Đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị phân tử RAPD - PCR và khả năng sinh tổng hợp sinensetin ở loài cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu ở Việt Nam Orthosiph105042

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC Tự NHIÊN
____________
Q
____________
ĐỀ TÀI NGHIÊN c ú u KHOA HỌC
ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỂN n h ờ c h ỉ t h i p h â n t ử
RAPD-PCR VÀ KHẢ NĂNG SINH TổNG HỢP SINENSETIN ở LOÀI
CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG XUÂT KHAL ớ v i ệ t n am
ORTHOSIPHON STAMINEƯS BENTH.
(BÁO CÁO TỔNG HỢP)
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Duy Thành
Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội
Hà Nội, 3 - 2007
Để tài này được hoàn thành với sư tài trợ cua
Đại hoc Quốc gia Hà Nội (Mã sỏ: QG.04.28)
TÓM TẮT
ĐỂ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
Tên Đề tài: "Đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ chí thị phân tử RAPD-PCR
và khả năng sinh tổng hợp sinensetin ở loài cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu
của Việt Nam Orthosiphon stamineus Benth.".
Chủ nhiệm đ ề tài: PGS.TS. Lê Duy Thành
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN.
Cơ quan phối hợp thực hiện: Viện Dược Liệu, Bộ Y tế.
Mục tiêu và nội dung của Để tài
Đ ề tài được thực hiện với các mục tiêu chính như sau: (1) Thu thập
được ít nhất 10 dòng Râu mèo từ một số địa phương khác nhau ở Việt
Nam; (2) Xác định khoảng cách (mối quan hệ) di truyền giữa các quần
thể mẫu bằng việc phân tích chí thị RAPD-PCR; (3) Phân tích được sự
biến động về thành phần hợp chất có hoạt tính sinh học sinensetin từ các

mẫu thu thập được nhằm chọn ra dòng Râu mèo có hàm lượng dược
chất sinensetin cao phục vụ công tác bảo tồn và phát triển nguồn
nguyên liệu làm thuốc; (4) Bước đầu đề xuất một số phương án bảo tổn,
chọn, tạo giống nhằm phát triển nguồn nguyên liệu làm thuốc từ cây
Râu mèo ở Việt Nam trên cơ sở kết quả đánh giá tính đa dạng di truyền
nhờ sử dụng chỉ thị RAPD-PCR.
Các nội dụng nghiên cứu của đề tài gồm có:
(1) Điều tra và thu thập
mẫu thực vật từ các quần thế Râu mèo 0
Oríhosiphon stamìneus
Benth.)
từ một số địa phương khác nhau ớ Việt Nam phục vụ cho các nghiên
cứu phân tích về cấu trúc ADN và thành phần hóa học, (2) Nshiên cứu
hoàn thiện quy trình tách chiết ADN, và phán tích chi thị RAPD-PCR
loài cây thuốc Râu mèo ở Việt Nam. (3) Nghién cứu hoàn thiên quy
trình chiết xuất và phân tích thành phần sinensetin từ Orthosiphon
sĩamineus Benth. bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp RP-HPLC. (4) Xác
định mức độ khác biệt (đa dạng) vể mặt di truyền và thành phần
sinensetin giữa các quần thể Orthosiphon stamỉneus Benth. của Việt
Nam nhằm định hướng bảo tổn, chọn, tạo giống và phát triển loài cây
thuốc quý này ở Việt Nam trong tương lai.
- Kết quả khoa học: Đã thu thập được 10 dòng Râu mèo (Orthosiphon
stamineus Benth.) trồng tại các địa phương khác nhau ở Việt Nam (Hà Nội,
Thanh Hóa, Phú Thọ, Quảng Nam). Kết quả phân tích RP-HPLC cho thấy
dược chất sinensetin có mật trong dịch chiết lá của tất cả các dòng Râu mèo
thu thập được. Tuy vậy, hàm lượng hợp chất này rất dao động, từ 0,002% đến
0,188% (hàm lượng chất khô). Sinensetin cũng có trong thân, nhưng chỉ ở
hàm lượng vết (thấp hơn khoảng 30 lần so với lá). Trên cơ sở kết quá phân
tích RP-HPLC đã chọn lọc được dòng TH0 (thu ở Thanh Hóa) có hàm lượng
sinensetin cao nhất.

- Đã xây d ự n g được quy trình tách chiết ADN và phân tích chỉ thị RAPD-PCR
nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền và xác định khoáng cách di truyền
giữa các dòng Râu Mèo khác nhau được thu thập trong nghiên cứu. Kết quá
phân tích cho thấy các dòng Râu Mèo hiện có ở miền Bắc nước ta có tính đa
dạng di truyền không cao và tương quan với vị trí phân bố ở các địa phương.
- Không có sự tương quan chặt giữa sự biến động về hàm lượng sinensetin và
sự khác biệt về mặt di truyền của dòng Râu Mèo khác nhau cho thấy có thê
các yếu tố môi trường đã có ảnh hưởng trực tiếp (bên cạnh yếu tố về kiểu
gen) đến khả năng tổng hợp và tích lũy sinensetin ở cây Râu Mèo.
Kết quả nghiên cứu của đề tài đổng thời khẳng định: mô hình sử dụng
các kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử (ADN), hóa học và một số biện pháp
công nghệ sinh học, như nuôi cấy mô thực vật in vitro có thế được áp dung
nhằm mục đích bảo tồn. phát triển neuồn gen cây dược liệu và tiêu chuẩn
hóa nguồn nguyên liệu làm thuốc từ các loài tháo dược ơ Việt Nam trong
tương lai.
-
Kết quả ứng dụng: Thiết lập được 01 quy trình kỹ thuật chiết xuất và phán
tích dược chất sinensetin từ các dòng Râu mèo ở Việt Nam. 01 quv trình
2. Kết quả
IV
phân tích chỉ thị ADN từ các dòng Râu mèo ở Việt Nam bàng phương pháp
RAPD-PCR.
- Kết quả đào tạo: Đào tạo được 01 Cử nhân hệ Đào tạo Cứ nhân Khoa học
Tài năng (SV. Trần Tuấn Tú, Khoá 7, tốt nghiệp năm 2006). Đang tiếp tục
đào tạo một NCS Tiến sĩ (ThS. Vũ Hoài Sâm, Khoa Sinh học Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên).
- Kết quả công bố: Đã công bố được 01 bài báo Tiếng Anh trên Tạp chí
Khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội; 02 bài báo Tiếng Anh khác được công
bố trên Tạp chí Khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội có một phần nội dung
liên quan đến đề tài.

