Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




TRẦN VĂN TÍNH



TỔNG HỢP CƠ CHẤT, CHẾ TẠO KÍT
VÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU ĐỂ
NHUỘM TẾ BÀO PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN
BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU NGƢỜI

Chuyên nHóa hữu cơ
Mã số:
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC


ỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
Hƣớng dẫn 1: PGS.TSKH. Lƣu Văn Bôi
Hà Nội,2012

HÀ NỘI - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


TRẦN VĂN TÍNH

TỔNG HỢP CƠ CHẤT, CHẾ TẠO KÍT
VÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU ĐỂ
NHUỘM TẾ BÀO PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN
BỆNH UNG THƢ BẠCH CẦU NGƢỜI

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62 44 27 01


LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TSKH. Lƣu Văn Bôi
2. GS.TS. Nguyễn Anh Trí


HÀ NỘI - 2012

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC
i
DANH MỤC CÁC BẢNG
iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
iv
CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
v
MỞ ĐẦU
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. Tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
3
1.1.1. Phƣơng pháp một giai đoạn
3
1.1.2. Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng phƣơng
pháp hai giai đoạn

5
1.2. Tính chất của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
6
1.2.1. Tính chất vật lý
6
1.2.2. Tính chất phổ
7
1.2.3. Tính chất hóa học
8
1.3. Ứng dụng của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
10
1.3.1. Ứng dụng để sản xuất phẩm màu
10
1.3.2. Sản xuất cơ chất để nhuộm tế bào bạch cầu
13

CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM
25
2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu
25
2.2. Hóa chất và thiết bị
25
2.2.1. Hóa chất
25
2.2.2. Các dụng cụ và thiết bị
27
2.3. Phần thực nghiệm
28
2.3.1. Điều chế các dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
28
2.3.2. Điều chế các dẫn xuất este 3-(N-thế)naphtalen-2-yl cacboxylat
34
2.3.3. Tối ƣu hóa phản ứng nhuộm esteraza bằng phƣơng pháp đơn hình
37



iv
2.3.4. Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời bằng các cơ chất este tổng hợp
theo kỹ thuật đã tối ƣu hóa

41
2.3.5. Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời bằng naphtol AS-OL
-clopropionat naphtol AS-OL

42

2.3.6. Pha chế kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời bằng các cơ chất
naphtol AS-OL -clopropionat tổng hợp đƣợc

42
2.3.7. Đánh giá thời gian ổn định của bộ kít
43
2.3.8. Ứng dụng bộ kít để chẩn đoán dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp
43
2.3.9. Nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính
44
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
47
3.1. Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
48
3.1.1. Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phƣơng pháp truyền thống
48
3.1.2. Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phƣơng pháp lò vi sóng
51
3.1.3. Tổng hợp 3-hiđroxi-[N-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl)]naphtalen
-2-cacboxamit

63
3.2. Tổng hợp 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat
73
3.3. Nghiên cứu nhuộm tế bào bạch cầu bằng các cơ chất tổng hợp đƣợc
95
3.3.1. Nghiên cứu tối ƣu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu
96
3.3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng của cơ chất đến kết quả nhuộm
101

3.4. Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa hoạt tính và cấu trúc của các cơ
chất bằng phƣơng pháp tính hóa lƣợng tử

110
3.5. Nghiên cứu chế tạo kít bằng cơ chất mới naphtol AS-OL α-clopropionat
115
3.5.1. Thành phần bộ kít cho 100 tiêu bản nhuộm
115
3.5.2. Tài liệu hƣớng dẫn sử dụng bộ kít naphtol AS-OL α-clopropionat
116
3.5.3. Đánh giá chất lƣợng bộ kít
117
3.5.4. Nghiên cứu thời gian bảo quản và sử dụng kít
118
3.5.5. Ứng dụng bộ kít để chẩn đoán dòng tế bào trong bệnh bạch cấp
120
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
123
Danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án
125
Tài liệu tham khảo
126
Phụ lục phổ, ảnh và các tài liệu khác
136


v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.
Các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit đã đƣợc thƣơng

mại hóa

6
Bảng 1.2.
Một số phẩm màu từ naphtol AS
10
Bảng 1.3.
Mối tƣơng quan giữa độ tan và cấu trúc phẩm màu
12
Bảng 1.4.
Các lĩnh vực ứng dụng của phẩm màu naphtol AS
13
Bảng 1.5.
Bảng phân loại theo tiêu chuẩn FAB về nhuộm hóa học tế bào
19
Bảng 2.1.
Giá trị ri và Ri
38
Bảng 2.2.
Ma trận mã hóa đơn hình S
0

38
Bảng 2.3.
Ma trận mã hóa thay số đơn hình S
0

38
Bảng 2.4.
Lựa chọn mức gốc thực nghiệm

39
Bảng 2.5.
Ma trận thực nghiệm đơn hình S
0

39
Bảng 3.1.
Mối tƣơng quan giữa điều kiện phản ứng và hiệu suất Ia tổng hợp
theo phƣơng pháp truyền thống

50
Bảng 3.2.
Mối tƣơng quan giữa điều kiện tiến hành phản ứng và hiệu suất
tổng hợp Ia bằng phƣơng pháp lò vi sóng

53
Bảng 3.3.
Mối quan hệ giữa nhiệt độ phản ứng với hiệu suất Ia tổng hợp
theo phƣơng pháp lò vi sóng

53
Bảng 3.4.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và ESI-MS của
các naphtol AS-X

57
Bảng 3.5.
Dữ liệu phổ
1
H-NMR của các naphtol AS-X

59
Bảng 3.6.
Ảnh hƣởng của hiệu ứng điện tử các nhóm thế lên độ chuyển dịch
hóa học của các proton OH và NH

61
Bảng 3.7.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và ESI-MS của
3-hiđroxi-N-( xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/1-antraxyl) naphtalen-
2-cacboxamit


70
Bảng 3.8.
Phổ
1
H-NMR của 3-hiđroxi-N-(xiclohexyl/phenyl/1-naphtyl/
1-antraxyl)naphtalen-2-cacboxamit

71
Bảng 3.9.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, số liệu phổ IR và ESI-
MS của các naphtol AS-X cloaxetat

