Phân lập và lưu giữ 2 loài tảo silic lông chim sống đáy Navicula sp. và Nitzschia sp

i




Để có được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn
chân thành tới Ban Chủ Nhiệm Khoa cùng các quý thầy cô trong Khoa Nuôi
Trồng Thủy Sản - Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ tôi hoàn thành chương
trình học và thực hiện công tác tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô hướng dẫn: TS Hoàng
Thị Bích Mai và ThS Tôn Nữ Mỹ Nga đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ hai phòng thí nghiệm: Thực
hành Sinh Lý và Thực hành Môi Trường - Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản đã hết
lòng giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất cả những người thân trong gia
đình, bạn bè cùng lớp đã giúp đỡ, động viên tôi về mặt vật chất cũng như tinh
thần để tôi có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình.
Xin chân thành cảm ơn!

LỜI CẢM ƠN


ii



MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Phân loại và đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo Silic 3
1.1.1. Hệ thống phân loại 3
1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu 3
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Navicula sp và Nitzschia sp 3
1.1.2.2. Sinh trưởng 5
1.2. Thành phần sinh hóa của tảo 7
1.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của tảo 8
1.3.1. Ánh sáng 8
1.3.2. Nhiệt độ 8
1.3.3. Độ mặn 9
1.3.4. pH 9
1.3.4. Các yếu tố dinh dưỡng 10
1.4. Khái quát các công trình nghiên cứu nuôi trồng vi tảo 11
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới 11
1.4.2. Ở Việt Nam 14
CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
2.1.1. Đối tượng 16
2.1.2. Thời gian 16
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu 16
2.2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu 16
2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, nước và môi trường thí nghiệm 18
2.2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm 18
2.2.2.2. Nguồn nước 19
2.2.3. Nguồn tảo 19
2.2.4. Pha môi trường dinh dưỡng dùng trong các thí nghiệm 19
2.2.5. Phương pháp phân lập 20
2.2.5.1. Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 20
2.2.5.2. Phân lập bằng phương pháp pha loãng 21
2.2.6. Xác định điều kiện lưu giữ tảo thích hợp 22
2.2.6.1. Xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp . 22
2.2.6.2. Thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp 23
2.2.7. Định lượng tảo và xử lý số liệu 23
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Phân lập tảo bằng các phương pháp khác nhau 26
MỤC LỤC


iii

3.1.1. Phương pháp pha loãng 26
3.1.1.1. Navicula sp 26
3.1.1.2. Nitzschia sp 27
3.1.2. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 28
3.1.2.1 Navicula sp 28

3.1.2.2. Nitzschia sp 30
3.2. Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau 31
3.2.1. Navicula sp 31
3.2.1.1. Lưu giữ tảo trong môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau31
3.2.1.2. Lưu giữ tảo trong khoảng thời gian khác nhau 34
3.2.2. Nitzschia sp. 36
3.2.2.1. Lưu giữ trong môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 36
3.2.2.2. Lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau 40
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 42
4.1. Kết luận 42
4.2. Đề xuất ý kiến 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng 1.1. Thành phần của vi tảo 7

Bảng 2.1. Các lô thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ
thích hợp đối với tảo Navicula sp. và Nitzschia sp. 22
Bảng 3.1. Sự sinh trưởng của tảo Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi
lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 32
Bảng 3.2. Sự sinh trưởng của tảo Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi
lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau. 35
Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của tảo Nitzschia sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi
lưu giữ ở các môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau. 37
Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của tảo Nitzschia sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi
lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau. 40

v


DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình 1.1. Hình dạng tế bào Nitzschia sp. 3
Hình 1.2. Hình dạng tế bào Navicula sp. 3
Hình 1.3. Cấu tạo vỏ của tảo Silic 4

Hình 1.4. Thể màu ở tảo Silic 5

Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu 17
Hình 2.2. Cách pha độ mặn 18
Hình 2.3. Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng 21
Hình 2.4. Nhân sinh khối tảo 25

Hình 3.1. Quần tảo Navicula sp. thuần chủng 26
Hình 3.2. Quần tảo Nitzschia sp. thuần chủng 27

Hình 3.3. Quần lạc tảo mọc trên các đĩa thạch 28

Hình 3.4. Tảo chuyển sang các ống nghiệm 29
Hình 3.5. Diễn biến về mật độ tế bào tảo Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối
sau khi lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 33

Hình 3.6. Diễn biến về mật độ tế bào Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau
khi lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau 36
Hình 3.7. Diễn biến về mật độ tế bào tảo Nitzschia sp. được đưa ra nuôi sinh khối
sau khi lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 38
Hình 3.8. Diễn biến mật độ tế bào Nitzschia sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau
khi lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau 41

CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT

ctv: Cộng tác viên
g: Gram
mg/l: Minigram/lít
ppt: Phần ngàn
tb: Tế bào


1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam phát triển
rất mạnh, nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất giống và nuôi lớn Bào ngư, Ốc
hương, cua, Trai ngọc, Điệp, Hải sâm, giáp xác và một số loài cá biển đã thành
công và có triển vọng lớn. Vi tảo (Microalgae) đã có những đóng góp nhất định
vào thành công đó bởi chúng là nguồn thức ăn không thể thiếu trong công nghệ
sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm. Vì vậy, việc nghiên cứu về vi tảo là
vấn đề đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm, đặc biệt là tảo Silic.
Ở trong các thủy vực nước ngọt, tảo Silic là thành phần chính của năng
suất sơ cấp. Ở biển và đại dương, tảo Silic chiếm ưu thế cả về sinh khối và thành
phần loài. Chúng đóng vai trò chủ đạo trong việc tạo nên các năng suất sơ cấp
trong hệ sinh thái biển, nhất là những vùng không được tiếp nhận nguồn thức ăn
hữu cơ mang tới từ các dòng lục địa
[
10]. Mặt khác, hiện nay trên thế giới, tảo
Silic, đặc biệt là một số loài tảo Silic sống đáy như Navicula sp., Nitzschia sp.…
đang là thức ăn rất phổ biến cho ấu trùng Bào ngư cũng như một số đối tượng
thủy sản khác, phổ biến nhất là ở Mexico. Giống Nitzschia đã được phân lập từ
trại nuôi Bào ngư ở Esenada, Mexico (Corea-Reyes và ctv), còn Navicula được
phân lập từ vùng nước ven biển của Bahina, Mexico để làm thức ăn cho các loài
động vật thân mềm ăn lọc (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12].
Ở nước ta, tảo Silic nói chung, Navicula sp. và Nitzschia sp. nói riêng là
những loài tảo phù hợp về kích thước và chất lượng dinh dưỡng cho ấu trùng
động vật thủy sản, đặc biệt là động vật thân mềm 2 mảnh vỏ. Tảo có tốc độ tăng
trưởng nhanh, có thể nuôi trong điều kiện nhân tạo, trong các trại giống. Đến nay,
chúng ta đã phân lập được một số loài. Tuy nhiên, hiện nay hai loài Navicula sp.,
Nitzschia sp. phải nhập từ nước ngoài, chủ yếu là từ Úc và Trung Quốc, nhưng
giá thành nhập rất cao. Việc nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố như hàm
lượng muối dinh dưỡng, độ mặn… đến sự phát triển của chúng đã có nhiều tài

2

liệu đề cập đến [10], [12], nhưng chưa tìm thấy tài liệu nào công bố về phương
pháp phân lập cũng như điều kiện lưu giữ thích hợp cho mỗi loài.
Vì vậy, để góp phần vào việc phân lập ra một số loài tảo Silic thuần chủng
và điều kiện lưu giữ thích hợp hơn, tạo cơ sở cho việc thiết lập ngân hàng tảo,
giảm chi phí nhập tảo, từ ngày 30/7/2007 đến ngày 10/11/2007, tôi thực hiện đề
tài: “Phân lập và lưu giữ hai loài tảo Silic lông chim sống đáy Navicula sp. và
Nitzschia sp.”.
Mục tiêu của đề tài
- Phân lập được hai loài tảo Navicula sp., Nitzschia sp. thuần chủng.
- Xác định điều kiện lưu giữ giống thích hợp cho mỗi loài (môi trường dinh
dưỡng, nhiệt độ, thời gian).
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập hai loài tảo Navicula sp. và Nitzschia sp. bằng 2 phương pháp khác
nhau (phương pháp pha loãng và phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch).
- Lưu giữ giống Navicula sp. và Nitzschia sp. thuần chủng trong môi trường
dinh dưỡng, nhiệt độ và thời gian khác nhau.
Ý nghĩa của đề tài
- Góp phần vào việc thành lập ngân hàng tảo, nhằm cung cấp tảo giống cho
công nghệ sản xuất giống thủy sản.
- Lưu giữ giống Navicula sp., Nitzschia sp. hiệu quả hơn.
Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian ngắn, tài liệu tham khảo khan
hiếm, trình độ chuyên môn có hạn nên một số nội dung nghiên cứu còn hạn chế.
Được sự hướng dẫn của TS Hoàng Thị Bích Mai và ThS Tôn Nữ Mỹ Nga nên tôi
đã hoàn thành được nội dung. Tôi xin chân thành cảm ơn đến sự giúp đỡ quý báu
này.
Nha Trang, tháng 11 năm 2007
Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Vân


3

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. Phân loại và đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo Silic
1.1.1. Hệ thống phân loại [8]
Ngành: Bacillariophyta Ngành: Bacilariophyta
Lớp: Bacillariophyceae Lớp: Bacillariophyceae
Bộ: Pennales Bộ: Pennales
Bộ phụ: Biraphidineae Bộ phụ: Biraphidineae
Họ: Nitzschiaceae Họ: Navicuceae
Giống: Nitzschia Giống: Navicula
Loài: Nitzschia sp. Loài: Navicula sp.









Hình 1.1. Hình dạng tế bào Nitzschia sp. Hình 1.2. Hình dạng tế bào Navicula sp.

1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu

1.1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Navicula sp. và Nitzschia sp.
Navicula sp. và Nitzschia sp. cũng như các loài tảo Silic khác, có thể nhận
biết bằng kính hiển vi quang học nhờ thành tế bào (cấu tạo vỏ) bằng chất silic
cứng. Kích thước tế bào 30 x 4 µm (Navicula sp.), 30 x 5 µm (Nitzschia sp.). Mỗi
tế bào được bao bọc bởi vách tấm silic như một cái hộp có nắp đậy lại được gọi




4

là vỏ. Như vậy, vỏ có hai mảnh lồng vào nhau, giống như một hộp petri với cái
nắp và đáy hộp, mảnh trên hơi to hơn và úp lên mảnh dưới với đai là 2 mảnh
chồng vào nhau. Đối với Navicula sp., tảo có dạng hình thuyền, đường sống ở
trên đường giữa nhỏ và gần với đường giữa, do đó hình dạng mặt phẳng thẳng,
rãnh dọc cũng thẳng. Hình dạng mặt vỏ là hình chữ S hoặc hình cong. Rãnh dọc
cũng hình chữ S hoặc hình cong, có đốt giữa và đốt cực.