3. Tình hình sử dụng kinh phí:
- Số kinh phí đã được cấp: 60.000.000 đồng (Sáu mươi triệu đồng).
- Số kinh phí đã sử dụng : 60.000.000 đổng (Sáu mươi triệu đồnạ).
Đã thanh quyết toán
Khoa quản lý Chủ nhiệm đề tài
PGS.TS. Lê Duy Thành
TRƯ Ờ N G ĐAI H Ọ C K H O A H O C TIT ự N H IÊN
V
SUMMARY
SCIENTIFIC RESEARCH PROJECT
1. Title of project : “Assessment of genetic polymorphism of Vietnamese
exportable medicinal plant Orthosiphon stamineus Benth. using RAPD-PCR
markers in relation with the biosynthesis of sinesetine”
2. Number code: QG.04.28
3. Grant holder: Prof. Dr. Le Duy Thanh
4. Instỉtutỉon: Hanoi University of Science, Vietnam National ưniversity.
Associated institution: Vietnam Institute of Medicinal Materials, Ministry of
Health.
5. Objects and contents of project
Obịects: (1) collection of at least ten accessions of Orthosiphon stamineus Benth.
from different locations in Vietnam; (2) determination of genetic distance of the
population samples using RAPD-PCR markers; (3) analysis of variation of the
content of bioactive compound - sinensetin from the collected samples, in order
to find the accessions which have high content of sinensetin and use for
conservation and development of medical materials resource; (4) first
proposition of some methods for conservation, selection and breeding, aimed for
the development the medical materials from Orthosiphơn stamìneus in Vietnam
and evaluation of the genetic diversity using RAPD-PCR.
Contents:
(1) Investigation and collection of plant samples from populations of

Orthosiphon stamineus
Benth. in different locations oí' Vietnam. which used for
analysis of DNA characterization and chemical compositions; (2) Study for
completion of DNA extraction procedure, analysis of RAPD-PCR markers from
Orthosiphon stamineus Benth.; (3) Study for completion of extraction procedure
and composition analysis of sinensetin from Ortliosiphon stamineus Benth.
using RP-HPLC method; (4) Identification of genetic diversity and variaties of
V I
sinensetin content in Orthosiphon stamineus Benth. from different populations
in Vietnam, aiming to the direction of conservation, selection, breeding and
development of this valuable medicinal plant in Vietnam in future.
6. Results
- Scientific results: (1) Collected ten accessions of Orthosiphon stamineus
Benth., which are plated at different areas in Vietnam (Hanoi, Thanh Hoa, Phu
Tho and Quang Nam). The results of RP-HPLC analysis shovved that sinensetin
exists in extract from leaves of all collected accessions of Orthosiphon
stamineus Benth. However, these contents are variable, from 0.002% to 0.188%
(dry materials). Sinensetin presents in stem, but in trace content (lower 30 times
than that in leaves). Based on results of RP-HPLC analysis, we have collected
the accession TH0 (collected from Thanh Hoa), which has highest sinensetin
content. (2) Designed the DNA extraction and RAPD-PCR analysis procedure,
used for assessment of genetic diversity and identification of genetic distance of
different accessions of Orthosiphon stamineus Benth The results show that
accessions of Orthosiphon stamineus Benth. presenting in Nothern of Vietnam
have low genetic diversity and corresponding to locations of their distibution. (3)
There is no close correspondence betv/een the variation of content of sinensetin
and difference of genetic characteristics of different accesstions of Orthosiphon
stamineus, which reflects the direct affection of environmental factors to
potential of synthesis and acummulation of sinensetin in Orthosiphon stamineus.
The results confirmed that the model of analysis techniques using molecular

marker (DNA), chemical markers and biotechnology as in vitro plant tissue
propagation could be used for conservation, development gene pool of medicinal
plants and standardization of materials from medicinal plants in Vietnam.
- Applied results: Establisment of 01 procedure of extraction and analysis of
sinensetin from Vietnam
Orthosiphon stamineus,
01 procedure of analysis DNA
marker from Orthosiphon stamineus usins RAPD-PCR method.
- Training results: 01 Bachelor (Honor Bachelor Training Program in Biological
Sciences - Tran Tuan Tu, 6lh Course, 2006), 01 PhD student in progress.
- Publications: 01 paper (in English) publised in the Jounal of Science, VNU
(2006); 02 other related papers published also in the Jounal of Science, VNU
(2005 and 2006).
Grant holder
Assc. Prof. Dr. Le Duy Thanh
V111
MỤC LỤC
T rang
Mở đầu 1
1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 4
1.1. Tổng quan về cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) 4
1.1.1. Phân loại học thực vật, phân bố và tên g ọ i 4
1.1.2. Hình thái học thực vậ t 5
1.1.3. Trồng trọt 6
1.1.4. Công dụng trong y học cổ truyền 6
1.1.5. Các hợp chất sinh học đã b iết 7
1.1.5.1. Các hợp chất ílavonoid
7
1.1.5.2. Các hợp chất diterpen 8
1.1.5.3. Các hợp chất kh ác 9

1.1.6. Các nghiên cứu về dược lý học và lâm sàng 10
1.1.7. Các chỉ định sử dụng trong chữa bệnh 13
1.2. Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) và hóa học trong nghiên cứu phát triển
các loài cây dược liệu 15
1.2.1. Giới thiệu chung 15
1.2.2. Chỉ thị ADN và hóa học trong công tác kiểm định dược liệu

17
1.2.3. Chỉ thị ADN trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuôcs

19
1.2.4. Sử dụng các chi thị RAPD-PCR và hóa học trong chọn, tạo giống cây
thuốc 19
1.2.2. Chi thị ADN và hóa học trong công tác kiểm định dược liệ u

17
1.3. Các nội dung nghiên cứu của đề tà i
20
2. Thời gian, địa điểm và phương pháp nghiên cứu
22
2.1. Thời gian nghiên c ứ u 22
2.2. Địa điểm nghiên c ứ u 22
2.3. Phương pháp nghiên cứ u 22
2.3.1. Chuẩn bị mẫu thực vật 22
2.3.2. Các hợp chất sử dụng trong nghiên cứ u 23
2.3.3. Chiết xuất và phân tích thành phần sinensetin băng RP-HPLC

23
2.3.4. Các thí nghiệm phân tích chỉ thị RAPD-PCR 26
3. Kết quả và bàn luận 28

3.1. Kết quả điều tra và thu thập cây Râu Mèo ờ các địa phươns

28
3.2. Phân tích thành phđn sinensetin trong các dòng Râu mèo Việt N a m

31
IX
3.2.1. Chiết xuất và phân tích sinensetin bằng phương pháp R P-H PL C

31
3.1.2. Thành phần sinensetin trong các dòng Râu mèo thu thập ở Việt Nam 32
3.3. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị RA PD -PCR

34
3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng s ố 34
3.3.2. Kết quả phân tích RA PD -PCR 35
3.4. Đề xuất phương án bảo tồn, chọn giống, nhân giống nhằm mở rộng sản xuất
cây Râu M è o 39
4. Kết luận và đề nghị 41
4.1. Kết lu ậ n 41
4.2. Đề n g h ị 42
5. Tài liệu tham kh ả o 43
X
BẢNG CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
ADN
cs.
ED50
FDA
HIV
HPLC

RP-HPLC
LD50
M
MeOH
PCR
RAPD
RAPD-PCR
RP-HPLC
SD
TLC
SE
UV-VIS
Axit deoxyribonucleic
cộng sự
Liều hiệu lực 50%
(.effective dose)
Cơ quan thực phẩm và dược phấm Hoa Kỳ
Virut gây suy giảm miễn dịch ớ người
(human immunodefìciency virus)
Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp
(high per/ormance liquid chromatography)
Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp đảo pha
(reverse-phase high perỷormance liquid chromatography)
Liều gây chết 50%
(,lethal dose)
Mole
Methanol
Phản ứng chuỗi trùng hợp khuếch đại ADN
(polymerase chain reaction)
Đa hình độ dài ADN khuếch đại ngẫu nhiên