79
Bảng 3.10.
Dữ liệu phổ
1
H-NMR của các naphtol AS-X cloaxetat
81

Bảng 3.11.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, số liệu phổ IR và ESI-
MS của các naphtol AS-X -clopropionat

83
Bảng 3.12.
Số liệu phổ
1
H-NMR của các các naphtol AS-X -clopropionat
85

vi
Bảng 3.13.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, các dữ liệu phổ IR và
ESI-MS của 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxylcacbamoyl)
naphtalen-2-yl cacboxylat


87
Bảng 3.14.
Số liệu phổ
1
H-NMR của 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl
cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat

89
Bảng 3.15.
Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, các dữ kiện phổ IR,
ESI-MS của naphtol AS-D và naphtol AS-OL cacboxylat

92
Bảng 3.16.
Phổ
1
H-NMR của các naphtol AS-D và naphtol AS-OL
cacboxylat

93
Bảng 3.17.
Lựa chọn mức gốc thực nghiệm
97
Bảng 3.18.
Kết quả nhuộm theo phƣơng pháp quy hoạch hóa thực nghiệm
đơn hình

97
Bảng 3.19.
Kết quả thí nghiệm lặp lại ở đỉnh tối ƣu
99
Bảng 3.20.
Tính đặc hiệu của 26 cơ chất naphtol AS-X cloaxetat và
α-clopropionat đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch
cầu máu ngoại vi


102
Bảng 3.21.
Điểm nhuộm của các este naphtol AS-X cloaxetat
102
Bảng 3.22.

Điểm nhuộm của các este naphtol AS-X α-clopropionat
103
Bảng 3.23.
Tính đặc hiệu của các cơ chất Va-h đối với phản ứng nhuộm
esteraza các loại bạch cầu máu ngoại vi

105
Bảng 3.24.
Kết quả nhuộm tế bào bạch cầu bằng các cơ chất este dãy Va-h
105
Bảng 3.25.
Tính đặc hiệu của các cơ chất có gốc cacboxylat khác nhau đối
với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch cầu máu ngoại vi

108
Bảng 3.26.
Kết quả nhuộm bằng naphtol AS-D và AS-OL cacboxylat có các
gốc hiđrocacbon khác nhau

108
Bảng 3.27.
Kết quả các góc nhị diện thu đƣợc từ tính toán lƣợng tử và điểm
nhuộm thực nghiệm

112
Bảng 3.28.
Điểm nhuộm thực tế và điểm tính theo phƣơng trình hồi quy
114
Bảng 3.29.
Kết quả theo dõi tính ổn định của bộ kít

118
Bảng 3.30.
Độ đặc hiệu của cơ chất naphtol AS-OL α-clopropionat và kít của
hãng Sigma đối với phản ứng nhuộm esteraza các loại bạch cầu
trong tủy.

120
Bảng 3.31.
Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời bằng kít naphtol
AS-OL α-clopropionat tổng hợp đƣợc và kít naphtol AS-D
cloaxetat hãng Sigma.


121

vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.
Tâm hoạt động của esteraza
14
Hình 1.2.
Phân tử esteraza
16
Hình 2.1.
Màn hình cài đặt chƣơng trình tính toán
44
Hình 2.2.
Màn hình cài đặt phƣơng pháp tính toán
45
Hình 2.3.

Cửa sổ cài đặt dung môi và câu lệnh thêm vào
45
Hình 3.1.
Phổ IR của 3-hiđroxi-N-(2-metylphenyl)-, N-(4-metylphenyl)-,
N-(2-bromphenyl)- và N-(4-bromphenyl)naphtalen-2-cacboxamit

54
Hình 3.2.
Hai cấu dạng của phân tử naphtol AS-X
55
Hình 3.3.
Phổ IR của chất Ik và Il
56
Hình 3.4.
Phổ MS của chất Il
63
Hình 3.5.
Sự phân mảnh của hợp chất Il
63
Hình 3.6.
Phổ IR của hợp chất IIc
68
Hình 3.7.
Phổ MS của hợp chất IId
69
Hình 3.8.
Sắc kí bản mỏng của naphtol AS-D và sản phẩm phản ứng
75
Hình 3.9.
Biểu diễn điểm của các đơn hình (S) trong quá trình tối ƣu hoá

98
Hình 3.10.
Ảnh nhuộm enzym esteraza bạch cầu ở điều kiện tối ƣu hoá với
cơ chất naphtol AS-D cloaxetat (Sigma-Aldrich)

99
Hình 3.11.
Ảnh nhuộm esteraza bạch cầu bằng các cơ chất IIIa và IIIi
104
Hình 3.12.
Ảnh nhuộm esteraza bạch cầu bằng naphtol cơ chất Vc và Vg
106
Hình 3.13.
Kết quả nhuộm esteraza bạch cầu ngƣời bằng các cơ chất naphtol
AS-D và naphtol AS-OL cloaxetat và α-clopropionat

109
Hình 3.14.
Góc nhị diện của nhóm cacboxylat
111
Hình 3.15.
Biểu đồ biểu thị độ ổn định của bộ kít theo thời gian
119
Hình 3.16.
Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời bằng các cơ
chất naphtol AS-OL α-clopropionat tổng hợp đƣợc và naphtol
AS-D cloaxetat hãng Sigma.


122

8

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

Asp:
Asparagine
C.I
Danh mục các chất màu (Color Index)
c.s
Cộng sự
kDa
Kilo dalton
DFT:
Thuyết phiến hàm mật độ điện tử (Density Functional Theory)
DIPEA
N,N-Diisopropylethylamine
DMF
Đimetyl Focmamit
DMSO
Đimetyl Sunfoxit
EC:
Uỷ ban Enzym (The enzyme commission )
ELISA:
Kỹ thuật miiễn dịch gắn enzym (Enzyme-Linked Immuno Sorbent
Assay )
EST
Nhuộm Esteraza không đặc hiệu (Esterase).
EST:
Esteraza (Essterase)
EST+NaF

