Nghiên cứu biểu hiện gen NovU tham gia sinh tổng hợp đuờng khử dTDP–L–Noviose thuộc nhóm gen sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin

Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
MỤC LỤC
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DNA
RNA
mRNA
tRNA
Amp
EDTA
EtBr
SDS
TAE
TE
Taq
OD
Nu
Kb
Bp
Kp
KDa
ORF
E.coli
M
NCBI
Deoxyribonucleotit acid
Ribonucleotit acid
Messenger RNA (RNA thông tin)
Transfer RNA (RNA vận chuyển)
Ampicillin

Ethylen diamin tetra–acetic acid
Ethidium bromide
Sodium dodecyl sulphate
Tris–Acetate–EDTA
Tris–EDTA
Polymerase Thermus aquaticus
Optical Density
Nucleotid
Kilo base
Bazơ pairs
Kilo bazơ
Kilo Dalton
Open reading frame (khung đọc mở)
Escherichia coli
Marker
National Center for Biotechnology Information
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
DANH MỤC HÌNH VẼ
TT Số hình Tên hình Trang
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
Cấu trúc hóa học của kháng sinh Novobiocin
Sơ đồ tổng hợp kháng sinh Novobiocin
Con đường chung mô tả cơ chế sinh tổng hợp
đuờng deoxy–hexose từ glucose–1–phosphate
Cấu tạo đường L–Noviose
Con đường sinh tổng hợp đường dTDP–L–
Noviose (ring C)
Vị trí gen NovU trong cosmid (9–6G)
Vector pET-32a(+)
Trình tự gen NovU
Kết quả so sánh sự tương đồng của gen NovU
với các gen cùng chức năng trên Genbank

Kết quả so sánh tương đồng axit amin của
enzyme NovU với các enzyme cùng chức năng
trên Genbank
Kết quả chạy điện di sản phẩm NovU
được chuyển vào pET-32a(+)
Kết quả điện di các mẫu protein tái tổ hợp ở các
nồng độ IPTG khác nhau
Kết quả điện di các mẫu protein tái tổ hợp ở điều
kiện nhiệt độ khác nhau
Kết quả điện di các mẫu protein tái tổ hợp ở các
điều kiện thời gian khác nhau
11
13
16
18
19
19
22
34
35
36
38
39
41
42
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học đã và đang được ứng dụng vào trong rất nhiều lĩnh
vực như: công nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ

cho mọi nhu cầu của cuộc sống như: dinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sức
khỏe… Bằng những kiến thức sinh học về thực vật, động vật, nấm, vi
khuẩn… và sử dụng “Công nghệ DNA tái tổ hợp” những nhà khoa học đang
cố gắng tạo ra những cây trồng, vật nuôi có năng suất và chất lượng cao,
những loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh con người…
Hiện nay, trên thế giới ngành công nghệ hóa dược đã phát triển lên đến
đỉnh cao. Các công ty dược, công ty công nghệ sinh học đã, đang sản xuất và
bán các loại thuốc có nguồn gốc là các sản phẩm của ngành công nghệ sinh
học, công nghệ protein, công nghệ gen nhờ những ứng dụng của công nghệ vi
sinh và sinh học phân tử.
Xu hướng nghiên cứu về hóa dược hiện nay trên thế giới là nghiên cứu
tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốc đường mới vào gốc
đường cũ của một số nhóm kháng sinh [1]. Vì vậy, các kháng sinh thế hệ mới
có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh được hiện tượng kháng thuốc của vi
khuẩn, đồng thời khả năng thải trừ của thuốc cao hơn.
Hiện nay ở Việt Nam quan tâm nhiều đến nghiên cứu, trong đó gồm
nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng tạo ra kháng sinh thế hệ mới. Vì
vậy nghiên cứu về gen sinh tổng hợp đường dTDP–L–Noviose có ý nghĩa
khoa học và thực tiễn.
Nội dung đề tài: "Nghiên cứu biểu hiện gen NovU tham gia sinh tổng
hợp đuờng khử dTDP–L–Noviose thuộc nhóm gen sinh tổng hợp kháng
sinh Novobiocin"
Mục tiêu đề tài là kiểm tra vector tái tổ hợp có chứa gen NovU và nghiên
cứu biểu hiện gen NovU.
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
1
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh
1.1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh trên thế giới
Giữa thế kỉ XVII, một thầy thuốc hoàng gia Anh đã chữa bệnh bằng cách
dùng rêu đắp lên vết thương. Đến cuối thế kỉ thứ XIX người ta đã chữa lành
các vết thương bằng cách sử dụng các mẫu bánh mì mốc.
Năm 1928, Alexander Fleming (Bệnh viện Saint Mary, London) phát
hiện nấm tiết ra chất có tác dụng diệt khuẩn. Với phát hiện này ông được coi
là người mở ra kỉ nguyên sử dụng kháng sinh trong y học. Ông được trao giải
thưởng Nobel y học năm 1945 cùng với Ernst Boris Chain và Howard Walter
Florey về việc tìm ra và phân tách được penicillin, từ đây penicillin được coi
là loại kháng sinh đầu tiên trong việc điều trị những bệnh nhiễm trùng.
Sulfonamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào năm 1932.
Streptomycin được Selman Waksman và Albert Schatz tìm ra vào năm 1934.
Năm 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey (Đại học Oxford) bắt
đầu nghiên cứu tác dụng điều trị của penicillin [2].
Năm 1939, Chain theo Florey nghiên cứu các tác nhân tự nhiên chống vi
khuẩn do các vi sinh vật sản xuất gây ra và xem xét lại công trình của
Alexander Fleming – người đã mô tả penicillin từ 9 năm trước đây. Từ đó
Chain và Florey quyết định khám phá tác dụng chữa bệnh của penicillin và
thành phần hóa học của nó. Ông cũng tạo ra lý thuyết cấu trúc của penicillin,
và lý thuyết này đã được xác nhận bởi việc xác định cấu trúc trong một tinh
thể bằng phương pháp chiếu tia X ba chiều (X–ray crystallography) do
Dorothy Hodgkin làm. Vì thế Chain, Florey và Fleming đã đoạt giải Nobel
năm 1945.
Ngày 25/05/1940, thử nghiệm tác dụng của kháng sinh thành công trên
chuột. Edward Abraham nghiên cứu điều chế penicillin tinh chất.
Năm 1943, dự án sản xuất penicillin được chính phủ Mỹ đặc biệt chú ý
nghiên cứu thử nghiệm và bước đầu sản xuất.
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
2

Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Đến nay, có hơn 1600 chất kháng sinh được tìm ra nhưng chỉ có khoảng
150 loại được sử dụng rộng rãi (các chất kháng sinh không được sử dụng
phần lớn là do: có tính độc, có tác dụng phụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành
sản xuất cao…)
1.1.1.2 Lịch sử phát triển kháng sinh ở Việt Nam
Ở nước ta kháng sinh đã đánh đấu một bước ngoặt lớn trong công tác
cấp cứu, điều trị chiến thương và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Năm 1950 trong kháng chiến chống Pháp, GS. Đặng Văn Ngữ đã nuôi
cấy Penicillin Chryroylum và dùng chiết môi trường nuôi cấy để điều trị vết
thương cho thương binh.
Năm 1968, bộ môn công nghệ dược của Đại học Dược Hà Nội được
thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh do giáo sư Trương Công
Quyền làm chủ nhiệm được ra đời nhưng sau một thời gian hoạt động không
thành công nên bộ môn này không được duy trì.
Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ),
Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp đỡ sản xuất, điều chế
kháng sinh nhưng sau đó cũng không thành công do nhiều nguyên nhân [3].
Năm 1985 – 1990, một chương trình nghiên cứu Nhà nước 64C – Bộ Y
Tế nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin nhưng
đạt kết quả không cao về cả công nghệ lẫn hiệu suất.
Như vậy, trong một thời gian nghiên cứu cộng tác điều chế sản xuất
kháng sinh gặp rất nhiều khó khăn và chưa thành công. Hiện nay trên thế giới
có khoảng 800 kháng sinh được tìm thấy có nguồn gốc từ vi sinh vật. Và việc
sử dụng kháng sinh không chỉ giới hạn trong lĩnh vực y học mà còn áp dụng
rộng rãi trong chăn nuôi, trồng trọt và công nghiệp thực phẩm.
1.1.2 Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh được định nghĩa theo nhiều cách, theo định nghĩa của
Waskman (1942): “Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được
các vi sinh vật tạo ra có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi

sinh vật khác” [4]. Trong thời đại ngày nay, định nghĩa này đã bộc lộ những
hạn chế, vì chưa nêu ra được những loại kháng sinh bán tổng hợp, kháng sinh
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
3
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
thực vật và các hợp chất hóa học có tác dụng tương tự như kháng sinh. Vì vậy
có thể định nghĩa kháng sinh rộng hơn: “Kháng sinh là tất cả các hợp chất tự
nhiên, tổng hợp và bán tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc
các vi sinh vật gây bệnh mà không có hoặc hầu như không tác dụng lên
người, động vật và thực vật” [5].
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các
kháng sinh ngày càng nhiều thêm, có nhiều cơ sở để phân loại kháng sinh, có
thể dựa vào phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, vào nguồn gốc, con đường sinh
tổng hợp hay theo cấu trúc hóa học. Dưới đây là cách phân loại dựa theo cấu
trúc hóa học. Theo cách này kháng sinh có 9 nhóm chính [4]:
1. Các kháng sinh cacbonhydrat
Các saccarid thuần nhất như nojirimycin
Các aminoglycosid như streptomycin
2. Các lacton macrocylic
Các kháng sinh macrolid như erythromycin
Các kháng sinh polyen như nystatin
3. Các kháng sinh quinon và dẫn xuất
Các tetracylin như tetracylin
Các antracylin như adriamycin
4. Các kháng sinh peptid và acid amin
Các dẫn xuất axit amin như cycloserin
Các kháng sinh β–lactam như penicillin
5. Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
Các kháng sinh nucleotid như polyoxin

6. Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
Kháng sinh polyete monenzin
7. Kháng sinh mạch vòng no
Các dẫn xuất alkan cycloheximid
Kháng sinh steroid như axit fuzidic
8. Các kháng sinh chứa nhân thơm
Các dẫn chất benzen như chloramphenicol
Các chất nhân thơm ngưng tụ như griseofulvin
Các ete thơm như Novobiocin (kháng sinh được nghiên cứu
trong đề tài này)
9. Các kháng sinh mạch thẳng
Các kháng sinh chứa photpho như photphomycin
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
4
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Gồm có 6 cơ chế chính:
1. Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp thành tế bào vi khuẩn
Quá trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn gồm rất nhiều phản ứng với
các bước khác nhau như sau:
- Sự tổng hợp UDP–N–acetyl–muramyl–pentapeptid.
- Tổng hợp các đơn vị peptidoglycan (murein).
- Nối các đơn vị peptidoglycan với nhau qua phản ứng xuyên mạch
peptid tạo không gian ba chiều sẽ được một mạng lưới dày đặc, tức màng vi
khuẩn. Trong quá trình xuyên mạch phải có sự tham gia của enzyme
transpeptidase. Các thuốc kháng sinh sau khi khuếch tán vào dịch thể tổ chức
mô bào chúng sẽ kết hợp với enzyme transpeptidase tạo phức nhầm với kháng
sinh bền vững không hồi phục, phức này sẽ cản trở phản ứng xuyên mạch
peptid của vi khuẩn [6]. Vi khuẩn lúc này vẫn tiếp tục tổng hợp protein nhưng
vỏ bị dị dạng.

2. Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp màng tế bào vi khuẩn
Màng của tế bào vi khuẩn gồm các thành phần chính:
- Murein chủ yếu ở Gram (+) (các đơn vị peptidoglycan)
- Polysaccarid, Protein, Lipoprotein: có chủ yếu ở Gram (–) và
Lypopolysaccarid.
Các thành phần này gắn kết với nhau hài hòa để tạo nên màng tế bào vi
khuẩn đặc biệt chú ý đến Murein đã tạo nên những polymer dạng lưới. Các
kháng sinh đã làm cản trở sự hình thành các dạng lưới này. Ví dụ:
+ Penicillin, Baxi tranxin vô hiệu hóa enzyme Transpeptidase (là
enzyme chuẩn bị Murein để xây dựng nên màng vi khuẩn) làm cho việc tu bổ
màng tế bào vi khuẩn bị ngừng trệ.
+ Vancomycin đã cản trở quá trình tạo nên màng lưới Mureinpolymer do
kháng sinh gắn chặt với Alanindipeptid (là một chất quan trọng trong quá
trình này).
+ Chloramphenicol là dày không cân đối, tạo nên những u ở thành vỏ vi
khuẩn. Gentamycin làm đông đặc biến dạng thành vỏ vi khuẩn [6].
+ Các nhóm kháng sinh ức chế chức năng của màng tế bào gồm có:
colistin, polymycin, gentamycin, amphoterricin [4]. Kháng sinh sẽ làm mất
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
5
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
chức năng của màng tế bào cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị
thoát ra ngoài.
3. Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp Protein của vi khuẩn
Các kháng sinh làm rối loạn và ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn ở
mức ribosome. Vi khuẩn không tạo nên các chất tham gia vào quá trình phân
chia di truyền của tế bào. Kháng sinh gắn vào các tiểu phần 30s, 50s và 70s
của ribosome trong tế bào vi khuẩn làm cho quá trình tổng hợp của protein
không diễn ra.
Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30s của robosome

làm cho quá trình dịch mã không chính xác.
Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50s của ribosome ức chế
enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi
polypeptide.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50s của ribosome
làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên trong chuỗi
polypeptide [6].
Nhóm kháng sinh tác dụng lên hệ thống enzyme có chức năng điều hòa
quá trình sinh tổng hợp protein. Theo cơ chế này, mỗi một loại kháng sinh sẽ
tác động vào các giai đoạn khác nhau của quá trình sinh tổng hợp đó.
Ví dụ như: Tetracycline, Gentamycin đã cản trở vận chuyển
phenylalaline làm giảm ái lực của tRNA với các acid amin. Chloramphenicol
và Puromycin lại tác động vào giai đoạn cuối của aminoacetyl–adenul–là chất
gắn vào tRNA, làm cho tRNA không vận chuyển được các acid amin [4].
4. Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp DNA của vi khuẩn
Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic.
Nhóm refampin gắn với enzyme polymerase ngăn cản quá trình sao mã
tạo thành mRNA (RNA thông tin).
Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai
mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn, làm ngăn cản quá trình nhân đôi
của DNA.
Nhóm Sulfomide có cấu trúc giống PABA (p–aminobenzoic acid) có tác
dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleic.
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
6
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Nhóm trimethoprim tác động vào ezyme xúc tác cho quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic.
5. Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp axit Folic
Tác động lên tổng hợp Folate coenzyme.