Hình 1.3. Cấu tạo vỏ của tảo Silic (Cupp)
(trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12]
a. Mảnh vỏ trên c. Đường rãnh e. U chót
b. Mảnh vỏ dưới d. U giữa

- Cấu tạo vách tế bào:
Tế bào tảo được bao bọc bởi lớp vỏ cấu tạo bằng chất silic và chất pectin gồm 2
tầng: Tầng ngoài (silic) và tầng trong (pectin).
- Sắc tố, thể sắc tố:



5

Số lượng ít, kích thước lớn, thể sắc tố sẻ thùy, có dạng hình sao, gồm
chlorophyll, phycoxanthin, carotenoit và diatomi.
- Nguyên sinh chất:
Là chất sống căn bản của tế bào, có tính lỏng, nhớt, đàn hồi, và trong suốt.










Hình 1.4. Thể màu ở tảo Silic (Geitler)
(trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12]

a. Thể màu của tảo thuộc Pennales c. Thể màu của Cocconeis
b. Sơ đồ hình thể của chúng
- Nhân:
Mỗi tế bào tảo Silic có một nhân, thường có dạng hình cầu, kích thước phụ thuộc
vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của tế bào. Nhân nằm trên cầu nguyên
sinh chất chạy qua trung tâm tế bào. Nhân có màng nhân cố định chứa một hay
nhiều hạch nhân, quá trình phân chia không giảm nhiễm [1].
- Chất dự trữ:
Dạng giọt dầu màu da cam với kích thước nhỏ.
1.1.2.2. Sinh trưởng
Trên thế giới và ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu về sinh
trưởng của tảo Silic. Những nghiên cứu về các giai đoạn sinh trưởng của tảo Silic

H
ạt tạo bột
H
ạt tạo bột



6

phải kể đến công trình của Đặng Ngọc Thanh (1974) [9], Fluks và Main (1991)
[20], Sato (1991) [22].
Cũng như các ngành tảo khác, chu kỳ sinh trưởng của tảo Silic cũng trải qua 5
pha [4]:
- Pha gia tốc dương: Tảo bắt đầu thích nghi với môi trường nuôi, hấp
thụ chất dinh dưỡng và tiến hành phân cắt tế bào nhưng tốc độ tăng
trưởng quần thể chậm.
- Pha logarit: Ở pha này mật độ hay sinh khối tế bào tăng lên với tốc độ

nhanh nhất, theo cấp số nhân do tảo hấp thụ chất dinh dưỡng mạnh và
tăng tốc độ sinh sản.
- Pha gia tốc âm: Được đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng chậm dần so
với pha logarit.
- Pha cân bằng: Sinh khối tảo không tăng và đạt mật độ cực đại. Quá
trình quang hợp và phân chia tế bào vẫn xảy ra trong suốt pha này,
nhưng số lượng tế bào mới sinh ra gần ngang bằng với số lượng tế bào
chết đi, do đó không có sự tăng trưởng của tảo.
- Pha tàn lụi: Sinh khối tảo giảm đi một cách rõ rệt do khả năng sinh sản
của tảo mất dần sau khi đạt mật độ cực đại.
Như vậy, các pha sinh trưởng khác nhau, tốc độ sinh trưởng của tảo cũng
khác nhau. Ngoài ra tốc độ sinh trưởng của tảo nói chung và tảo Silic nói riêng
còn phụ thuộc vào loài tảo nuôi và sự thay đổi của các yếu tố môi trường như:
cường độ và chế độ ánh sáng [17], nhiệt độ [15], [22], muối dinh dưỡng [4], [10],
mức độ xáo trộn hoặc sục khí môi trường nuôi [15], [17], [20].








7

1.2. Thành phần sinh hóa của tảo
Thành phần sinh hóa của vi tảo được Brown và ctv (1989) [14] bổ sung
trong bảng 1.1.

Bảng 1.1. Thành phần của vi tảo (tính theo khối lượng khô của tế bào).

Protein 30-55% Thành phần aminoacid tương tự trứng gà
Cacbohydrat 10-30% Chủ yếu là polysaccharid
Lipid 10-25%
Các acid béo: 20-40% lipid tổng số
Phospholipid: 10% lipid tổng số
Khoáng 10-40% Silic (tảo Khuê), phospho, natri, canxi
Acid nucleic 4-6% RNA:DNA = 3:1

Giá trị dinh dưỡng của những loài tảo khác nhau rõ rệt giữa các loài, và
ngay giữa các dòng trong cùng một loài cũng khác nhau (Enright và ctv, 1986;
Ryther và Goldman, 1975; trích theo Hà Lê Thị Lộc) [3]. Ngành
Prymnessiophyceae có hàm lượng lipid 17%, và ngành Eustigmatophyta tảo có
hàm lượng lipid là 17% khối lượng khô tế bào. Giống Navicula và Nitzschia
thuộc ngành tảo Silic và có hàm lượng lipid cao nhất, với giá trị trung bình là
18% (trích theo Hà Lê Thị Lộc, 2000) [3]. Mặt khác, trong lipid của tảo có chứa
một số axit béo không no, có thể mạch ngắn hay mạch dài, rất quan trọng cho
động vật tiêu thụ tảo, ngay cả con người cũng không thể tổng hợp được axit béo
không no này: DHA (Docosahec xaenoic-acid) chiếm 0,2-11%, EPA
(Eicosapentaenoic - acid) chiếm 7-34% khối lượng khô của tảo. Đối với 2 loài
tảo Navicula sp. và Nitzschia sp., EPA chiếm 1-5%, AA rất cao chiếm hơn 20%
khối lượng khô. Ngoài ra, ở Navicula sp., DHA chiếm 0,2-1%, và Nitzschia sp.
chiếm 1-5% khối lượng khô [13].
Tuy nhiên, giá trị dinh dưỡng của tảo có thể bị thay đổi rất lớn ở các pha
sinh trưởng hay ở các điều kiện nuôi khác nhau (ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, pH,
muối dinh dưỡng, …). Vào cuối pha logarit, tất cả các loài chứa khoảng 30-40%


