùng ngâm màng trong dung dịch có chứa
kháng thể đặc hiệu đã được đánh dấu. Sau đó rửa màng. Nếu có mặt kháng
nguyên đặc hiệu với kháng thể thì chấm nhỏ kháng nguyên sẽ có kháng thể bám
vào và có thể phát hiện vì kháng thể đã được đánh dấu. Năm 1990, Siragusa cùng
cộng sự đã chứng minh sự đặc hiệu của kháng thể đơn dòng với vi khuẩn L.
monocytogenes bằng phương pháp Dot blot. Bằng phương pháp này, Siragusa đã
phát hiện được L. monocytogen ở nồng độ 10
6
cfu/ml (Hình 1.6) [60].

Hình 1.6. Phát hiện vi khuẩn L.monocytogenes bằng phương pháp Dot blot
Trong ba phương pháp, mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng.
Western blot là phương pháp cho độ chính xác nhất do các protein được điện di
11

phân tách nhau ra. Độ nhạy của phương pháp này là 10
5
cfu/ml. Nhược điểm của
phương pháp Western blot là phức tạp, nhiều bước, nhiều dụng cụ máy móc và
lâu cho kết quả. ELISA là phương pháp cho độ nhạy cao (10
3
cfu/ml). Tuy vậy,
phương pháp ELISA cũng khá phức tạp và nhiều bước. Còn phương pháp Dot
blot tuy độ chính xác và độ nhạy có phần kém hơn hai phương pháp trên nhưng
kết quả vẫn khá tốt (độ nhạy 10
6
cfu/ml). Bù lại, phương pháp Dot blot lại đơn
giản, dễ thực hiện, cần ít dụng cụ, máy móc và cho kết quả nhanh.
1.2.3. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng kỹ thuật lai phân tử ADN
1.2.3.1. Phát hiện L. monocytogenes bằng phương pháp lai hóa ADN trên
giá thể
Sự hiện diện của ADN đích được phát hiện bằng cách sử dụng một đầu dò
oligonucleotide (đoạn ADN ngắn) có trình tự bổ sung với trình tự ADN đích.
Đầu dò oligonucleotide được đánh dấu để dễ dàng phát hiện. Trước đây các mẫu
dò thường được đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ. Năm 1993, Datta cùng
cộng sự đã phát hiện vi khuẩn L monocytogenes bằng cách sử dụng các mẫu dò
ADN được đánh dấu bởi P
32
và HRP ( Horseradish Perosidase – là một enzyme
được tìm thấy trong cải horseradish, khi bị oxy hóa sẽ sinh ra các thay đổi về
tính chất mà có thể được phát hiện bởi các phương pháp đo quang phổ) [13].
Gần đây, việc sử dụng các mẫu dò có gắn biotin, mẫu dò được đánh dấu huỳnh
cho phép phát hiện các trình tự đích với độ nhạy cao tương đương với đầu dò
phóng xạ mà không gây nguy hiểm.
1.2.3.2. Phát hiện L. monocytogenes bằng phương pháp PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ ADN polymerase do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985.
Thực chất đây là một phương pháp tổng hợp ADN in vitro, không cần sự hiện
diện của tế bào.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp PCR là sử dụng một enzyme chịu
nhiệt để khuếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo quy luật hàm số mũ. Tất cả
các ADN polymerase khi tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần
có mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung
với một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành
mạch mới [2].
12

Phương pháp PCR là một phương pháp khuếch đại ADN nhanh và đặc hiệu
được ứng dụng rất nhiều trong việc phát hiện các vi khuẩn và virus. Phương
pháp PCR đã được sử dụng để phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes trong thực
phẩm [33]. Phương pháp PCR có độ nhạy cao so với phương pháp miễn dịch
nhưng bước chuẩn bị mẫu lại phức tạp. Phương pháp PCR có nhiều loại khác
nhau, trong đó Real-time PCR là loại được sử dụng nhiều nhất để phát hiện vi
khuẩn gây bệnh trong thực phẩm L. monocytogenes [28, 46, 52]. Một bộ kít
thương mại dựa trên phương pháp PCR có tên gọi là Probelia® (Bio-Rad) được
so sánh với phương pháp tiêu chuẩn ISO 11.290-1 để phát hiện vi khuẩn L.
monocytogenes trong các mẫu cá hồi bởi Wan và cộng sự [63]. Kết quả chỉ ra
rằng phương pháp Probelia® PCR cho hiệu quả tốt như phương pháp ISO
11.290-1. Tuy nhiên, sử dụng các phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn L.
monocytogenes trực tiếp từ các mẫu thực phẩm gặp khó khăn khi lượng vi sinh
vật trong mẫu quá thấp. Ví dụ như trong mẫu thực phẩm ăn nhanh có nhiễm vi
khuẩn L. monocytogenes, Gombas và cộng sự (2003) đã phát hiện ra rằng 70%
số mẫu có nồng độ thấp hơn 0,3 tế bào/g [23]. Vì vậy để phát hiện được vi
khuẩn thì việc làm giàu là rất cần thiết [47]. Ngoài phương pháp nuôi cấy để làm
giàu vi khuẩn, gần đây người ta hay sử dụng các hạt nano (đặc biệt là hạt từ) cho