Ví dụ: Sulfamethaxozol, Rifamycin…
6. Kháng sinh ức chế một số quá trình sinh tổng hợp khác
1.1.5 Ứng dụng của kháng sinh
a. Các penicillin
Các penicillin là nhóm kháng sinh đầu tiên được phát hiện ra. Ban đầu
được chiết suất từ nấm Penicillin. Hiện nay được tổng hợp từ một số loại hóa
chất khác.
Các dòng penicillin gồm có:
- Penicillin G và penicillin V: Hai loại được tổng hợp đầu tiên.
- Aminopenicillin: Là penicillin bán tổng hợp gồm có ampicillin,
amocillin…
- Các penicillin kháng enzyme penicillinase: Như axacillin, methicillin,
chloxacillin…
- Penicillin chuyên dùng để điều trị vi khuẩn nhóm Pseudomonas: như
piperacillin, carbercillin, ficarcillin…
b. Các cephalosporin
Gồm 4 thế hệ: I, II, III, IV.
Thế hệ I, II chủ yếu điều trị các vi khuẩn Gram (+), thế hệ III, IV chủ
yếu điều trị vi khuẩn Gram (–).
- Các penicillin kết hợp chất ức chế enzyme β–lactamase.
- Nhóm tetracycline gồm: tetracyclin, oxytetracycline,
chlorotetracycline, cloxycyclin…
- Nhóm chloramphenicol như: chlocid, chloramphenicol…
- Nhóm macrolide gồm: erythromycin, spiramycin, azthromycin,
rovamycin, tylosin…
- Nhóm lincoxinamide: lincoxin
- Nhóm aminoglycosid: streptomycin, neomycin…
- Nhóm quinolon: ciprofloxacin, ciprofloxacin–d8, oxolinic acid,
danofloxacin, enrofloxacin, difloxacin, sarafloxacin, ofloxacin, norfloxacin…
c. Các aminosid

Có từ nguồn gốc vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên vi khuẩn
Gram (–), theo nguồn gốc vi sinh có thể chia ra:
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
7
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
- Thuốc chiết xuất từ nấm Streptomyces như: streptomycin,
dihydrostreptomycin, kanacycin, neomycin, paramomycin…
- Thuốc chiết xuất từ Microspora: Gentamycin, Sirimycin…
Sau này, khi thay đổi cấu trúc của các hợp chất tự nhiên nói trên người ta
thu được các thuốc bán tổng hợp như: Amikacin, Netilmycin, Dibekacin…
d. Các chloramphenicol (phenicol)
Nhóm này bao gồm 2 kháng sinh:
- Chloramphenicol: Thường được gọi là Chlorocid, được phân lập từ
nấm Streptomyces venezaclae, nay sản xuất bằng phương pháp tổng hợp toàn
phần. Có tác dụng điều trị bệnh thương hàn và sốt phát ban do Rickettsia (là
tác nhân truyền bệnh rận, chấy).
- Thiamphenicol: Là dẫn xuất của Chloramphenicol, khi thay thế gốc
Nitro bằng gốc Metylsulfon, dung nạp tốt hơn Chloramphenicol.
e. Các tetracycline
Các tetracycline có hoạt phổ rộng (các vi khuẩn Gram (+) và Gram (–),
Rickettsia, xoắn khuẩn…). Chỉ định điều trị bằng cách kết hợp với các kháng
sinh khác để điều trị các bệnh: Brucella, tả, sốt định kỳ, lậu cầu, giang mai,
viêm đường tiêu hóa, sốt rét…
Các Macrolide là kháng sinh có hoạt phổ kháng khuẩn rộng, có tác dụng
mạnh hơn trên Gram (–), nhóm này hầu hết được thải trừ qua thận. Độc tính
trên thận (gây độc tử ống thận cấp) và thính giác (gây ù tai, điếc) nếu dùng
kéo dài các thuốc của nhóm như: gentamycin, novomycin… các thuốc này
hầu hết không hấp thu qua đường tiêu hóa, nếu dùng điều trị nhiễm khuẩn
toàn thân thì phải dùng dạng tiêm.
1.2 Novobiocin

1.2.1 Kháng sinh Novobiocin
Novobiocin thuộc nhóm amino caumarin được sinh bởi chủng xạ khuẩn
Streptomyces spherodes có tác dụng rất hiệu quả trong điều trị các bệnh bị
nhiễm bởi nhóm vi khuẩn Gram (+) như Staphyloccus spp., Streptococus
spp., đồng thời có khái niệm kháng lại với các enzim thuộc nhóm β–lactamase
[7]. Hiện nay Novobiocin đang được sử dụng để bào chế kháng sinh dùng
điều trị một số bệnh cho đại gia súc.
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
8
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Novobiocin là loại kháng sinh có thể coi như giữ kỉ lục về số lần phát
hiện nhiều nhất. Đầu tiên, vào năm 1955, nó được mô tả độc lập dưới cái tên
Cathomycin (Cathocin, Mer) và Streptonivicin (Albamycin, Upjohn). Cùng
lúc đó, hãng dược phẩm Pfizer cũng đã tìm ra và được công nhận qua hai loại
thuốc và tên của họ kháng sinh là Novobiocin, đã được chấp thuận vào năm
1956 [8].
Vài tháng sau, một loại kháng sinh được tách ra bởi các nhà khoa học ở
Lepetit, được phát hiện từ Streptimycete trong một mẫu đất lấy ở Rome, cũng
cho kết quả là Novobiocin.
Vào năm 1958, Nhật Bản cũng đưa ra bằng chứng về một loại kháng
sinh chưa được định rõ đặc điểm. Griseo Havin, mà họ tìm ra từ vài năm
trước và đã được mô tả vào năm 1953, tại Đại Học Tohoku ở Sendai – Nhật
Bản. Loại kháng sinh này là sản phẩm của Streptomyces griseoflavus và kết
luận là có cùng đặc điểm với Novobiocin.
1.2.2. Cơ chế tác dụng của Novobiocin
Novobiocin có khái niệm kìm hãm quá trình tổng hợp DNA của vi khuẩn
bởi sự tương tác của thuốc với tiểu phần B của E.DNA gyrase (GyrB),
enzyme này có tác dụng tham gia quá trình cắt và nối DNA vòng để hình
thành siêu xoắn (suppercoils) hoặc tham gia sửa chữa lỗi sao chép của quá
trình tổng hợp DNA của nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào đơn giản