Nhuộm Esteraza không đặc hiệu với chất ức chế là NaF.
FAB:
Hội các nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (French-American-British)
FPIA:
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Fluorescen Polary Immuno
Assay)
Glu:
Gly
Glutamine
Glycin
His:
Histidine
IUB:
Hiệp hội Hóa sinh quốc tế (International Union of Biochemistry)
L1
Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho đã biệt hóa (Acute lymphoblastic)
L2
Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chƣa biệt hóa (Acute
lymphoblastic)
L3
Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại Burkitt (Acute
lymphoblastic)
M0
Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ biệt hóa tối thiểu (Minimally
differentiated acute myeloid).
M1
Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ không có tế bào trƣởng thành (Acute
myeloblastic without maturation).
9

M2
Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ có tế bào trƣởng thành (Acute
myeloblastic with maturation).
M3
Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tuỷ (Acute promyelocytic).
M4
Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ-monoxit (Acute myelomonocytic).
M5
Bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit (Acute monocytic).
M6
Bệnh bạch cầu cấp dòng hồng cầu (Erythroleukemia).
M7
Bệnh bạch cầu cấp dòng tiểu cầu (Acute megakaryoblastic).
mM
miliMol
mRNA
ARN thông tin (messenger RiboNucleic Acid)
NaF
Natri Florua
NAS
Naphtol AS (Naphthol AS)
NASD
Naphtol AS-D (Naphthol AS-D)
NASDCl
Nhuộm esteraza đặc hiệu (Naphthol AS-D chloroacetate)
NEAT
New Eindhoven Architectural synthesis Toolbox
NMP
N-Metyl Pyroliđinon
P.A

Nhuộm photphataza axit.
PAS
Nhuộm glucozit bằng thuốc thử Periodic Axit Schiff.
PER
Nhuộm peroxydaza.
QSAR:
Mối tƣơng quan định lƣợng giữa hoạt tính và cấu trúc (Quantitaive
Structure-Activity Relationship)
SD
Nhuộm hạt mỡ bằng Sudan B
Ser:
Serine
SUDAN
Tên riêng của phẩm màu
THF
TetraHydroFuran
Tnc
Nhiệt độ nóng chảy
Ts
Nhiệt độ sôi
WHO:
Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

10

MỞ ĐẦU
Bệnh bạch cầu cấp là một nhóm bệnh của cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ
khoảng 38,5% các bệnh về máu [1]. Cũng nhƣ các bệnh ung thƣ khác, bệnh có xu
hƣớng ngày càng tăng do môi trƣờng ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật
không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam dioxin do chiến tranh để lại [2].

Đặc trƣng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bào non ác tính lấn át các tế
bào tủy và máu ngoại vi bình thƣờng. Đặc điểm của các tế bào này là có sự rối loạn
về protein và cấu trúc tế bào. Bệnh gồm nhiều thể loại khác nhau, theo tiêu chuẩn
FAB thì đƣợc ký hiệu từ M0 đến M7 và L1 đến L3 [16]. Việc xếp loại đúng, nhanh
chóng và chính xác thể bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng
các phác đồ điều trị có hiệu quả cho ngƣời bệnh. Đặc biệt trong thể M3 có nguy cơ
chảy máu cao thì việc chẩn đoán nhanh chóng, chính xác còn có ý nghĩa quyết định
đến sinh mạng bệnh nhân [6]. Tiêu chuẩn FAB dựa trên kết quả xét nghiệm của ba
phƣơng pháp là miễn dịch, di truyền và nhuộm hóa học tế bào. Phƣơng pháp miễn
dịch và di truyền sử dụng các kỹ thuật đòi hỏi máy móc hiện đại đắt tiền và nguồn
lao động có trình độ cao. Phƣơng pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ gồm các kỹ
thuật nhuộm PAS, peroxidaza, nhuộm sudan B, photphataza axit, photphataza kiềm,
esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu ức chế với NaF và không ức chế. Esteraza đặc
hiệu chỉ có mặt trên các tế bào dòng tủy còn các dòng khác âm tính hoặc dƣơng tính
với cƣờng độ rất thấp. Esteraza không đặc hiệu có mặt ở nhiều dòng tế bào khác
nhau nhƣng ở dòng monoxit thì bị ức chế bằng NaF. Ngoài hai kỹ thuật nhuộm PAS
và nhuộm Sudan dùng để phát hiện glucozit và lipit thì sáu kỹ thuật còn lại là
nhuộm phát hiện enzym. Do độ đặc hiệu còn thấp, việc phân loại dòng tế bào theo
tiêu chuẩn FAB dựa trên phƣơng pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều
chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền. Phƣơng pháp xác định tế
bào thuộc dòng tủy dựa chủ yếu vào kết quả nhuộm peroxidaza và esteraza đặc
hiệu. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza thƣờng không ổn định do dễ bị phân hủy bởi ánh
sáng vì thế cần bổ sung thêm kỹ thuật nhuộm esteraza có độ ổn định hơn. Hiện nay,
cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu là naphtol AS-D cloaxetat đƣợc đƣợc hãng Sigma
bán trên thị trƣờng với giá thành rất cao (13 triệu/1 gam). Qua nghiên cứu tài liệu có
thể thấy, cơ chất naphtol AS-D cloaxetat đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp truyền
thống là ngƣng tụ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với o-toluiđin, sau đó este hóa bằng
cloaxetyl clorua. Phản ứng ngƣng tụ cần thời gian dài, hiệu suất thấp; quá trình
chuyển hóa naphtol AS-D thành dẫn xuất cloaxetat hiệu suất cũng không ổn định.
11

Do việc nghiên cứu thiếu hệ thống nên chƣa xác định đƣợc mối tƣơng quan
giữa cấu trúc và hoạt tính, chƣa tìm đƣợc cơ chất có độ nhạy và độ đặc hiệu cao
nhất. Quá trình nhuộm chƣa đƣợc tối ƣu hóa gây khó khăn cho cán bộ thực hiện và
tốn kém cho bệnh nhân. Nƣớc ta chƣa sản xuất đƣợc cơ chất, phải nhập ngoại. Cơ
chất dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ > -20
0
C, là một trong những khó khăn lớn cho việc
vận chuyển và bảo quản. Những thách thức đó đã làm cho phƣơng pháp xét nghiệm
này chƣa đƣợc triển khai rộng rãi ở Việt Nam.
Vì vậy, đề tài nghiên cứu tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và tối ƣu hóa quy
trình nhuộm esteraza đặc hiệu để phân loại tế bào bạch cầu phục vụ việc khám và
điều trị bệnh ung thƣ máu có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội sâu sắc.
Mục tiêu của đề tài là xây dựng phƣơng pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp
cơ chất; khảo sát một cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để
tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao; tối ƣu hóa các điều kiện
nhuộm và chế tạo kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục vụ việc khám và điều
trị bệnh ung thƣ máu.
Nội dung nghiên cứu
1- Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên
liệu điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu ngƣời.
2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm
cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời.
3- Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý
và hóa lý hiện đại (Phổ IR,
1
H-NMR và MS) và nghiên cứu mối tƣơng quan giữa
độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử cơ chất bằng phƣơng
pháp tính hóa lƣợng tử.
4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để

nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời và tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu
và độ nhạy cao.
5- Nghiên cứu ảnh hƣởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu ứng không gian
của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử
cơ chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm esteraza.
6- Nghiên cứu tối ƣu hóa quy trình nhuộm bằng phƣơng pháp đơn hình và ứng dụng
để chế tạo bộ kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu
ngƣời từ cơ chất tổng hợp đƣợc.
12

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT
3-HIĐROXI-(N-THẾ)NAPHTALEN-2-CACBOXAMIT
3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có cấu trúc nhƣ sau:
2
3
1
4
6
5
7
8
NH
R
1
OH
O
9
10

R
1
là các vòng thơm có các nhóm thế thƣờng ở vị trí octo- hoặc para-
Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit đƣợc ứng dụng rất
rộng rãi trong thực tiễn. Trong công nghiệp chúng đƣợc dùng làm nguyên liệu đầu
để sản xuất phẩm màu, đặc biệt là mực in. Do quy trình sản xuất đơn giản, gam màu
phong phú, độ bền cao, nên loại hợp chất này đã có lúc chiếm tỷ trọng rất lớn đối
với thị trƣờng phẩm màu thế giới. Vai trò của họ hợp chất này trở nên đặc biệt quan
trọng khi ngƣời ta sử dụng chúng làm nguyên liệu sản xuất cơ chất để nhuộm
esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu ngƣời. Do những ứng dụng quan trọng nhƣ vậy,
nên loại hợp chất này đã thu hút sự quan tâm to lớn của các nhà khoa học. Số công
trình công bố trong lĩnh vực này rất lớn và đa dạng. Trong khuôn khổ tổng quan này
chỉ đề cập các phƣơng pháp tổng hợp quan trọng, những tính chất hóa lý cơ bản và
một số ứng dụng phổ biến liên quan đến họ hợp chất này.
1.1. Tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
Theo tài liệu [45] ngƣời ta tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacbox-
amit chủ yếu theo phƣơng pháp trực tiếp một giai đoạn hoặc phƣơng pháp gián tiếp
hai giai đoạn.
1.1.1. Phƣơng pháp một giai đoạn
Phƣơng pháp này lần đầu tiên đƣợc Schopf là nhà hóa học ngƣời Đức dùng
để tổng hợp naphtol AS vào năm 1892 [45], dựa trên phản ứng ngƣng tụ giữa axit
3-hiđroxi-2-naphtoic với anilin có mặt PCl
3
. Phƣơng pháp này còn đƣợc dùng cho
tới ngày nay với một số cải tiến, thay vì dùng PCl
3
vừa làm tác nhân vừa làm dung
môi, ngƣời ta tiến hành phản ứng trong các dung môi để tăng hiệu suất sản phẩm
[11]. Đây còn đƣợc gọi là phƣơng pháp tổng hợp trực tiếp. Quá trình phản ứng đƣợc
mô tả trên sơ đồ 1.1.

13

Sơ đồ 1.1
COOH
O
H
N
H
2
R
+
130-136
0
C/3h
CONH
O
H
R
+
PCl
Cl
Cl
P
N
N
H
R
R
Clobenzen (Xylen)
P

N
N
H
R
R
70-80
0
C
Clobenzen (Xylen)

Phản ứng đƣợc thực hiện bằng cách khuấy hỗn hợp của anilin, axit 3-hiđroxi-
2-naphtoic và một lƣợng dƣ PCl
3
trong dung môi hữu cơ nhƣ clobenzen hoặc toluen
ở nhiệt độ thấp, thƣờng là dƣới 40
0
C, tốt nhất là từ 0
0
C đến 25
0
C. Khi phản ứng xảy
ra, nhiệt độ sẽ tự tăng lên trên 40
0
C. Để đuổi HCl ngƣời ta phải đun hỗn hợp ở nhiệt
độ 75
0
C đến 180
0
C trong thời gian vài giờ. Hiệu suất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-
2-cacboxamit đạt từ 60-70%.

Theo phƣơng pháp trực tiếp một giai đoạn, ngƣời ta còn có thể tổng hợp
3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng cách cho axit 3-hiđroxi-2-naphtoic
tác dụng với lƣợng dƣ SOCl
2
. Sau khi khuấy 10 phút, ngƣời ta bắt đầu cho thêm dẫn
xuất anilin thế vào hỗn hợp [14]. Dung môi sử dụng trong phƣơng pháp này là
axetonitrin. Quá trình phản ứng đƣợc mô tả trên sơ đồ 1.2.
Sơ đồ 1.2
OH
O
OH
+
NH
2
PCl
3
/SOCl
2
OH
O
NH

Tuy nhiên trong quá trình thêm anilin thế vào hỗn hợp, HCl tách ra từ SOCl
2

phản ứng rất mãnh liệt tạo kết tủa phenylamoni clorua làm cho hiệu suất 3-hiđroxi-
(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit thu đƣợc rất thấp.
14

1.1.2. Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng phƣơng pháp

hai giai đoạn
Ngoài phƣơng pháp một giai đoạn, 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
còn đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp gián tiếp hai giai đoạn [10, 33, 35].
Trong giai đoạn 1, ngƣời ta tiến hành phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-
2-naphtoic với SOCl
2
để điều chế sản phẩm trung gian 3-hiđroxi-2-naphtoyl clorua.
Phản ứng đƣợc mô tả trên sơ đồ 1.3.
Sơ đồ 1.3
COOH
OH
SOCl
2
HCl, SO
2
COCl
OH