(random ampliỷied polymorphism ofD N A )
Giống RAPD
Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp đảo pha
(reverse phase higlì perỷormance liquid chromatographv)
Phương sai tiêu chuẩn
(Standard deviation)
Sắc ký lớp mỏng
(thin lơỵer chromatography)
Sai số tiêu chuẩn trung bình
(.Standard error ofthe means)
Dải ánh sáng vùng cực tím và nhìn thấy
(,uỉtravioìet - visible wavelength)
XI
DANH M ỤC CÁC BẢNG
T rang
Bảng 1. Danh sách và địa điểm các dòng Râu mèo 0Orthosiphon stamineus Benth.)
được thu thập và sử dụng trong nghiên c ứ u
23
Bảng 2. Danh sách các mồi RAPD-PCR được sử dụng trong nghiên c ứ u

26
Bảng 3. Danh sách các địa điểm điều tra và thu thập các dòng Râu mèo tại một số tinh
miền Bắc và tại tỉnh Quảng N am 28
Bảng 4. Hàm lượng sinensetin trong các dòng Râu mèo thu thập ở Việt N a m

33
Bảng 5. Dịch chiết ADN tổng số thu được từ 10 dòng Orthosiphon stamineus Benth 34
Bảng 6. Số băng ADN được khuếch đại bằng kỹ thuật RAPD-PCR thu được từ 10
dòng Râu mèo được thu thập ở Miền Bấc và Miền Trung, Việt N a m

36
Bảng 7. Hệ số khoảng cách di truyền giữa các dòng cây Râu Mèo (Orthosiphon
stamineus Benth.) thu thập ở Việt Nam dựa trên chỉ thị RAPD-PCR


.

38
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Hình thái lá cây Râu mèo Orthosiphon stamineus Benth 5
Hình 2. Hình thái hoa của Orthosiphon stamineus Benth 5
Hình 3. Dược liệu được thu hái từ cây Orthosiphon stamineus Benth

6
Hình 4. Cấu trúc hoá học của các hợp chất ílavonoid và dẫn xuất tìm thấy ở Râu mèo 8
Hình 5. Cấu trúc hoá học của các hợp chất diterpen và dẫn xuất tìm thấy ở Râu m è o

9
Hình 6. Một số hợp chất sinh học khác tìm thấy ở cây Orthosiphon stamineus Benth

10
Hình 7. Một số biệt dược và chế phẩm được bào chế từ cây o. stamineus Benth

14
Hình 8. Quy trình chiết xuất Aavonoid tổng số từ cây Râu mèo o. stamineus Benth

24
Hình 9. Sơ đồ tóm tất quy trình phân tích sinensetin từ các dịch chiết Râu mèo (0.
stamineus Benth.) bằng kỹ thuật RP - H PL C

25
Hình 10. Các dòng Râu Mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) THn thu tại vườn trồng
của người dân tại Thanh Hóa và dòng HN| thu tại Hà N ộ i
29
Hình 11. Hình ảnh các mẫu cây Râu Mèo
(■Orthosiphon stamineus
Benth.) thu tại
Thanh Hóa (ảnh trái) và Phú Thọ (ánh phải) được đưa về Phòng thí nghiệm
tiến hành phân tích chỉ thị RAPD-PCR và thành phần sinensetin


3
Q
Hình 12. Đường biếu diễn mức độ tuyến tính và chính xác cúa phương pháp phân
tích H PL C ’
.

7
.

*

31
Hình 13. Phổ hấp thụ UV-VIS của hợp chất sinensetin 32
Hình 14. Phổ sắc ký RP-HPLC của hợp chất sinensetin chuấn và của dịch chiết
ílavonoid tổng số từ lá của dòng Râu mèo TH0 33
Hình 15. Ảnh điện di dịch chiết ADN tốns số từ các dòng Râu m èo

35

Hình 16. Mối quan hệ di truyền đươc xác định trên cơ sớ chi thị RAPD-PCR giữa 10
dòng Râu Mèo 37
xii
Hình 17. Tính đồng hình di truyền giữa các dòng Râu Mèo được phán ánh bới phổ
điện di các phân đoạn ADN được khuếch đại bằng các mồi RAPD là OPA-
18 và O P C -4

'

’


38
Hình 18. Tính đa hình biểu hiện qua phổ điện di RAPD-PCR các dòng Râu Mèo khác
nhau có ADN được khuếch đại bằng các mồi OPA-5 và OPC-1 8

38
Hình 19. Tính đa hình biểu hiện qua phổ điện di RAPD-PCR các dòng Râu Mèo khác
nhau có ADN được khuếch đại bằng các mồi OPA-3 và OPC-IO 39
X111
MỞ ĐẦU
Ở nước ta nói riêng và trên thế giới nói chung, việc sử dụng các chỉ thị phàn tử, đặc
biệt là các chỉ thị ADN (như RAPD-PCR, RFLP, AFLP, SSR, ) đã và đang ngày càng
được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác
định đặc trưng cá thể và khoảng cách di truyền giữa các cá thể hoặc quần thể thực vật
nhằm mục đích định hướng bảo tồn và chọn tạo giống.
So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái, chỉ thị izozym), các chỉ thị ADN
có một số ưu điểm nổi bật như sau: 1) Dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm,
trong đó đặc biệt là chỉ thị RAPD-PCR là phép phân tích nhanh, đơn giản, có chi phí
tương đối thấp; 2) Không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường (là các yếu tô' thường ảnh

hưởng đến sự biểu hiện của kiểu gen); 3) Không phụ thuộc vào hiện tượng tương tác giữa
các gen và hiệu quả biểu hiện kiểu hình của các gen (chẳng hạn như các gen đột biến,
gen gây chết, gen lặn thường không biểu hiện trong tự nhiên); 4) Có thể phát hiện được
các dạng biến dị ADN trong các giai đoạn phát triển khác nhau hoặc giữa các cơ quan
khác nhau ở thực vật.
Đối với phần lớn các loài cây thuốc, phương pháp thu hái hiện nay chủ yếu từ các
nguồn nguyên liệu mọc hoang dại nên không rõ về bản chất di truyền, thành phần hoá
học cũng như hoạt tính sinh học. Phương pháp thu hái này còn bộc lộ nhiều nhược điểm,
chẳng hạn như: 1) Việc thu hái bừa bãi không có quy hoạch dẫn đến nguy cơ mất đi các
nguồn tài nguyên di truyền. Do vậy, nhiều loài cây thuốc quý hiếm dễ dàng trở nên có
nguy cơ tuyệt chủng; 2) Các nguồn nguyên liệu từ các cây mọc hoang dại không đáp ứng
được yêu cầu của công nghiệp dược phẩm chất lượng cao, do nguồn nguyên liệu ban đầu
thường không ổn định và không kiểm soát được về mặt hoá học, hoạt chất sinh học, hoạt
lực sinh học, cũng như độc tính; 3) Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy cơ nhiễm
độc với các nguồn hoá chất độc khác nhau, như chất diệt cỏ, chất trừ sâu, các chất thải
công nghiệp, thậm trí chất phóng xạ và thực tế tình trạng này hiện nay ở nước ta
không kiểm soát được; 4) Dược liệu thu thập hoang dại có nguy cơ nhiễm với các dạng
vi sinh vật (nấm, vi khuẩn), vì vậy có thể mang theo các nguồn chất độc khác ngoài ý
muốn; v.v
Trong hoàn cảnh đó, một trong những yêu cầu hàng đầu hiện nay của nền công
nghiệp dược phẩm dựa trên các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên là yêu cầu tiêu chuán
hóa nguồn nguyên liệu ban đầu. Trong đó, việc xác định thành phần các hợp chất có hoạt
tính sinh học, hoạt lực sinh học và độc tính, cũng như công tác chọn tạo giống có vai trò
1
hết sức quan trọng. Trên cơ sở tiêu chí này, nhiều sản phẩm dược phẩm từ các loài cây
thuốc hiện nay trên thế giới đang được định hướng sản xuất dựa trên tiêu chuẩn về thành
phần các hợp chất có hoạt tính sinh học đã biết. Tuy vậy, trong nhiều trường hợp, việc
chỉ sử dụng các chỉ thị hóa học cũng có nhược điểm là bản thân quá trình sinh tổng hợp
các hợp chất sinh học thứ cấp có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường. Vì vậy, khi
trồng các dòng cây thuốc có cùng nguồn gốc (vật liệu di truyền tương tự nhau) nhưng ở