(prokaryotes) [7].
1.2.3. Cấu tạo kháng sinh Novobiocin
Về cấu tạo, Novobiocin bao gồm 3 tiểu phần, gốc người khử Noviose
(ring C), gốc counmarin (ring B) và gốc acid prenylated–4–hydroxylbenzoic
(ring A) (Hình 1.1) [9].
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
9
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
(Systematic (IUPAC) name: 4-Hydroxy-3-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-
enyl)benzamido]-8-methylcoumarin-7-yl 3-O-carbamoyl-5,5-di-C-methyl-α-l-
lyxofuranoside)
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của kháng sinh Novobiocin
Trong đó gốc đường Noviose có tác dụng tăng tính tan của thuốc và tăng
sự tương tác của thuốc với tác nhân gây bệnh, Ring A và Ring B có vai trò
chính trong quá trình gây bắt hoạt chức năng của enzime tại trung tâm hoạt
động enzyme DNA gyrase [10] (Hình 1.1).
1.2.4 Các nghiên cứu về kháng sinh Novobiocin
Năm 2000, nhóm gen tham gia vào đường sinh hóa tổng hợp Novobiocin
đã được tách dòng thành công bởi nhóm nghiên cứu M.Steffensky và các
cộng sự. Toàn bộ DNA với tổng số 26.5 kb và 23 gen (ORFs) nằm trên hệ gen
của xạ khuẩn Streptomyces spheroides sản phẩm NCBI 11891 [1] đã được
giải trình tự và công bố trên ngân hàng gen (genbank – NCBI).
Bằng cách so sánh trình tự với các gen tương tự trên ngân hàng gen tất
cả chức năng của từng ORF trong nhóm gen đó đã được dự đoán. Tuy nhiên
để chứng minh chức năng này cần có các nghiên cứu tiếp theo bằng các
nghiên cứu thực nghiệm [1].
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
10
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Theo như công bố của nhóm nghiên cứu CTWalsh năm 2008 và các

cộng sự, gốc coumarin là gốc chính tương tác với enzime gyrase của vi khuẩn
và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chỉnh. Gốc này được bắt đầu tổng hợp từ
tyrosin dưới sự xúc tác của các enzime được tạo ra từ NovH, NovJ, NovK và
cuối cùng được kết thúc bằng hoạt tính của enzyme NovH (Hình 1.2).
Các gen này được tác dòng chứng minh hoạt tính bằng phương pháp gây
đột biến, ngoài ra gen tách dòng được biểu hiện trên vật chủ Ecoli các enzyme
được tinh sạch và chứng minh hoạt tính bằng phương pháp khối phổ.
Nghiên cứu về nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp Novobiocin
từ Streptomyces spheroides sản phẩm được Heide và cộng sự thể hiện năm
1999 và công bố năm 2000 đã xác định được 23 ORFs và hơn 11 ORFs khác
có khả năng đóng vai trò trong quá trình sinh tổng hợp Novobiocin.
1.2.5 Ứng dụng của Novobiocin
Novobiocin là một kháng sinh chống lại sự hoạt động của staphy lococus
epidermidis và có thể đã được dùng để nhận biết vi khuẩn Coagulase–
Negative Staphylococcus saprophyticus (một vi khuẩn kháng lại được với
Novobiocin). Trong nuôi cấy, Novobiocin được đặt và dùng với cái tên
Albamycin (Pharmacia And Upjpohn) năm 1960. Hậu quả của nó đã được
chứng minh thử nghiệm trong các thuốc điều trị bệnh. Novobiocin có hiệu lực
trong điều trị Methicillin Resistant Staphyloccus Aureus (MRSA).
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
11
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Hình 1.2. Sơ đồ tổng hợp kháng sinh Novobiocin [1]
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
12
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
1.3 Đường khử
1.3.1 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh
Đường khử là gốc đường đặc biệt được tìm thấy rất nhiều trong cấu trúc
tế bào vi khuẩn, trong tế bào nấm, trong cấu trúc của rất nhiều các chất có