Ở giai đoạn 2, cho naphtoyl clorua tác dụng với anilin thế tạo ra sản phẩm
cuối là 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit. Quá trình phản ứng đƣợc mô tả
bằng sơ đồ 1.4.
Sơ đồ 1.4
COCl
OH
HCl
CONH
OH
anilin

Do naphtoyl clorua dễ phân huỷ trong không khí, nên phản ứng phải đƣợc

thực hiện trong điều kiện bảo ôn rất nghiêm ngặt. Hiệu suất phản ứng này cũng
không cao, chỉ khoảng 60%.
Kock-Yee Law và cs [59] đã thực hiện phản ứng hai giai đoạn theo cách khác.
Ở giai đoạn một, các tác giả đã đun hỗn hợp 2,8-đihiđroxi-3-naphtoic với phenol có
mặt xúc tác ngƣng tụ là POCl
3
ở 125
0
C, dƣới áp suất khí nitơ. Để tránh phản ứng
phụ đối với nhóm 8-OH, lƣợng dƣ phenol đã đƣợc sử dụng vừa làm tác nhân vừa
làm dung môi. Sau 2 giờ hiệu suất phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat đạt 76%. Ở giai
đoạn 2, tiến hành đun hồi lƣu hỗn hợp phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat và các dẫn
xuất anilin thế tƣơng ứng ở 250
0
C trong dung môi là N-metyl pyroliđinon (NMP)
dƣới áp suất nitơ. Sau 2 giờ hiệu suất N-thế-2,8-đihiđroxinaphtalen-3-cacboxamit
đạt trên 89%. Quá trình phản ứng đƣợc mô tả trên sơ đồ 1.5.
15

Sơ đồ 1.5
COOH
O
H
POCl
3
, 125
0
C
OH
O

H
O
O
O
H
O
O
NMP
NH
2
X
O
H
N
H
O
X
1)
2)

X = H, p-F, p-Cl, o-C
2
H
5
; NMP = N-metyl pyroliđinon.
1.2. Tính chất của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
1.2.1. Tính chất vật lý
3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit là những chất rắn có nhiệt độ nóng
chảy ổn định và nhiệt độ sôi tƣơng đối cao [45], nhƣ có thể thấy trên bảng 1.1. Tùy
theo nhóm thế trong vòng benzen mà 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có

độ phân cực khác nhau, chúng gần nhƣ không tan trong nƣớc, nhƣng tan hoàn toàn
trong các dung môi hữu cơ nhƣ clobenzen, THF, DMF, DMSO
Bảng 1.1. Các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit đã đƣợc thƣơng mại hóa
CONH
O
H
R
1
R
2
R
3
R
4

Naphtol AS thế
R
1

R
2

R
3

R
4

Tnc (
0

C)
Ts (
0
C)
Naphtol AS
H
H
H
H
247
494,0
Naphtol AS-D
CH
3

H
H
H
194
399,7
Naphtol AS-OL
OCH
3

H
H
H
162
421,0
Naphtol AS-LT

H
H
CH
3

H
220
436,8
Naphtol AS-E
H
H
Cl
H
264
416,5
Naphtol AS-MX
CH
3

H
CH
3

H
226
412,5

16

1.2.2. Tính chất phổ

Phổ IR: Các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có ba dao động hóa trị
đặc trƣng có cƣờng độ mạnh [36]. Một dao động của nhóm νC=O amit ở vùng
1695-1700 cm
-1
, dao động thứ hai của nhóm νNH amit ở vùng ~3400 cm
-1
và thứ ba
là dao động của nhóm νOH ở ~3500 cm
-1
. Do trong phân tử của các 3-hiđroxi-
(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit chứa đồng thời nhóm OH và NHC=O có khả năng
tạo liên kết hiđro nội phân tử, nên tần số dao động các nhóm 
NH
và 
OH
có

thể giảm
xuống đáng kể.
Phổ MS: Vì cấu trúc phân tử không phức tạp, nên nhìn chung phổ MS của các
3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit tƣơng đối đơn giản. Dƣới tác dụng của
chùm điện tử, xác suất phân mảnh cao nhất sẽ xảy ra tại liên kết amit và phân tử sẽ
tạo thành hai gốc chính, sau đó tiếp tục phân huỷ tạo thành những mảnh nhỏ hơn.
Phổ MS của naphtol AS-D có 5 đỉnh chính, đỉnh thứ nhất có số khối m/z = 277
tƣơng ứng với ion phân tử chƣa phân mảnh. Dƣới tác dụng của chùm điện tử đã liên
kết amit bị cắt đứt tạo thành hai mảnh ion m/z = 171 và 106, sau đó mảnh ion với số
khối 171 tiếp tục phân huỷ tạo thành hai mảnh ion với m/z = 143 và 115 nhƣ sơ đồ
1.5 [66].
Sơ đồ 1.5
CONH

OH
R
R
NH
-
OH
C
+
O
m/z = 171
O
-
CH
+
m/z = 115
m/z = 143

Phổ
1
H-NMR: độ chuyển dịch hóa học của các proton trong các dẫn xuất
3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit xuất hiện ở ba vùng chính [46]. Ở vùng từ
trƣờng yếu nhất là cộng hƣởng của proton nhóm OH ở ~11,80 ppm và nhóm NH ở
~10,60 ppm, cộng hƣởng của các proton vòng naphtyl ở vùng 7,60-8,70 ppm và các
proton vòng phenyl ở vùng 7,20-7,50 ppm. Độ chuyển dịch hóa học của các proton
vòng naphtyl ít thay đổi, trong khi đại lƣợng này của các proton vòng phenyl phụ
thuộc vào bản chất của các nhóm thế X. Nhóm thế đẩy điện tử sẽ làm tăng mật độ
điện tử trong vòng phenyl và độ chuyển dịch hóa học của các proton sẽ chuyển về
phía trƣờng mạnh và ngƣợc lại.
17