các điều kiện sinh thái và khí hậu khác nhau, hiệu suất thu hoạch các hợp chất sinh học
thứ cấp có thể khác nhau và ngược lại, dẫn đến việc có thể đánh giá nhầm mức độ đa
dạng của một loài cây thuốc nếu chỉ dựa vào các chỉ thị hoá học Trong khi đó, các
dấu chuẩn ADN do không bị ảnh hưởng bởi các nhân tố môi trường là một công cụ có
thể khắc phục được hiện tượng này.
Cây Râu mèo (Orthosiphon stơmineus Benth) là loài cây thuốc thuộc họ Lamiaceae
phân bố rộng rãi trên nhiều vùng ở nước ta. Gần đây, loài cây thuốc này và các chế phẩm
của nó đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của một số phòng thí nghiệm trên thê
giới. Trong y học cổ truyền của các nước Đông Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Thái
Lan, Việt Nam), Râu mèo được sử dụng trong điều trị một số rối loạn đường tiết niệu, trị
bệnh sỏi thận, bệnh đái tháo đường, và bệnh huyết áp cao. Ở các nước châu Âu và Nhật
Bản, lá của loài cây thuốc này được sử dụng cho mục đích lợi tiểu. Trên cơ sở đó, dịch
chiết lá và dược chất sinesetin của loài cây Orthosiphon stamineus đã được ghi nhận
trong dược điển một số nước Châu Âu để điều trị một số rối loạn đường tiết niệu. Một số
nghiên cứu gần đây cũng chứng minh tác dụng gây độc đối với tế bào ung thư ruột kết
của dịch chiết methanol của cây Râu mèo cho thấy tiềm năng sử dụng các chế phẩm của
nó trong điều trị ung thư. Từ những hiểu biết trên đây, trong nhưng năm qua ở nước
ngoài cũng như ở Việt Nam, dược liệu từ Râu mèo đã được một số công ty dược phẩm
phát triển thành một số biệt dược hoặc thực phẩm chức năng dùng trong điều trị các
chứng bệnh đường tiết niệu, đặc biệt là bệnh sỏi thận, như Uriphron® (Phytopharmica,
Mỹ), Kim Tiền Thảo - Râu mèo® (Fidopharm, Việt Nam), Râu mèo - Chuối hột®
(Domesco, Việt Nam), v.v
Về thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học, phần lớn các nghiên cứu đến nay
đã xác định tác dụng lợi niệu của các dịch chiết từ cây râu mèo có liên quan đến nhóm
hợp chất polyphenol, trong đó đáng quan tâm nhất là các hợp chất ílavonoid là sinesetin.
eupatorin, và các dẫn xuất của axít caffeic, axit rosmarinic, và axit cichoric. Hiện nay.
Indonesia đang là các nước xuất khẩu lớn nhất các chế phẩm từ Râu mèo sang thị trường
2
Châu Âu và Bắc Mỹ Hàm lượng senensetin thường được dùng làm tiêu chí để đánh
giá chất lượng các nguồn dược liệu có nguồn gốc từ Orthosiphon stamineus. Riêng Việt

nam, trong vài năm qua cũng đã bắt đầu xuất khẩu được dược liệu từ Râu mèo. Năm
2002, sản lượng xuất khẩu Râu mèo của nước ta đạt gần 50 tấn (tương đương doanh thu
là 100.000 USD). Tuy vậy, sản lượng xuất khẩu này còn thấp so với tiềm năng phát triển
của loài cây dược liệu này ở Việt Nam (theo số liệu của Bộ Y Tế, 2003).
Về các nghiên cứu cơ bản, cho đến nay ngoài một số nghiên cứu điều tra tương đối
rời rạc phân bố của loài cây Râu mèo, có thể nói ở nước ta chưa có một nghiên cứu nào
được tiến hành nhằm đánh giá sự đa dạng về cấu trúc di truyền, thành phần hoá học và
hoạt tính sinh học của loài cây thuốc này. Việc ứng dụng các dấu chuẩn di truyền hiện
nay còn chưa được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu các loài cây thuốc ở Việt nam nói
chung. Đây chính là một trong những trở ngại cho việc định hướng và xây dựng chương
trình chọn tạo giống và tiêu chuẩn hoá nguồn dược liệu từ các loài cây thuốc phục vụ
cho quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa nền y-dược học cổ truyền ở nước ta.
Trong hoàn cảnh như vậy, việc tiến hành thu thập, phân tích mức độ đa dạng di
truyền và thành phần hoá học ở loài cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus) sẽ là cơ sở
cho việc định hướng bảo tổn, chọn tạo giống và tiêu chuẩn hóa các nguồn dược liệu từ
loài cây thuốc này nói riêng, và xây dựng một mô hình sử dụng các chỉ thị phân tử trong
việc nghiên cứu đánh giá và tiêu chuẩn hoá các nguồn dược liệu từ các loài cây thuốc
của Việt nam nói chung. Đây là lý do để chúng tôi lựa chọn và tiến hành thực hiện đề tài
“Đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị phân tử RAPD-PCR và khả năng sinh
tổng hợp sinensetin ở loài cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu ở Việt Nam
Orthosiphon stamineus B enth.”.
3
1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ u TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1. TổNG QUAN VỂ CÂY RÂU MÈO (Orthosiphon stamineus Benth.)
1.1.1. Phàn loại học thực vật, phân bô và tên gọi
Cầy Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) là loài cây thuốc thuộc chi Orthosiphon
Benth., họ Lamiaceae, lớp hai lá mầm Dicotyledonae. Chi này gồm khoảng 40 loài, phân bố
rải rác ở nhiều vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi và Châu Đại Dương. Vùng nhiệt đới Đông
Nam Á được coi là nơi tập trung và có tính đa dạng cao nhất các loài của chi Orthosiphon,
trong đó riêng ở nước ta đã có 8 loài được phát hiện. Đây là một loài cây nhiệt đới tương đối