hoạt tính sinh học và trong thành phần cấu trúc của rất nhiều thuốc kháng
sinh hay các chất chống ung thư [2].
Về cấu tạo các chất đường khử là chất mà trong phân tử của chúng có
một hay nhiều hơn một nhóm hydroxyl (–OH) được thay thế bởi nguyên tử H
hay các nhóm chức khác như amino, methyl, alkyl… Các loại đường khử này
có thể tồn tại ở dạng đường đơn hay đường đa hoặc phân nhánh và là dẫn xuất
của các sản phẩm trao đổi chất bậc 2 trong các hợp chất tự nhiên [10].
Trong các chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai trò quan trọng
đối với xác định hoạt tính của các chất này, có rất nhiều các nghiên cứu đã
chứng minh rằng các chất hoạt tính sinh học sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính nếu
như gốc đường trong cấu trúc bị loại bỏ [12].
Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật đường khử tham gia tạo thành cấu trúc
peptidoglycon là thành phần của lớp thành tế bào của rất nhiều loài vi sinh vật
đặc biệt là một số vi khuẩn gram (+) hoặc hình thành lớp lipopolyscharide
trong cấu trúc màng tế bào của nhóm gram (–).
1.3.2 Một số nghiên cứu về gốc đường khử
Theo như nghiên cứu [1] gốc đường khử trong nhóm kháng sinh enedine
có vai trò quyết định hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng khuẩn, nghiên cứu
cho thấy gốc đường rhamnose trong kháng sinh calicheamicin đóng vai trò
làm cầu nối liên kết phân tử kháng sinh với enzyme tham gia vào quá trình
sao mã hay sinh tổng hợp mRNA.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gốc đường khử trong nhóm kháng sinh
macrolide như erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai trò trong gắn
kháng sinh này với các enzyme tham gia tổng hợp protein của vi khuẩn [13].
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
13
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Việc nghiên cứu vai trò của gốc đường đã chỉ ra rằng nếu mất đi gốc
đường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật sẽ gây ức chế sự sinh
truởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật [12].

Xu hướng nghiên cứu về hoá dược hiện nay trên thế giới đó là nghiên
cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốc đường mới vào
gốc đường cũ của một số nhóm kháng sinh [1].
Vì vậy kháng sinh thế hệ mới này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn,
tránh đựơc hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đồng thời khả năng thải trừ
của thuốc nhanh hơn.
1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử trong tế bào vi sinh vật
Hầu hết đường khử trong cấu trúc kháng sinh đựợc sinh ra từ vi sinh vật
là đường 6–deoxyhexose. Tiền chất đầu tiên tham gia quá trình sinh tổng hợp
các gốc đường này đều bắt đầu từ glucose–1–phosphate.
Qua một chuỗi các phản ứng sinh hoá trong tế bào được xúc tác bởi
nhóm enzyme và kết quả là tạo ra được gốc đường khử có thể 1 hay nhiều
hơn 1 nhóm OH bằng các nguyên tử H, nhóm –CH
3
, nhóm =O, hay nhóm
CHO– (Hình 1.3).
Các vị trí đánh dấu chỉ ra vị trí có thể có các nhóm chức hay các nguyên
tử khác thay thế cho gốc OH của phân tử đường để hình thành nên các cấu
trúc đường khác nhau.
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
14
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
O
HO
HO
OH
OH
OPO
-
3

O
HO
HO
OH
OH
OdTDP
O
O
HO
OH
OdTDP
H
3
C
C
3
* epimeration
* deoxygeneration
* O-methylation
* C- methylation
* Transamination
* N-demethylation
* Ketoreduction
NDP
4

keto
deoxyglucose
6
C

4
*
Deoxygeneration
*
O-methylation
*
Transamination
*
Ketoreduction

C
5
* epimeration
* C-methylation
C
2
* Deoxygeneration
* O-methylation
NDP-D-hexose sythase
NDP-D-hexose-4,6-dehydratase
Hình 1.3. Con đường chung mô tả cơ chế sinh tổng hợp đuờng deoxy–hexose
từ glucose–1–phosphate
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
15
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
1.3.4 Đường khử trong cấu trúc Novobiocin
Đường khử là chất trong phân tử của nó có nhiều hơn một nhóm
hydroxyl (–OH) được thay thế bởi nguyên tử hidro hoặc các nhóm chức:
amino, methyl, alkyl… Đường khử tồn tại ở dạng đường đơn hoặc đường đa
hoặc phân nhánh là dẫn suất bậc hai trong hợp chất tự nhiên. Đường khử xác