8

protein, 10-20% lipid, 5-15% cacbohydrat [14]. Vì vậy, chúng ta cần xác định

thời gian thu hoạch thích hợp để có tảo đạt giá trị dinh dưỡng cao nhất.
1.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của tảo
1.3.1. Ánh sáng
Ánh sáng là nguồn năng lượng chính cho quá trình quang hợp của vi tảo.
Ánh sáng ảnh hưởng không chỉ đến sự phát triển số lượng của vi tảo, mà còn ảnh
hưởng đến thành phần hóa sinh của vi tảo. Hầu hết các loài vi tảo sử dụng trong
nuôi trồng thủy sản thích ứng với cường độ ánh sáng từ 50 đến 300 µEm
-2
s
-1
,
tương ứng với thời gian chiếu sáng 12-18 giờ/ngày [16].
Brand và Guillard (1981) (trích theo Thinh, 1999) [23], khi nghiên cứu
trên 22 loài tảo cho thấy có một số loài tảo không tăng trưởng trong điều kiện
chiếu sáng liên tục. Một số loài tăng trưởng tốt nhất ở chế độ 14 giờ, cũng có một
số thích nghi với thời gian chiếu sáng 12 giờ trong ngày. Navicula và Nitzschia
thích nghi với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày [10], [12].
1.3.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào, tốc độ phản ứng trao đổi
chất, sinh trưởng, quá trình quang hợp, mật độ phân bố, cường độ hô hấp, kích
thước tế bào và sự thích nghi của loài. Vi tảo có thể sống được trong khoảng
nhiệt độ 16-30
o
C. Ở nhiệt độ cao hơn 35
o
C và thấp hơn 16
o
C, vi tảo phát triển rất
kém [3]. Tuy nhiên, nhiệt độ được coi là thích hợp cho sự phát triển của hầu hết
các loài vi tảo là khoảng 20-25

o
C (Coutteau, 1996) [15]. Một số loài sinh trưởng
ngoài tự nhiên ở nhiệt độ thấp, nhưng khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì lại
thích nghi với độ mặn cao hơn. Chẳng hạn, Skeletonema costatum ngoài tự nhiên
sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 12-13
o
C và 14-20
o
C, trong khi nuôi cấy trong phòng
thí nghiệm thì nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của chúng là 20-30
o
C (Fogg,
1965) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10]. Navicula sp. và Nitzschia sp.
có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 10-35
o
C, trong đó, nhiệt độ tối ưu cho
Nitzschia sp. là 20-30
o
C, và Navicula sp. là 26-31
o
C [10], [12].



9

1.3.3. Độ mặn
Khả năng chịu đựng sự thay đổi độ mặn của vi tảo biển rất lớn. Các loại
tảo khác nhau thì khả năng thích nghi của chúng đối với các độ mặn cũng khác
nhau. Có những loài tảo có khả năng phát triển tốt trong môi trường có độ mặn

cao đến hơn 35 ppt, nhưng cũng có những loài chỉ sống được trong môi trường
có độ mặn chỉ vài phần ngàn. Hầu hết, các loài tảo sinh trưởng và phát triển
được trong khoảng độ mặn 12-40 ppt, nhưng phát triển tốt hơn trong khoảng 20-
35 ppt (Ukeles, 1976; Duerr và Misui, 1982; trích theo Fulks và Main, 1991)
[20].
Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu của Hoàng Thị Bích Mai (1995)
[4] cho thấy loài tảo Chaetoceros sp. thích hợp phát triển ở độ mặn 20-35 ppt, tốt
nhất ở 30 ppt, còn S. costatum lại thích hợp phát triển ở độ mặn thấp từ 15-25
ppt,… Tảo Chaetoceros gracilis có thể phát triển tốt như nhau trong khoảng độ
mặn 10-35 ppt (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6]. Hầu hết, các loài tảo thuộc giống
Nitzschia, Navicula đều là những loài rộng muối, chúng có thể sinh trưởng ở độ
mặn dao động từ 5-35 ppt [10], [12]. Trong thực tế, Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản III đã nuôi Navicula ở độ mặn 25-28 ppt. Trong điều kiện bị sốc
mặn, khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu, duy trì cân bằng nội môi của tế bào
tảo sẽ bị ảnh hưởng. Độ mặn cao có thể ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt tính quang
hợp, hô hấp, tốc độ sinh trưởng của tế bào tảo [10].
1.3.4. pH
pH được coi là yếu tố biến đổi nội tại, sự biến đổi của nhiệt độ cũng như
ánh sáng đều tác động đến pH thông qua quá trình quang hợp của tảo. pH của
môi trường quá cao hoặc quá thấp đều làm chậm tốc độ tăng trưởng của vi tảo.
Mỗi loài tảo sinh trưởng tối ưu trong môi trường có pH nhất định. pH tốt đối với
hầu hết các loài tảo trong khoảng 7-9, và thích hợp nhất từ 8,2-8,7 (Ukeles 1971;
trích theo Fulks và Main, 1991) [20]. Khoảng pH này cũng thích hợp cho
Navicula sp. và Nitzschia sp. [10], [12]. Tuy nhiên, có những loài chịu được


10

khoảng dao động pH khá rộng, như Isochrysis galbana có thể phát triển tốt trong
khoảng dao động pH từ 5-9 (Fulk và Main, 1991) [20].