điển hình tìm thấy mọc tự nhiên ở Indonesia, Ấn độ, Malaysia, Thái lan, các nước Đông
Dương và ở một số nước Châu Phi. Ngoài ra, cây còn được trồng ở Indonesia, Ấn độ, Thái
lan, Malaysia, CuBa và gần đây là Nhật Bản. Ở nước ta, cây được trồng ở một sô' nơi nhưng
chỉ mang tính tự phát chưa có quy hoạch (Đỗ Huy Bích, 2004).
Theo điều tra của Viện Dược liệu khoảng 5 năm trước đày, Râu mèo phân bố rải rác ở
một số tỉnh như Cao Bằng, Thanh Hóa (Vĩnh Lộc); Hà Tây (Ba Vì); Lâm Đồng, Phú Yên
(Tuy Hòa); Vũng Tàu — Côn Đảo (Bà Rịa); Ninh Thuận (Phan Rang); Kiên Giang (Phú
Q uốc) Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc trên đất giàu chất mùn ớ
ven rừng, gần bờ nước hoặc trong thung lũng. Độ cao phân bô' của cây từ khoảng 10 m (ở
Phú Yên) đến 600 m (ở Cao Bằng) so với mặt nước biển.
Nguồn dự trữ Râu mèo tự nhiên ở Việt Nam hiện nay không đáng kể. Dược liệu từ loài
cây này chủ yếu do trồng trọt. Indonesia hiện là nước trồng và xuất khẩu Râu mèo nhiều
nhất, với sản lượng xuất khẩu hàng năm đạt khoảng 200 tấn dược liệu khô.
Trong các tài liệu về phân loại học thực vật, loài cây Râu mèo ngoài tên Orthsiphon
stamineus Benth. còn được biết đến dưới một số tên đồng nghĩa khác, chẳng hạn như
Orthosiphon aristatus, Ortỉĩosiphon spicatus, Orthosiphon spiralis. Ngoài ra, đôi khi bị
dùng nhầm để chỉ các loài Clerodendranthus spicatus (Thunb) C.Y.Wu ex H. w . Li,
Ocimum aristatum Blume, Ocimum grandiỊỉorum Blume, Orthosiphon grandiýìorus
(Blume) Boldingh. ex Heyne. Sở dĩ như vậy chủ yếu là do sự giống nhau về hình thái giữa
những loài này.
Do cây Râu mèo đã và đang được sử dụng từ lâu đời trong nền y học cổ truyền ở nhiều
nước (như Trung quốc, ấn độ, Thái lan, Malaysia, Việt Nam, Indonesia, ) đồng thời cũng
được những người Châu Âu bắt đầu biết đến từ khoảng 1000 năm trước, cho nên đến nay
loài cây này được gọi với nhiều tên gọi địa phương khác nhau, như java tea,javatee, kidney
4
tea (Hawaii, Ấn Độ); kumis kuching, kumis
kucing, misai kucing, misai kuching hay
remurung (Malaysia); Yaa Nuat Maeo,
Koemis Koetjing (Indonesia); Secho hay
Myit-Shwe ở Malaysia; Orthosiphon-blatter

hay Indisher Nierentee (Đức, Áo, Thụy sĩ);
Feuilles de Barbiflore (Pháp); v.v. Trong
khi đó ở nước ta, trong dân gian tên Râu
mèo được dùng chung để gọi tên các loài
cây thuộc chi Orthosiphon và cả dược liệu
chế biến từ chúng.
1.1.2. Hình thái học thực vật
Cây Orthosiphon stamineus Benth. có
đặc điểm hình thái cơ bản như sau: thân
thảo, sống lâu năm, cao trung bình 0,3 - 0,5
mét, tuy nhiên đôi khi có thể mọc cao đến
1,5 mét. Thân mảnh cứng hình vuông, mọc
đứng, thường có màu nâu tím, nhẵn hoặc có
ít lông, ít phân cành. Lá mọc đối hình trứng,
dài 4 — 6 cm, rộng 2,5 — 4 cm, gốc tròn, đầu
nhọn, mép khía răng to, gân lá hơi nổi rõ ở
mặt dưới, cuống lá thường dài 3 - 4 cm
(Hình 1)
Cụm hoa mọc thẳng ở ngọn thân và
đầu cành, dài khoảng 8 - 1 0 cm, gồm 6 —
10 vòng, mỗi vòng có 6 hoa màu trắng hoặc
hơi tím; lá bắc nhỏ rụng sớm; đài hình
vuông có 5 răng, răng trên rộng toẽ ra
ngoài; tràng hình ống hẹp, thảng hoặc hơi
cong, dài 2 cm, môi trên chia 3 thùy, môi
dưới nguyên; nhị mọc thò ra ngoài hoa, dài
gấp 2 — 3 lần tràng, chỉ nhị mảnh, nhần; vòi
nhụy dài hơn nhị (Hình 2).
Hình 1. Hình thái lá cây Râu mèo
Orthosiphon stamineus Benth.

Hình
2. Hình thái hoa của Orthosiphon
slamineus Benth.
5
1.1.3. Trồng trọt
Râu mèo thích hợp với nhiều loại đất, ưa khí hậu nóng, ẩm, sinh trưởng mạnh vào
mùa hè và mùa thu, nhưng không chịu được úng.
Cây được trồng bằng thân cành vào khoảng tháng 2 — 3 hàng năm. Đất được cày
bừa kỹ, nhặt sạch cỏ, lên luống cao 20 — 25 cm, rộng 0,8 — 1,0 m, bón lót một lượng
phân chuồng kèm NPK. Các đoạn thân cành gồm 3 — 4 mắt được trồng ở độ sâu 5 - 7
cm với khoảng cách khoảng 30 X 40 cm. Trồng xong, tưới ngay và duy trì độ ẩm trong 1
- 2 tuần đầu cho đến khi cây mọc đểu. Trong 1 — 2 tháng đầu, khi cây chưa phủ kín
luống, cần làm cỏ và tưới thúc 2 — 3 lần bằng nước giải hoặc phân chuồng pha loãng. Sau
mỗi ỉần thu hái, tỉa bớt thân cành và bón thúc. Khi trời mưa to, tháo nước kịp thời.
Dược liệu thu hoạch bao gồm lá và phần thân trên mặt đất, thu hái trước khi cây ra
hoa, sấy khô. Có thể thu hoạch 5 - 6 lứa / 1 vụ hè (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
1.1.4. Công dụng trong y học cổ truyền
Theo kinh nghiệm dân gian, Râu
mèo đưực dùng làm thuốc lợi tiểu trong
điều trị viêm thận, sỏi thận, sỏi mật, tê
thấp, phù thũng, viêm gan. Tài liệu Ấn
Độ coi dịch hãm lá Râu mèo là thuốc
điều trị đặc hiệu các bệnh thận và bàng
quang, ngoài ra còn dùng điều trị bệnh
thấp khớp và bệnh gút.
Trong một số bài thuốc y học cổ
truyền Việt Nam, Râu mèo được sử dụng
trong điều trị các bệnh sỏi thận, chứng
phù nề, sốt ban cua, cúm, thấp khớp,
viêm gan, vàng da và sỏi mật (Nguyễn