định hoạt tính của các chất có hoạt tính sinh học, nếu mất gốc đường trong
cấu trúc thì hoạt tính sinh học cũng mất.
Đường khử tham gia vào thành phần cấu trúc peptidoglycon, một số loại
vi sinh vật, đặc biệt vi khuẩn gram dương (+), thành cấu trúc
lipopolysacharide mành tế bào vi khuẩn gram âm (–). Đường khử trong nhóm
kháng sinh enedine có vai trò quyết định hoạt tính kháng khuẩn của chất
kháng khuẩn. Đường khử trong nhóm kháng sinh macrolide gắn kháng sinh
với enzyme tham gia tổng hợp protein của vi khuẩn.
Các nhà khoa học nhận thấy nếu mất đi gốc đường khử trong cấu trúc tế
bào gây ức chế sự trưởng thành của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật.
1.4 Nghiên cứu về NovU
1.4.1 Đường dTDP–L–Noviose
Đường Noviose là một trong ba nhóm cấy trúc kháng sinh Novobiocin.
Đường Noviose là đường khử có nhóm –TDP gắn với gốc –O tại vị trí C
1
, hai
nhóm –CH
3
gắn tại vị trí C
5
. Còn lại là các nhóm –OH được gắn tại vị trí C
2
,
C
3
và C
4
(Hình 1.4). Trong các kháng sinh đại phân tử thì gốc đường khử có
vai trò vô cùng quan trọng trong việc tăng tính tan của chúng trong dung môi
và tăng khă năng tương tác của thuốc với tác nhân gây bệnh và đôi khi gốc

đường còn có vai trò chính gây bất hoạt khả năng gây bệnh của tác nhân gây
bệnh. Trong đó gốc đường Noviose (Ring C) có vị trí rất lớn trong việc xác
định phổ kháng khuẩn của gốc coumarin bởi ba nhóm methyl trong phân tử
đường và chính phân tử Noviose giúp cho gốc coumarin của kháng sinh này
tương tác tốt hơn với enzyme gyrase (GyrB) [9].
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
16
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Hình 1.4. Cấu tạo đường L–Noviose
1.4.2 Con đường sinh tổng hợp đường dTDP–L–Noviose
Quá trình sinh tổng hợp đường Noviose được bắt đầu từ đường Glucose–
1–phosphate dưới sự hoạt động của enzyme dTDP–glucose synthase NovV,
sự xúc tác của enzyme dTDP–D glucose–4,6–dehydeatase NovT để hình
thành dTDP–4–keto–6 deoxyglucose như một chất trung gian trong con
đường sinh tổng hợp phần lớn đường deoxy từ dTDP–D–glucose. Quá trình
đồng phân hóa dTDP–4–keto–6 deoxyglucose 3,5–epimerase được mã hóa
bởi NovW.
Bước tiếp theo trong quá trình sinh tổng hợp Noviose là quá trình methyl
hóa tại C
5
bởi enzyme 5–methyltransferase được mã hóa bởi NovU, sự khử
C
4
cacbonyl cacbon được thể hiện bởi enzyme 4–ketoreductase được mã hóa
bởi NovS và enzyme O–methyltransterase được mã hóa bởi NovP. Sự gắn
đường deoxy vào phân tử coumarin trong kháng sinh coumarin và vào
aglycons trong những kháng sinh khác bởi enzyme glycosyltransterase trước
khi quá trình methyl hóa vào nhóm 4–hydroxyl của vòng pyranose.
Những giả thuyết về chức năng của protein được mã hóa bởi NovW,
NovS, NovV được đưa ra bởi sự so sánh về độ tương đồng của trình tự acid

amin đã biết và được đăng kí trên ngân hàng gen thế giới [11]. Tuy nhiên để
chứng minh chức năng của các gen này bằng các nghiên cứu thực nghiệm và
các phương pháp nghiên cứu khác nhau thì chưa thực hiện được.
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
17
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Để khám phá chức năng của các sản phẩm của gen NovW, NovS, NovU
trong quá trình sinh tổng hợp đường Noviose. Chúng tôi đã clined và biểu
hiện những gen này trong E.coli và tiến hành các thí nghiệm kiểm tra những
đặc tính đã biểu hiện.
Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp đường dTDP–L–Noviose (ring C)
1.4.3 Gen NovU
Trong con đường sinh tổng hợp đường noviose (Ring C) của kháng sinh
Novobiocin có sự tham gia của 5 gene bao gồm: NovV, NovT, NovW, NovU,
NovS [10]. Vị trí của gene NovU trong một phần bộ gene tham gia quá trình
sinh tổng hợp Novobiocin được thể hiện dưới hình 1.6.
Hình 1.6. Vị trí gen NovU trong cosmid (9–6G)
Mặc dù đã xác định được trình tự từng gen trong mỗi bước, nhưng chưa
biết được chức năng cụ thể của mỗi gen. Qua nghiên cứu này sẽ đưa ra được
dự đoán về chức năng của gen NovU trong quá trình sinh tổng hợp đường
Noviose.
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
18
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Gen NovU được tìm thấy trong bộ gen của một số loài xạ khuẩn như:
Streptomyces roseochromogenes sub sp., Streptomyces caeruleus. Trong
cosmid (9–6G) được cung cấp, gen NovU có độ dài 1.2 kb.
Theo dự đoán con đường sinh tổng hợp đường Noviose thì gen NovU có
thể có chức năng C–Methyltransferase, gắn một nhóm –CH3 vào vị trí C
5