1.2.3. Tính chất hóa học
Các phân tử 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có chứa hai nhóm chức
chính là CO-NH và –OH. Là những phân tử có nhiều trung tâm phản ứng, chúng có
thể tham gia các chuyển hóa khác nhau. Trƣớc hết, nhóm hiđroxyl đẩy điện tử làm
dễ dàng cho phản ứng thế ái điện tử vào vòng naphtyl, đặc biệt là nguyên tử cacbon
C
4
. Thứ 2 là bản thân nhóm -OH dễ tham gia phản ứng este hóa. Thứ 3 là nhóm
amit có thể bị anion hóa trong môi trƣờng kiềm mạnh và bị axyl hóa bằng các tác
nhân axyl halogenua.
a) Phản ứng este hóa
Phản ứng este hóa trực tiếp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng
các axit cacboxylic thƣờng cho hiệu suất thấp (40-50%). Vì vậy, để điều chế các
este của chúng ngƣời ta thƣờng tiến hành theo phƣơng pháp kinh điển Schotten-
Baumann đƣợc mô tả trong nhiều tài liệu hữu cơ cơ bản [4, 5, 107], tức là cho các
dẫn xuất naphtol tác dụng với clorua axit hoặc anhiđrit axit hữu cơ trong môi trƣờng
kiềm hoặc piridin nhƣ mô tả trên sơ đồ 1.6.
Sơ đồ 1.6
NH
OH
O
R
1
NH
O
O
R
1
R
2

O
R
2
COCl
NH
OH
O
R
1
NH
O
O
R
1
R
2
O
(R
2
CO)
2
O

Áp dụng phƣơng pháp này Burston [18] đã tiến hành tổng hợp các este
3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat theo sơ đồ chung 1.7.
Sơ đồ 1.7
NH
O
OH
X

NaOH, THF/0
0
C
RCHClCOCl
NH
O
OOCCHClR
X

Về nguyên tắc quá trình este hóa chia làm 2 giai đoạn. Ở giai đoạn 1, trong
môi trƣờng kiềm, nhóm hiđroxyl của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit sẽ
chuyển hóa thành anion naphtolat; ở giai đoạn 2, anion naphtolat natri sẽ tác dụng
18

với cloaxyl clorua tạo thành sản phẩm este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cac-
boxylat (sơ đồ 1.8).
Sơ đồ 1.8
CONH
OH
X
NaOH 5N
X
CONH
ONa
1)
2)
CONH
ONa
X
RCHCOCl

Cl
X
CONH
OCOCHR
Cl
R = H, CH
3
THF
THF

Các sản phẩm este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat hiện đang
đƣợc bán trên thị trƣờng dƣới có tên thƣơng mại là naphtol AS-thế khác nhau:
-X
-R
Tên sản phẩm
-H
-H
Naphtol AS axetat
-H
-Cl
Naphtol AS cloaxetat
-CH
3

-H
Naphtol AS-D axetat
-CH
3

-Cl

Naphtol AS-D cloaxetat
…
b) Sự anion hóa trong môi trường kiềm mạnh
Hiệu suất este phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện tiến hành phản ứng. Thứ
nhất phải thực hiện ở nhiệt độ thấp để tránh phân huỷ sản phẩm este. Thứ hai là
nồng độ NaOH không quá cao (<5%). Nếu nồng độ NaOH > 5%, nhóm hiđroxyl sẽ
tấn công vào nhóm amít tạo ra đinatri aminnolat theo sơ đồ 1.9, muối này sẽ kết tủa
làm cho hiệu suất este giảm xuống [45].
Sơ đồ 1.9
NH
O
OH
X
NaOH, THF/60-90
0
C
N
O
ONa
X
Na

c) Phản ứng điazo hóa
Nhƣ đã nói ở trên, các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit dễ tham gia
phản ứng thế ái điện tử. Phản ứng đƣợc nghiên cứu tỷ mỷ và có ứng dụng thực tiễn
rộng rãi nhất là điazo hóa ở nguyên tử cacbon C
4
(sơ đồ 1.10).

19

Sơ đồ 1.10
NH
X
3
X
2
O
N
+
N
NH
OH
O
X
1
+
NH
OH
O
NH
X
3
X
2
O
N
N
X
1

Theo Herbst W [45] thì phản ứng này đƣợc A.Winter và các cộng sự tìm ra từ
năm 1911 và đƣợc dùng để sản xuất các phẩm màu azo nguồn gốc hữu cơ có ứng
dụng đặc biệt rộng rãi trên thực tế.
1.3. Ứng dụng của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
1.3.1. Ứng dụng để sản xuất phẩm màu
Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của các 3-hiđroxi-(N-thế)
naphtalen-2-cacboxamit là dùng làm tác nhân ghép đôi với các muối điazo để sản
xuất phẩm màu azo. Trong các loại phẩm màu sản xuất từ 3-hiđroxi-(N-thế)
naphtalen-2-cacboxamit thì nhóm naphtol AS thế là phổ biến nhất. Chúng rất phong
phú về chủng loại, chiếm lĩnh thị trƣờng phẩm nhuộm nửa đầu thế kỷ 20 nhờ có phổ
màu rộng từ vàng nhạt đến hồng, đỏ boocđô, đỏ son, nâu và tím Tùy theo cấu trúc
phẩm màu naphtol AS thế đƣợc chia làm 2 nhóm. Ở nhóm thứ nhất, tác nhân điazo
điều chế từ dẫn xuất cloanilin cho màu từ vàng đến đỏ tƣơi; còn từ dẫn xuất
clotoluiđin chủ yếu có màu đỏ ánh xanh; từ dẫn xuất nitrotoluiđin và nitroanisiđin
lại cho màu đỏ boocđô. Bảng 1.2 dƣới đây cho ta thấy màu sắc đa dạng của một số
phẩm màu đƣợc sản xuất từ naphtol AS [45, 115].
Bảng 1.2. Một số phẩm màu từ naphtol AS
R
2
R
5
N
R
4
N
OH O
NH
R
1