Huy Bích và cs, 2004). ở Indonesia, lá
Râu mèo đưực dùng là thuốc lợi tiểu,
điểu trị thấp khớp, tiểu đường và cao
huyết áp. Trong khi ở Myanma, cày này thường được dán địa phương dùng chú yếu để
điểu trị chứng tiểu đường, hoặc sắc nước uống trong điểu trị các bệnh thận và đường tiết
niệu (Banskota et al., 2003).
Hình
3. Dược liệu được thu hái từ cây
Orthosiphon stamineus Benth.
6
Trong một số bài thuốc y học cổ truyền Việt Nam, Râu mèo được sử dụng như sau:
lấy 5 - 12 g lá hãm với nước sôi, chia làm 2 lần uống trước khi ăn cơm 1 5 -3 0 phút. Nên
uống lúc dịch hãm còn nóng, hoặc sắc nước uống, thường dùng liên tục 8 ngày, nghỉ 2 -
4 ngày lại tiếp tục nếu cần thiết. Có thể nấu thành cao lỏng, mỗi ngày dùng 2 - 5g cao.
Cao lỏng Râu mèo được dùng làm thuốc hạ đường huyết trong bệnh tiểu đường. Nếu
dùng cả cây Râu mèo thì liều lượng hàng ngày là 30 - 40g, dùng riêng hoặc phối hợp với
các vị thuốc khác.
Một số tài liệu cho rằng khi thu hái dược liệu từ cây Râu mèo, nếu cây ra hoa thì
phải ngắt bỏ hoa vì hoa làm giảm lượng hoạt chất trong lá.
1.1.5. Các hợp chất sinh học đã biết
Các nghiên cứu về các hợp chất sinh học ở cây Râu mèo được tiến hành từ rất sớm,
ngay từ những năm 1930. Cho đến nay, các nhóm chất sau đã được phát hiện và nghiên
cứu nhiều nhất: các diterpen kiểu isopimarane và staminane, triterpene, saponin,
ílavonoid, các dẫn xuất của axit cinnamic, và chromen.
7.7.5.7. Các hợp chấtfỉavonoid
Một số hợp chất thuộc nhóm ílavonoid (Hình 4) được tìm thấy khá phổ biến ở
Orthosiphon stamineus Benth Malterud và cs. (1989) là nhóm nghiên cứu đầu tiên phát
hiện và tách chiết được 8 hợp chất ílavonoid từ loài cây này, bao gồm sinensetin (1),
tetramethylscutellarein (2), eupatorin (3), 5-hydroxy-6,7,3’,4’-tetramethoxyflavone (4),
salvigenin (6), 5,7,4’-trimethoxyflavone (7) và 5,7,3’,4’-tetramethoxyflavone (8), trong

số đó thì hai hợp chất là sỉnensetin và tetramethylscutellarein là phổ biến nhất. Một sô
tác giả khác cũng tìm thấy sinensetin và tetramethylscutellarein cùng với cirsimaritin,
pillion và rhamnazin khi phân tích các mẫu Râu mèo khác (W ollenweber and Mann,
1985; Bombardelli et al., 1972; Matsuuta et al., 1973; Schneider và Tan, 1973).
Sumarayono và cộng sự gần đây (1997) đã tách chiết thêm được 20 hợp chất phenol
khác, trong đó có 9 loại aglycon và 2 hợp chất Aavonol glycoside. Khi phân tích thành
phần dịch chiết MeOH, các tác giả tìm thấy sinensetin là ílavonoid phổ biến nhất, với
hàm lượng là 5,3 |im ol/g mầu khô. Khi nghiên cứu trên đối tượng mẫu Râu mèo Việt
Nam, nhóm nghiên cứu của Banskota (2003) cũng tìm thấy có sinensetin.
tetrascutellarein, eupatorin cùng với
7 ,3 \4 ’-tri-0-m ethylluteolin (17),
ladanein và 6-
hydroxy-5,7,4’-trimethoxyflavon (13).
7
Hình 4. Cấu trúc hoá học của các hợp chất ílavonoid và dẫn xuất tìm thấy ở Râu mèo.
(1) sinensetin, (2) tetramethylscutellarein, (3) eupatorin, (4) 5-hydroxy-6,7,3’,4’-
tetramethoxyAavone, (5) 3-hydroxy-5,6,7, 4'-tetramethoxyflavone, (6) salvigenin, (7) 5,7,4’-
trimethoxydavone, (8) 5,7,3’,4'-tetramethoxyfiavone, (9) cirsimatin, (10) pillion, (11) rtiamnazin,
(12) 5,4’-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavone, (13) 6-hydroxy-5,7,4’-trimethoxyfiavone, (14) 4'-
hydroxy-5,6,7-trimethoxyflavone, (17) 7,3’,4’-tri-0-methỵlluteolin, (18) ladanein, (19) 6-hydroxy-
5,7,4'-trimethoxyflavone ; 2 dẫn xuất glycoside: (15) kaempíerol 3-O-p-glucoside, và (16)
quercetin 3-O-p-glucoside.
1.1.5.2. Các hợp chất diterpen
o . stamineus chứa nhiều hợp chất thuộc nhóm diterpen (Hình 5), bao gồm các
diterpen kiểu isopimarane, và gần đây các nhà nghiên cứu tìm thấy thêm một số loại
diterpen kiểu staminane. M asuda và cs. (1992b) là những tác giả đầu tiên tách chiết được
các orthosiphol A (20) và B (21), thuộc nhóm diterpen kiểu isopimarane từ lá của Râu
mèo được trồng ở vùng Okinawa, Nhật Bản. Sau đó, Takeda và cs. (1993) tiếp tục tìm ra
hai hai hợp chất diterpen hàm lượng nhỏ hơn gọi là orthosiphol D (22) và E (23) cũng từ
lá và thân của mẫu Râu mèo thu ở vùng Okinavva. Gần đây, nhóm nghiên cứu tại Nhật

bản của Banskota (2003) đã phát hiện thêm một số hợp chất diterpen từ mẫu Râu mèo
thu ở Việt nam, gồm có: 5 loại diterpen kiểu isopimarane được đặt tên là orthosiphol F
(24), G (25), H
(26),
I (27), và J
(28);
và 2 loại diterpen kiểu staminane được gọi tên là
staminol A (31) và B (32). Từ nguồn vật liệu này, các tác giả cũng tìm ra các dẫn xuất
của các diterpen kiểu staminane là staminolactone A (35) và B (36), và norstaminol A
(37). Trong khi đó, Shibuya và cs. (1999) ghi nhận việc phát hiện thấy 2 hợp chất
diterpen kiểu isopimarane mới, đặt tên là orthosiphonol A (29) và B (30); cùng với 2
staminane mới là neoorthosiphol A (33) và B (34) từ mẫu Râu mèo thu được từ
Indonesia.
8
Hình 5. Cấu trúc hoá học của các hợp chất diterpen và dẫn xuất tìm thấy ở Râu mèo.
(20) orthosiphol A, (21) orthosiphol B, (22) orthosiphol D, (23) orthosiphol E, (24) orthosiphol F,
(25) orthosiphol G, (26) orthosiphol H, (27) orthosiphol I, (28) orthosiphol J, (29) orthosiphonol
A, (30) orthosiphonol B, (31) staminol A, (32) staminol B, (33) neoorthosiphol A, (34)
neoorthosiphol B, (35) staminolactone A, (36) staminolactone B, (37) norstaminol A.
7.7.5.5. Các hợp chất khác
Một số hợp chất khác như benzochromene, coumarin, các hợp chất triterpen, axit
caffeic và một số dẫn xuất của nó cũng đã từng được tìm thấy và tách chiết từ Râu mèo.
Hợp chất methylripariochromene A được tìm thấy từ cây Râu mèo thu ở Indonesia bằng
phương pháp chụp tinh thể tia X (Guerin et al., 1989). Sumaryono và cs. (1997) ghi nhận
việc tìm thấy coumarin (39), axit caffeic (40), axit rosmarinic (41), axit 2,3-
dicaffeoyltartaric cùng với một số dẫn xuất khác của axit caffeic. Cũng trong các dòng
Râu mèo thu ở Indonesia, các tác giả cùng phát hiện thấy axit rosmarinic là hợp chất
phenol phổ biến, có hàm lượng đạt tới 22,2 |amol/g dịch chiết khô bằng MeOH, tiếp theo
là axit 2,3-dicaffeoyltartaric với hàm lượng là 7,4 I^mol/g. Axit rosmarinic cũng được
tìm thấy từ các mẫu Râu mèo thu ở Okinawa, Nhật bản (Takeda và cs., 1993). Từ mẫu