mục đích này [7].
1.2.4. Phát hiện L. monocytogenes bằng cảm biến sinh học
Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì:
“Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp
thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử
nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi”.
Nguyên lí chung của cảm biến sinh học là chuyển đổi các phản ứng hay tương
tác sinh học thành các tín hiệu điện. Khi mẫu cần phân tích (phần tử sinh học
đích) tiếp xúc với bộ cảm biến, tương tác sinh học sẽ chuyển đổi thành các tín
hiệu có thể phân tích được như tín hiệu điện, nhiệt, quang…
Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính: (1)
Đầu thu sinh học: có tác dụng tương tác với tác nhân sinh học cần phân tích; (2)
Tác nhân cố định: giúp gắn các đầu thu lên trên giá đỡ; (3) Bộ phận chuyển đổi
tín hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh học thành các tín hiệu có thể đo đạc được;
(4) Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra (bộ phận này có tác dụng chuyển thành các tín
hiệu điện để máy tính và các thiết bị khác có thể xử lý).
13

Gần đây, cảm biến sinh học là thiết bị mà các nhà khoa học rất quan tâm
nghiên cứu, ứng dụng cho nhiều lĩnh vực và đối tượng. Một trong những ứng
dụng quan trọng của cảm biến sinh học là phát hiện các vi khuẩn gây bệnh.
Leonard cùng cộng sự đã sử dụng cảm biến sinh học BIAcore 3000 kháng thể đa
dòng đã phát hiện được vi khuẩn L. monocytogenes. Tế bào vi khuẩn L.
monocytogenes được ủ với kháng thể đa dòng trong khoảng thời gian ít hơn 30
phút [32]. Tuy nhiên, các cảm biến sinh học chỉ cho phép phát hiện được một
đối tượng trong một thời điểm.

Hình 1.7. Cảm biến sinh học
Hiện nay, công nghệ nano đã và đang phát triển rất mạnh với hàng loạt
các ứng dụng của vật liệu nano trong y – sinh học, đặc biệt là các hạt nano. Năm

2007, Wang cùng cộng sự đã sử dụng hạt nano từ và chấm lượng tử trong cảm
biến quang để phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes. Hạt nano từ và chấm lượng
tử được bọc strepravidin trên bề mặt liên kết với kháng thể được đánh dấu
biotin. Hạt từ gắn kháng thể được sử dụng để chọn lọc tế bào đích, sau đó dùng
chấm lượng tử gắn kháng thể để phát hiện bằng phép đo huỳnh quang. Bằng
phương pháp này Wang đã phát hiện được L. monocytogenes ở nồng độ 3
cfu/ml, thời gian phát hiện là 1,5 giờ [64]. Năm 2012, Wei Sun cùng cộng sự đã
sử dụng các hạt nano vàng trong cảm biến DNA điện hóa để phát hiện vi khuẩn
L. monocytogenes tại nồng độ ADN là 2,9x10
-13
mol/l.
14

Sử dụng các hạt nano vào trong các phương pháp chẩn đoán phát hiện vi
khuẩn đang là một hướng rất mới, làm tăng độ nhạy, độ chính xác của phương
pháp đem lại hiệu quả cao. Chính vì vậy, trong đề tài luận văn này chúng tôi tập
trung nghiên cứu sử dụng phức hạt nano–kháng thể đơn dòng để phát hiện vi
khuẩn L. monocytogenese dựa trên kỹ thuật miễn dịch.
1.3. Hạt nano
1.3.1. Đặc điểm chung
Hạt nano là vật liệu nano không chiều, tức là cả ba chiều đều có kích
thước nano mét, không còn chiều tự do nào cho điện tử, ví dụ như hạt nano từ,
hạt nano vàng, chấm lượng tử… Các hạt nano có kích thước khoảng 1-100 nm.
Ở kích thước này chúng làm nên rất nhiều tính chất kỳ diệu mà các loại vật liệu
khối không có.
Hạt nano có hai đặc trưng quan trọng, đó là hiệu ứng kích thước và hiệu
ứng bề mặt. Khi kích thước của vật liệu giảm xuống, tỉ số giữa nguyên tử bề mặt
trên tổng số nguyên tử tăng lên. Giả sử vật liệu nano hình cầu, gọi n
s
là số