1.3.4. Các yếu tố dinh dưỡng
Dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và
phát triển của vi tảo cả về số lượng và chất lượng. Mật độ tế bào tảo nuôi thường
cao hơn nhiều so với mật độ tảo trong tự nhiên, nên việc bổ sung dinh dưỡng vào
môi trường nuôi là cần thiết. Thành phần dinh dưỡng đa lượng cần thiết cho tảo
nuôi gồm các muối nitơ, photpho, silic… Các nguyên tố vi lượng tác động đến
quá trình trao đổi chất của vi tảo. Môi trường bổ sung dinh dưỡng cho tảo đang
được sử dụng phổ biến hiện nay cho tảo Silic là môi trường L và L1 (Guillard &
Hargraves, 1993) [17]. Ở Việt Nam, môi trường bổ sung dinh dưỡng của Hoàng
Thị Bích Mai rất phù hợp cho ngành tảo trần, đang được sử dụng phổ biến tại các
cơ quan nghiên cứu và trại nuôi tôm Sú Nha trang [3].
 Nitơ:
Mặc dù nitơ chỉ chiếm từ 1-10% khối lượng cơ thể trong hầu hết các loại tảo,
nhưng nhu cầu nitơ rất quan trọng đối với sự phát triển của tảo. Khi mà amon
được sử dụng như nguồn nitơ duy nhất cho tảo thì môi trường pH sẽ giảm nhanh,
gây ra một số hiệu ứng phụ ảnh hưởng tới sinh trưởng của tảo. Mzapharov và ctv
(1974) (trích theo Phan Thị Thu Trang) [10] cho biết tảo có khả năng sử dụng
đạm dưới dạng 3 hợp chất: Amoni, nitrat, và nitrit. Mỗi loài có nhu cầu sử dụng
hàm lượng nitơ khác nhau. Hàm lượng nitơ bổ sung tốt nhất cho tảo Chaetoceros
gracilis là 12,41-17,41 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6]. Đối với Navicula sp. và
Nitzschia sp., nhu cầu này từ 10-45 ppm, và tốt nhất ở 30 ppm [10], [12].
 Photpho:
Là một trong những yếu tố không thể thiếu trong nhu cầu dinh dưỡng của tảo.
Nó có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của tảo. Chức năng chính của
photpho là tham gia vào việc hình thành nhiều hợp chất hữu cơ có vai trò là
những khâu chuyển hóa trung gian hoặc những chất có ý nghĩa then chốt trong
trao đổi năng lượng và trao đổi chất. Hàm lượng photpho cần bổ sung cho hầu


11

hết các loài vi tảo từ 2,5-15 ppm (trích theo Hà Lê Thị Lộc) [3], cho loài C.
gracilis là 2,27-3,27 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6]. Đối với Navicula sp. và
Nitzschia sp., hàm lượng photpho bổ sung tối ưu khoảng 10 ppm [10]. Lượng
photpho nhiều quá hay ít quá đều không tốt cho sự phát triển của tảo [3].
 Silic:
Vừa là yếu tố tạo sinh, vừa là nguyên tố tạo nên vỏ silic của tảo Silic. Theo
Nguyễn Trọng Nho (1972) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10], silic rất
cần cho việc xây dựng vỏ tảo Khuê. Nếu thủy vực tồn tại nhiều tảo Khuê thì
trong thời kỳ tảo Khuê phát triển mạnh, hàm lượng silic sẽ giảm nhiều, và do đó,
sẽ hạn chế sự phát triển cực đại của tảo. Một số tác giả khác chỉ ra rằng khi thiếu
silic, tảo Khuê vẫn phát triển bình thường nhưng cấu trúc tế bào sẽ bị thay đổi và
khó khăn cho việc xác định loài. Cấu trúc phức tạp của vỏ silic giúp cho tảo có
khả năng sử dụng đầy đủ ánh sáng mặt trời (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12].
Đối với Chaetoceros gracilis, hàm lượng silic bổ sung tối ưu là 1,49 ppm (Tôn
Nữ Mỹ Nga, 2006) [6]. Trong phòng thí nghiệm, Richer (1961) đã nghiên cứu 2
loài tảo Navicula sp. và Nitzschia sp. và thấy rằng môi trường nuôi chúng nên bổ
sung thêm silic (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10]. Hàm lượng silic
thích hợp đối với Navicula sp. là 5-30 ppm và tối ưu là 20-30 ppm [12]; còn ở
Nitzschia sp., hàm lượng silic thích hợp từ 5-20 ppm, tốt nhất là 10 ppm [10].
1.4. Khái quát các công trình nghiên cứu nuôi trồng vi tảo
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới
Theo Hans R. và Robert A. (2005) [18], môi trường nuôi, phương pháp
nuôi của tảo được nghiên cứu từ những năm 1800-1900, và kỹ thuật nuôi trồng vi
tảo được mô tả trong khá nhiều sách báo, tạp chí. Vào thế kỷ 19-20, khá nhiều
công trình về nuôi trồng vi tảo được công bố, song phần lớn các công trình này
mô tả cách nuôi vi tảo, ít đề cập đến phương pháp phân lập, lưu giữ các loài tảo
này như thế nào, đặc biệt là các loài tảo sống đáy. Mặc dù vậy, có thể đề cập đến
một số công trình sau:

12

Vào năm 1850, mặc dù Ferdinand Cohn đã lưu giữ thành công tảo Lục
đơn bào có roi Hamatococcus, song Cohn đã không phân lập được thuần chủng
loài tảo này trong phòng thí nghiệm [18]. Năm 1971, Famintzin đã nuôi được hai
loài tảo Lục Chlorococcum infusionum, Protcoccus viridis trong môi trường có
chứa muối vô cơ. Môi trường này đã được phát minh bởi Knop (1865) khi ông
nghiên cứu về thực vật [18].
Báo cáo đầu tiên về nuôi thuần chủng tảo được công bố bởi Beijerinck
(1890) [18]. Ông đã giới thiệu kỹ thuật nuôi tảo trong môi trường hỗn hợp (nước
muối, muối dinh dưỡng và gelatin). Vào năm 1893, ông đã phân lập được 2 loài
tảo Lục (Chlorella, Scenedesmus) và một loài tảo Vàng Trebauxia. Ngoài ra,
Beijerinck còn nuôi thuần chủng một số loài tảo khác (tảo Lam Anabana ).
Miquel (Pháp) cũng được xem là người có nhiều đóng góp trong nuôi
trồng tảo. Từ 1890-1898, ông đã pha loãng tảo tạp trong môi trường có chứa các
nguyên tố khoáng khác nhau để phân lập một số loài tảo Silic trung tâm. Tuy
nhiên, độ thuần chủng của tảo còn rất thấp [18].
Năm 1892, Noll và Oltmanns (Đức) [18] đã xuất bản những bài báo về
nuôi trồng tảo, song chủ yếu là về nuôi và lưu giữ tảo chứ không đề cập đến phân
lập chúng. Năm 1894, Kriiger (Đức) [18] đã nuôi thuần chủng quần lạc tảo Lục,
bao gồm Prototheca, Chlorella. Năm 1896-1898, Klebs đã phân lập được tảo
trong các đĩa petri có agar hay gelatin cho dù tảo vẫn còn bị nhiễm vi khuẩn [17].
Kế đó là Tischutkin (1897) [18], tại Belarus cũng đã nuôi thuần chủng được một
số loài tảo Lam bằng môi trường có agar, nhưng độ thuần chủng cũng không cao
hơn.
Tại đại học Cambirdge (Mỹ), Ward (1899-1942) [18] đã giới thiệu
phương pháp phân lập tảo thuần chủng bằng cách trộn agar, axit axetic loãng với
môi trường giàu dinh dưỡng, sau đó đổ vào đĩa petri và nuôi trong phòng thí
nghiệm, song một vài ngày sau đó chỉ có một số loài tảo mọc được trên bề mặt

agar. Tuy nhiên, Ward cũng được xem là người đầu tiên phân lập tảo thành công
trên bề mặt môi trường đặc. Đến năm 1900, Winkler đã tiến hành thu mẫu tảo ở


13

vùng nước ngọt xung quanh nhà và ông đã thuần chủng được một số loài tảo
nước ngọt bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch. Đồng thời, ông cũng đã tìm ra
môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của chúng và nuôi ở các thể
tích khác nhau (1-5 lít) [24].
Zumstein (1900) [18] cũng đã phân lập được loài tảo Mắt Euglena gracilis
bằng pipet và tách được vi khuẩn khỏi môi trường nuôi mà không ảnh hưởng đến
sự phát triển của tảo. Năm 1903, bằng phương pháp phân lập tảo của Miquel,
Richter đã lưu giữ được một số loài, trong đó có tảo Silic trung tâm. Ở Đức, từ
năm 1926 đến 1960 [18], Vischer cũng đã thu và lưu giữ được một số loài thuộc
các bộ Vovocales, Euglenales, Cryptomonadales. Tại Trung Quốc, nghiên cứu
tảo nuôi đã được bắt đầu từ năm 1940. Guo và ctv (1959) đã phân lập và nuôi 2
loài tảo đơn bào Tetraselmis sp. và Dunaliella sp. (trích theo Hà Lê Thị Lộc,
2000) [3].
Vào năm 1997, Comtois [18] đã phân lập và nuôi thuần chủng được một
số loài tảo Silic bằng phương pháp nhặt tế bào bằng Micropipette, một phương
pháp mới và đòi hỏi kỹ thuật khá cao. Bristol đã phân lập được tảo Lục từ nhiều
môi trường dinh dưỡng khác nhau (môi trường của Detmet, Beierinck 1, và
Beierinck 2). Ông cũng là người khẳng định việc phân lập tảo thường khó hơn
việc phân lập vi khuẩn kỵ khí [25]. Những năm gần đây, các nhà tảo học chủ yếu
quan tâm đến việc cải tiến và nâng cao hiệu quả những phương pháp phân lập,
lưu giữ và nuôi sinh khối các loài đã công bố trước đây (Robert A. Anderden,
2005) [18]. Năm 2007, Trường Đại học Murdoch (Úc) đã sử dụng phổ biến 4
phương pháp phân lập tảo (phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường
thạch, dùng Micropipette, và phương pháp làm giàu). Đặc biệt, khi phân lập bằng

phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch, được làm sạch bằng hỗn hợp kháng
sinh khi tảo bị nhiễm vi khuẩn: 100 g Peniciline + 25 g Dihydrostreptomysin
sulphate (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2007) [7].
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều loài tảo (300-400 loài) được phân lập,
lưu giữ và nuôi sinh khối nhằm phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau (y học,