R
3
R
6

20

TT
R
2

R
4

R
5

R
1

R
3

R
6

Màu
1
2
3

4
5
6
7
8
Nhóm thứ I
1
Cl
H
Cl
H
H
H
Đỏ
2
CH
3

Cl
H
CH
3

Cl
H
Đỏ ánh xanh
3
Cl
H
Cl

OCH
3

H
H
Vàng nhạt
4
CH
3

H
Cl
CH
3

H
Cl
Đỏ ngọc
5
CH
3

NO
2

H
CH
3

H

H
Đỏ boocdo
6
NO
2

Cl
H
OCH
3

H
H
Nâu sẫm
7
CH
3

H
NO
2

H
H
NO
2

Đỏ son
8
Cl

Cl
H
CH
3

H
H
Vàng
9
Cl
H
Cl
OCH
3

H
OCH
3

Nâu
10
OCH
3

CONHC
6
H
5
CH
3

Naphtyl
Tím
Nhóm thứ II
12
H
CONH
2

H
OC
2
H
5
H
H
Đỏ
13
OCH
3

CONHC
6
H
5

H
H
H
NO

2

Đỏ ánh xanh
14
Cl
SO
2
N(CH
3
)
2

Cl
OCH
3

H
H
Vàng nhạt
15
OCH
3

CONHC
6
H
5

H
CH

3

H
Cl
Đỏ ngọc
16
OCH
3

CONHC
6
H
5

H
CH
3

H
Cl
Hồng
17
Cl
CONH
2
H
NHCOCH
3
H
H

Da cam
18
OCH
3

CONHC
6
H
5

H
OCH
3

Cl
OCH
3

Đỏ son
19
OCH
3

CONHC
6
H
5

OCH
3

H
H
H
Tím
20
OCH
3

CONHC
6
H
5

CH
3

H
H
H
Tím
21

Sự phong phú của phẩm màu naphtol AS chính là ở chỗ chúng tồn tại ở ít
nhất là hai dạng tinh thể có thể chuyển hóa lẫn nhau. Các nhóm thế khác nhau trong
nhân aryl của muối điazo có ảnh hƣởng lớn đến tính chất của phẩm màu naphtol AS
thế. Ví dụ nhƣ xét về khả năng hòa tan, phẩm màu naphtol AS thế nhóm I thƣờng
tan kém hơn so với nhóm II. Sunfoamit và cacbonamit (nhóm II) tạo thành dung
dịch một cách nhanh chóng mặc dù cấu trúc của chúng đồ sộ hơn rất nhiều so với
những naphtol AS thế nhóm I.

Khả năng tan trong dung môi (cũng nhƣ xu hƣớng chuyển hóa giữa hai dạng
tồn tại) quyết định tính chất và ứng dụng của các loại phẩm màu. Có những môi
trƣờng trong đó phẩm màu có khả năng chuyển từ dạng bị phai màu mạnh sang
dạng không phai màu. Số lƣợng các nhóm CONH càng nhiều thì khả năng tan của
phẩm màu càng tốt, không phụ thuộc vào cấu trúc của nó (bảng 1.3).
Bảng 1.3. Mối tƣơng quan giữa độ tan và cấu trúc phẩm màu [45]
STT
Cấu trúc phẩm màu
Số nhóm
CONH
Độ tan trong
etyl axetat
1
N
N
OH
N
+
O
-
O


0
Ít tan
2
Cl
Cl
N
N

OH O
NH


1
Ít tan
3
N
N
OH O
NH
O
NH
2
O


2
Tan
22

4
N
N
OH O
NH
O
O
NH
O

NH
2
O
Cl

3
Tan tốt
Các phẩm màu naphtol AS thế đƣợc dùng rất rộng rãi, trong đó có ba lĩnh
vực chủ yếu là mực in, sơn mạ và nhựa [45] (bảng 1.4).
Bảng 1.4. Các lĩnh vực ứng dụng của phẩm màu naphtol AS
Lĩnh vực
Mực in
Sơn, mạ
Nhựa
Dệt
Nhuộm sợi
Giấy
Khác
%
53
23
12
4
3
2
3
Trong lĩnh vực mực in, phẩm màu naphtol AS chiếm khoảng hơn 50% tổng
lƣợng tiêu dùng của thế giới. Lĩnh vực mà phẩm màu naphtol AS cũng đƣợc sử
dụng không ít là công nghiệp mạ và sơn. Các loại nhựa thƣờng dùng phẩm màu
naphtol AS thế là PVC, polystyren, polyeste… Các phẩm màu đƣợc sử dụng thƣờng

tan tốt trong dầu (dung môi hữu cơ) và có độ bền cao trong điều kiện khắc nghiệt.
1.3.2. Sản xuất cơ chất để nhuộm tế bào bạch cầu
Một ứng dụng quan trọng có tính đột phá của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-
2-cacboxamit là dùng làm tiền chất tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl)
naphtalen-2-yl cacboxylat để làm cơ chất cho phản ứng nhuộm hóa học tế bào. Đặc
biệt trong phân loại thể bệnh bạch cầu cấp 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-yl
cacboxylat đƣợc sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch
cầu ngƣời. Thực chất đây là một phản ứng thủy phân dƣới xúc tác của esteraza tạo
thành các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit tƣơng ứng. Hợp chất này sẽ
đƣợc ghép đôi với muối điazo để tạo thành phẩm màu azo tại các vùng có chứa
enzym trong bào tƣơng của tế bào. Phƣơng pháp nhuộm esteraza đặc hiệu giúp phân
loại thể bệnh dòng tủy với các dòng tế bào khác theo tiêu chuẩn FAB, phục vụ điều
trị bệnh ung thƣ máu.
1.3.2.1. Giới thiệu về esteraza trong tế bào bạch cầu
Theo phân loại của tiểu ban enzym (EC) thuộc Hội Hóa sinh quốc tế (IUB),
esteraza là một enzym hiđrolaza thuộc nhóm cacboxylesteraza (E.C.3.1.1.1) [101]
23

xúc tác các phản ứng thủy phân este cacboxylat thành axit và ancol, trong môi
trƣờng nƣớc đƣợc gọi là sự thủy phân:
Este cacboxylat + H
2
O ancol + cacboxylat
Trong tế bào bạch cầu ngƣời, esteraza đƣợc chia làm hai nhóm là esteraza
đặc hiệu và không đặc hiệu. Sở dĩ đƣợc gọi là esteraza đặc hiệu vì nó chỉ có trong
các tế bào dòng tủy từ nguyên tủy bào đến bạch cầu trung tính, các dòng tế bào khác
âm tính. Esteraza không đặc hiệu có ở nhiều loại tế bào khác nhau, nhƣ bạch cầu
mast, bạch cầu mono, bạch cầu trung tính nhƣng khi ức chế bằng NaF thì chỉ có
esteraza trong bạch cầu mono bị giảm hoạt tính, không hiện màu trong phản ứng
nhuộm hóa học tế bào bằng xúc tác bởi esteraza. Dựa vào tính chất khác nhau trong