của
phân tử đường [1]. Vai trò C–Methyltransferase của một số gen thì đã có
nhiều nghiên cứu và công bố trên ngân hàng gen, để so sánh gen NovU với
gen có chức năng C–Methyltransferase thì cần tách dòng gen NovU từ cosmid
(9–6G) và giải trình tự, sau đó so sánh với các gen được cho là có cùng chức
năng. Nếu tương đồng về trình tự nucleotid và các acid amin thì có thể kết
luận được chức năng gen NovU.
1.5 Vector pET-32a(+)
Vector pET-32a(+) cơ bản là một plasmid có 5899 bp. Vector pET-
32a(+) được thiết kế cho nhân dòng vô tính và biểu hiện ở cấp độ cao chuỗi
trình tự peptide nối với protein thioredoxin 109aa Trx.Tag™. Vị trí tách dòng
được dùng gắn gen biểu hiện là fusionproteins, bao gồm chuỗi 6xHis.Tag
dùng để phát hiện và tinh sạch protein của gen cần biểu hiện. Vị trí duy nhất
để chuyển gen được biểu hiện trên vector. Vùng biểu hiện hay vùng cloning
của gen cần biểu hiện được gắn với T7 promotor, đây là promotor mạnh giúp
cho điều tiết tăng cường quá trình tổng hợp protein [14].
Trong chức năng của vector pET-32a(+) thì trình tự 6xHis.Tag là trình tự
rất đáng chú ý, có ý nghĩa quan trọng trong việc tinh sạch protein biểu hiện.
Chuỗi 6xHis.Tag nằm từ vị trí Nu 327 đến 344, gồm 18 nucleotide. Sau khi
chuyển gen cần biểu hiện vào vị trí này, trình tự 18 Nu này sẽ nằm trên liền
kề với phần đầu của gen cần biểu hiện.
Chuỗi 6xHis.Tag mã hóa cho 6 acid amin histidin, gen chuyển vào mã
hóa cho protein mong muốn. Sau khi chuyển sẽ được sản phẩm: 6-aa-histidin
+ protein mong muốn. Một điều đặc biệt là trình tự 6 acid amin histidin tích
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
19
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
điện (–) và nó gắn với protein sản phẩm của gen cần biều hiện. Vì vậy khi
tinh sạch dựa vào đặc tính này người ta sẽ đưa sản phẩm vào môi trường có
điện tích (+) để tinh lọc sản phẩm [15] [16].

Bố trí thiết kế vector pET-32a (+) gồm có:
- Promoter T7 : 764–780 (Nu)
- T7 transcription start : 763 (Nu)
- Trình tự coding 6His.Tag : 327–344 (Nu)
(6His.Tag có chứa 6 acid amin histidin được sử dụng để tinh sạch
Protein)
Vị trí chuyển gen
(Nco I - Xho I) 158–217 (Nu)
Trình tự coding His.Tag 140–157 (Nu)
T7 terminator 26–72 (Nu)
Trình tự coding LacI 1171–2250 (Nu)
Điểm khởi đầu pBR322 3684 (Nu)
Trình tự coding bla 4445–5302 (Nu)
Điểm khởi đầu fl 5434–5889 (Nu)
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
20
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
Hình 1.7. Vector pET-32a(+)
CHƯƠNG II
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
21
Khóa luận tốt nghiệp Lê Văn Thịnh – Lớp 08.01
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Hóa chất
- Enzyme giới hạn, enzyme RANase.
- Cao nấm men, trypton, NaCl, agar dùng trong môi trường nuôi cấy vi
sinh vật.
- Đĩa peptri nuôi vi khuẩn.
- Ống fancol 15ml, 50ml, ống eppendorf.

- Bình tam giác 250ml để nuôi cấy vi sinh vật.
- Pipette, đầu côn, nút bông, tăm.
- Kháng sinh ampicillin.
- TE buffer để tách ly tâm.
- Cồn 96
0


và cồn 70
0
sử dụng trong khử trùng và vệ sinh.
2.1.2 Thiết bị
- Nồi hấp: vô trùng môi trường, dụng cụ
- Tủ cấy UV dùng trong nuôi cấy vi sinh vật.
- Tủ lắc để nuôi cấy môi trường lỏng.
- Tủ lạnh, tủ đông dùng trong bảo quản môi trường, vi sinh vật.
- Máy lắc vortex: dùng lắc, trộn, hoà tan dung dịch.
- Máy ly tâm: ly tâm thu tế bào.
- Máy chạy điện di:
+ Máy chạy điện di DNA
+ Máy chạy điện di protein.
- Lò vi sóng, bếp từ… dùng trong chạy điện di.
- Bình ổn nhiệt
- Cân điện tử.
2.1.3 Chủng vi sinh vật
- Chủng Chủng vi khuẩn E.coli XL1–Blue MRF (Stratagene, Mỹ) được
sử dụng là vật chủ chuẩn bị plasmid tái tổ hợp và thao tác ADN.
- Chủng vi sinh vật E.coli BL21 DE3 (Hàn Quốc) là vật chủ biểu hiện
plasmid chứa gen NovU.
2.1.4 Vector và Plasmid tái tổ hợp

Tên Đặc điểm Nguồn tham khảo
pET-32a(+) Vector biểu hiện trong E.coli
T7 promoto; Amp
r
Công ty Novogen,
Hàn Quốc
Viện Đại Học Mở Hà Nội – Khoa Công nghệ sinh học
22