14

công nghệ thực phẩm, nông nghiệp…), nhưng chỉ có khoảng 40-50 loài tảo được
sử dụng làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (trích theo Thinh,
1999) [23].
1.4.2. Ở Việt Nam
Các công trình nuôi trồng tảo được bắt đầu và phát triển cùng với sự phát
triển của nghề nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, các báo cáo khoa học về vấn đề
này lại không nhiều, đặc biệt là quá trình phân lập và lưu giữ giống tảo thuần
chủng. Vào năm 1974, Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Đại Học Nha Trang đã
nghiên cứu và nuôi sinh khối ngoài trời một số tảo Lục (Chlorella), tảo Silic
(Skeletonema) làm thức ăn cho động vật nổi, thức ăn cho cá và ấu trùng tôm…
Từ năm 1976-1984, Viện Nghiên Cứu Hải Sản Hải Phòng đã có những nghiên
cứu về tảo Silic hỗn hợp làm thức ăn cho cá biển. Năm 1989, trại giống non nước
(liên doanh Vatech) Đà Nẵng đã phân lập và nuôi đại trà tảo Silic trung tâm
Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm đạt kết quả khá tốt [2]. Cũng
năm 1989, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã phân lập được
Skeletonema costalum tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa. Theo Lê Viễn Chí
và cộng sự 1994, Viện Nghiên Cứu Hải Sản Hải Phòng đã lưu giữ và nuôi đại trà
một số loài tảo Silic trung tâm Chaetoceros calcitrans và tảo lục
Chlamydomonas sp., Dunnalliela salina làm thức ăn cho ấu trùng Điệp quạt [10].
Hoàng Thị Bích Mai (1995) [4] đã đưa ra quy trình nuôi 2 loài tảo Silic trung tâm
Chaetoceros sp. và Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú (giai

đoạn Zoea-Mysis1). Lê Viễn Chí (1996) [1] cũng đã thành công trong nuôi và
ứng dụng Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm Sú tại Hải Phòng.
Năm 1995, Hoàng Thị Bích Mai [4] đã thiết lập được môi trường dinh dưỡng
TH04 dùng để phân lập, lưu giữu và nuôi sinh khối một số loài tảo Lục đơn bào
(Chlorella sp., Scenesmus sp., Chlamydomonas sp. ).
Những năm gần đây, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã tiến
hành lưu giữ và nuôi sinh khối các loài tảo Silic (Chaetoceros calcitrans,
Chaetoceros sp., Skeletonema costatum, Navicula sp., Nitzschia sp.), tảo Lục


15

(Nanochloris sp., Chlorella sp., Tetraselmis sp.), tảo Eutisgmatophyta
(Nanochloropsis oculata), tảo vàng ánh (Isochrysis sp.) (trích theo Phan Thị Thu
Trang, 2006) [10]. Tuy nhiên, phần lớn các loài tảo trên được di nhập từ nước
ngoài (chủ yếu là từ Trung Quốc và từ Úc).
Năm 2005, Vũ Thị Thùy Minh đã phân lập được loài tảo Chlorella sp. thu
mẫu từ ao nuôi tôm, và Đoàn Văn Phúc cũng đã phân lập được loài tảo Silic
Pseudo-nitzschia cuspidata tại vịnh Nha Trang trong phòng thí nghiệm. Hiện
nay, Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản (Đại học Nha Trang) cũng đã và đang lưu giữ
một số loài tảo (Tetraselmis sp., Nanochloropsis oculata, Isochrysis gabana) làm
thức ăn chp Artemia, Rotatoria để nuôi ấu trùng cá chẽm…
Tóm lại, có khá nhiều loài tảo (chủ yếu là tảo Lục và tảo Silic) được phân
lập, lưu giữ và nuôi đại trà làm thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản. Nhưng
việc đề cập đến phương pháp phân lập và lưu giữ hai loài tảo Navicula sp.,
Nitzschia sp. thì ở Việt Nam chưa thấy có tài liệu nào đề cập đến. Hiện nay, trên
thế giới đã có 4 phương pháp phân lập thường được sử dụng để thu tảo thuần
chủng: nhặt tảo bằng Micropipet, pha loãng, nuôi cấy trên môi trường agar hoặc
gelatin, hay phương pháp làm giàu [26]. Tuy nhiên, việc ứng dụng các phương
pháp trên vào nuôi tảo ở Việt Nam còn chưa phổ biến. Các loài tảo dùng làm

thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản (đặc biệt là giai đoạn ấu trùng) chủ yếu
được nhập giống thuần chủng từ nước ngoài và được lưu giữ trong phòng thí
nghiệm. Hiện nay, một số loài đã bị tạp, nhiễm vi khuẩn hoặc thoái hóa.










16

CHƯƠNG II
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng: Tảo Silic lông chim sống đáy Navicula sp. và Nitzschia sp.
2.1.2. Thời gian: 30/07/2007 đến 10/11/2007.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu: Trường Đại Học Nha Trang.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu

17

Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu
Môi trường
F2,
25
o

C

Môi trường
HBM-95,
25
o
C

Phương pháp pha loãng
Môi trường
HBM-95,
7
-
8
o
C

Thu mẫu tảo ngoài tự nhiên Thu mẫu tảo ngoài tự nhiên
Nhân sinh kh
ối

Phân l
ập

Môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp
Nhân sinh khối
Phân lập
Nuôi cấy trên môi trường thạch
Tảo giống thuần chủng
Lưu giữ tảo

Nhân sinh khối
Lưu giữ 2 tuần

Lưu giữ 4 tuần
Nhân sinh khối
Thời gian lưu giữ thích hợp
Lưu giữ giống thuần chủng
Môi trường
F2,
7
-
8
o
C



18

2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, nước và môi trường thí nghiệm
2.2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm
- Lưới vớt thực vật nổi, động vật nổi, các chai nhựa để thu mẫu
- Sử dụng các đĩa petri để phân lập tảo, các bình nón 100 ml, 300 ml, 500 ml,
1000 ml để lưu giữ và nuôi thí nghiệm. Ngoài ra còn có các dụng cụ khác
như: lamen làm giá thể, pipet Pasteur, pipet 2 ml, 10 ml, đũa thủy tinh, cốc
thủy tinh, các ống nghiệm, que cấy… Tất cả các dụng cụ được rửa bằng xà
phòng, nước máy, để khô, sau đó đưa vào tủ sấy vô trùng ở 105
o
C, trong thời
gian 12 giờ.