quá trình nhuộm esteraza này mà các nhà Huyết học Pháp-Mỹ-Anh (FAB) [16] đã
đề ra tiêu chuẩn phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy và các dòng tế bào khác.
Esteraza có mặt ở hầu hết các mô trong cơ thể. Hàm lƣợng esteraza cao nhất
là trong các tế bào thực bào, sau đó đến tế bào gan, ruột, dạ dày, phổi, tiền liệt tuyến,
tụy và ít nhất là trong tế bào não. Trong tế bào, esteraza thƣờng phân bố chủ yếu
trong lƣới nội nguyên sinh chất, máy golgi, lysosom và màng tế bào [53, 90, 102
].
Esteraza là một enzym serin có tâm hoạt động đƣợc cấu tạo bởi axit amin Ser
đóng vai trò nucleophin, axit amin His đóng vai trò bazơ và một axit amin thứ 3,
đóng vai trò axit là Asp. Ở một số isoenzym thì Asp đƣợc thay bằng Glu và vì thế
esteraza còn đƣợc gọi là enzym có tâm hoạt động theo cơ chế Ser-His-Asp/Glu [80,
95] (hình 1.5).

Hình 1.1. Tâm hoạt động của esteraza
24

Esteraza là nhóm enzym không đồng nhất về mặt cấu trúc [104]. Các công
trình công bố gần đây cho thấy trong các tổ chức khác nhau thì esteraza có cấu trúc
khác nhau. Trọng lƣợng phân tử từ 19.500-180.000 dalton (Da) [81, 83]. Kích thƣớc
của enzym vào khoảng 2-3 Ǻ. Bằng kỹ thuật sắc ký cột sephadex Kaphalia và c.s
[58] đã xác định đƣợc esteraza gồm 2 chuỗi có trọng lƣợng phân tử là 60kDa và
phần kia là 180 kDa. Phần 180 kDa là một trimer và bị ức chế bởi diisopropyl
flophotphat trong các phản ứng nhuộm, tức nó thuộc loại B esteraza (bị ức chế bởi
hợp chất florua) [52, 78]. Về mặt điện tích thì esteraza là một enzym mang điện tích
âm và các isoenzym nằm trong vùng đẳng điện (pI) từ 5,5-6,1 [94]. Nhiều isoenzym
có tính đặc hiệu khá cao cho từng dòng tế bào và có thể coi nó nhƣ một giá trị tham
chiếu để nhận dạng dòng tế bào. SM Gignac và c.s [38] bằng phƣơng pháp điện di
đã tìm ra 5 isoenzym khác nhau của esteraza đặc hiệu cho các tế bào máu, là
esteraza mono 1/mono 2 tìm thấy trong các tế bào bạch cầu mono; My 1/My 2 dòng
tủy, bệnh đa u tủy, dòng hồng cầu, dòng tiểu cầu; Lym 1/Lym 2 trong tế bào

lympho và cuối cùng là Unc trong tế bào chƣa biệt hóa. Nhƣ vậy có thể khẳng định
esteraza là một tập hợp gồm nhiều isoenzym không đồng nhất. Bằng phƣơng pháp
sắc ký điện di Scott và c.s [87] đã thu đƣợc esteraza tinh khiết từ các tế bào bạch
cầu dòng tủy và tìm ra hai isoenzym của esteraza A và B. Hai isoenzym này thƣờng
có mặt trong các bào quan của cả hai dòng bạch cầu đoạn và bạch cầu mono. Nhiều
công trình nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hai isozym này khác nhau về sự ức
chế bởi nhiệt độ và NaF [20, 27, 84, 90].
Năm 1991, bằng kỹ thuật Northern blot, Zschunke F và c.s [114] đã giải mã
ARN thông tin (mARN) tinh khiết chiết xuất từ tế bào bạch cầu mono và đã tìm ra
cấu trúc bậc 1 của enzym này gồm 503 axit amin. Trên bản đồ gen ngƣời, esteraza
bạch cầu đƣợc mã hóa trên nhiễm sắc thể thứ 16. Trọng lƣợng phân tử là 60kDa và
bị ức chế bởi diisopropyl flophotphat nồng độ 2 mM. Tác giả cũng chỉ ra sự giống
nhau đến 90% về cấu trúc của esteraza bạch cầu với esteraza ở microsome của tế
bào gan. Các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn của enzym đang tiếp tục đƣợc
nghiên cứu [87].
1.3.2.2. Phản ứng thủy phân este
Esteraza xúc tác cho quá trình thủy phân các este thành axit cacboxylic và
ancol. Các este này có thể là các este béo, este vòng thơm [44, 77]. Đây là phản
ứng phổ biến trong mọi tế bào, đặc biệt trong chuyển hóa các chất nội và ngoại sinh.
25

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy các gốc Ser, His, Glu, Asp và Gly ở trong tâm
hoạt động của esteraza có vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác phản ứng thủy
phân este. Điều này đƣợc minh chứng bằng sự sụt giảm khả năng xúc tác trong phản
ứng thủy phân este của enzym khi thiếu một hoặc một số axit amin nêu trên ở các
esteraza phân lập đƣợc [53].
Hiện nay, nhiều hợp chất đƣợc sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm
esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời, trong đó phổ biến nhất là naphtol AS axetat và
naphtol AS-D cloaxetat. Cơ chế của phản ứng thủy phân các cơ chất này dƣới tác
dụng của esteraza bạch cầu ngƣời xảy ra theo sơ đồ 1.11 [23, 61, 78, 101].

Sơ đồ 1.11
N
H
O
O
X
RO
N
H
O
H
O
X
Esteraza / H
2
O
- RCOOH

Trong đó: X: -H, -CH
3
; R: CH
3
, CH
2
Cl
Đây là phản ứng thủy phân dƣới xúc tác của enzym nên nó đòi hỏi phải có
những điều kiện phù hợp với từng isoenzym nhƣ pH, nhiệt độ, dung dịch đệm Đặc
biệt, cấu trúc của phân tử cơ chất (este) phải phù hợp với tâm hoạt động của enzym
nhƣ “ổ khóa và chìa khóa” thì phản ứng mới diễn ra thuận lợi (hình 1.6).

Hình 1.2. Phân tử esteraza