Râu mèo thu ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Tezuka đã xác định được các hợp chất
axit caffeic, axit rosmarinic, vomiíoliol, aurantiamide acetate, axit oleanolic, axit ursolic.
axit betulinic, và P-sitosterol. Bên cạnh các hợp chất phenol, meso-inositol (Nikonov.
1971) và một số hợp chất kém bền cũng tìm thấy ở cây o . stamineus (Kudritskaya et al
1987; Schmidt and Bos, 1986; Schut and Zwaving, 1986).
9
0
ỌH
HO
COOH
HO
OMc
38. R -OMê
43.R-H
OMo
44.
39.
OH
40.
HO
41.
HO
o COOH
OH
42.
OM
Hình 6. Một số hợp chất sinh học khác tìm thấy ở cây Orthosiphon stamineus Benth.
(38) methylripariochromene, (39) coumarin, (40) axit caffeic, (41) axit rosmarinic,
(42) axit 2-caffeoỵltartaric, (43) acetovanillochromene, (44) orthochromene A.
Ngoài ra, một số nghiên cứu ở Ấn Độ trước đây (K rishnam urthy, 1971) cho thấy

lá Râu mèo chứa saponin, một alcaloid, tinh dầu 0,2 - 0,6%, tanin, axit hữu cơ (axit
tartic, axit citric, và axit glycolic) và dầu béo. Saponin khi thủy phân cho sapogenin và
đường là arabinoza và glucoza (hoặc fructoza). Phần không xà phòng của dầu béo là P-
sitosterol và a-am yrin. Hoạt tính của lá do có hàm lượng kali cao (0,7 - 0,8%) và một
glycosid đắng là orthosiphonin. Theo Schmidt và cs (1985), tinh dầu lá, cành và thân của
Orthosiphon stamineus chứa P-caryophylen, Ị3-elemen humulen, P-bourbonen và 1-
octen-3-ol, caryophyllen oxyt.
Mặc dù, các nghiên cứu về thành phần hóa học như trình bày ở trên cho thấy đến
nay đã phát hiện được nhiều các hợp chất sinh học khác nhau từ cây Râu mèo, nhưng
trong thực tế chế biến và sản xuất dược phẩm từ loài Râu mèo hiện nay ở Châu Âu và
Bắc Mỹ, người ta thường chỉ tập trung quan tâm vào thành phần các flavonoid ưa nước là
sinensetin, scutellareintetram ethylether và eupatorin. Trong đó, hàm lượng sinensetin
(khoảng 0,2% trọng lượng chất khô) thường được sử dụng làm chỉ thị đánh giá dịch chiết
từ Râu mèo được nhập khẩu vào thị trường Châu Âu và Bắc Mỹ (Bueter, 2004).
1.1.6. Các nghiên cứu về dược lý học và lâm sàng
Gần đây, Orthosiphon stamineus và một sô' hợp chất chính được tách chiết từ loài
cây này đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các phòng thí nghiệm về dược lý
học. Nhờ vậy, một sô' hoạt tính sinh học của Râu mèo đã được xác định bẽn cạnh các
thông số về độc tính, dược động học, quá trình bài tiết các hợp chất khi sử dụ n g ,
Theo các tác giả Chow và Liao (Đài loan), dịch chiết từ Râu mèo trên chó thí
nghiệm bằng đường truyền tĩnh mạch với liều 18,8 mg/kg/phút có tác dụng tăng cường
1 0
bài tiết nước tiểu và chất điện giải Na+, K+, cr. Trên chuột nhắt trắng, Râu mèo bằng
đường tiêm xoang bụng với liều 2 - 4 g/kg làm giảm hoạt động vận động của chuột. Trên
chó, bằng đường tiêm tĩnh mạch với liều 0,179 g/kg có tác dụng hạ huyết áp và làm giảm
tần số hô hấp. Dịch chiết bằng ethanol của Râu mèo trên chuột nhắt trắng bằng đường
tiêm xoang bụng có giá trị LD50= 196 g/kg.
Các tác giả Schut và Zwaving (1996) đã xác định tác dụng lợi tiểu của 2 hợp chất
ílavonoid là sinensetin và 3’-hydroxy-3,6,7,4’-tetramethoxyflavon của Râu mèo. Thí
nghiệm trên chuột nhắt trắng cho thấy chất 3’-hydroxy-3,6,7,4’-tetramethoxyflavon

bằng đường tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg, lượng nước tiểu thu được sau 140 phút là
410mg, còn sinensetin dùng cùng liều trên, lượng nước tiểu thu được sau 160 phút là
614mg, trong khi đó ở chuột lô đối chứng, sau 120 phút không thu được lượng nước tiểu
nào. Hai hợp chất ílavonoid nêu trên dùng với liều 1 mg/kg có so sánh với tác dụng của
hydrochlorothiazid thấy tác dụng lợi tiểu yếu hơn và xuất hiện chậm. Đổng thời, các tác
giả trên cũng khẳng định hai Aavonoid trên với liều 10 mg/kg trên chuột công trắng
không thể hiện tác dụng lợi mật tuy trong y học cổ truyền có ghi nhận là Râu mèo có tác
dụng lợi mật. Xuất phát từ tác dụng điều trị viêm thận của Râu mèo, hai tác giả trên đã
tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm và tác dụng kháng khuẩn của các ílavonoid
tách chiết từ Râu mèo. Kết quả cho thấy trên thí nghiệm gây viêm bằng phương pháp cấy
viên bông, sinensetin không thể hiện tác dụng chống viêm, v ề tác dụng kháng khuẩn, đã
nghiên cứu với các chủng Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa,
Stapphylococcus aureus và Enterococcus là những chủng có thể gây nhiễm đường tiết
niệu, nhưng kết quả cho thấy cả sinensetin, tetramethylscuttellarein và 3’- hydroxy-
3,6,7,4’-tetramethoxyflavon đều không có tác dụng kháng khuẩn rõ rệt.
Về dược lý lâm sàng, theo các tác giả Ấn Độ, Râu mèo rất có ích cho điều trị bệnh
thận và phù thũng. Trên bệnh nhân, Râu mèo có tác dụng làm kiềm hóa máu, sự có mặt
của hợp chất orthosiphonin và muối kali trong dược liệu có tác dụng giữ cho axit uric và
muối urat ở dạng hòa tan, do đó phòng ngừa được sự lắng đọng của chúng để tạo thành
sỏi thận. Ở Thái Lan, thí nghiệm trên những người tình nguyện khoẻ mạnh, dịch chiết
Râu mèo có tác dụng làm tăng sự bài tiết citrat và oxalat; nếu như oxalat có hàm lượng
cao trong cơ thể có thể tăng nguy cơ sỏi thận, thì sự bài tiết citrat được tăng cường giúp
ngăn ngừa sự hình thành sỏi thận.
Nghiên cứu trên chuột nhắt trắng, Robins (1988) chứng minh sinensetin có tác
dụng chống ngưng kết tiểu cầu mạnh hơn cả nobiletin là hợp chất đã được biết trước đây
11
có khả năng chống ngưng kết hồng cầu và huyết khối. Cho thấy có thể sử dụng hợp chất
này trong điều trị các chứng bệnh liên quan đến sự hình thành huyết khối, ngăn ngừa
những chứng bệnh như nhồi máu cơ tim, nghẽn mạch,
Choi và cs. (2002) khi nghiên cứu trên các dòng tế bào ung thư kháng thuốc trong