nguyên tử bề mặt, n là tổng số nguyên tử thì mối liên hệ giữa hai số này là n
s
=
4n
2/3
suy ra tỉ số giữa số nguyên tử bề mặt với tổng số nguyên tử sẽ là f = n
s
/n =
4/n
1/3
= 4r
0
/r, trong đó r
0
là bán kính nguyên tử, r là bán kính hạt nano. Như vậy
khi kích thước giảm (r giảm) thì tỉ số này tăng lên, và khi kích thước giảm
xuống cỡ nano mét thì tỉ số này tăng lên đáng kể. Không phải chỉ có vật liệu
nano mới có hiệu ứng bề mặt mà vật liệu khối cũng có hiệu ứng đó, nhưng rất
nhỏ lên thường bỏ qua. Còn ở vật liệu nano hiệu ứng này khá rõ nét và có ảnh
hưởng lớn đến tính chất của vật liệu. Hiệu ứng bề mặt có tính liên tục, không có
sự “nhảy bậc” về tính chất khi vật liệu thu nhỏ dần kích thước. Nguyên tử bề
mặt có nhiều tính chất khác biệt so với các nguyên tử bên trong lòng vật liệu,
chúng có vai trò quan trọng trong các quá trình hóa học, vật lý [1]. Khác với
hiệu ứng bề mặt, hiệu ứng kích thước lại có sự khác biệt rõ rệt khi vật liệu
chuyển từ kích thước khối đến kích thước nano. Nó là yếu tố làm nên nhiều sự
kì lạ của vật liệu nano. Khi kích thước vật liệu tiến đến cỡ nano mét thì nhiều
tính chất của vật liệu thay đổi hẳn, mà không có sự chuyển tiếp một cách liên tục
như tính chất bề mặt ở trên.
1.3.2. Hạt nano từ
15

Hạt nano từ là vật liệu từ ở kích thước nano mét.Vật liệu từ là loại vật liệu
mà dưới tác dụng của từ trường ngoài có thể bị từ hóa, tức là có những tính chất
từ đặc biệt. Bất cứ vật liệu từ nào đều có sự hưởng ứng với từ trường ngoài (H),
thể hiện bằng độ từ hóa (từ độ - M). Tỷ số c = M/H được gọi là độ cảm từ. Tùy
thuộc vào giá trị độ cảm từ có thể phân ra làm các loại vật liệu từ khác nhau. Vật
liệu có c < 0 (~ -10
-6
) được gọi là vật liệu nghịch từ. Vật liệu nghịch từ là vật
liệu không có momen từ nguyên tử (tức là momen từ sinh ra do các điện tử bù
trừ lẫn nhau), vì thế khi đặt một từ trường ngoài vào, nó sẽ tạo ra các momen từ
ngược với từ trường ngoài [4]. Vật liệu có c > 0 (~ 10
-6
) được gọi là vật liệu
thuận từ. Vật liệu thuận từ là vật liệu có momen từ nguyên tử, nhưng momen từ
này cũng rất nhỏ, có thể xem một cách đơn giản, các nguyên tử của vật liệu từ
như các nam châm nhỏ (Hình 1.8), nhưng không liên kết được với nhau (do
khoảng cách giữa chúng xa và momen từ yếu). Khi đặt từ trường ngoài vào vật
liệu thuận từ, các “nam châm” (momen từ nguyên tử) sẽ có xu hướng bị quay
theo từ trường, vì thế momen từ của chất thuận từ là dương, tuy nhiên do mỗi
“nam châm” này có momen từ rất bé nên momen từ của chất thuận từ cũng rất
nhỏ. Hơn nữa do các nam châm này không hề có tương tác với nhau nên chúng
không giữ được từ tính, mà ngay lập tức bị mất đi khi ngắt từ trường ngoài [4].
Vật liệu có c > 0 với giá trị rất lớn có thể là vật liệu ferri từ. Chất sắt từ
được biết đến là chất có từ tính mạnh, tức là khả năng cảm ứng dưới từ trường
ngoài mạnh (ví dụ: Fe, Co, Ni, Gd…). Vật liệu sắt từ là vật liệu có momen từ
nguyên tử. Nhưng nó khác biệt so với chất thuận từ ở chỗ các momen từ này lớn
hơn và có khả năng tương tác với nhau (tương tác trao đổi sắt từ) làm cho độ từ
hóa tồn tại ngay cả khi không có từ trường) [4].

Hình 1.8. Hình ảnh đơn giản về vật liệu thuận từ