2.2.2.2. Nguồn nước
- Nước biển được lấy từ vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa, nước biển được
bơm lên bằng máy bơm, được xử lý bằng chlorine và lọc bằng hệ thống bể lọc
tại trại sản xuất giống nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang. Sau
đó, để lắng và sục khí nhằm làm bay hơi dư lượng chlorine còn trong nước.
- Nước ngọt: Nước cất tại phòng thí nghiệm Môi trường - Trường Đại Học Nha
Trang.
- Độ mặn được pha theo quy tắc đường chéo (hình 2.2) [11]
a ppt (c-b) V
a

c

b ppt (a-c) V
b

Hình 2.2. Cách pha độ mặn
Trong đó:
a, b, c: Độ mặn tương ứng của nước mặn, nước ngọt và nước sau khi hòa trộn.
V
a,
V
b
: thể tích nước ngọt và nước mặn để trộn lẫn.




19

2.2.2.3. Kiểm tra các yếu tố môi trường
- Nhiệt độ nước được đo bằng nhiệt kế thủy ngân (0 đến 100
o
C).
- Độ mặn được đo bằng khúc xạ kế.
- pH đo bằng test pH.
2.2.3. Nguồn tảo
- Địa điểm thu mẫu: Tảo được thu tại các địa điểm cầu Xóm Bóng - Nha Trang.
- Cách thu mẫu: Mẫu tảo được thu bằng cách rũ các đám rong, hoặc dùng que
gạt nhẹ các viên gạch, đá, lọc lại bằng lưới vớt thực vật nổi, cho vào chai
nhựa mở nắp. Sau đó đưa về phòng thí nghiệm lọc lại bằng lưới vớt động vật
nổi để loại bỏ các động vật nổi và các cặn bẩn.
- Tiến hành nhân sinh khối bằng các bình nón 500 ml, với môi trường dinh
dưỡng HBM-95, sau đó đặt ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ
phòng thí nghiệm (28-30
o
C), kiểm tra tảo hàng ngày. Sau 4-5 ngày, khi tảo
phát triển tốt (mật độ dày, màu vàng nâu đậm, tế bào tảo quan sát dưới kính
hiển vi rõ nét), ta có thể tiến hành lấy mẫu phân lập.
2.2.4. Pha môi trường dinh dưỡng dùng trong các thí nghiệm
 Môi trường HBM-95 (Hoàng Thị Bích Mai, 1995) [4].
Để tránh kết tủa trong dung dịch, ta pha thành các dung dịch khác nhau:
(KNO
3
: KHPO
4
: Na
2
SiO
3

: EDTA: FeCl
3
= 3: 1: 1: 1:0,5)
- Dung dịch 1: KNO
3
: 30 g
KH
2
PO4: 10 g
Na
2
EDTA: 10 g
Nước: 1 lít
- Dung dịch 2: Na
2
SiO
3
. 9 H
2
O: 10 g
Nước: 1lít
- Dung dịch 3: FeCl
3
. 6H
2
O: 5 g
Nước: 1 lít
Đưa các dung dịch đã pha vào vô trùng bằng nồi thanh trùng ở 120
o
C, áp

suất 1,5 atm, trong thời gian 20 phút.


20

Cách bón phân: 1 ml dung dịch 1 + 1 ml dung dịch 2 + 1 ml dung dịch 3
cho vào 1 lít nước nuôi cấy tảo.
 Môi trường F2 (Guillard, 1975) [17].
- Dung dịch 1: KNO
3
: 89,6 mg/l
KH
2
PO
4
: 5,6 mg/l
Na
2
SiO
3
. 9 H
2
O: 30 mg/l
- Dung dịch 2: Na
2
EDTA: 4,36 mg/l
FeCl
3
. 6H
2

O: 3,15 mg/l
CuSO
4
. 5H
2
O: 0,01 mg/l
ZnSO
4.
H
2
O: 0,022 mg/l
CoCl
2
. 6H
2
O: 0,01 mg/l
MnCl
2
. 4H
2
O: 0,18 mg/l
NaMoO
4
. 2H
2
O: 0,006

mg/l
- Vitamin: Thiamin (B1): 0,1 mg/l
Biotin (B6): 0,0005 mg/l

Riboflavin (B12): 0,0005 mg/l
Cách bón: Mỗi lần bón lấy 1 ml dung dịch 1+ 1 ml dung dịch 2 + 1 ml hỗn
hợp vitamin cho vào 1 lít nước tảo nuôi.
2.2.5. Phương pháp phân lập
- Quá trình phân lập sử dụng môi trường dinh dưỡng HBM-95 (Hoàng Thị Bích
Mai, 1995) [4]. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.5.1. Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch
- Chuẩn bị môi trường thạch: Pha 10 g agar với 500 ml nước biển trong cốc
thủy tinh 1 lít và bổ sung môi trường dinh dưỡng HBM-95.
- Đun sôi cho tan agar rồi cho vào đĩa petri (10 ml/đĩa).
- Khi thạch đông, nguội, nhỏ 1 ml mẫu tảo hỗn hợp vào bề mặt thạch và tráng
đều.
- Đậy nắp lại và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang (thời gian chiếu sáng
12 giờ/ngày).