điều kiện in-vitro đã chứng minh sinensetin có khả năng gây mẫn cảm trở lại của các tế
bào này với thuốc chống ung thư vincristine, mà không làm tăng sự tổng hợp P-
glycoprotein, là dẫn xuất điều hòa khả năng kháng thuốc của dòng tế bào ung thư này.
Nhiều nghiên cứu khác nhau đã chứng minh các hợp chất polymethoxylated
ílavone (trong đó có sinensetin) có khả năng ức chế sự xâm thực của các tế bào khối u ở
động vật thí nghiệm (Bracke và cs., 1994), đồng thời thúc đẩy quá trình biệt hóa của các
tế bào bạch cầu, ức chế sự phân chia tế bào song song với việc thúc đẩy quá trình các tế
bào đột biến tự chết theo chương trình (apotosis) (Mookerjee và cs, 1996).
Fujimoto và cs. (1972) đã chiết xuất được meso-inositol từ dịch chiết nước của Râu
mèo cũng là một hợp chất có tính chất lợi tiểu. Tuy vậy, năm 1992, một số bác sĩ Việt
Nam và Thụy Điển đã sử dụng Râu mèo trên làm sàng cho bệnh nhân ở Bệnh viện Việt
Nam - Thụy Điển ở Uông Bí và thấy thuốc không làm tăng lượng nước tiểu bài tiết trong
12 - 24 giờ, cũng như không làm ảnh hưởng đến bài tiết Na+. Trong trường hợp này, có
thể phải kiểm tra lại thời gian thu hái và chất lượng dược liệu (Doan et al., 1992). Ngược
lại với kết quả nghiên cứu này, khi nghiên cứu trên chuột, Beaux và cs. (1999) đã chứng
minh rằng dịch chiết cồn của 0 . stamineus (50 mg/kg) qua đường tiêm dưới da có tác
dụng lợi tiểu rõ rệt trên chuột thí nghiệm so với đối chứng trong vòng 2 - 2 4 giờ sau khi
tiêm. Hơn nữa, các tác giả này cũng cho biết sự bài tiết muối K+ cũng tăng lên rõ rệt ở lô
thí nghiệm trong vòng 8 giờ sau khi tiêm. Theo một nghiên cứu khác, Matsubata và cs.
(1999) ghi nhận hoạt tính chống tăng huyết áp của hợp chất methylripariochromene A là
một hợp chất cũng tìm thấy tương đối phổ biến ở Râu mèo. Methylripariochromene A
làm giảm rõ rệt huyết áp và nhịp tim ở chuột gây tăng huyết áp thực nghiệm. Ngoài ra.
kết quả thí nghiệm cho thấy, việc ức chế co thành mạch phụ thuộc vào nồng độ thuốc thừ
là do sự giải phóng K+, /-phenylephrine và prostaglandin F2a trong động mạch chủ ngực
ở chuột thí nghiệm. Nghiên cứu của Ohashi và cs. (2000) cũng đã chứng minh các hợp
chất diterpen, flavonoid, và benzochromene có hiệu quả ức chê co thành mạch ơ động
mạch ngực trên chuột thí nghiệm, điều này có thể có liên quan đên hoạt tính chóng tăng
huyết áp của các dịch chiết Râu mèo đã được ghi nhận trước đây.
12
Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất orthosiphol A và B được chứng minh trong

nghiên cứu của Masuda và cs. (1992b) trên chuột bị gây viêm thực nghiệm bằng TPA
(12-ơ-tetradecanoylphorbol-13-acetate). Cả hai hợp chất này ở liều sử dụng là 200 mg
đều có hoạt động kháng viêm mạnh. Điều này cũng cho thấy các hợp chất này cũng có
thể có hoạt tính kháng sự phát triển của tế bào khối u. Banskota và cs. (2003) đã thử độc
tính của dịch chiết từ o . stamineus trên dòng tế bào ung thư ruột kết 26-L5 và thấy dịch
chiết MeOH từ mẫu Râu mèo thu ở Việt Nam có độc tính nhẹ trên dòng tế bào ung thư
này. Trong khi đó, một số hợp chất diterpene có độc tính yếu, còn các ílavonoid như
eupatorin, 6-hydroxy-5,7,4’-trimethoxyflavone, 7 ,3 \4 ’-tri-0-methylluteolin và ladanein
có độc tính nhẹ (với các chỉ số ED50 tương ứng là 11,3; 56,5; 87,7 và 50,4 f!g/ml). Trong
một nghiên cứu trước đây, Malterud và Hanche-Olsen (1989) đã ghi nhận hoạt tính ức
chế dòng tế bào khối u báng Ehrlich của sinensetin và tetramethylscutellarein trong điều
kiện in vitro với các chỉ số ED5() tương ứng là 30 và 15 1-ig/ml.
Một số nghiên cứu gần đày cũng chứng minh tác dụng gây độc đối với tế bào ung thư
ruột kết của dịch chiết methanol của cây Râu mèo cho thấy tiềm năng sử dụng các chế
phẩm của nó trong điều trị bệnh ung thư này (Stampoulis và cs., 199%). Trong một chương
trình sàng lọc, Chen và cộng sự (1989) đã nhận thấy dịch chiết nước từ o . stamineus có hoạt
tính mạnh với vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans. Ngoài ra, Sheu và cộng sự
(1984) xác định được hoạt tính hạ đường huyết của axit ursonic tách chiết được từ Râu mèo.
Hơn nữa, hai hợp chất ílavonoid quan trọng ở Râu mèo là sinensetin và
tetramethylscutellarein có hoạt tính ức chế mạnh enzym 15-lipoxygenaza tách chiết từ đậu
tương với các axit linolic và arachidonic là cơ chất (Lyckander và Malterud, 1992;
Lyckander và Malterud, 1996).
Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu trên đây, Râu mèo được hội đồng dược học Đức
(German Commision E), là tổ chức tương đương với FDA ở Mỹ, thừa nhận với tác dụng lợi
tiểu trong điều trị bệnh thận và chống các chứng co thắt nhẹ (Englert và Hamischíeger,
1991; Masuda và cs., 1992a,b; Beaux và cs., 1999).
1.1.7. Các chỉ định sử dụng trong chữa bệnh
Trong y học cổ truyền Việt Nam, Râu mèo được biết đến trong một sỏ' bài thuốc,
với các liều lượng cụ thể như sau (Đỗ Huy Bích và cs, 2004):
1) Chữa viêm thận mãn tính, viêm bàng quang, viêm khớp, phong thấp, viêm đường

ruột: Râu mèo 40 g, Tỳ giải và Rễ ý mỗi vị 30 g, sắc uống.
13